JPH0240984B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、テオフイリンの定量方法に関し、更
に詳細には、競合蛋白結合分析によるテオフイリ
ンの定量方法に関する。更に、本発明は、テオフ
イリンの定量用キツトにも関する。 テオフイリン（１，３―ジメチルキサンチン）
は喘息、高血圧、ネフローゼ浮腫の治療に普通使
用され薬物である。高血漿値でテオフイリンは吐
き気を起こすことが時々あり、又約25〜70μｇ／
mlの高血漿濃度では重大な毒性が生ずることがあ
る。血清テオフイリン濃度は患者間にかなりの個
人差を示し、これは、代謝、分泌及び、投薬と投
薬との間の吸収、分布速度の変動の程度の差が大
きいことによる。幼児の場合には血液量が少いの
でこれらの問題は一層深刻である。 高血清テオフイリン量の結果としての重大な副
作用に鑑み、テオフイリン量をモニターするため
の高感度技術が提供されることが重要である。こ
の技術は迅速で、正確で、又、テオフイリンをそ
の正常・代謝産物及び様々な類似体（例えばキサ
ンチン、カフエイン）から容易に識別するもので
なければならない。 アメリカ特許第3690834号；第3817837号；第
3850752号；第3766162号の各明細書及びそこに引
用されている参照文献には一連の様々な免疫分析
法が記載されている。均質酵素免疫分析について
述べているアメリカ特許第3817837号明細書の開
示内容を参考のため本明細書に記載する。キサン
チン誘導体の合成は“Advances in
Heterocyclic Chemists”1966年第巻、Lister
等著、Rev.Pure ＆ Applied Chem.（オースト
ラリア）に述べられている。キサンチン誘導体の
製造についてはアメリカ特許第2517410号、第
2673848号各明細書、HolmesとLeonardの共著
“J.Org.Chem.”第41巻、第568頁（1976年）、
Cavalieri等著“J.Am.Chem.Soc.”第76巻、第
1119頁（1954年）を参照されたい。Rasmussen
とLeonardの共著、“J.Am.Chem.Soc.”第89巻、
第5439頁．（1967年）には保護基としてのピバロ
イルオキシメチル基の使用が開示されている。 本発明において、テオフイリン誘導体は抗原と
酵素とに結合される。抗原テオフイリン結合体
は、テオフイリンを特異的に認識するための抗体
の生成に用いられる。酵素結合体はテオフイリン
（特に血清中の）を測定するための競合蛋白結合
分析で用いられる。 前述の如く、本発明は３―置換―１―メチルキ
サンチン（その前駆体を含む）、テオフイリンの
抗体を製造するための抗原及び、競合蛋白結合分
析で使用される酵素結合体を使用する。該３―置
換基は短鎖であり、普通（しかし必ずしもその必
要はない）非オキソカルボニル基（その窒素類似
基とイオウ類似基とを含む）であり、ポリアミノ
酸（天然及び合成のポリペプチド、蛋白及び補欠
分子族とこれらの結合体を包含する）に結合され
る。特に重要なポリアミノ酸は抗原と酵素であ
る。結合基は炭化水素基でよく、これは鎖中の炭
素原子に結合された通常１〜４個のヘテロ原子
（酸素、窒素及び／又はイオウである）を有する。
普通、該鎖は水素以外に１〜10個の、更に普通に
は約２〜６個の原子からなる。 大部分の場合、本発明で用いられるポリアミノ
酸誘導体は次の一般式で示される。 式中、PAAはポリアミノ酸、特に抗原と酵素
をさし、該抗原は通常約5000〜10000000の、更に
普通には約10000〜500000の、好ましくは約25000
〜300000の分子量を持ち、一方該酵素は通常約
10000〜600000の、更に普通には約10000〜300000
の、好ましくは約10000〜200000の分子量を持
ち； ｎはPAAに結合したキサンチン基の数であり、
平均すると少なくとも１からPAAの分子量の
1500分の１、更に普通には2000分の１までであ
り；抗原に対してはｎは一般に平均して４〜250、
