JPH0240189B2 - Katekooruruinoteisei*teiryohoho - Google Patents
Katekooruruinoteisei*teiryohohoInfo
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- JPH0240189B2 JPH0240189B2 JP15180782A JP15180782A JPH0240189B2 JP H0240189 B2 JPH0240189 B2 JP H0240189B2 JP 15180782 A JP15180782 A JP 15180782A JP 15180782 A JP15180782 A JP 15180782A JP H0240189 B2 JPH0240189 B2 JP H0240189B2
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- Japan
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- catechols
- sample
- cyanoacetamide
- fluorescence
- catecholamines
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
- G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators
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- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
本発明はカテコール類の定性、定量方法に関す
る。カテコール類は生体内に広く存在し、生化学
的或は臨床化学的に重要な意味を持つものが多
い。例えば、ピロカテコールの誘導体であるカテ
コールアミン類、３，４−ジヒドロキシフエニル
アラニンあるいは３，４−ジヒドロキシフエニル
酢酸などは副腎髄質の機能、交感神経系、パーキ
ンソン氏病などに深い関連があり、それらの定
性、定量は生体内での生合成系および代謝系の異
常の判定、疾病の診断にとつて重要な意味を有す
る。 しかしながら、これらカテコール類の生体内に
おける存在量は極めて微量であるため、従来、知
られあるいは行われている定性、定量方法におい
ては種々解決すべき問題点が存在していた。 すなわち、従来行われている生体由来の試料中
のカテコール類の定性、定量方法としては次のも
のがあげられるが、それらは、いずれも後述する
如き欠点を有する。 (1) セリウム塩法 (2) UV法 (3) トリヒドロキシインドール法 (4) エチレンジアミン法 上記(1)のセリウム塩法は、試料に対し、アンモ
ニアの存在下にセリウム塩水溶液を作用させ、生
成する物質の紫色の発色を測定するものである
が、この方法は、その検出感度が低いという欠点
を有する。上記(2)のUV法はカテコール類が紫外
領域に吸収を持つことを利用して、分析対象物の
紫外吸収を測定するという方法で、簡単な操作で
行い得るという利点はあるが、カテコール類以外
の物質の吸収も含まれてしまうことおよび感度が
低いことが、欠点として存在する。上記(3)のトリ
ヒドロキシインドール法は、分析対象物をフエリ
シアンイオンや沃素などの酸化剤で処理して、ヒ
ドロキシインドールを生成させ、そのけい光を測
定するという方法で、上記(1)、(2)の方法に比し
て、高感度の分析が可能ではあるが、操作が煩雑
であること、特定の物質例えばドパミン、ドーパ
などに対しては、感度が著しく低く、特にクロマ
トグラフイによる分析において使用する場合に
は、他のカテコールアミンであるエピネフリンや
ノルエピネフリンなどの場合と同等の感度が得ら
れない（数十分の一乃至百分の一程度である）と
いう重大な欠点を有する。上記(4)のエチレンジア
ミン法は、分析試料に対し、アルカリ性の下でエ
チレンジアミンを作用させ、生成するけい光性物
質のけい光を測定する方法であるが、比較的感度
が低いため、微量のカテコール類を分析するため
の、より、高感度の測定が所望される場合には、
満足すべき結果が得られず、そのため、適用に制
約があるという欠点を有する。 本発明者らは、カテコール類の定性、定量方
法、特に、生体由来の試料中における微量のカテ
