JPH0240681B2

JPH0240681B2 -

Info

Publication number: JPH0240681B2
Application number: JP62069246A
Authority: JP
Inventors: Deru Bono Rinarudo; De Anburoji Ruigi; Fueraari Janni; Ruigi Rugaruri Pieru; Giuzetsupe Pajera Pieru
Original assignee: MEDEIORANAMU PHARM Srl
Current assignee: MEDEIORANAMU PHARM Srl
Priority date: 1986-03-25
Filing date: 1987-03-25
Publication date: 1990-09-12
Also published as: EP0238994A3; KR870008916A; EP0238994B1; AU7054087A; DK122187A; EP0238994A2; NO870962D0; IN163520B; CA1334516C; IT8619864A1; FI871209A0; GR3002341T3; AU599638B2; YU44187A; NO167676B; PT84491B; DK122187D0; IT8619864A0; KR910006811B1; IT1189085B

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、高純度デルマタン硫酸（dermatan
sulphate）の製造方法、および活性成分としてこ
れを含有する薬用組成物に関する。デルマタン硫酸（DS）は、次の構造式を有する、１，３グルコシド結合により連結した
イズロン酸１モルとＮ−アセチルガラクトサミン
スルホン酸とから成る二糖単位の繰返しによつて
構成されるムコ多糖（MPS）であることは知ら
れている。 DSの分子量は、プロテオグリカンの抽出法お
よびこれをMPSから分離するために用いる方法
によつて変更することができる。カルボキシル基の、スルホン基に対する比は理
輪的には１：１であるが、これも実際には、若干
のガラクトサミンおよびイズロン酸に比較的多数
のスルホン化ヒドロキシルが存在するために変動
し得る。 DSが最近かなり広く関心を集めているのは、
それがヘパリン助因子を選択的に活性化し、こ
れによつてかなり大きい抗トロンビン活性をあら
わし、しかも血液凝固プロセスを調節する他の多
数のセリンプロテアーゼ阻害物質を妨害しないこ
とが判明したからである。しかしこれを薬剤として使用できるかどうか
は、これを、存在する種々の基の分解または化学
的変形をおこすことなくほとんど変化しない形で
天然プロテオグリカンから抽出でき、マイナスの
副作用をおこし得る異物、たとえば蛋白質および
ヌクレオチドをほぼ完全に除去できるかどうかに
かかつている。実際的観点からは、上述の要求を満足するDS
製造法を確立することは極めて困難であることが
わかつている。したがつて、種々濃度の無機塩溶液でラツト皮
膚プロテオグリカンを抽出する研究では
（Chemical Abstracts−84巻−1976−194ページ
要約71173d）、少量のデルマタン硫酸とその他の
プロテオグリカン類との混合物が生成した。グリコサミノグリカン混合物から純粋なデルマ
タン硫酸を分離することはむづかしく、最終生成
物の収量は非常に低くなる。（欧州特許出願第0097625号に提案されている
ように）、グリコサミノグリカン水溶液から種々
の温度で分別結晶化することにより生成したデル
マタン硫酸も、所望の純度要求を満たしていな
い。我々は今回、本発明の主題、すなわち物質器官
からのDS抽出法を発見した；この方法において
DSは、出発原料中に存在するときの分子量およ
び構造をほとんど変化させることなく、不都合な
副作用をおこす汚染残留物を完全に排除して得ら
れる。新しい方法は本質的には次の段階から成る：好ましくは、段階(a)の前にウシまたはブタ腸粘
膜、またはブタ肺、膵臓、大動脈、脾臓、脳、胸
腺、または軟骨の形の生原料を選び、変化を避け