更に普通には約６〜100であり、一方酵素に対し
てはｎは一般に約１〜30、更に普通には約２〜
20、好ましくは約２〜12であり； Ｒは結合基であり、これは直接結合でもよいが
通常は、水素原子以外に１〜12個の、更に普通に
は２〜10個の原子（炭素、酸素、窒素及び／又は
イオウ）を有する基であり、一般に０〜１個の脂
肪族不飽和部位（普通にはエチレン型）を有し、
酸素原子は通常炭素原子にのみ結合して存在して
おり、即ちエーテル又は非オキソカルボニルを形
成しており、窒素原子はアミド基又は三級アミノ
基として存在し、イオウ原子はチオエーテル又は
チオノとして存在し、普通は酸素原子と窒素原子
のみが存在し；Ｒは脂肪族基、脂環式基、芳香族
基又はそれらの組合せでもよいが、通常は、１個
以上の脂肪族不飽和部位（例えばエチレン型）を
持つ脂肪族基であり、好ましくは飽和脂肪族基で
ある。 本発明で使用される化合物には、７位と８位が
置換されたキサンチンは完全ないし実質上含まれ
ない。本発明の目的にとつては、生成物がキサン
チンの３位置換体のみであることが必要である。 大部分の場合、Ｒ基は次の一般式で示され
る。 式中、ＸとX′とは同一でも異なつてもよく、
酸素原子、イミノ基（NH）又はイオウ原子であ
り、特に酸素原子かイミノ基であり； ＴとT′とは同一でも異なつてもよく、直接結
合か炭化水素基であり、この炭化水素基は１〜10
個の、更に普通には１〜４個の炭素原子（炭素原
子合計数は１〜８個、更に普通には１〜６個であ
る）を有し、一般には脂肪族基、好ましくは飽和
脂肪族基（特にメチレン基、ポリメチレン基）で
あり、又、T¹は窒素原子が

【式】に結合して いるヒドロカルビルアミノ基（該炭化水素基と同
一の制限を持つ）でもよく； Ｙは直接結合、アミド基又はオキシ基であり； ｍとｐは０〜１の整数であり、好ましくはｐは
１であり、ｍは０であり、この場合

【式】はキサン チンに結合しており、

【式】はポリアミノ酸に結合 している。 〔ヒドロカルビル基は、水素と炭素とのみから
構成される有機基であり、脂肪族、脂環式、芳香
族又はそれらの組合せでもよく、又飽和でも不飽
和でもよい。本発明においてはこのヒドロカルビ
ル基は１個以下の不飽和部位（例えばエチレン
型）を持つ〕 結合基を例示すると以下の式で示される。 ―CH₂CO― ―CH₂C（NH）― ―COCH₂CH₂CO― ―COCHCHCO― ―CH₂CONHCH₂CO― ―COCH₂N（CH₃）CH₂CO― ―CH₂CH₂C（NH）― ―COCH₂CH₂OCH₂CH₂CO― ―COCH₂OCH₂CO― ―CH₂CHCHCO― ポリアミノ酸へ結合できる化合物は大部分が次
の一般式で示される。 式中、R¹は直接結合か結合基であり、この結
合基は水素原子以外に１〜12個の、更に普通には
１〜６個の、好ましくは約１〜５個の原子（炭
素、酸素、窒素及び／又はイオウの原子である）
からなり、その炭素、酸素、窒素、イオウの特徴
はＲの場合と同一であり Ｚはオキソカルボニル基（CHO）、非オキソカ
ルボニル基（窒素―イミド―類似基とイオウ―チ
オノ―類似基とを含む）、カルボキシル基、カル
ボキシエステル基（エステル基はニトロフエニル
基かＮ―スクシンイミジルオキシ基である）、ア
ルコキシイミド基（アルコキシ基はC_1〜3である）、
イソチオシアネート基又はイソシアネート基であ
る。 オキソ基は還元アミノ化により有効アミノ基に
結合してもよい。カルボン酸基とその窒素類似
基、イオウ類似基は、活性エステルを用いるか、
カルボジイミドで活性化するか、クロル炭酸エス
テル、例えばC_2〜7アルコキシカルボニル基を用い
て混成無水物を製造することにより有効アミノ基
に直接に結合してもよい。 前述の如く、特に重要なのは、オキソカルボニ
ル基（ケト基以外）と非オキソカルボニル基がア
ミノ基（抗原であるポリペプチド又は蛋白質の一
部である）に結合している化合物である。キサン
チンのカルボニル誘導体をポリペプチド又は蛋白
質へ結合することにより、テオフイリンに対する
