JPH0237B2

JPH0237B2 -

Info

Publication number: JPH0237B2
Application number: JP60002725A
Authority: JP
Inventors: Kanehiko Enomoto; Yoshiaki Sato; Yasutaka Nakajima; Atsushi Fujiwara; Toshiaki Doi
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1985-01-11
Filing date: 1985-01-11
Publication date: 1990-01-05
Also published as: DE3685337D1; FI860084L; EP0187681B1; BR8600088A; FI86202C; FI860020A0; JPS61162195A; EP0187681A2; FI86202B; EP0187681A3; SU1568892A3; FI860084A0

Description

【発明の詳細な説明】

発明の背景技術分野本発明は、ニトリラーゼ活性を有する微生物の
作用によりニトリル化合物を水和して対応するア
ミド化合物に転化させる方法に関する。さらに具
体的には、本発明は、使用微生物に光を照射する
ことによつて収率、空時収率および菌体生産性
（単位菌体量当り可能なアミド化合物生産量のこ
とをいう）よくアミド化合物を製造する方法に関
する。近年、微生物またはそれから得られた酸素を用
いて種々の化学反応を実施する技術が開発されつ
つある。一般に、微生物ないし酸素による反応
は、常温常圧下に実施できるのでエネルギー消費
が少なく、しかも目的生成物への選択性が極度に
高いので高純度の製品が得られ易いという特徴が
ある。しかしその反面、この反応は、反応活性お
よび微生物ないし酸素の触媒としての寿命の点で
改善すべき余地がある。特に、目的とする反応の
速度すなわち反応活性が常法通り反応条件特に温
度および（または）PHの至適化を行なつたとして
も低位の場合は、空時収率が低いので反応器の容
量を増大しなければならないばかりでなく、反応
速度が遅いため反応時間が長くなるところから、
これがさらに反応活性の低下につながつて、菌体
生産性が悪化する。従つて、微生物あるいは酸素の反応活性をを高
位に発現させることは、基本的に重要なことであ
り、工業生産における経済性を左右するものであ
る。先行技術ニトリル化合物を水和して対応アミド化合物に
転化させる酸素活性、すなわちニトリラーゼ活
性、を有する微生物の作用下にニトリル化合物を
水和して対応アミド化合物を製造する方法は、特
公昭56−17918号、同56−38118号および特開昭51
−86186号各公報に記載されている。この反応で
は微生物が重要な役割を担うところ、これら各公
報には何種類かの微生物が開示されている。問題点これらの微生物のニトリラーゼ活性を利用して
ニトリル化合物の水和を工業的規模で実施すべく
容量の大きな金属製反応装置を使用したところ、
ニトリラーゼ活性の発現が不充分であつた。この
ような現象が微生物自体に起因するのかあるいは
反応装置の材質、構造その他の理由によるのかは
不明であつたが、この点が解決されなければこの
微生物学的なアミド化合物の製造法を工業的に実
施することはできない。一つの解決策上記の点に解決を与えるものとして、本発明者
らは既に一つの発明をなした（特願昭58−125588
号）。その発明は、水和反応を少なくとも一部が
光不透性材料からなる容器の中で実施する場合
に、少なくとも約１×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光
エネルギーを受けさせるということを骨子とする
ものである。しかし、その後、受けさせる光の波長とニトリ
ラーゼ活性の発現との関係を詳細に検討した結
果、菌体の活性向上が期待し得る最少の光エネル
ギーは光の波長によつて変り、波長が約300〜
450nｍの場合には先の値より大幅に低減し得る
ことが見出された。発明の概要要旨本発明は上記の知見に基づくものである。従つて、本発明による微生物によるアミドの製
造法は、ニトリル化合物をニトリラーゼ活性を有