コール類の定性、定量方法につき、種々研究した
ところ、２−シアノアセトアミドを用いて、分析
試料をこの２−シアノアセトアミドで処理し、そ
れにより生成するけい光性物質のけい光を測定す
ることにより、極めて優れた結果をもつてカテコ
ール類の定性、定量を行い得ることを見出した。 本発明は、かかる知見に基づくものである。 本発明方法は、従来法の欠点を有せず、カテコ
ール類の各物質に対して同等レベルの高感度を有
する定性、定量を可能にし、しかも、簡便な操作
と低廉な費用という利点を有し、自動化も容易で
あるという優れた長所を有するものである。 以下に本発明を詳述する。 本発明方法は、カテコール類を含有する分析対
象物（試料）を、化学式NCCH2CONH2で表わ
される２−シアノアセトアミドで処理し、試料中
に存在するカテコール類と２−シアノアセトアミ
ドとを反応せしめ、その反応により生成するけい
光性物質のけい光を測定することにより、試料中
のカテコール類の定性、定量を行うものである。
ここに分析対象とされるカテコール類は、その化
学構造式中に、式、 で示されるカテコールの構造を有する化合物であ
つて、特に後掲の表１に掲げるような、生体成分
として極微量存在するカテコールアミン類をはじ
めとするカテコール構造を有する物質群である。 本発明方法において定性、定量を行おうとする
対象物（試料）としては、通常は、生体由来の試
料例えば血液、髄液、組織液などの体液、尿など
生化学的あるいは臨床化学的に測定しようとする
カテコール類を含有した材料があげられる。 これら試料は、必要に応じ、前処理、例えば夾
雑物の除去、あるいはカテコール類の分離など、
定性、定量の精度を高めるための処理に付され
る。カテコール類を予め分離しておくためには、
クロマトグラフイなどの手段が使用される。 本発明方法においては、上記の如き分析対象物
を、２−シアノアセトアミドにより処理するが、
その処理方法としては、分析対象物中のカテコー
ル類が、２−シアノアセトアミドと反応してけい
光性物質を生成するように、両者を接触せしめる
方法であればいずれでもよい。通常は、２−シア
ノアセトアミドを水溶液として調製しておき、こ
の水溶液を分析対象物（試料）と合わせることに
より行う。この水溶液濃度は、通常は0.01w／ｖ
％〜10.0w／ｖ％の範囲であり、反応混合液中で
好ましくは0.1w／ｖ％〜2.0w／ｖ％濃度を示す
ように用いられる。 上記のカテコール類と２−シアノアセトアミド
とを反応させるにあたつては、緩衝溶液中でその
反応を行わしめると、より好ましい結果が得られ
る。 本発明方法は下記(1)〜(6)の条件に適合して実施
するときに、より好ましい結果が与えられるが、
実施条件はこれに限定されるものではない。 (1) 使用する２−シアノアセトアミドの濃度 反応混合液中で0.1w／ｖ％〜2.0w／ｖ％の
範囲の濃度を示すように用いるのが好ましい。
反応混合液中で2.0w／ｖ％以上の濃度を示す
場合には、若干の試薬ブランクの増加が認めら
れる。 (2) 緩衝溶液の種類と濃度 緩衝溶液の種類は、特に限定されない。例え
ば、りん酸緩衝溶液、ほう酸緩衝溶液、りん酸
−ほう酸系緩衝溶液などが用いられる。濃度
は、反応混合液中で0.01M以上（緩衝溶液とし
て通常使用される濃度）が用いられる。 (3) 緩衝溶液のPH ９〜13であるが、至適PHは個々の化合物によ
つて異る。至適PHから大巾に外れる場合は感度
の低下が見られる。 (4) 反応温度 通常は100℃以下が適当である。100℃以上で
はけい光強度の増大が見られるが、同時に反応
液の沸騰に対する配慮が必要となる。 (5) 反応時間 反応温度と関連して任意に定められるが、
100℃程度の反応温度では、５分〜10分程度の
反応時間でけい光強度は最高値に達する。 (6) 測定波長 個々の化合物によつて、極大励起波長と極大
けい光波長は若干異るが（表１参照）、定性の
場合は、紫外線光線を照射して、けい光を目測
すれば足りる。定量の場合は、カテコール類の
個々の物質の極大励起波長と極大けい光波長と
を選択して、けい光強度を測定するか、又は若
干の感度低下を許容して、任意の特定の波長を
選択して測定するという簡便法をとることもで
きる。 本発明方法は、結局、分析対象物のカテコール
類が２−シアノアセトアミドと反応して生成けい
光性物質のけい光を測定することにより、定性又
は定量を行うものであるので、液体クロマトグラ
フイにより分離溶出した個々の物質についてこれ
を行う場合、分離した個々の物質を流動系で測定