抗体（競合蛋白結合分析においてテオフイリンを
カフエインから識別する）を形成できる。そのま
ま抗原としては使用できるが、通常はそのままの
形では使用されないより狭い種類の蛋白質は、免
疫分析系で検出体として用いられる酵素である。
抗原としては不活性酵素を使用できる。 ポリペプチド（本発明では一般にポリアミノ酸
と呼ぶ））は普通、約２〜100個のアミノ酸単位を
有する（普通、分子量は約12000未満）。本明細書
ではより大きなポリペプチドを便宜上蛋白質と呼
ぶ。蛋白質は普通、サブユニツト（共有又は非共
有結合により結合されている）と呼ばれる１〜20
個のポリペプチド鎖から構成されている。サブユ
ニツトは通常、約100〜300個のアミノ酸基（又は
10000〜35000の分子量）からなる。本発明におい
て、ポリアミノ酸は、各ポリペプチド単位と、ヘ
モグロビン又はチトクロームオキシダーゼの場合
における様に他の官能基（例えばポルフイリン）
と結合したサブユニツト又はポリペプチド単位で
あるポリペプチドとを包含する。 キサンチン基の数か、ポリアミノ酸が酵素か抗
原であるかにより異なる。基の最大数は、溶解
性、活性等に対する置換の効果により限定され
る。抗体を形成するためには、充分の数のキサン
チン基を存在させてテオフイリンに対して満足す
べき量の抗体（テオフイリンに対する抗体）を与
えるべきである。さもなければ抗体とテオフイリ
ンとの割合が抗体と他化合物との割合に比べて低
く好ましくないことになる。 第１に考慮すべき蛋白質物質即ちポリペプチド
の群は抗原性ポリペプチドである。これらはアミ
ノ基を通じてテオフイリンのカルボニル基に結合
できる。生成物はテオフイリンの抗体の形成に使
用できる。使用できる蛋白物質は様々であり、通
常は5000〜１千万の分子量、更に普通には25000
〜500000の分子量を持つ。 酵素は通常約10000〜600000の、普通には約
10000〜150000の、更に普通には12000〜80000の
範囲内の分子量を持つ。幾つかの酵素は複数の酵
素サブユニツトを持つ。酵素の分子量について述
べる時は酵素全体をさす。特定アミノ基に限定せ
ずに計算すれば、平均して１酵素当たり少なくと
も１個の、普通には少なくとも２個のキサンチン
基が存在し、希には40個以上のこともあるが、普
通には30を越えない。リゾチームの場合を例にす
ると、キサンチン基の平均数は約２〜５の範囲内
にある。グルコース―６―ホスフエートデヒドロ
ゲナーゼとリンゴ酸デヒドロゲナーゼとの場合に
は平均数は２〜20、普通には２〜12の範囲内にあ
る。 テオフイリン類似体は非オキソカルボニル基を
通じてヒドロキシル基かメルカプト基（蛋白質中
に存在する）に結合してもよいが、大部分の場合
に結合はアミノ基に対して行なう。それゆえエス
テルとチオエステルも存在するが、生成化合物を
アミド（窒素誘導体とイオウ誘導体、例えばアミ
ジンとチオアミド、を含む。非オキソカルボキシ
ル誘導体には尿素、グアニジン、チオ尿素も含ま
れる）として記述する。アルデヒド誘導体は還元
アミノ化によりアミノ基にのみ結合してアルキル
アミン基を形成する。 カルボキシ修飾キサンチンへ結合するための遊
離アミノ基を持つ蛋白質中に存在するアミノ酸は
リジン、Ｎ―末端アミノ酸等である。ヒドロキシ
ル基とメルカプタン基とを含むアミノ酸はセリ
ン、システイン、チロシン、スレオニンである。 様々なタイプの蛋白質とポリペプチドとを抗原
物質として用いることができる。これらのタイプ
にはアルブミン、酵素、血清蛋白、例えばグロブ
リン、水晶体蛋白、リポ蛋白等、が含まれる。蛋
白質を例示すると、牛血清アルブミン、カサガイ
（Keyhole limpet）ヘモシアニン、卵アルブミ
ン、牛γ―グロブリン等である。グラミシジンの
様な免疫原性である天然小ポリペプチドも用いる
ことができる。リジン、グルタミン酸、フエニル
アラニン、チロシン等のポリマーの様な様々な合
成ポリペプチドも単独で又は組み合せて用いるこ
とができる。特に重要なのはポリリジン又はリジ
ンとグルタミン酸との組合せである。いかなる合
