JPH02417A - 形質転換システム - Google Patents
形質転換システムInfo
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- JPH02417A JPH02417A JP63238648A JP23864888A JPH02417A JP H02417 A JPH02417 A JP H02417A JP 63238648 A JP63238648 A JP 63238648A JP 23864888 A JP23864888 A JP 23864888A JP H02417 A JPH02417 A JP H02417A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
この発明は、ペニシリウム・クリゾゲヌム（Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に外部のＤＮＡ
を導入するための形質転換システム、この形質転換シス
テムを用いて形質転換ベニツリウム・クリゾゲヌムを製
造し選択する方法および該製造法で製造されたピー・ク
リゾゲヌム（Ｐ、 ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ）形質転
換菌株に関する。
ｉｌｌｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）に外部のＤＮＡ
を導入するための形質転換システム、この形質転換シス
テムを用いて形質転換ベニツリウム・クリゾゲヌムを製
造し選択する方法および該製造法で製造されたピー・ク
リゾゲヌム（Ｐ、 ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ）形質転
換菌株に関する。
（ロ）従来の技術
ペニシリウム・クリゾゲヌムは、重要な抗生物質である
ペニシリンＧとペニシリンＶを産生ずるので、産業上非
常に重要な糸状菌である。しかし、ピー・クリゾゲヌム
を宿主として用いる組換えＤＮＡ技術の開発は、適当な
りローニングベクターと形質転換法がないので従来非常
に困難であった。
ペニシリンＧとペニシリンＶを産生ずるので、産業上非
常に重要な糸状菌である。しかし、ピー・クリゾゲヌム
を宿主として用いる組換えＤＮＡ技術の開発は、適当な
りローニングベクターと形質転換法がないので従来非常
に困難であった。
ピー・クリゾケヌム内に低頻度でしか産生されない形質
転換細胞の同定を、適当な選択システムなしで行うこと
は、不可能ではないとしても困難である。
転換細胞の同定を、適当な選択システムなしで行うこと
は、不可能ではないとしても困難である。
形質転換法は、多数の糸状菌について発表されているか
、一般に、栄養要求突然変異株の入手しやすさによって
きまる。そしてこの栄養要求突然変異株に対応する野生
型遺伝子でプラスミド産生形（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒ
ｎｅ ｒｏｒｍ）のらのは選択可能ナマーカーを提供す
る。上記の方法によるピー・クリゾゲヌムの形質転換法
が最近報告された〔サンチエら（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ
ａｌ） 、Ｇｅｎｅ、 Ｌ９８７年、５１＠、９７−
１０２頁コが、この方法は、トリプトファン要求突然変
異菌株をリリーフ（ｒｅｌｉｅｖｅ）するのに野生型ｔ
ｒｐ−ｃ遺伝子を用いる方法である。しかしこの方法の
問題点は、形質転換菌株が栄養要求性突然変異を行なう
菌株からしか選択することができないということである
。
、一般に、栄養要求突然変異株の入手しやすさによって
きまる。そしてこの栄養要求突然変異株に対応する野生
型遺伝子でプラスミド産生形（ｐｌａｓｍｉｄ−ｂｏｒ
ｎｅ ｒｏｒｍ）のらのは選択可能ナマーカーを提供す
る。上記の方法によるピー・クリゾゲヌムの形質転換法
が最近報告された〔サンチエら（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ
ａｌ） 、Ｇｅｎｅ、 Ｌ９８７年、５１＠、９７−
１０２頁コが、この方法は、トリプトファン要求突然変
異菌株をリリーフ（ｒｅｌｉｅｖｅ）するのに野生型ｔ
ｒｐ−ｃ遺伝子を用いる方法である。しかしこの方法の
問題点は、形質転換菌株が栄養要求性突然変異を行なう
菌株からしか選択することができないということである
。
受性の選択可能な遺伝子を用いる、糸状菌の形質転換法