しようとする場合、薄層クロマトグラムのスポツ
トにより測定する場合、その他、種々の実施態様
において、その態様に応じた、けい光測定の方法
が採用される。 けい光測定による定量の手段は、通常、一般に
光強度の測定による定量法に行われている作図的
あるいは非作図的な検量線による算定法による。
すなわち、あらかじめ標準濃度に基づく検量線を
定め、測定結果を検量線に準拠して、その濃度を
知る方法である。 以下に、本発明の実施例を検量線の作定をも含
めて、詳述する。 実施例 １ 表１中に列挙した各試料の溶液（１×10-5M）
１mlに対し、1w／ｖ％２−シアノアセトアミド
水溶液１mlおよび0.3Mほう酸緩衝溶液（PH11.0）
２mlを加えて沸騰水浴上で10分間加熱した。冷
後、分光けい光光度計でけい光強度を測定した。
表１にその結果を示した。
る。カテコール類は生体内に広く存在し、生化学
的或は臨床化学的に重要な意味を持つものが多
い。例えば、ピロカテコールの誘導体であるカテ
コールアミン類、３，４−ジヒドロキシフエニル
アラニンあるいは３，４−ジヒドロキシフエニル
酢酸などは副腎髄質の機能、交感神経系、パーキ
ンソン氏病などに深い関連があり、それらの定
性、定量は生体内での生合成系および代謝系の異
常の判定、疾病の診断にとつて重要な意味を有す
る。 しかしながら、これらカテコール類の生体内に
おける存在量は極めて微量であるため、従来、知
られあるいは行われている定性、定量方法におい
ては種々解決すべき問題点が存在していた。 すなわち、従来行われている生体由来の試料中
のカテコール類の定性、定量方法としては次のも
のがあげられるが、それらは、いずれも後述する
如き欠点を有する。 (1) セリウム塩法 (2) UV法 (3) トリヒドロキシインドール法 (4) エチレンジアミン法 上記(1)のセリウム塩法は、試料に対し、アンモ
ニアの存在下にセリウム塩水溶液を作用させ、生
成する物質の紫色の発色を測定するものである
が、この方法は、その検出感度が低いという欠点
を有する。上記(2)のUV法はカテコール類が紫外
領域に吸収を持つことを利用して、分析対象物の
紫外吸収を測定するという方法で、簡単な操作で
行い得るという利点はあるが、カテコール類以外
の物質の吸収も含まれてしまうことおよび感度が
低いことが、欠点として存在する。上記(3)のトリ
ヒドロキシインドール法は、分析対象物をフエリ
シアンイオンや沃素などの酸化剤で処理して、ヒ
ドロキシインドールを生成させ、そのけい光を測
定するという方法で、上記(1)、(2)の方法に比し
て、高感度の分析が可能ではあるが、操作が煩雑
であること、特定の物質例えばドパミン、ドーパ
などに対しては、感度が著しく低く、特にクロマ
トグラフイによる分析において使用する場合に
は、他のカテコールアミンであるエピネフリンや
ノルエピネフリンなどの場合と同等の感度が得ら
れない（数十分の一乃至百分の一程度である）と
いう重大な欠点を有する。上記(4)のエチレンジア
ミン法は、分析試料に対し、アルカリ性の下でエ
チレンジアミンを作用させ、生成するけい光性物
質のけい光を測定する方法であるが、比較的感度
が低いため、微量のカテコール類を分析するため
の、より、高感度の測定が所望される場合には、
満足すべき結果が得られず、そのため、適用に制
約があるという欠点を有する。 本発明者らは、カテコール類の定性、定量方
法、特に、生体由来の試料中における微量のカテ
コール類の定性、定量方法につき、種々研究した
ところ、２−シアノアセトアミドを用いて、分析
試料をこの２−シアノアセトアミドで処理し、そ
れにより生成するけい光性物質のけい光を測定す
ることにより、極めて優れた結果をもつてカテコ
ール類の定性、定量を行い得ることを見出した。 本発明は、かかる知見に基づくものである。 本発明方法は、従来法の欠点を有せず、カテコ
ール類の各物質に対して同等レベルの高感度を有
する定性、定量を可能にし、しかも、簡便な操作
と低廉な費用という利点を有し、自動化も容易で
あるという優れた長所を有するものである。 以下に本発明を詳述する。 本発明方法は、カテコール類を含有する分析対
象物（試料）を、化学式NCCH2CONH2で表わ
される２−シアノアセトアミドで処理し、試料中
に存在するカテコール類と２−シアノアセトアミ
ドとを反応せしめ、その反応により生成するけい
光性物質のけい光を測定することにより、試料中
のカテコール類の定性、定量を行うものである。