成ポリペプチドも、例えばリジンにより与えられ
る様に充分な数の遊離アミノ基を有しなければな
らない。 第２の蛋白分子群は検出体である。これらはカ
ルボニル修飾キサンチンが結合してもよい酵素で
ある。前述の如く、キサンチン修飾酵素は免疫分
析に役立つ。免疫分析技術については以下に記述
する。 ペプチダーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、ホ
スホリラーゼ、カーボヒドラーゼ、オキシダー
ゼ、例えばデヒドロゲナーゼ、リダクターゼ等の
様々な酵素を使用できる。特に重要なのは、リゾ
チーム、ベルオキシダーゼ、α―アミラーゼ、デ
ヒドロゲナーゼ（特にリンゴ酸デヒドロゲナーゼ
とグルコース―６―ホスフエートデヒドロゲナー
ゼ）、アルカリホスフアターゼ、β―グルクロニ
ダーゼ、セルラーゼ、ホスホリパーゼの様な酵素
である。I.U.B.分類に準拠すれば、重要な酵素は
1.オキシドリダクターゼ、特に1.1群（更に詳細
には1.1.1群）と1.11群（更に詳細には1.11.1）；及
び3.ヒドロラーゼ、特に3.2群（更に詳細には
3.2.1群）；である。 酵素テオフイリン結合体は大部分の場合に次の
一般式で示される。 式中、ENZは酵素、好ましくはオキシドリダ
クターゼ又はヒドロラーゼ、特にDPN又は
DPNPを用いるオキシドリダクターゼ、例えばデ
ヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ及びペルオキシダ
ーゼ、又はヒドロラーゼ（エステラーゼを含む）
例えばホスフアターゼ、リゾチーム等であり；こ
の酵素はその原活性の少なくとも２％、一般的に
は少なくとも10％、更に普通には少なくとも20
％、好ましくは少なくとも30％を有する； n¹は平均すると、１から酵素分子量の約2000分
の１の、更に普通には約１〜30の、好ましくは１
〜20の、更に好ましくは約２〜16の範囲内にある
整数であり； R²は結合基であり、これは直接結合か、水素
原子以外に１〜10個の原子（炭素、酸素、窒素及
び／又はイオウの、特に炭素、酸素、窒素の、更
には炭素と酸素の原子）からなる二価有機基（酸
素原子はオキシ又は非オキソカルボニルとして存
在し、即ち炭素原子にのみ結合しており、窒素原
子はアミドの一部であるか、ｔ―アミノ基として
炭素原子にのみ結合しており、一方イオウ原子は
チオノとして存在する）であり；普通、R²は０
〜１個のエチレン型不飽和部位を持ち、好ましく
は飽和されている脂肪族基であり、１〜６個の、
更に普通には１〜４個の炭素原子を有し、好まし
くはメチレン基かポリメチレン基であり； Ｘ，X¹，ｍは前記定義通りである。 用いられる酵素は、この酵素に結合したキサン
チン基が、キサンチン基に対する抗体即ちテオフ
イリンに対する抗体に結合する時にその活性が阻
止されるものが好ましい。抗テオフイリンで飽和
された時の酵素活性失活率は結合酵素の原活性の
少なくとも20％、普通には少なくとも30％、好ま
しくは少なくとも40％、一般的には90％以下とす
べきである。 本発明で使用できる様々なアミド生成物の製造
においては通常、カルボン酸を活性化させる。こ
れは様々な方法で達成できる。特に重要な２つの
方法のうちの１つは、不活性極性溶媒（例えばジ
メチルホルムアミド、アセトニトリル、THF、
DMSO、ヘキサメチルホスホルアミド）中での
カルボジイミド（普通には、水溶性の二脂肪族又
は二環式脂肪族カルボジイミド）との反応であ
る。この反応は、様々な試薬を緩和な条件下であ
わせ反応が生ずるに足る時間経過させることによ
り実施される。 第２の方法は、クロルギ酸アルキルエステル
（例えばクロルギ酸イソブチル）を用いて混成無
水物を形成することである。この混成無水物は、
カルボキシ置換キサンチン、クロルギ酸アルキル
エステル、ｔ―アミンをあわせることにより形成
される。温度は通常、周囲温度以下であり、又小
量のカルビトールを使用してもよい。 キサンチン誘導体を基準として少なくとも化学
量論量の、普通には過剰量（普通、化学量論量の