るためにそれを直ちに速かに凍結する。 (a) 生原料そのものまたは冷アセトンで均質化し
た生原料をCaCl₂水溶液と共に超微粒子化する
段階と、 (b) 水性生原料／CaCl₂ホモジネートをアルカリ
性PH、低温度で蛋白分解酵素により酵素性消化
をする段階と； (c) 溶解質を酸性にし、加熱し、ろ過する段階
と、 (d) 澄明なろ液を、MPSと錯化合物を生成し得
る第四級アンモニウム塩で処理する段階と、 (e) 高純度のDSを選択的に取する段階。以上に概略記した個々のプロセス段階の実施法
を次いで一層詳細に説明する。段階(a)は新規な方法に必須の重要な段階の一つ
であるCaCl₂との混合に関するものであり、実際
には、本発明の本質を決して変えるものでない種
種の方法で行われる。それだけで冷凍された生原料ホモジネートの場
合には、それを、原料：溶液の重量比が１：0.5
になるような割合で加えた0.01M CaCl₂水溶液で
超微粒子化する。生原料をアセトン処理粉末の形で用いる場合
は、最初の冷凍原料を、原料：溶液の重量比１：
１の割合の1M CaCl₂水溶液で超微粒子化し、そ
れを重量比１：３の割合の冷アセトン（＋５℃）
と共に撹拌し、過し、残渣を再び１：２の比の
冷アセトン中にとり、過し、その後残渣を比
１：１で冷アセトン中にとる。最終産物を35℃で
真空下で乾かし、その後の酵素的溶解のために低
温で保存するか、または直ちに溶解段階にまわし
て、適当な反応器中で、１：20の比の脱イオン水
と混合する。また別の方法によると、冷凍した出発原料を、
原料：溶液の重量比１：10の割合で加えた0.1M
CaCl₂溶液で超微粒子化する。混合物を小口径の
ローターと導入空気とで噴霧乾燥し、この時の空
気が温度150℃以上にならないようにし、接触時
間が数秒以上にならないようにする。この方法で
生成した粉末は、プラスチツクバツグ中に低温で
保存してその後の溶解に備えてもよいし、それ
を、粉末：水の重量比１：20になるように加えた
脱イオン水と共に、反応器に加えることによつて
直ちに使用することもできる。 DSを胸腺、下垂体または心臓のような特にデ
リケートな器官から抽出する場合には、小規模処
理のための凍結乾燥を利用するのが有利である。
この場合には冷凍した原料を、粉末ソルビトール
10％を含む1M CaCl₂水溶液と共に超微粒子化す
る、この場合、生原料：CaCl₂溶液の重量比は
１：１である。２cmの厚さに層別後、−40℃に凍結し、＋25℃で
凍結乾燥し、最後には残留水分を除去するために
拡散ポンプを用いる。凍結乾燥生成物は水分含有
量約２％の脆い粉末の形である。凍結乾燥粉末
を、その後溶解するまで再び保存してもよいし、
直ちに脱イオン水で１：20に希釈して次の段階に
まわしてもよい。酵素的溶解を含む段階(b)の特徴は、DSの解重
合または分解を阻止する特に緩和な条件で、普通
の蛋白分解酵素、たとえばトリプシン、キモトリ
プシン、一層好ましくはアルカラーゼ、モキサタ
ーゼおよびスペラーゼを用いて行われることであ
る。水性混合物を、好ましくはCa（OH）₂でPH７〜
９の間にアルカリ性にし、それから40゜〜55℃の
温度に加熱する。それから酵素を、原料：酵素の
重量比が１：0.0001〜１：0.001の間になるよう
に加える。溶解は６〜24時間続き、その間連続的
に電気泳動的チエツクを行つて、プロテオグリカ
ン溶解が完了する時を決定する。この時点ではこ
の材料は完全に液体である。上記液体溶解質について段階(c)を行う。これは
好ましくはHClを用いて（これは“既に存在する
塩素イオン”以外のイオンの導入を回避する）、
多分少量の他の酸も同時に用いてPH３〜６の間に
軽度に酸性にし、その液体材料を約１時間70〜80
℃に加熱することから成る。段階(c)の条件は、存在するCa塩との錯化合物
という形で、蛋白質凝固および核蛋白質誘導体の
沈澱をおこす。その間、PHおよび温度条件は
MPSをCa塩の形で水中に溶解させる。その溶液
を回転過機で過し、多分さらにフイルタープ
レスを通して過して加塩した脂肪酸の痕跡すら
除去する。この方法で、Ca塩の形の、したがつてほとん
ど純粋のMPSのみを含む完全に透明な液が得
られる。この透明な溶液は、直接次の段階(d)へ移すこと