ここに分析対象とされるカテコール類は、その化
学構造式中に、式、 で示されるカテコールの構造を有する化合物であ
つて、特に後掲の表１に掲げるような、生体成分
として極微量存在するカテコールアミン類をはじ
めとするカテコール構造を有する物質群である。 本発明方法において定性、定量を行おうとする
対象物（試料）としては、通常は、生体由来の試
料例えば血液、髄液、組織液などの体液、尿など
生化学的あるいは臨床化学的に測定しようとする
カテコール類を含有した材料があげられる。 これら試料は、必要に応じ、前処理、例えば夾
雑物の除去、あるいはカテコール類の分離など、
定性、定量の精度を高めるための処理に付され
る。カテコール類を予め分離しておくためには、
クロマトグラフイなどの手段が使用される。 本発明方法においては、上記の如き分析対象物
を、２−シアノアセトアミドにより処理するが、
その処理方法としては、分析対象物中のカテコー
ル類が、２−シアノアセトアミドと反応してけい
光性物質を生成するように、両者を接触せしめる
方法であればいずれでもよい。通常は、２−シア
ノアセトアミドを水溶液として調製しておき、こ
の水溶液を分析対象物（試料）と合わせることに
より行う。この水溶液濃度は、通常は0.01w／ｖ
％〜10.0w／ｖ％の範囲であり、反応混合液中で
好ましくは0.1w／ｖ％〜2.0w／ｖ％濃度を示す
ように用いられる。 上記のカテコール類と２−シアノアセトアミド
とを反応させるにあたつては、緩衝溶液中でその
反応を行わしめると、より好ましい結果が得られ
る。 本発明方法は下記(1)〜(6)の条件に適合して実施
するときに、より好ましい結果が与えられるが、
実施条件はこれに限定されるものではない。 (1) 使用する２−シアノアセトアミドの濃度 反応混合液中で0.1w／ｖ％〜2.0w／ｖ％の
範囲の濃度を示すように用いるのが好ましい。
反応混合液中で2.0w／ｖ％以上の濃度を示す
場合には、若干の試薬ブランクの増加が認めら
れる。 (2) 緩衝溶液の種類と濃度 緩衝溶液の種類は、特に限定されない。例え
ば、りん酸緩衝溶液、ほう酸緩衝溶液、りん酸
−ほう酸系緩衝溶液などが用いられる。濃度
は、反応混合液中で0.01M以上（緩衝溶液とし
て通常使用される濃度）が用いられる。 (3) 緩衝溶液のPH ９〜13であるが、至適PHは個々の化合物によ
つて異る。至適PHから大巾に外れる場合は感度
の低下が見られる。 (4) 反応温度 通常は100℃以下が適当である。100℃以上で
はけい光強度の増大が見られるが、同時に反応
液の沸騰に対する配慮が必要となる。 (5) 反応時間 反応温度と関連して任意に定められるが、
100℃程度の反応温度では、５分〜10分程度の
反応時間でけい光強度は最高値に達する。 (6) 測定波長 個々の化合物によつて、極大励起波長と極大
けい光波長は若干異るが（表１参照）、定性の
場合は、紫外線光線を照射して、けい光を目測
すれば足りる。定量の場合は、カテコール類の
個々の物質の極大励起波長と極大けい光波長と
を選択して、けい光強度を測定するか、又は若
干の感度低下を許容して、任意の特定の波長を
選択して測定するという簡便法をとることもで
きる。 本発明方法は、結局、分析対象物のカテコール
類が２−シアノアセトアミドと反応して生成けい
光性物質のけい光を測定することにより、定性又
は定量を行うものであるので、液体クロマトグラ
フイにより分離溶出した個々の物質についてこれ
を行う場合、分離した個々の物質を流動系で測定
しようとする場合、薄層クロマトグラムのスポツ
トにより測定する場合、その他、種々の実施態様
において、その態様に応じた、けい光測定の方法
が採用される。 けい光測定による定量の手段は、通常、一般に
光強度の測定による定量法に行われている作図的
あるいは非作図的な検量線による算定法による。
すなわち、あらかじめ標準濃度に基づく検量線を
定め、測定結果を検量線に準拠して、その濃度を
知る方法である。 以下に、本発明の実施例を検量線の作定をも含
めて、詳述する。 実施例 １ 表１中に列挙した各試料の溶液（１×10-5M）
１mlに対し、1w／ｖ％２−シアノアセトアミド
水溶液１mlおよび0.3Mほう酸緩衝溶液（PH11.0）
２mlを加えて沸騰水浴上で10分間加熱した。冷
後、分光けい光光度計でけい光強度を測定した。
表１にその結果を示した。
【表】
実施例 ２
エピネフリン溶液（１×10-8M〜１×10-4M）