３倍は越えない）のクロルギ酸エステルを用い
る。ｔ―アミンはクロルギ酸エステルに対して少
なくとも等モル量で存在させる。 混合物をついで、結合すべきアミノ化合物とあ
わせ、反応を緩和な条件下で進行させる。 又、アミン官能体をアシル化するために水中で
使用できるカルボキシ修飾キサンチンのエステル
も用いることができる。ヒドロキシル基を例示す
ると、それぞれｐ―ニトロフエニルエステルとＮ
―スクシンイミジルオキシエステルの製造に使用
できるｐ―ニトロフエニルとＮ―ヒドロキシスク
シンイミドとである。アルデヒドを結合させるた
めには、還元剤としてシアノ水素化ホウ素ナトリ
ウムを用いて還元アミノ化を、極性の、普通には
水性の媒体中で実施する。 他の異性体を含まない１―メチル―３―置換キ
サンチンを製造するための新規かつ簡単な方法が
提供される。出発物質は１―メチルキサンチンで
あり、これを塩基性条件下で極性無水非ヒドロキ
シル有機媒体例えばDMF，THF，DMSO，
HMP等）中でほぼ化学量論量のピバル酸ハロメ
チル（ハロは原子番号が17〜35のもの、特にクロ
ルである）と縮合させる。０〜50℃の緩和な温度
を用いる。周囲温度が便利である。使用塩基は窒
素塩、炭酸ナトリウム、ｔ―アミン等である。反
応を進行させて完了させ、小量の二置換物質から
一置換ピバロイルオキシメチル誘導体を分離す
る。 ７―置換生成物を単離し、ハロ置換脂肪族カル
ボン酸のアルキルエステルと結合させる。該ハロ
は原子番号が17〜53のものであり、ヨードが好ま
しく、又他の置換基も存在することが好ましい。
アルコール部分のアルキル基はC_1〜6、好ましくは
C_1〜2であり、酸基はC_2〜7である。前述の如く類似
反応条件下で塩基性の無水非ヒドロキシ極性媒体
を用いる。 生成物の単離後にエステル基を通常の条件下で
加水分解する。塩基水溶液を約75〜100℃の温度
で用いることができる。溶液を酸性にすると所望
の１―メチル―３―カルボキシルアルキルキサン
チンを単離できる。 本発明で使用される結合抗原に応答して製造さ
れる抗体は、親薬物、結合抗原に対して強力な特
異的結合性を示す。 分析により０〜100μｇ／mlの濃度範囲内のテ
オフイリンを検出することが可能であり、又この
分析は零量と5μｇ／ml（好ましくは2.5μｇ／ml）
とを識別できるものでなければならない。他のサ
ンプル源も用いることもできるが、通常、対象サ
ンプルは血清である。 分析は一般に、水性緩衝済媒体（一般には５〜
10の、更に普通には６〜９の範囲内のPH値にあ
る）中で分析用サンプルと酵素／テオフイリン結
合体とテオフイリンに対する抗体をあわせること
により実施する。水の他に20容量％までの極性有
機溶媒（例えばアルカノール、エーテル、アミド
等）も分析溶媒体中に含めることができる。 試薬の量は、酵素／テオフイリン結合体の酵素
活性、テオフイリンに対する抗体が酵素／テオフ
イリン結合体に結合したことによる酵素活性の低
下度、測定方法、テオフイリン濃度の違いに対す
る試薬系の感度、テオフイリンに対する抗体の結
合定数等により変動する。主要な観点は、対象と
なるテオフイリン濃度域をカバーできるというこ
とである。酵素変換によりもたらされる分析媒体
の吸光の変化に起因する光学密度の変化を、約０
〜50μｇ／mlのテオフイリン濃度範囲にわたつて
測定する時、測定される吸収の変化は少なくとも
約0.25△OD、好ましくは少なくとも0.5△ODで
なければならない。 普通、酵素／テオフイリン結合体中のテオフイ
リンに対するテオフイリンに対する抗体のモル比
は結合部位に基づいて約0.01〜100：１である。
酵素／テオフイリン結合体の濃度は一般に約10^-5
〜10^-10モルの範囲内にある。 分析媒体中に酵素基質が含まれうる。普通、こ
れら基質のうちの１つが、紫外線又は可視光線の
領域内で顕著な吸収性を示す生成物に変換され
る。便宜上、NAD又はNADPをNADH又は
NADPHに変換する酵素を用いることができ、
NADH又はNADPHの形成後に分光光度計で測