する微生物の作用によつて水と反応させて対応す
るアミド化合物に転化させる方法において、この
反応を下記の条件下に実施すること、を特徴とす
るものである。 (イ) ニトリラーゼ活性を有する微生物が、グラム
染色性が陽性のものであること。 (ロ) 使用する微生物菌体に、水和反応の終了以前
に約300〜450nｍの光を照射して約２×10^-3〜
約１×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光エネルギーを
受けさせること。 (ハ) 水和反応を、少なくとも一部が光不透過性材
料からなる容器の中で実施すること。効果このように、本発明ではニトリラーゼ活性を有
する微生物の作用によつてニトリルの水和反応を
実施するに当り、この微生物に光を照射すること
によつて、光不透過性材料で製作した反応容器中
では光が実質的に存在しないので実質的に進行し
ないこの水和反応を進行させることができ、また
一部を光不透過性材料で製作した反応容器中では
光が存在するのである程度は進行するこの水和反
応を光照射によつて著しく促進することができ
る。この水和反応におけるような光照射の効果はニ
トリラーゼ活性を持たない微生物には検討した限
りでは認めることができない。酸素の利用を含めて微生物学的な方法で有用物
質を生産することは既に多くの事例が知られてい
るのであるが、光のような電磁波を照射して微生
物ないしその酸素の活性を高める例は殆んど知ら
れておらず、むしろ一般には照射は有害であるこ
とが多いとされていることをも考慮すれば、上記
の特定の場合について認められた光照射の効果は
全く思いがけなかつたことといわなければならな
い。発明の具体的説明使用微生物ニトリラーゼ活性を有する微生物の作用によつ
てニトリル化合物を対応アミド化合物に転化させ
ることが公知であることは前記した通りである
が、本発明者の見出したところによれば前記特公
昭56−17918号、同56−38118号および特開昭51−
86186号公報に記載されている属の微生物は一般
に光による活性向上がある。これらの属の微生物に共通する特徴は、グラム
染色性が陽性であり、一般にりん脂質を有し、細
胞膜が厚く、そのため物質の透過に抵抗があり、
また細胞内酸素を取り出すに当つての膜破砕も容
易ではない、ということである。さて、本発明で使用される微生物は、ニトリラ
ーゼ活性を有するグラム陽性菌である。このよう
な微生物の具体例を挙げれば、下記の群から選ん
だ属に属するものがある。 (イ) コリネバクテリウム属 (ロ) ノカルジア属 (ハ) バチルス属 (ニ) バクテジリウム属 (ホ) ミクロコツカス属 (ヘ) ブレビバクテリウム属これらの属に属する具体的な菌株の例を挙げれ
ば、コリネバクテリウム属のものとしてはＮ−
771株（昭和53年５月30日付微工研菌寄第4445号）
およびＮ−774株（昭和53年５月30日付微工研菌
第4446号）、ノカルジア属のものとしてはＮ−775
株（昭和53年５月30日付微工研菌寄第4447号）が
あつて特公昭56−17918号および同56−38118号公
報に記載されており、バチルス属以外のものとし
ては特開昭51−86186号公報に記載されたものが
あつて、CBSおよび微工研に寄託されていると
記載されている。これらの菌株の菌学的性質はこ
れら諸公報に記載されていて公知である。ニトリル化合物およびアミド化合物ニトリル化合物は一般に式Ｒ−（CN）_oで表わさ
れ、ｎの値によつてモノニトリル（ｎ＝１）およ
びポリニトリル（ｎ＞２）があるうえ、Ｒは水素
あるいは種々の炭素数の直鎖状、分岐鎖状または
環状の飽和または不飽和の炭化水素残基、および
アミノ基、ヒドロキシル基、ハロゲン基、カルボ
キシル基、その他の置換基を有する炭化水素残基
であつて、広範囲の化合物が包含される。後記実施例に示されているように、多くのニト
リル化合物について実験した結果ではすべて例外
なく光照射でニトリラーゼ活性向上が認められて
おり、本発明はニトリル化合物に対して一般に成
立つ。水和反応生成物は出発ニトリル化合物のシアノ
基が水和したアミド化合物である。生成物の有用性の観点からは、少なくとも現在
の判断基準からすれば、アクリロニトリルからア
クリルアミドおよびジアノピリジンからニコチン
酸アミドの生産が重要であろう。水和反応ニトリラーゼ活性を有する微生物の作用下にニ