１mlに1w／ｖ％２−シアノアセトアミド水溶液
１mlと0.3Mほう酸緩衝溶液（PH12.0）２mlを加
え沸騰水浴上で10分間加熱し、冷後実施例１、表
１に示される波長でけい光強度を測定した。 緩衝溶液のPHをノルエピネフリンについては
10.0、ドパミンについては、11.0とし、それ以外
の条件は上記のエピネフリンにおけると同様にし
てノルエピネフリンおよびドパミンについて測定
し、直線性の検量線を得た。その結果を添付の図
面、第１図に示す。 第１図の縦軸は相対けい光強度であり、横軸は
試料の濃度（Ｍ）である。第１図中Ｅはエピネフ
リン、NEはノルエピネフリン、DAはドパミン
を示している（以下、第２〜５図中において同
じ）。 実施例 ３ 実施例２と同じ試料を用い、濃度１〜10-6Mの
場合について、本発明方法と他の従来法、トリヒ
ドロキシインドール（THI）法、エチレンジア
ミン（ED）法の感度を比較した。その結果を表
２に示す。第２にみられる様に本発明方法は、従
来法に比して、より高感度で、且つ、化合物によ
つて感度のバラツキが少いという優れた結果を示
している。
１mlに1w／ｖ％２−シアノアセトアミド水溶液
１mlと0.3Mほう酸緩衝溶液（PH12.0）２mlを加
え沸騰水浴上で10分間加熱し、冷後実施例１、表
１に示される波長でけい光強度を測定した。 緩衝溶液のPHをノルエピネフリンについては
10.0、ドパミンについては、11.0とし、それ以外
の条件は上記のエピネフリンにおけると同様にし
てノルエピネフリンおよびドパミンについて測定
し、直線性の検量線を得た。その結果を添付の図
面、第１図に示す。 第１図の縦軸は相対けい光強度であり、横軸は
試料の濃度（Ｍ）である。第１図中Ｅはエピネフ
リン、NEはノルエピネフリン、DAはドパミン
を示している（以下、第２〜５図中において同
じ）。 実施例 ３ 実施例２と同じ試料を用い、濃度１〜10-6Mの
場合について、本発明方法と他の従来法、トリヒ
ドロキシインドール（THI）法、エチレンジア
ミン（ED）法の感度を比較した。その結果を表
２に示す。第２にみられる様に本発明方法は、従
来法に比して、より高感度で、且つ、化合物によ
つて感度のバラツキが少いという優れた結果を示
している。
【表】
実施例 ４
日立635型高速液体クロマトグラフに3011−Ｃ
ゲルを充填したカラム（内径2.6mm、長さ25cm）
を装着して、カラム温度45℃でカテコールアミン
類を分離定量した。10μl又は100μlの試料液液は、
0.05％りん酸中0.05Mりん酸二カリウムを含む溶
離液を毎分0.60mlの割合で送液して分離溶出させ
た。この溶出液に、１％２−シアノアセトアミド
溶液を毎分0.050mlおよび0.60Mほう酸中0.75M水
酸化カリウムを含む緩衝液を毎分1.0mlの割合で
送液して混合させた後、これを反応コイル（内径
0.5mm、長さ500cm）に導き100℃に加熱した。次
に、この液を冷却コイルに導いた後、けい光検出
計内に導かれけい光を測定た。また、必要に応じ
て、クロマトグラムを自動記録し、更に積分計に
よつて定量した。本実施例で測定に要した時間は
約10分であつた。 上記の如くして得られたクロマトグラムを添付
の図面、第２図に示す。数値は時間（分）であ
り、NE、Ｅ、DAは第１図と同じ意味をもつ
（以下、第３〜５図において同じ）。 本例で、作定した検量線を添付の図面、第３図
に示す。縦軸は積分計の応答値（μV、sec）を示
し、横軸は、試料の量（×10-12モル）を示す。 添付の図面、第４図は、本実施例の試料とし
て、血清を使用し、その血清中のカテコールアミ
ン類を測定したクロマトグラムを示すものであ
る。 添付の図面、第５図Ａ，Ｂは、本実施例の試料
として尿を使用し、その尿中のカテコールアミン
類を測定したクロマトグラムを示すものである。
Ａは休息時、Ｂは興奮後のものを示す。 本実施例において測定した血清中のカテコール
アミン、尿中のカテコールアミンの分析結果を以
下に示す。 血清中のカテコールアミンの分析結果 エピネフリン 0.85ng／ml ノルエピネフリン 2.6 〃 ドパミン 2.5 〃 尿中カテコールアミンの分析結果 休息時 エピネフリン 14.1ng／ml ノルエピネフリン 24.4 〃 ドパミン 254.0 〃 興奮時 エピネフリン 22.2 〃 ノルエピネフリン 48.9 〃 ドパミン 276.0 〃 実施例４において用いられた試料溶液の量、溶
離液の組成と流速、２−シアノアセトアミド溶液