ができるかあるいは、先づ電気泳動法によつて分
析し、存在するMPSの性質および量を確認する。最初に述べたように、段階(d)は本質的には、
MPSCa塩を含む水溶液を、MPSと不溶性錯化合
物を形成することのできるアンモニウム塩で処理
することから成る。しかしながら本発明の目的は
薬物学的純度のDSを得ることであり、このため
にはどちらでも選び得る二つの方法がある、すな
わち(1)溶液を、ジメチル−エチル−セチルアンモ
ニウムエチル硫酸で処理して錯化合物を形成し、
DSを選択的に沈澱させるかまたは(2)存在するす
べてのMPSを錯化合物の形で沈澱させる能力を
有する、ハイアミン、セチル−トリメチルアンモ
ニウムブロミドおよびセチル−ジメチルエチルア
ンモニウムブロミドから成る群からなるべく選ば
れる第四級アンモニウム塩でその溶液を処理し、
その錯化合物から有機溶媒による選択的可溶化に
よりDS錯化合物を単離する。どちらの方法を選択するかは、本質的には、溶
液中にあるDSおよびその他のMPSの相対的量次
第であり、またDSに加えて他のMPSも回収する
意図があるかどうかにかかつている。一般には方法(1)によるDSの選択的沈澱が好ま
しい。ジメチル−エチル−セチルアンモニウムエチル
硫酸で沈澱させるためには、出発生原料を冷凍ホ
モジネートの形で用いる場合は、この塩をこの出
発生原料に対する重量比が１：1500になるように
溶液に加え、出発生原料を粉末の形で用いる場合
には、重量比１：300になるように加える。混合
物を数時間放置する。DS錯化合物はCaイオンの
存在のために速かに沈澱する。それを傾瀉し、遠
沈により錯化合物を集める。しかし方法(2)によりすべてのMPSを沈澱する
ことが必要な場合には、透明溶液の温度を60−70
℃に上げ、電気泳動で測定したMPSの重量に等
しい量のアンモニウム塩を加え、混合物を脱イオ
ン水で希釈して溶液のモル濃度を0.4Mに下げる。それをそのまま５−12時間放置し、それから遠
沈して、沈澱した固体錯化合物の混合物を回収す
る。混合物を水で洗つて過剰のアンモニウム塩を
除去し、乾燥する。アンモニウム塩による沈澱が方法(1)によるか(2)
によるかによつて、段階(e)による高純度DSの選
択的回収の方法は異なる。 DS／ジメチル−エチル−セチルアンモニウム
エチル硫酸錯化合物を選択的に沈澱させ単離した
場合には、上記錯化合物を、エタノール10％を含
む2M CaCl₂水溶液で処理する。DS錯化合物の、
CaCl₂ヒドロアルコール溶液に対する重量比は
１：５である。溶液のPHをCa（OH）₂で７〜９に
調節し、１−３時間、60〜80℃に加熱し、過し
た。溶液は20m²らせんカラムで分子を10000で切断
する処理を含む精製段階に誘導される。溶液は
１：10に濃縮され、１：１に希釈され、塩および
最後の痕跡の汚染成分も完全に除去されるまで、
絶え間なく通過させる。DSは、10：１濃縮溶液
から、１：0.3の比のアセトン（溶液容量：アセ
トン容量）で処理することにより、または１：
0.5の比のエタノールまたはメタノールで処理す
ることにより沈澱する。デルマタン硫酸は軽い粉
末の形で沈澱する。この方法で得られたDSは、DS重量；塩溶液容
量比１：10を用いて、2Mの塩化NaKLiまたは
Mg溶液に溶解することによつてアルカリ塩に転
化させることが好ましい。混合物を２−10時間撹
拌し、蒸溜水で１：２に希釈し、ろ過し、１：
0.5の比でアセトンで沈澱させる。この方法で、用いた塩溶液に依つて、デルマタ
ン硫酸のNa−、Ｋ−、Li−またはMg−塩が得ら
れる。アンモニウム塩による沈澱が段階(d)の方法(2)に
よつて行われる場合には、段階(e)のDS分離およ
び精製段階は次のように行われる。MPSアンモ
ニウム塩錯化合物の混合物を約25℃の温度で１−
２時間、アセトンに分散させる。 DS錯化合物は選択的にアセトンに溶け、一方
その他の錯化合物は溶けないで残り、分離処理を
受けて分離される。DS錯化合物の完全な可溶化
のためにはアセトン使用量が重要である。処理混
合物が10％DS錯化合物を含む場合、アセトン１
容量（処理錯化合物の容量に対し）を加え、混合
物が20％DS錯化合物を含む場合にはアセトン２