定する。所定期間にわたつて特定波長で２回の読
みを取ることにより、酵素活性に関連した値を得
ることができる。既知濃度のテオフイリンを含む
サンプルで用いたと同一の方法を未知サンプルに
用いることにより、得られた結果をテオフイリン
濃度にかえることができる。 分析時の温度は一般には約10〜50℃の、普通に
は25〜40℃の範囲内にある。 以下の参考例及び実施例は本発明を例示するた
めに提示するものであり、限定するものではな
い。 参考例及び実施例において、％は、容量による
液体混合物以外は、特記ない限り全て重量によ
る。温度は特記ない限り全て℃単位である。
DMFはＮ，Ｎ―ジメチルホルムアミド；TLCは
薄層クロマトグラフイー；ECDIは塩酸１―エチ
ル―３―（ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド；THFはテトラヒドロフラン；の略号であ
る。 参考例 １ １―メチル―７―ピバロイルオキシメチルキサ
ンチン 窒素下の20mlの乾燥DMF中の１―メチルキサ
ンチン（844mg、5.08ミリモル）と炭酸ナトリウ
ム（538mg、5.08ミリモル）との混合物に、ピバ
ル酸クロルメチル（828μl、5.59ミリモル）の
DMF（６ml）溶液を室温で１時間かけてゆつくり
加え、反応混合物を一夜撹拌した。混合物を過
し、液を蒸発発乾燥させ、残渣を50mlの10V／
Ｖ％EtOH／CHCl₃で研和した。得られた固体は
出発物質だつた。有機層をシリカゲルプレートで
クロマトグラフイーに付した（10V／Ｖ％
EtOH／CHCl₃）。125mlの10V／Ｖ％EtOH／
CHCl₃で溶出することにより２つの生成物を観察
し、R_f値が0.48の帯から365mgの所望生成物を得
た。他の帯は３，７―二置換物質であることが証
明された。 参考例 ２ １―メチル―３―（カーボエトキシプロピル）
―７―（ピバロイルオキシメチル）キサンチン 5.8mlの乾燥DMF中の１―メチル―７―（ピバ
ロイルオキシメチル）キサンチン（350mg、1.25
ミリモル）と炭酸ナトリウム（265mg、2.50ミリ
モル）と４―ヨード酪酸エチル（384μ、2.50ミ
リモル）との混合物を窒素下、室温で18時間撹拌
した。水を加え、反応混合物をクロロホルムで抽
出した。乾燥後に抽出液をスピトリツピング処理
に付して黄色油状物を得これを４枚の厚いシリカ
ゲルプレートでクロマトグラフイーに付した（10
％EtOH／CHCl₃で展開した）。帯を分離し、100
mlの25％EtOH／CHCl₃で溶出して609mgの所望
生成物を油状物として得た。 参考例 ３ １―メチル―３―（3′―カルボキシプロピル）
キサンチン １―メチル―３―（カーボエトキシプロピル）
―７―（ピバロイルオキシメチル）キサンチン
（508mg）の2N NaOH（36.2ml）中油状サスペン
シヨンを窒素下95〜100°で２時間加熱した。油状
物は溶解し、TLCにより反応が完了したことが
示された。反応混合物をその冷却後に15mlの12％
塩酸でPH２〜３の酸性にし、溶液を各５mlのクロ
ロホルムで３度抽出してピバル酸を除去した。ク
ロロホルム抽出液を５mlの0.5N HClで洗つた後
に水溶液をあわせ、ストリツピング処理して乾燥
し、残渣を室温で真空乾燥した。粗生成物を約22
mlの熱水に溶解し、脱色し濃縮して15mlとし、冷
却したら159mgの結晶生成物（mp220〜221゜）が
得られた。 参考例 ４ １―メチル―３―（3′―カルボキシプロピル）
キサンチンの牛γ―グロブリンへの結合 １―メチル―３―（３―カルボキシプロピル）
キサンチン（45mg、0.178ミリモル）のDMF（1.5
ml）澄明溶液にＮ―ヒドロキシスクシンイミド
（20.5mg、0.178ミリモル）とEDCI（39.1mg、0.20
ミリモル）とを0゜で窒素下加えた。溶液を5゜で18
時間撹拌後に反応混合物を、27mlの炭酸塩緩衝剤
（PH９、0.05モル）とDMFとの混合液中の牛γ―
グロブリン（550mg）溶液に0゜で加え、混合物を