の報告が最近現れた。アスペルギルス・ニデユランス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ−ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄ
ｓ遺伝子は、エイ・ニデュランンス（Ａ、ｎ１ｄｕｌａ
ｎｓ）の形質転換のみならずピー・クリゾゲヌムを含む
他の真菌類の種を形質転換することができ［べりおよび
ターナ−（Ｂｅｒｉ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ） 、 Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、 １９８７年、１１＠
、６３９−６４１頁］、原則として、アセトアミド上で
の増殖性を欠いている子のう菌らしくはこれと近縁のい
ずれの糸状菌種上でも選択することができる。
の報告が最近現れた。アスペルギルス・ニデユランス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ−ｎｉｄｕｌａｎｓ）のａｍｄ
ｓ遺伝子は、エイ・ニデュランンス（Ａ、ｎ１ｄｕｌａ
ｎｓ）の形質転換のみならずピー・クリゾゲヌムを含む
他の真菌類の種を形質転換することができ［べりおよび
ターナ−（Ｂｅｒｉ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ） 、 Ｃ
ｕｒｒｅｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓ、 １９８７年、１１＠
、６３９−６４１頁］、原則として、アセトアミド上で
の増殖性を欠いている子のう菌らしくはこれと近縁のい
ずれの糸状菌種上でも選択することができる。
欧州特許願公開第０２１５５３９号および同第０２６０
７６２号ら、ペニシリウム属の形質転換菌株の製造・選
択法を開示している。後者の文献（本願発明の侵先日に
は未公開であっｆ二）には、形質転換された宿主を選択
するｆこめに、オリゴマイシンに対する耐性を与える遺
伝子を用いる可能性が、漠然と述べられているが、実施
例はすべて、栄養要求性宿主と、代謝経路内の酵素をコ
ードする構造遺伝子との相補性に関するものである。
７６２号ら、ペニシリウム属の形質転換菌株の製造・選
択法を開示している。後者の文献（本願発明の侵先日に
は未公開であっｆ二）には、形質転換された宿主を選択
するｆこめに、オリゴマイシンに対する耐性を与える遺
伝子を用いる可能性が、漠然と述べられているが、実施
例はすべて、栄養要求性宿主と、代謝経路内の酵素をコ
ードする構造遺伝子との相補性に関するものである。
オリゴマイシンは、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼを
阻害する疎水性抗生物質であるＵアンスおよびクリドル
（Ｅｎｎｓ ａｎｄ Ｃｒ１ｄｄｌｅ） 、Ａｒｃｈ。
阻害する疎水性抗生物質であるＵアンスおよびクリドル
（Ｅｎｎｓ ａｎｄ Ｃｒ１ｄｄｌｅ） 、Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅａ＋、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 、１９７７年
、【８２巻、５８７−６００頁コ。
、【８２巻、５８７−６００頁コ。
ノイロスポラ′クラツサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒ
ａｓｓａ）の核オリゴマインン耐性突然変異体が、変え
られたサブユニット９ （ａｌｔｅｒｅｄ ５ｕｂｕｎ
ｉｔ９ ）のアミノ酸配列を有するＡＴＰシンターゼを
含有していることが提示された［セバルトら（Ｓｅｂａ
ｌｄ ｅｔａｌ）、“Ｍｉ。１０ｃｈｏｎｄｒｉａ １
９７７−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄＢｉｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ ｏｒ Ｍｉ。１０ｃｈｏｎｄｒｉａ″、バンドロー
・ダブリュら（Ｂａｎｄｌｏｗ Ｙ、 ｅｔ ａｌ）
’ＪＡ集、ダブリュ。
ａｓｓａ）の核オリゴマインン耐性突然変異体が、変え
られたサブユニット９ （ａｌｔｅｒｅｄ ５ｕｂｕｎ
ｉｔ９ ）のアミノ酸配列を有するＡＴＰシンターゼを
含有していることが提示された［セバルトら（Ｓｅｂａ
ｌｄ ｅｔａｌ）、“Ｍｉ。１０ｃｈｏｎｄｒｉａ １
９７７−Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄＢｉｏｇｅｎｅｓｉ
ｓ ｏｒ Ｍｉ。１０ｃｈｏｎｄｒｉａ″、バンドロー