容量を加える、等々。こうして常に、DS含量パ
ーセント：使用アセトン量の比が一定になる。溶媒で処理した混合物を遠心分離または過す
る。透明なアセトン液を周囲温度で、3M塩溶液
（Na、Ｋ、Li、またはMgの塩化物）で、アセト
ン抽出液；塩溶液の容量比が0.25と１との間にあ
るようにして処理する。これらの条件下でDSアンモニウム錯化合物は
分離し、使用した塩溶液によつて、Na−、Ｋ−、
Li−またはMg塩の形で沈澱する。すべての場合、上に説明した段階(e)から生成す
るDS塩は次の特性を有する： −種々の緩衝液系で電気泳動を行つた場合、単バ
ンドを形成。 −分子量：20000〜40000 −有機硫黄：６〜８％ −ウロン酸：30〜36％ −硫酸基の、カルボキシル基に対する比：1.2〜
1.5 −ウロン酸の、ガラクトサミンに対する比：１：
１ −イズロン酸；総ウロン酸の80〜90％ −〔α〕_D：−60゜〜−65゜ −ヘパリン活性；10U／mgUSP 本発明の方法を用いる場合、DS収量は原料と
する器官または組織によつて変動し、生原量
10000Kgにつき１〜８Kgである。出発原料中にあるその他のMPSも回収しなけ
ればならない場合には、使用する操作法は段階(d)
の方法(2)、すなわちアンモニウム塩錯化合物とし
て総MPSを沈澱する方法が好ましい。前記の段階(e)で述べたようにDS錯化合物をア
セトンで溶解後、溶解しない材料を２容量の蒸溜
水に分解させ、アセトン残留物を排除し、遠沈
し、アセトンに関して説明した方法によつてエタ
ノールに溶解−懸濁させる。この方法でヘパラン
硫酸が分離する。エタノールに溶けない材料からは、他の溶媒に
ついて述べた同じ方法を用いて、メタノール処理
によつて純粋なヘパリンが抽出される。本発明による方法によつて得られるデルマタン
硫酸のナトリウム、カリウム、リチウム、カルシ
ウムまたはマグネシウム塩は、いわゆるヘパリン
助因子を活性化する点で生物学的に活性である
が（約60μAａ／mg）、それらは部分的トロンボ
プラスチン活性化時間に与える抗凝固性に関して
は活性をもたず、弱い因子Xa阻害活性を有する
（約20UA Xa／mg）。生体内では、この生成物は無毒であり、出血を
おこさない、しかしかなりの血管拡散をおこすよ
うにみえる。静脈内−、皮下−および回腸内投与
される場合、それは実験的血栓症を効果的に阻止
する、そしてアドリアマイシン投与によつて生ず
る損傷から動物を一部防御することができる。表層性静脈循環の血栓症によつて誘起された変
化にこの生成物を局所適用すると、その線維素溶
解性−並びに抗炎症性活性のために症状は急速に
緩解する。本発明の方法によつて生成したDSは、以下に
説明するように実験動物で毒物学的並びに薬物学
的に評価された。急性毒性急性毒性は、本発明の方法により生成したデル
マタン硫酸をスイス・マウスに経口、静脈内、腹
腔内および皮下投与した後に評価した。相対的LD₅₀値を１表に示す、この表はデルマ
タン硫酸の急性毒性が低いことを示している。１表デルマタン硫酸の急性毒性投与法 LD₅₀mg／Kg i.v.（静脈内） 2700 s.c.（皮下） 3600 i.p.（腹腔内）＞5000 o.a.（経口）＞5000 反復投与による毒性 DS毒性を、ウイスター種ラツトに５週間にわ
たつて反復経口−および筋肉内投与した後に評価
した。生成物を異なるラツト群に、200mg／Kg／
日量を経口投与で、20および40mg／Kg／日を筋肉
内投与で毎日与えた。生理的食塩溶液をそれぞれ経口−および筋肉内
投与した２群のラツトを対照として用いた。治療期間中、DS治療ラツト群には、賦形剤の
みで治療したラツト群に比較して、行動、重量ま
たは食餌消費量の変化は認められなかつた。治療終了時にラツトをエーテル麻酔下で殺し
た。筋肉注射したラツトは、注射部分に何の変化
も示さなかつた。血液学的−、血液化学的指標ま
たは尿の指標には有意な変化はなかつた。40mg／
Kgを筋肉内注射したラツトは、脾臓の軽度の重量
増加を示した、しかし組織学的試験では脾臓構造
の損傷は認められなかつた。その他の変化は器官には認められなかつた。抗トロビン活性 DS抗トリビン活性を二つの実験的血栓症モデ
ルにより評価した。第一に、ウメツT.サナイK.