の濃度と流速、反応コイルの形状や反応温度など
は、一例であり、これらの条件は種々の要件によ
り、任意に選択することができる。 実施例４における検出限界の一例を示すと、エ
ピネフリン：0.1×10-12モル、ノルエピネフリ
ン：0.3×10-12モル、ドパミン：0.1×10-12モル
であつた。また、検量線はそれぞれ（１〜200）×
10-12、（１〜1000）×10-12および（１〜200）×
10-12モルの範囲で直線となつた。 本実施例に関連して、試料の前処理法の例を血
清の場合、尿の場合を取上げ以下に掲げる。 血清の前処理 １） 市販のアルミナ（200メツシユ）に濃塩酸
を加えて攪拌し、静置した後、その上澄液を棄
てる。この操作を３回繰返した後、蒸留水で繰
返し洗浄し、洗浄液のPH値が４になつたところ
でアルミナを取し、110℃で一夜乾燥させる。
（アルミナ前処理） ２） 乾燥したアルミナ100mgを1Mのトリス緩衝
液（PH8.7）１mlに懸濁させ、これに採血直後
の血清１mlを加え、10分間振盪した後静置す
る。上澄液を棄て、蒸留水５mlで３回、次いで
メタノール３mlで３回洗浄し、カテコールアミ
ンを吸着したアルミナを遠心分離し、減圧下で
乾燥する（カテコールアミンの吸着）。 ３） 乾燥したアルミナに、4Mの酢酸３mlを加
えて吸着したカテコールアミンを溶出させ、遠
心分離後、上澄液を濃縮乾涸する。残渣を蒸留
水90μに溶かす。（カテコールアミンの溶出） ４） その10μを分離カラムに注入してクロマ
トグラフイを行う。 尿の前処理 １） 尿５mlに2M塩酸5.3mlを加え、沸騰水浴上
で20分間加熱する。（カテコールアミン抱合体
の加水分解） ２） 混合物を室温に冷却した後0.05Mのエチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウム溶液１mlを加え、
次いで濃アンモニア水でPHを8.5に調整する。 ３） 血清の場合と同様、前処理した乾燥アルミ
ナ500mgを1.0φ×10.0cmのガラス管（下端に栓
を有するもの）に填め、下端に栓をしたまま上
記の溶液全量を加え、10分間振盪する。 ４） 次に栓を開けて液を流下させた後、蒸留水
10mlを用いてアルミナを洗浄する。 ５） 次に0.3Mの酢酸５mlを流して、吸着した
カテコールアミンをアルミナから溶出させる。 ６） 溶出液10μを分離カラムに注入して分離
を行う。 実施例 ５ （薄層クロマトグラフの使用の例） メルク社製シリカゲル薄層板（シリカゲル
60TLCプレート、10×20cm）を使用し、エピネ
フリン、ノルエピネフリンおよびドパミンをそれ
ぞれ別に、0.1〜10ngずつ含む水溶液10μを別々
にスポツトした後、ｎ−ブタノール：酢酸：水
（３：１：１）の混合溶媒を用いて展開する。展
開し終つた後、各薄層板を風乾し、これに
1.0w／ｖ％の２−シアノアセトアミドを含む
0.3Mほう酸緩衝溶液（PH：11.0）を均一に噴霧
する。この薄層板を110℃で15分間加熱乾燥した
後放冷する。次に365nmで強く発光する水銀ラン
プを備えたデンシトメーターにこの薄層板をセツ
トし、各スポツトの螢光強度を測定して、各々の
試料について検量線を作成する。 この展開条件で、エピネフリン、ノルエピネフ
リンおよびドパミンのRf値はそれぞれ0.45、0.50
および0.55であつた。 次に人の尿について前述の前処理法に従つて処
理し、その10μを同様にして展開し、そのスポ
ツトについて発けい光させた後Rf値を測定する
ことによつてスポツトの同定を行い、同時にその
螢光強度を測定し、上で得た検量線を用いて定量
を行つた。。 以上、本発明を詳細に説明したが、本発明方法
の利点を列挙すると以下の通りである。 (1) 高感度であつて極微量のカテコール類の分析
が可能である。 (2) カテコール類の化合物の種類による感度の変
動が少い。 (3) 使用される試薬はすべて安価に入手し得、実
施コストが低い。 (4) 操作が簡単である。 (5) 反応条件が制御し易いため自動化が容易であ
るため自動分析の系路や液体クロマトグラフの
検出系に容易に組入れることができる。
ゲルを充填したカラム（内径2.6mm、長さ25cm）
を装着して、カラム温度45℃でカテコールアミン
類を分離定量した。10μl又は100μlの試料液液は、
0.05％りん酸中0.05Mりん酸二カリウムを含む溶
離液を毎分0.60mlの割合で送液して分離溶出させ
た。この溶出液に、１％２−シアノアセトアミド