・ダブリュら（Ｂａｎｄｌｏｗ Ｙ、 ｅｔ ａｌ）
’ＪＡ集、ダブリュ。
ド・グルイタ−社（Ｙ、ｄｅ、Ｇｒｕｙｔｅｒ） 、ベ
ルリン参照］。その変えられたオリゴマイシン耐性形の
サブユニット９の遺伝子が、アスペルギルス・ニデユラ
ンスの突然変異株からクローン化され［ワードら（Ｙａ
ｒｄ ｅｔ ａｌ） 、Ｍａｔ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、 、 １９８６年、２０２巻、２６５〜２７０頁］
、野性型エイ・ニデユランスを形質転換した後にオリゴ
マイシン耐性を直接選択することが達成された。
ルリン参照］。その変えられたオリゴマイシン耐性形の
サブユニット９の遺伝子が、アスペルギルス・ニデユラ
ンスの突然変異株からクローン化され［ワードら（Ｙａ
ｒｄ ｅｔ ａｌ） 、Ｍａｔ、 Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅ
ｔ、 、 １９８６年、２０２巻、２６５〜２７０頁］
、野性型エイ・ニデユランスを形質転換した後にオリゴ
マイシン耐性を直接選択することが達成された。
しかしいままで、選択可能なマーカーとしてオリゴマイ
シン耐性の相同遺伝子を用いるピー・クリゾゲヌムの形
質転換法については発表されていない。
シン耐性の相同遺伝子を用いるピー・クリゾゲヌムの形
質転換法については発表されていない。
（ハ）課題を解決するための手段及び作用この明細書で
“相同”という用語を遺伝子らしくはＤＮＡ配列に用い
る場合は、ピー・クリゾゲヌム中に見出された遺伝子も
しくはＤＮＡ配列を意味して用いられる。
“相同”という用語を遺伝子らしくはＤＮＡ配列に用い
る場合は、ピー・クリゾゲヌム中に見出された遺伝子も
しくはＤＮＡ配列を意味して用いられる。
この発明は、ペニシリウム・クリゾゲヌムを形質転換し
生成した形質転換菌株を選択する方法、すなわち Ｉ）ピー・クリゾゲヌム宿主生物と、オリゴマイノン耐
性をコードする相同ＤＮＡ配列を有する組換え体ベクタ
ーとを、形質転換条件下で混合し、ｉｉ）オリゴマイシ
ンを含有する培地内で培養した際に増殖する１以上の微
生物を選択する工程からなる方法を提供するものである
。
生成した形質転換菌株を選択する方法、すなわち Ｉ）ピー・クリゾゲヌム宿主生物と、オリゴマイノン耐
性をコードする相同ＤＮＡ配列を有する組換え体ベクタ
ーとを、形質転換条件下で混合し、ｉｉ）オリゴマイシ
ンを含有する培地内で培養した際に増殖する１以上の微
生物を選択する工程からなる方法を提供するものである
。
オリゴマイシン耐性をコードするＤ Ｎ Ａ配列が、ピ
ー・クリゾゲヌム内に組込まれて発現することができた
と考えられる。
ー・クリゾゲヌム内に組込まれて発現することができた
と考えられる。
この発明は、もう一つの態様として、形質転換菌株のゲ
ノムが、その中にオリゴマイシン耐性をコードする相同
Ｄ Ｎ Ａ配列を組込まれたことを特徴とする、オリゴ
マイシン含有培地中で選択可能なピー・クリゾゲヌムの
形質転換菌株を提供するものであることは上記のことか
ら明らかである。
ノムが、その中にオリゴマイシン耐性をコードする相同
Ｄ Ｎ Ａ配列を組込まれたことを特徴とする、オリゴ
マイシン含有培地中で選択可能なピー・クリゾゲヌムの
形質転換菌株を提供するものであることは上記のことか
ら明らかである。
この発明の利点は、この発明によって、効果的な形質転
換と、ピー・クリゾゲヌムのオリゴマインン耐性形質耘
換菌株の便利で迅速な同定とが可能になったこのとであ
る。
換と、ピー・クリゾゲヌムのオリゴマインン耐性形質耘
換菌株の便利で迅速な同定とが可能になったこのとであ
る。
宿主細胞はピー・クリゾゲヌムのいずれの適切な菌株で
あってもよい。例えばピー・クリゾゲヌム ＮＲＲＬ
１９５１ （野生型）、またはこの野生型菌株のニコチ
ンアミド栄養要求菌株、例えば英国、サリー州、キュー
、フエリイレーンにあるコモンウエルス・マイコロジカ
ル・インスティチュート（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ
Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）に寄託
されたＣＭ＋ ３１７７３４を挙げることができる。
あってもよい。例えばピー・クリゾゲヌム ＮＲＲＬ
１９５１ （野生型）、またはこの野生型菌株のニコチ
ンアミド栄養要求菌株、例えば英国、サリー州、キュー
、フエリイレーンにあるコモンウエルス・マイコロジカ
ル・インスティチュート（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ
Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）に寄託
されたＣＭ＋ ３１７７３４を挙げることができる。
この発明に使用する適切な組換え体ベクターは、オリゴ
マイシン耐性をコードする相同ＤＮＡ配列を、例えばプ
ラスミドらしくはファージＤＮＡのようないずれかの適
切なベクターにクローン化することによって得ることが
できる。
マイシン耐性をコードする相同ＤＮＡ配列を、例えばプ
ラスミドらしくはファージＤＮＡのようないずれかの適
切なベクターにクローン化することによって得ることが
できる。
好ましいベクターは、プラスミドであり、特に、イー・
コリの複製起源（Ｅ、 Ｃｏ１１ ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ
ｒｅｐｌ １ｃａｔｉｏｎ）と、イー・コリ内の選択可
能な表現型をコードする配列とを有するプラスミドであ
この種の特定のプラスミドには、ｐＵｃ９ （ビエラお
よびメシング、Ｇｅｎｅ、１９８２年、１９巻、２５９
−２６８頁）が含まれろ。
コリの複製起源（Ｅ、 Ｃｏ１１ ｏｒｉｇｉｎ ｏｒ
ｒｅｐｌ １ｃａｔｉｏｎ）と、イー・コリ内の選択可
能な表現型をコードする配列とを有するプラスミドであ
この種の特定のプラスミドには、ｐＵｃ９ （ビエラお
よびメシング、Ｇｅｎｅ、１９８２年、１９巻、２５９
−２６８頁）が含まれろ。
さらに適切なベクターにはニスミド類が挙げられ、例え
ばｐＨＣ７９（ホーンおよびコリンズ、Ｇｅｎｅ、１９
８０年、１１巻、２９１−２９ｉ１１頁）がある。
ばｐＨＣ７９（ホーンおよびコリンズ、Ｇｅｎｅ、１９
８０年、１１巻、２９１−２９ｉ１１頁）がある。
好ましい態様として、オリゴマイシン耐性をコードする
相同ＤＮＡ配列：よ、オリゴマイシン耐性を得たピー・
クリゾゲヌムの突然変異菌株の染色体（核）ＤＮＡの一
部分である。相同ＤＮＡ配列としては、オリゴマイシン
が未形質転換のピー・クリゾゲヌム宿主に制真菌効果を
及ぼす場合の機構で阻害する蛋白質をコードする遺伝子
を含むものが適切である。
相同ＤＮＡ配列：よ、オリゴマイシン耐性を得たピー・
クリゾゲヌムの突然変異菌株の染色体（核）ＤＮＡの一
部分である。相同ＤＮＡ配列としては、オリゴマイシン
が未形質転換のピー・クリゾゲヌム宿主に制真菌効果を
及ぼす場合の機構で阻害する蛋白質をコードする遺伝子
を含むものが適切である。
この遺伝子としては、ピー・クリゾゲヌムのＡＴＰ−シ
ンターゼの変化されたサブユニット、特に変化されたサ
ブユニット−９蛋白質をコードする遺伝子が適切である
。
ンターゼの変化されたサブユニット、特に変化されたサ
ブユニット−９蛋白質をコードする遺伝子が適切である
。
ピー・クリゾゲヌムのＡＴＰ−シンターゼの変化された
サブユニット−９蛋白質をコードする遺伝子を有する好
ましいＤＮＡ配列は、野生型菌株（ビー・クリゾゲヌム
ＮＲＲＬ １９５１）のニコチンアミド栄養要求株の
突然変異によって産生されるビー・クリゾゲヌムのオリ
ゴマイシン耐性突然変位菌株から得られる。
サブユニット−９蛋白質をコードする遺伝子を有する好
ましいＤＮＡ配列は、野生型菌株（ビー・クリゾゲヌム
ＮＲＲＬ １９５１）のニコチンアミド栄養要求株の
突然変異によって産生されるビー・クリゾゲヌムのオリ
ゴマイシン耐性突然変位菌株から得られる。
上記目的に特に適切な突然変異体のオリゴマイシン耐性
菌昧は、ピー・クリゾゲヌム ＣＭＩ３１４６５２とい
う名称を有する菌株であり、これは、フタペスト条約の
規定に基づいてコモンウエルス・マイコロジカル・イン
スティチュートに１９８７年４月１６日付けで寄託され
た。
菌昧は、ピー・クリゾゲヌム ＣＭＩ３１４６５２とい
う名称を有する菌株であり、これは、フタペスト条約の
規定に基づいてコモンウエルス・マイコロジカル・イン
スティチュートに１９８７年４月１６日付けで寄託され
た。
ビー・クリゾゲヌム ＣＭＩ ３１４６５２はこの発明
の池の態様を形成する。
の池の態様を形成する。
ピー・クリゾゲヌムＣＭＩ ３１４６５２の由来と特性
は次のとおりである。
は次のとおりである。
ビー・クリゾゲヌム ＣＭＩ ３１４６５２の由来ピー
・クリゾゲヌム ＣＭＩ ３１７７３４が自然突然変異
を受けてオリゴマイシン耐性となり、５μ９／ｌ（ｌの
オリゴマイシンを含有する培地で活発に増殖しうる生物
を提供し几。この突然変異菌株は薬剤の入っていない培
地では親菌株と区別できなかった。
・クリゾゲヌム ＣＭＩ ３１７７３４が自然突然変異
を受けてオリゴマイシン耐性となり、５μ９／ｌ（ｌの