の“Thrombo.Haemostas.”39、1978、74の方
法によるラツトの動静脈吻合により、静脈性およ
び動脈性特徴の入り混つた血栓症を形成した。第
二には、レヤーズ（Reyers）外の“血栓症の動
物モデルの標準化（Standardization of animal
models of thrombosis）”（第17回血管学シンポ
ジウム、キツツビユーエル；ブレジンK.、チン
マーマン編、99ページ、1983）によりラツトの大
静脈を結紮して、静脈性の血栓症を形成した。１動静脈吻合：DSの抗トロンビン活性と抗凝
血活性の比較吻合の循環を活性化する直前にDSを静脈注
射した。テスト終了時に血栓をとり出し秤量し
た。血栓の測定直後に血液の一部を試験管の底
に集め、試験管壁に最初の凝塊が生成するまで
の時間を測定する（全血凝固時間）。２表に示した血栓重量および凝固時間に関す
る結果は、デルマタン硫酸が強力な抗トロビン
活性をあらわし得ることを示している。この点
に関しては、使用した最小量（0.125mg／Kg／
iv）でさえ、血栓重量はかなりに軽減する。同
時に凝血過程に関連する現象に対しても、より
軽度であるが影響を与える。この点に関して、
凝血時間の中程度の増加一統計的にのみ有意
で、生物学的には有意でない増加−をおこすた
めにすら、抗トロンビン的に有効である量より
ずつと多量のDSが必要であつた。

【表】２大静脈結紮：種々の投与法の比較 DSを静脈注射する場合は結10分前に与え、
皮下投与の場合には結紮１時間前に、回腸内適
用の場合には結紮15分前に与えた。テスト終了
時に血栓を除去し秤量した。結果を３表に示す。この表から、DSは静脈内、
皮下または回腸内に投与したとき、ラツトの下部
大静脈の結紮によつて生ずる血栓症を有効に阻止
することがわかる。予備的評価により投与量−効
果−曲線が作成される。それらは、考慮した時点
で、３種類の投与方法、すなわち静脈内、皮下お
よび回腸内投与では、１：４：16の比の面積の範
囲を定める。

【表】本発明は、表面および深部血栓症の治療に有効
な一定量のデルマタン硫酸を含む薬用製剤〔バイ
アル、錠剤、カプセル、軟膏（ointment）、軟膏
（unguent）、シロツプ、坐薬、点滴剤等〕にも関
係している。次の製剤が例として挙げられる。 −20−50−100−200mgのDSを含むカプセル −20−50−100−200mgのDS＋賦形薬、解凝集剤
等（一般に医薬分野で用いられるもの）を含む
錠剤； −20−50−100mgのDS＋水性賦形剤を含むバイア
ル； −20−50−100−200mg／mlのDS＋水性賦形剤、
保存剤等（一般に医薬分野で用いられるもの）
を含む点滴剤； −20−50−100−200mgのDS＋一般に医薬分野で
用いられる賦形剤を含む坐薬； −20−50−100−200mg／ｇのDS＋一般に医薬分
野で用いられる賦形剤を含む軟膏。本発明による方法を一層容易に再現可能にさせ
るように、このあとに本法の実際的実施例をいく
つか記載する。４好ましい実施例実施例１ 10000Kgの冷凍カシ−およびブタ腸粘膜を超微
粒子化し、0.01M CaCl₂水溶液5000を入れた反
応器に移した。その材料を完全に均質化するまで70rpmで撹拌
し続け、その後Ca（OH）₂溶液でPH７に調節し、
45℃に加熱した。水50中に10Kgのアルカラーゼホモジネートを
加え、生成した混合物を絶えず撹拌しながら12時
間、45℃に保つた。この時間の終りに、この液状
材料に塩酸を加えてPH４とし、その後30分間90℃