トリル化合物の水和を行なう方法は公知であつ
て、本発明でもその趣旨が損なわれない限り任意
の態様でこの反応を実施することができる（光照
射によつて、水和反応そのものには変化が認めら
れない）。この方法は、一般に微生物菌体と原料ニトリル
化合物とを水性媒体中で所定時間接触させること
からなる。微生物菌体は、培養液の形で、培養液から分離
した生菌体の形で（水洗したものが好ましい）、
生菌体を乾燥させた形で、あるいは生菌体（また
は乾燥菌体）を適当な担体に担持ないし固定化し
た形で、あることができる。好ましい形態は、生
菌体および生菌体を水性重合体ゲル（たとえば架
橋ポリアミドゲルあるいは架橋ポリビニルアルコ
ール）中に固定化したもの、である。水性媒体中の基質（ニトリル）濃度および菌体
濃度も上記のように適当に選択することができる
が、一般的には基質濃度約0.01〜約５％程度、菌
体濃度（乾燥菌体換算）約0.01〜約２％程度（以
上いずれも重量％）である。反応温度、反応PHそ
の他の反応条件も使用微生物の種類に応じて適当
に定めればよいが、反応温度は氷点〜20℃程度、
PHは７前後である。PH値を所定値に保つため適当
なバツフアーを使用することができることはいう
までもない。なお、水和反応に供すべき菌体の調製は、所与
の微生物をそれに適した条件で培養すればよいこ
とはいうまでもない。培養液から分離されて水和
反応に供される菌体は非増殖条件下にあるという
ことができる。光照射 (1) 光光照射は、水和反応終了以前の菌体に対して
行なう。ここで、水和反応終了以前とは水和反
応の終了（必ずしも転化率100％を意味しない）
以前の任意の時点を意味する。光照射は菌体に
対して行なうのであるから、水和反応終了以前
とは菌体をニトリル化合物と接触させる前の時
点をも意味する。すなわち、光照射は、菌体を
ニトリル化合物に接触させる前および（また
は）接触させた後に行なうことができる。このように、光照射は菌体をニトリル化合物
と接触させる前のみを行なうことができる。し
かし、光照射した菌体を光不存在下にニトリル
化合物と接触させる場合は、光照射による活性
向上効果は認められるけれどもその接続が充分
ではない（ただし、光照射をすれば回復する）。
従つて、本発明の好ましい実施態様では菌体を
ニトリル化合物と接触させた後に光照射を行な
う。具体的には、たとえば、ニトリル化合物と
接触させる前にも接触後の水和反応中にも行な
う。本発明で照射する「光」は、波長が約300〜
約450nｍのものであり、具体的には300〜400n
ｍの範囲のブラツクライト類やその他の水銀ラ
イト類からの光が例示される。しかし、螢光
灯、白熱球等の一般照明用ライト類からの光
（400〜800nｍ）からはほとんど得ることがで
きない。光の照射は、それによつて活性向上効果が実
現される限り任意の強度ないし量で行なえばよ
い。具体的には、菌体が約２×10^-3〜約１×
10^-2μE／ｇ菌体・秒、好ましくは約５×10^-3〜
約１×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光エネルギーを
受けるように照射を行なうべきである。なお、
固定化菌体を使用する場合はこれと同一濃度の
生菌体使用の場合にくらべて反応速度が約1/2
〜1/3に低下することがあるが、その場合は上
記値より約２〜３倍の光エネルギー量が必要で
ある。ここで、「μE」は１モル分子数に等しい
数の光量子のもつエネルギー（Ｅ（アインシユ
タイン））×10^-6で表わした光エネルギー量であ
り、「ｇ菌体」は乾燥菌体の菌体重量をｇで表
わしたものである。秒は照射時間を秒で表わし
たものである。本発明における光の波長は室内照明用水銀ラ
イトからの光や太陽光にも一部含まれるが、本
発明で必要とする本発明における最少の光エネ
ルギー量でも、通常の工業的生産規模での反応
容器その他の反応装置の環境においては上記の
ような照明光や一部室内への散乱太陽光によつ
ては得ることができない。 (2) 照射ニトリル化合物と接触する前の菌体あるいは
ニトリル化合物と接触している菌体が、それを
照射対象とする光源から所定量の光エネルギー
を連続的にあるいは非連続的に受けることがで
きる限り、任意の態様で照射を行なうことがで