この温度に1.5時間維持した。この間、PHは1N
NaOHを使つた8.5〜9.0に維持した。混合物を5゜
で一夜撹拌後に生成物を各４の水で10回、各４
の水酸化アンモニウムで３回透析した。結合体
を凍結乾燥して470mgの蛋白質を得た。吸光分光
分析を用いてそのハプテン価は15であると測定さ
れた。 参考例 ５ ３―（2′―シアノエチル）―１―メチルキサン
チン 反応フラスコに、1.42mlのDMFに溶解した７
―ピバロイルオキシメチル―１―メチルキサンチ
ン（100mg）と44.17mgの炭酸ナトリウムと47μlの
アクリロニトリルとを導入した。100゜で16時間加
熱後に混合物を水に注ぎ入れ、水性混合物をクロ
ロホルムで抽出した。クロロホルム抽出液を乾燥
し、蒸発させ、油状残渣をシリカゲルプレートで
２回クロマトグラフイーに付し帯を75mlの25％エ
タノール／クロロホルム（Ｖ／Ｖ）で溶出して
109mgの油状生成物（放置により固化した）を得
た。mp118〜120℃。 上記ニトリル（109mg）を0.35mlの1N水酸化ナ
トリウムに懸濁し、0.35mlのTHFを加えた。混
合物を温室で3.5時間撹拌しついで0.2mlの1N
NaOHを加え、撹拌を更に0.5時間続けた。混合
物をついで約２mlの水に注ぎ入れ、生成水溶液を
酸性にし、クロロホルムで完全に抽出した。クロ
ロホルム抽出液を８％重炭酸ナトリウムで洗い、
ついで乾燥し、蒸発乾燥させた。残渣を２枚のシ
リカゲルプレート（10％EtOH／CHCl₃）でクロ
マトグラフイーに付した（125mlの25％EtOH／
CHCl₃で溶出した）。蒸発乾して50mgの所望生成
物を得た。 題記ニトリルは容易にイミドエステルにかえポ
リアミノ酸に存在するアミノ基に結合してアミジ
ン結合を提供するのに使用できた。 参考例 ６ ３―カルボキシプロピル―１―メチルキサンチ
ンの、グルコース―６―ホスフエートデヒドロ
ゲナーゼ（G6PDH）への結合 G6PDHの凍結乾燥粉末を0.055モルトリス―
HCl（PH8.1）に溶解して蛋白濃度を約２〜３mg／
mlにした。混合物を4゜で一夜放置した。 反応フラスコに３―カルボキシプロピル―１―
メチルキサンチン（36mg、0.14ミリモル）と16.4
mgのＮ―ヒドロキシスクシンイミドと31.4mgの
ECDIと400μlのDMFとを導入し混合物を4゜で一
夜撹拌した。 ５mlの上記G6PDH溶液に50mgのグルコース―
６―ホスフエート二ナトリウム塩と100mgの
NADHと1.5mlのカルビトールとを加え、PHを2N
NaOHで約8.5〜９に調整した。上記で製造した
エステルのほぼ全量の400μlずつで２時間かけて
撹拌酵素溶液に加えた。この間、溶液は4゜に維持
した。反応中にPHは7.5〜８に低下した。ついで
生成結合体を4゜で0.055モルトリスHCl（PH8.1、保
存料として0.5％のナトリウムアジドと0.005％の
チメロサールとを含む）で透析した。 実施例 テオフイリン分析法における本発明で使用され
る化合物の有効性を実証するために多数の分析実
験を実施した。 分析の実施においては、フローセル付きサーモ
キユベツトを備えたギルボード300Nミクロサン
プル分光光度計を用いた。読みは全て340nmで行
つた。次の溶液を分析し使用する試薬として調製
した。

【表】 分析の実施に用いた方法は次の通りである。 50μｇの被検サンプルを希釈装置に入れ、250μl
の分析用緩衝剤と共に１mlクロアンキヤツプに入
れた。希釈剤サンプルの50μlを分析用緩衝剤
250μlと共に第２のクロアンキヤツプに入れた。
この第２のクロアンキヤツプに50μlの抗体試薬を
250μlの分析用緩衝剤と共に導入し、ついで50μl
の酵素試薬と250μlの分析用緩衝剤とを添加した。
酵素添加直後にサンプル全量をフローセル中に吸
引した。15秒後に最初の読みとり、その30秒後に
２度目の読みをとつた。結果は2.067における吸
光度の差として報告した。 次表に、既知量のテオフイリンを含む多数のサ
ンプルを用いて得られた結果を示す。