に加熱した。溶液を、セライトで作られたフイルタープレス
を通して過し、澄明な溶液を反応器に移し、澄
明化カードをつけたプレスを通して過した。完
全に澄明な溶液が約12000得られた。これに、
水100に溶かしたジメチル−エチル−セチルア
ンモニウムエチル硫酸溶液を、撹拌下で少量づつ
加えた。６時間経過後、澄明な溶液を傾瀉し、残留物を
トニアツチ（Toniatti）遠心分離器で10000r.p.m
で回収した。集められた錯化合物をエタノール100含む2M
CaCl₂溶液10000中に注入した。飽和Ca（OH）₂
溶液を加えてPHを約８に調節し、ゆつくり撹拌し
ながら約２時間80℃に加熱した。過助剤10Kgを
加えた後、その混合物を、溶液が澄明になるまで
プレスを通して過した。液体（ケークを洗浄後
1200）を、10000で切断するらせんカラム（20
m²）を通して限外過する。200に濃緒した後、
それを希釈して1000とし、再び約100まで濃
縮する。この操作を、透過物がCa塩に対して完
全に負になるまで続けた。アセトン30を溶液に加えてDSを沈澱させた。
沈澱物を集め、アセトン中で洗い、乾燥した。収量：無水粉末の形で８Kg。この粉末を2M NaCl溶液（12％）80で１時
間撹拌し、その後溶液を150に希釈し、ろ過し、
無水アセトン45で沈澱させた。沈澱物をフイルタープレス上に集め、40％アセ
トン水溶液で洗い、真空下で乾かした。収量：DSナトリウム塩７Kg。粉末を脱イオン水100中に溶かし、アニオン
樹脂を通過させることによつて脱色し、一晩加熱
状態下に置くことによつてパイロジエンを除き、
１：１アセトンで沈澱させ、ろ過し、凍結乾燥し
た。収量：次の特性を有するDS4Kg： −M.W.35000 −〔α〕_D−65゜ −硫酸基の、カルボキシル基に対する比1.25 −ウロン酸の、ガラクトサミンに対する比１：１ −電気泳動で単一バンド実施例２ウシ脾臓および肺から得たアセトン粉末1000Kg
を0.01M CaCl₂水溶液で超微粒子化し、0.01M
CaCl₂溶液で希釈して容量20000にする。約30分間混合し、45℃に加熱した後、50水中
に10Kgモキサターゼホモジネートを加え、撹拌下
で12時間、温度を45℃に維持した。実施例１に記載の方法を正確に行つた。収量：次の特性を有するDS5Kg： −M.W.40000 −〔α〕_D−65゜ −硫酸基の、カルボキシル基に対する比1.2 −ウロン酸の、ガラクトサミンに対する比１：１ −電気泳動で単一バンド噴霧乾燥によつて得られた上記器官の粉末から
出発する場合にも、方法および結果は同じであ
る。実施例３冷凍新鮮動物器官（肺、血管、腸）の混合物
100Kgをすりつぶしてパルプにし、それを0.01M
CaCl₂水溶液50を含む反応器に入れた。その材料を完全に均質化するまで撹拌し続け、
それからCa（OH）₂でPH7.2に調節し、50℃に加熱
した。 0.05重量％のスペラーゼを含み、50℃に加熱し
た酵素溶液200をその後加えた。混合物を撹拌しながら８時間50℃に保つた。こ
の時間後に溶解（lysis）は終了した。混合物を
HClでPH５に酸性にし、80℃に加熱し、高温状態
のもとでフイルターアース（fillter earth）を
過助剤として用いて過した。液試料を分析してMPS含量および特にDS含
量を測定し、次の段階に用いる第四級アンモニウ
ム塩基および有機溶媒の量を計算した。分析的測
定は次の方法によつて行つた：液10mlを濃縮して１mlにし、それから蒸溜水
を加えて総量２mlとした。酢酸バリウムおよび酢
酸から成る緩衝溶液を用いる電気泳動のための３