きる。ここで、「菌体を照射対象とする光源」とは、
菌体を照射すべく反応装置内または外に設けら
れた光源を意味し、反応装置を取りまく環境が
散乱太陽光および（または）室内照明光として
反応装置内に入射させることあるべき光を包含
するという趣旨である。なお、反応装置の在る
室内を不必要ないし不自然に明るくしてその光
により反応装置内への有意の光エネルギーの入
射が認められるときは、そのような光源は本発
明でいう光源と解すべきものとする。光の照射は、具体的には、たとえば、菌体の
存在する容器の上部空間（すなわち、菌体ある
いはそれが懸濁する水性媒体液面上の空間）に
光源を設置して照射を行なう方法、容器の上
部、側部または底部に窓を設けてそこから外部
光源から照射を行なう方法、および一般に光化
学反応器として多用されるように液中浸漬ラン
プにより照射する方法、その他の方法、によつ
て行なうことができる。また、必要ならば、あ
るいは可能ならば、菌体の存在する容器（特に
反応容器）から反応液を抜出して、それについ
て別の容器で上記のような照射を行なうことも
できる（この場合の「別の容器」は、透明ガラ
ス管の一本または複数本からなるものであつて
もよい）。なお、光照射による本発明の効果は、通常の
散乱太陽光や室内光の入射によつては光エネル
ギー量が不足するような工業的生産規模での反
応容器を使用する場合に特に顕著である。この
ような反応容器は光不透過性材料、特に金属に
よつてその実質的部分が製作されていることが
ふつうであり、このような光不透過性の反応容
器では例えば視き窓あるいは蓋部から得られる
一般照明による光エネルギーでは極めて不充分
で積極的な光の照射が不可欠である。なお、こ
こで「反応容器」とは、水和反応の少なくとも
大部分が実施される反応装置部分をいう。実験例実施例１グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、麦芽エキス0.3％および硫酸第一鉄・７水
塩0.05％を含む培地（PH7.2）により好気的に培
養して調製したＮ−774株（コリネバクテリウム
属）の洗滌菌体を得た。この菌体を暗所にて
0.05M リン酸バツフア−（PH7.7）に分散させ
て、2.0ｇ乾燥菌体／リツトルの濃度の菌体分散
液を調製した。この菌液を暗所にて０℃で15時間
放置した（以後、このサンプルを「暗放置」とい
う）後に二分し、一方は4Wブラツクライト（東
京芝浦電気(株)製）を用いて８×10^-3μE／ｇ菌
体・秒の光エネルギー照射下に０℃で４時間放置
し（以後、このサンプルを「明放置」という。）、
もう一方は暗放置を継続した。この菌液を用い
て、それぞれについて、以下の処方にて、アクリ
ロニトリルからアクリルアミドを生成させ、アク
リルアミドの生成量の差により反応速度を比較検
討した。すなわち、明放置にては、菌体0.088部（乾燥
菌体量（以後この重量で示す））、アクリロニトリ
ル１部および0.05M リン酸バツフアー（PH7.7）
98.912部を混合し、ガラス製50ミリリツトル反応
器中で上記と同じ光照射条件で撹拌下に10℃で20
分間反応させた（以後、この反応を「光照射反
応」という）。一方、暗放置は、光を照射しない
こと以外は、同条件で反応（以後、この反応を
「暗反応」という）を行なつた。それぞれの反応
終了液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフ
イーにより定量分析した。その結果、単位菌体当
りのアクリルアミド（AA）の生成能で比較する
と、明放置光照射反応では20.4μモルAA／mg菌
体・分であり、暗放置暗反応では0.31μモルAA／
mg菌体・分であつた。また、この生成能を比較す
ると、明放置光照射反応／暗放置暗反応＝66であ
つた。以下の実施例については、本実施例中の明放置
光照射反応の20.4μモルAA／mg菌体・分を100U
とした相対値で示す。従つて、本例での暗放置暗
反応は、換算すると1.52Uとなる。実施例２〜13 実施例１と同様にして得た明放置と暗放置の菌
体それぞれについて、表−１の組成の反応液をつ
くり、実施例１と同様に反応させて、それぞれの
反応終了液を得た。これらの反応終了液中の対応
各アミド化合物をガスクロマトグラフイーにより
定量分析して、表−２の結果を得た。