【表】

【表】 上記結果を半対数紙にグラフ化することによ
り、未知サンプルで得られた△ODを、上記結果
を用いて得られた濃度−△ODプロツトと比較す
ることにより未知サンプルのテオフイリン濃度を
決定できる。 １―メチルキサンチンに起因する交差反応性は
抗体試薬に小量の（―標的には、分析媒体中で約
１〜20μｇ／mlの、好ましくは２〜15μｇ／mlを
占めるのに充分な量の）１―メチルキサンチンを
添加することにより有効に低下できる。この方法
により、分析用血清サンプル中にある程度の１―
メチルキサンチンが存在する場合に示される為陽
性は避けることができる。 様々な類似構造化合物を用いて交差反応性の研
究を行つた。正確な結果を得るためには、本発明
の分析法は、テオフイリンと類似構造を持つ共存
化合物、例えばカフエインとその代謝産物、を識
別できるものでなければならない。交差反応性を
研究した化合物はカフエイン、１，３―ジメチル
尿酸、テオブミン、１―メチルキサンチン、３―
メチルキサンチンだつた。被検サンプルに100μ
ｇ／mlのこれら化合物を添加した時、観察値は、
１―メチルキサンチンの場合は例外として、2.5μ
ｇ／mlのテオフイリン濃度で得られた値よりは低
かつた。１―メチルキサンチンの場合には５〜
10μｇ／mlのテオフイリン濃度と均等だつた。し
かし、前述の如く、小量の１―メチルキサンチン
を分析媒体中に用いると、更に１―メチルキサン
チンを添加しても実質上の影響はない。 上記結果より、本発明により、生理学的流動体
（特に血清）中のテオフイリンを測定するための
高感度分析法が提供される。この分析法は、テオ
フイリンが極度に低濃度であつても、極度に類似
した構造を持つ化合物と識別できる。更に、この
方法は簡単であり、迅速であり、又通常の分光光
度計で容易に実施できる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ テオフイリンを含有すると予測されるサンプ
   ル中のテオフイリンの定量方法において、 (1) (i) 前記サンプル； (ii) テオフイリンがその３位で酵素に結合され
   ている酵素／テオフイリン結合体；及び (iii) テオフイリンの３位で、免疫原性と抗原性
   とを有するポリアミノ酸である抗原に結合さ
   れているテオフイリンから生成される、テオ
   フイリンに対する抗体 を水性媒体中で合わせ、そして (2) 前記酵素／テオフイリン結合体の酵素活性に
   対する前記サンプルの作用を前記水性媒体中で
   分析することからなり、 前記テオフイリンに対する抗体の濃度は、テ
   オフイリンの不存在下で前記酵素／テオフイリ
   ン結合体の酵素活性の実質的な減少をもたらす
   濃度であることを特徴とする前記定量方法。 ２ 該媒体が約１〜20μｇ／mlの１―メチルキサ
   ンチンを含む、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ３ 該酵素がグルコース―６―ホスフエートデヒ
   ドロゲナーゼである、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ４ 該媒体が１〜20μｇ／mlの１―メチルキサン
   チンを含む、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５ テオフイリンを含有すると予測されるサンプ
   ル中のテオフイリンを定量するための試薬キツト
   であつて、 (i) テオフイリンがその３位で酵素に結合されて
   いる酵素／テオフイリン結合体、及び (ii) テオフイリンの３位で、免疫原性と抗原性と
   を有するポリアミノ酸である抗原に結合されて
   いるテオフイリンから生成される、テオフイリ
   ンに対する抗体 を含有する前記キツト。 ６ 水性媒体中で約１〜20μｇ／mlを与えるのに
   足る量の１―メチルキサンチンを、テオフイリン
   に対する抗体と共に含める、特許請求の範囲第５
   項記載のキツト。