％アガロースプレートを別箇に作つた。試験試料
５〜10μをこのプレート上に置き、第一の電気
泳動を15volt／cm（120volt）で行つた。それか
ら第二の電気泳動を同じ条件下でプロパンジアミ
ン緩衝溶液中で行い、そのプレートを赤外線源に
よつて乾かした。それを２％トルイジンブルーで
染色し、５％酢酸で脱色した。この時点で光濃度計の読みを記録し、参照標準
との比較によつて個々のMPS領域を測定した。 MPSの分析測定の結果、MPS容量が200ｇで、
その中デルマタン硫酸含量が50ｇであることが判
明した。分析データに基づいて、ハイアミン200ｇを
液に加えた。撹拌しながら１時間70℃に保ち、脱イオン水で
希釈して、溶液のモル濃度を0.4Mとした。５時間放置し、MPS・第四級アンモニウム塩
錯化合物の混合物の形の沈澱物を遠沈により回収
した。このバター状外観の沈澱物を先づ水で洗つて過
剰の塩を除去し、その後デルマタン硫酸錯化合物
を選択的に溶解させるために、アセトン１を加
えた、この間懸濁液を３時間撹拌しながら周囲温
度に保つた。懸濁液を遠沈して約１のDS溶液
を得た、これに２の3M NaCl溶液を加え、次
に２のアセトンを加え、DSを沈澱させ、それ
を遠沈により分離し、エタノールで洗い、乾燥す
る。この方法で、次の特性を有する乾燥DS50ｇが
得られた： −M.W.35000 −〔α〕_D−60゜ −硫酸基の、カルボキシル基に対する比1.5 −ウロン酸とガラクトサミンとの比１：１ −電気泳動下で単一バンド実施例４実施例３に記載のようにしてMPS混合物を処
理することによつて得られたDS錯化合物の選択
的可溶化により生成した残留固体物質を、アセト
ン残留物を除去するために500ml蒸溜水に分散さ
せ、遠沈によつてアセトン残留物を水と共に除去
した。不溶性沈澱物を1.8エタノールで処理し、生
成懸濁液を撹拌しながら３時間温度50℃に保ち、
へパラン硫酸錯化合物の選択的可溶化を実現す
る。その後のヘパラン硫酸を得るための段階は実施
例３にデルマタン硫酸について説明した通りに行
われた。次の特性を有するヘパラン硫酸60ｇが得られ
た： −M.W.30000 −〔α〕_D＋55゜ −電気泳動により単一バンド実施例５実施例４に記載した処理によつて得られたヘパ
ラン硫酸錯化合物の選択的可溶化に由来する残留
固体物質を３蒸留水に分散させてエタノール残
留物を除去し、その後遠沈した。不溶性沈澱物を５メタノールで処理し、生成
した懸濁液を撹拌しながら３時間、温度50℃に保
ち、ヘパリン錯化合物の可溶化を実現する。その後のヘパリン回収および精製段階は、実施
例３のDSについて記載したように行つた。この方法で薬物的特性を有する純粋なヘパリン
が50ｇ得られた。

Claims

【特許請求の範囲】１ムコ多糖（MPS）に富みかつ変化を避ける
ために直ちに凍結した動物器官から薬物学的純度
のデルマタン硫酸（DS）を製造する方法におい
て、 (a) 凍結した材料そのまままたはアセトンで均質
化し凍結した材料を、材料：溶液の重量比が
１：0.5〜１：10になるような割合で加えた
0.01M〜1MCaCl₂水溶液で超微粒子化し、 (b) 水性の上記材料／CaCl₂ホモジネートをCa
（OH）₂水溶液によりPH７〜９に調節した後、
40〜55℃の温度で、６〜24時間、上記材料：酵
素の重量比が１：0.0001〜１：0.001となるよ
うな量の蛋白分解酵素により消化し、 (c) 酵素溶解物をPH３〜６の酸性にし、70〜90℃
で30分〜１時間加熱し、ついで濾過し、 (d) 濾液を、ジメチル−エチル−セチルアンモニ