【表】

【表】プロピオニトリ
ル（1)

【表】オニトリルピオアミド
実施例 14〜18 実施例１と同様にして調製した各種の属の菌
株、すなわち実施例14：バシラス属（CBS−
494）、実施例15：バクテリジウム属（CBS−
497）、実施例16：ミクロコツクス属（CBS−
497）、実施例17：ブレビバクテリウム属（CBS
−717）、および実施例18：ノカルジア属（Ｎ−
775）、の洗滌菌体を得て、実施例１と同様にして
明放置と暗放置の菌体を得た。この菌体をそれぞ
れ以下の処方にてアクリロニトリルからアクリル
アミドを生成させ、アクリルアミドの生成量の差
により反応速度を比較検討した。すなわち、それぞれの菌株の明放置と暗放置と
について菌体0.088部、アクリロニトリル１部、
0.05M リン酸バツフア−（PH7.7）98.912部を混
合し、撹拌下に10℃で20分間反応（光照射反応）
させ、また暗放置では光を照射しないこと以外は
同条件で反応（暗反応）を行なつて、反応終了液
を得た。それぞれの反応終了液のアクリルアミド
をガスクロマトグラフイーにより定量分析して、
表−３の結果を得た。

【表】実施例19〜21および比較例１〜２グルコース１％、ペプトン0.5％、酵母エキス
0.3％、麦芽エキス0.3％および硫酸第一鉄・７水
塩0.05％を含む培地（PH7.2）により好気的に培
養して調製したＮ−774株の洗滌菌体を得た。こ
の菌体を暗所にて0.05モルリン酸バツフア−
（PH7.7）に分散させて、22.72mg／ｍリツトルの
菌液を調製した。この菌液をそれぞれ鋼製の50ｍリツトル容器１
ｍリツトル採取し、24ｍリツトルの0.05モルリ
ン酸バツフアー（PH7.7）を加えて、実施例１と
同じ光源を用い、容器上部からの受光量を受光面
積の異なるフイルターを用いることにより、表−
４に示す光エネルギーとなるように調製して、０
℃、撹拌下光照射を１時間および20時間行なつ
た。これらの光照射菌液に、それぞれ同じ光照射条
件下に５％アクリロニトリル溶液（0.05モルリ
ン酸バツフアー（PH7.7）溶液）を25ml加え20時
間反応を行ない、反応終了液を得た。なお、比較
のため光照射を全く行なわなかつたものおよび１
×10^-3μE／ｇ菌体・秒の光エネルギーについて
も上記同様に反応を行なつた。これらの反応液中のアクリルアミドの生成量を
ガスクロマトグラフイーにより定量分析し反応速
度を求めた。結果を表−４に示した。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】１ニトリル化合物をニトリラーゼ活性を有する
微生物の作用によつて水と反応させて対応するア
ミド化合物に転化させる方法において、この反応
を下記の条件下に実施することを特徴とする、微
生物によるアミドの工業的製造法。 (イ) ニトリラーゼ活性を有する微生物が、グラム
染色性が陽性のものであること。 (ロ) 使用する微生物菌体に、水和反応終了以前に
約300〜450nｍの光を照射して約２×10^-3〜約
１×10^-2μE／ｇ菌体・秒の光エネルギーを受
けさせること。 (ハ) 水和反応を、少なくとも一部が光不透過性材
料からなる容器の中で実施すること。２光エネルギーが、約５×10^-3〜約１×
10^-2μE／ｇ菌体・秒である、特許請求の範囲第
１項に記載の方法。３光の照射を、微生物菌体をニトリル化合物に
接触させる前および（または）接触させた後に実
施する、特許請求の範囲第１〜２項のいずれかに
１項に記載の方法。４微生物が、コリネバクテリウム属、ノカルジ
ア属、バチルス属、バクテリジウム属、ミクロコ
ツカス属およびブレビバクテリウム属からなる群
から選ばれた属に属するものである、特許請求の
範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の方法。５ニトリル化合物が、アセトニトリル、プロピ
オニトリル、ｎ−ブチロニトリル、ｉ−ブチロニ
トリル、ｎ−バレロニトリル、アクリロニトリ
ル、メタクリロニトリル、ベンゾニトリル、シア
ノピリジン、マロノニトリル、サクシノニトリ
ル、フマロニトリル、クロロアセトニトリル、β
−ヒドロキシプロピオニトリル、アミノアセトニ
トリルおよびβ−アミノプロピオニトリルからな
る群から選ばれたものである、特許請求の範囲第
１〜４項のいずれか１項に記載の方法。