溶液を毎分0.050mlおよび0.60Mほう酸中0.75M水
酸化カリウムを含む緩衝液を毎分1.0mlの割合で
送液して混合させた後、これを反応コイル（内径
0.5mm、長さ500cm）に導き100℃に加熱した。次
に、この液を冷却コイルに導いた後、けい光検出
計内に導かれけい光を測定た。また、必要に応じ
て、クロマトグラムを自動記録し、更に積分計に
よつて定量した。本実施例で測定に要した時間は
約10分であつた。 上記の如くして得られたクロマトグラムを添付
の図面、第２図に示す。数値は時間（分）であ
り、NE、Ｅ、DAは第１図と同じ意味をもつ
（以下、第３〜５図において同じ）。 本例で、作定した検量線を添付の図面、第３図
に示す。縦軸は積分計の応答値（μV、sec）を示
し、横軸は、試料の量（×10-12モル）を示す。 添付の図面、第４図は、本実施例の試料とし
て、血清を使用し、その血清中のカテコールアミ
ン類を測定したクロマトグラムを示すものであ
る。 添付の図面、第５図Ａ，Ｂは、本実施例の試料
として尿を使用し、その尿中のカテコールアミン
類を測定したクロマトグラムを示すものである。
Ａは休息時、Ｂは興奮後のものを示す。 本実施例において測定した血清中のカテコール
アミン、尿中のカテコールアミンの分析結果を以
下に示す。 血清中のカテコールアミンの分析結果 エピネフリン 0.85ng／ml ノルエピネフリン 2.6 〃 ドパミン 2.5 〃 尿中カテコールアミンの分析結果 休息時 エピネフリン 14.1ng／ml ノルエピネフリン 24.4 〃 ドパミン 254.0 〃 興奮時 エピネフリン 22.2 〃 ノルエピネフリン 48.9 〃 ドパミン 276.0 〃 実施例４において用いられた試料溶液の量、溶
離液の組成と流速、２−シアノアセトアミド溶液
の濃度と流速、反応コイルの形状や反応温度など
は、一例であり、これらの条件は種々の要件によ
り、任意に選択することができる。 実施例４における検出限界の一例を示すと、エ
ピネフリン：0.1×10-12モル、ノルエピネフリ
ン：0.3×10-12モル、ドパミン：0.1×10-12モル
であつた。また、検量線はそれぞれ（１〜200）×
10-12、（１〜1000）×10-12および（１〜200）×
10-12モルの範囲で直線となつた。 本実施例に関連して、試料の前処理法の例を血
清の場合、尿の場合を取上げ以下に掲げる。 血清の前処理 １） 市販のアルミナ（200メツシユ）に濃塩酸
を加えて攪拌し、静置した後、その上澄液を棄
てる。この操作を３回繰返した後、蒸留水で繰
返し洗浄し、洗浄液のPH値が４になつたところ
でアルミナを取し、110℃で一夜乾燥させる。
（アルミナ前処理） ２） 乾燥したアルミナ100mgを1Mのトリス緩衝
液（PH8.7）１mlに懸濁させ、これに採血直後
の血清１mlを加え、10分間振盪した後静置す
る。上澄液を棄て、蒸留水５mlで３回、次いで
メタノール３mlで３回洗浄し、カテコールアミ
ンを吸着したアルミナを遠心分離し、減圧下で
乾燥する（カテコールアミンの吸着）。 ３） 乾燥したアルミナに、4Mの酢酸３mlを加
えて吸着したカテコールアミンを溶出させ、遠
心分離後、上澄液を濃縮乾涸する。残渣を蒸留
水90μに溶かす。（カテコールアミンの溶出） ４） その10μを分離カラムに注入してクロマ
トグラフイを行う。 尿の前処理 １） 尿５mlに2M塩酸5.3mlを加え、沸騰水浴上
で20分間加熱する。（カテコールアミン抱合体
の加水分解） ２） 混合物を室温に冷却した後0.05Mのエチレ
ンジアミン四酢酸ナトリウム溶液１mlを加え、
次いで濃アンモニア水でPHを8.5に調整する。 ３） 血清の場合と同様、前処理した乾燥アルミ
ナ500mgを1.0φ×10.0cmのガラス管（下端に栓
を有するもの）に填め、下端に栓をしたまま上
記の溶液全量を加え、10分間振盪する。 ４） 次に栓を開けて液を流下させた後、蒸留水
10mlを用いてアルミナを洗浄する。 ５） 次に0.3Mの酢酸５mlを流して、吸着した
カテコールアミンをアルミナから溶出させる。 ６） 溶出液10μを分離カラムに注入して分離
を行う。 実施例 ５ （薄層クロマトグラフの使用の例） メルク社製シリカゲル薄層板（シリカゲル
60TLCプレート、10×20cm）を使用し、エピネ
フリン、ノルエピネフリンおよびドパミンをそれ
ぞれ別に、0.1〜10ngずつ含む水溶液10μを別々
にスポツトした後、ｎ−ブタノール：酢酸：水