ウムエチル硫酸で処理して、DS錯化合物とし
てDSを沈殿させ、またはハイアミン、セチル
−トリメチルアンモニウムブロミドおよびセチ
ル−ジメチル−エチルアンモニウムブロミドか
ら成る群から選ばれる１種の第四級アンモニウ
ム塩で処理して、DSおよび濾液中に存在する
すべてのMPSを錯化合物として沈殿させ、 (e) DS錯化合物またはMPS錯化合物からDSを
回収し、精製する、上記諸段階から成る方法。２前記(b)段階の蛋白分解酵素が、トリプシン、
キモトリプシン、アルカラーゼ、モキサターゼお
よびスペラーゼから成る群から選ばれる酵素であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
方法。３前記(c)の段階の酵素溶解物が、HClにより酸
性にされることを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載の方法。４前記(e)の段階のDSを回収が、アンモニウム
錯化合物を、DS錯化合物：水溶液の重量比が
１：５になるように、エタノール10容量％を含む
2M CaCl₂水溶液で処理し、Ca（OH）₂によりPH７
〜９に調節した後、60〜90℃の温度で、１〜３時
間加熱し、得られた溶液を滲透性の違いにより分
子を10000で切断して精製し、次いでアセトン、
メタノール及びエタノールから選ばれる１種の有
機溶媒によりDSを沈殿させることにより行なわ
れることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の方法。５前記(e)の段階のDSの回収が、MPS錯化合物
を室温で１〜２時間、該錯化合物のDS含有量が
10％の場合該錯化合物に対して１容量となるよう
な量のアセトンに分散させ、次いで得られた溶液
を濾過し、次いでその濾液を室温で濾液１容量に
対して４容量の3M塩溶液で処理しDSを塩として
得ることにより行なわれることを特徴とする特許
請求の範囲第１項記載の方法。６前記塩溶液がNaCl、KCl、LiClおよび
MgCl₂から成る群から選ばれる１種の塩を含有す
る溶液であることを特徴とする特許請求の範囲第
５項記載の方法。７ムコ多糖（MPS）に富みかつ変化を避ける
ために直ちに凍結した動物器官から薬物学的純度
のデルマタン硫酸（DS）を製造する方法におい
て、 (a) 凍結した材料そのまままたはアセトンで均質
化し凍結した材料を、材料：溶液の重量比が
１：0.5〜１：10になるような割合で加えた
0.01M〜1M CaCl₂水溶液で超微粒子化し、 (b) 水性の上記材料／CaCl₂ホモジネートをCa
（OH）₂水溶液によりPH７〜９に調節した後、
40〜55℃の温度で、６〜24時間、上記材料：酵
素の重量比が１：0.0001〜１：0.001となるよ
うな量の蛋白分解酵素により消化し、 (c) 酵素溶解物をPH３〜６の酸性にし、70〜90℃
で30分〜１時間加熱し、ついで濾過し、 (d) 濾液を、ジメチル−エチル−セチルアンモニ
ウムエチル硫酸で処理して、DS錯化合物とし
てDSを沈殿させ、またはハイアミン、セチル
−トリメチルアンモニウムブロミドおよびセチ
ル−ジメチル−エチルアンモニウムブロミドか
ら成る群から選ばれる１種の第四級アンモニウ
ム塩で処理して、DSおよび濾液中に存在する
すべてのMPSを錯化合物として沈殿させ、 (e) DS錯化合物またはMPS錯化合物からDSを
回収し、精製する、上記諸段階から成る方法により得られ、薬物学的
純度のデルマタン硫酸を活性成分として含む、抗
トロンビン組成物。