（３：１：１）の混合溶媒を用いて展開する。展
開し終つた後、各薄層板を風乾し、これに
1.0w／ｖ％の２−シアノアセトアミドを含む
0.3Mほう酸緩衝溶液（PH：11.0）を均一に噴霧
する。この薄層板を110℃で15分間加熱乾燥した
後放冷する。次に365nmで強く発光する水銀ラン
プを備えたデンシトメーターにこの薄層板をセツ
トし、各スポツトの螢光強度を測定して、各々の
試料について検量線を作成する。 この展開条件で、エピネフリン、ノルエピネフ
リンおよびドパミンのRf値はそれぞれ0.45、0.50
および0.55であつた。 次に人の尿について前述の前処理法に従つて処
理し、その10μを同様にして展開し、そのスポ
ツトについて発けい光させた後Rf値を測定する
ことによつてスポツトの同定を行い、同時にその
螢光強度を測定し、上で得た検量線を用いて定量
を行つた。。 以上、本発明を詳細に説明したが、本発明方法
の利点を列挙すると以下の通りである。 (1) 高感度であつて極微量のカテコール類の分析
が可能である。 (2) カテコール類の化合物の種類による感度の変
動が少い。 (3) 使用される試薬はすべて安価に入手し得、実
施コストが低い。 (4) 操作が簡単である。 (5) 反応条件が制御し易いため自動化が容易であ
るため自動分析の系路や液体クロマトグラフの
検出系に容易に組入れることができる。
第１図は、実施例１における検量線の図であ
り、第２，４，５図は、実施例４におけるクロマ
トグラム、第３図は、同例における検量線の図で
ある。
り、第２，４，５図は、実施例４におけるクロマ
トグラム、第３図は、同例における検量線の図で
ある。
Claims (1)
- １ カテコール類の定性もしくは定量を行おうと
する試料を２−シアノアセトアミドで処理し、そ
れにより生成するけい光性物質のけい光を測定す
ることを特徴とするカテコール類の定性、定量方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15180782A JPH0240189B2 (ja) | 1982-09-02 | 1982-09-02 | Katekooruruinoteisei*teiryohoho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15180782A JPH0240189B2 (ja) | 1982-09-02 | 1982-09-02 | Katekooruruinoteisei*teiryohoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5942450A JPS5942450A (ja) | 1984-03-09 |
| JPH0240189B2 true JPH0240189B2 (ja) | 1990-09-10 |
Family
ID=15526732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15180782A Expired - Lifetime JPH0240189B2 (ja) | 1982-09-02 | 1982-09-02 | Katekooruruinoteisei*teiryohoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0240189B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9025516D0 (en) * | 1990-11-23 | 1991-01-09 | Cambridge Technology & Science | Assay |
| JP5317118B2 (ja) * | 2009-07-29 | 2013-10-16 | 花王株式会社 | ポリフェノールの定量法 |
| JP5548978B2 (ja) * | 2009-09-03 | 2014-07-16 | 花王株式会社 | ポリフェノールの検出法 |
-
1982
- 1982-09-02 JP JP15180782A patent/JPH0240189B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5942450A (ja) | 1984-03-09 |
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