オリゴマイシンを含有する培地で活発に増殖しうる生物
を提供し几。この突然変異菌株は薬剤の入っていない培
地では親菌株と区別できなかった。
突然変異が核ゲノムに位置することを検査するためにヘ
テロカリオンテストを実施した［ローランズおよびター
ナ−（Ｒｏｗｌａｎｄｓ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ）、Ｍ
ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 、 １９７３年、１
２６巻、２０１〜２１６頁（方法）参照二。
テロカリオンテストを実施した［ローランズおよびター
ナ−（Ｒｏｗｌａｎｄｓ ａｎｄ Ｔｕｒｎｅｒ）、Ｍ
ｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 、 １９７３年、１
２６巻、２０１〜２１６頁（方法）参照二。
ピー・クリゾゲヌム ＣＭＩ ３１４６５２の分類学ベ
ンツリウム・クリゾゲヌムの野生型菌株（ＮＲＲＬ １
９５１と命名されている）は、米国、イリノイ州、ビオ
リアにあるノーザーン・リージナル・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ。１０ｒｉｅｓ）で単離され
たものであるが［レーバーおよびアレキサンダー（Ｒａ
ｐｅｒａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ） 、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｒ ｔｈｅ ＥｌｉｓｈａＭｉｔｃｈｅ！ｌ ５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５ｏｃｉｅｔｙ、 １９４５年、
６１巻、７４−１１３頁］、本願における研究を通じて
用いた菌株の親菌株である。
ンツリウム・クリゾゲヌムの野生型菌株（ＮＲＲＬ １
９５１と命名されている）は、米国、イリノイ州、ビオ
リアにあるノーザーン・リージナル・リサーチ・ラボラ
トリーズ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ＲｅｇｉｏｎａｌＲｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａ。１０ｒｉｅｓ）で単離され
たものであるが［レーバーおよびアレキサンダー（Ｒａ
ｐｅｒａｎｄ Ａｌｅｘａｎｄｅｒ） 、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｒ ｔｈｅ ＥｌｉｓｈａＭｉｔｃｈｅ！ｌ ５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ５ｏｃｉｅｔｙ、 １９４５年、
６１巻、７４−１１３頁］、本願における研究を通じて
用いた菌株の親菌株である。
ビー・クリゾゲヌムの突然変異オリゴマイシン耐性菌株
の染色体ＤＮＡから、オリゴマイシン耐性をコードする
Ｄ Ｎ Ａ配列を得るには、適切ｔＤＮＡフラグメント
を単離するために、″プローブされうる（検出可能な）
染色体Ｄ Ｎ Ａフラグメントの“ライブラリィ°を構
築することが第一に必要でるる。
の染色体ＤＮＡから、オリゴマイシン耐性をコードする
Ｄ Ｎ Ａ配列を得るには、適切ｔＤＮＡフラグメント
を単離するために、″プローブされうる（検出可能な）
染色体Ｄ Ｎ Ａフラグメントの“ライブラリィ°を構
築することが第一に必要でるる。
このライブラリーは次の方法によって製造することがで
きろ （−Ｌ）適切な制限酵素例えば５ａｕ３Ａによる染色体
Ｄ −＜ Ａの部分切断： （ｂ）！切な長さ、適切なものとしては５〜４０ｋｂ、
好ましいのは１Ｏ−２０ｋｂのフラグメントを徨供する
サイズ分画、； （ｃ）フラグメントのベクターへの連結：および（ｄ）
生成した祖換え体ＤＮＡによる適切な宿主の形質転換で
ある。
きろ （−Ｌ）適切な制限酵素例えば５ａｕ３Ａによる染色体
Ｄ −＜ Ａの部分切断： （ｂ）！切な長さ、適切なものとしては５〜４０ｋｂ、
好ましいのは１Ｏ−２０ｋｂのフラグメントを徨供する
サイズ分画、； （ｃ）フラグメントのベクターへの連結：および（ｄ）
生成した祖換え体ＤＮＡによる適切な宿主の形質転換で
ある。
いずれの適切なベクターらライブラリーの構築に使用で
きる。
きる。
この発明の好ましい態ト舟として、ラムダベクターＥＭ
ｓｔ、４：フリソンヤウフら（Ｆｒｉｓｃｈａｕｒｅｔ
ａｌ）、Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ１、、１９８３年、
１７０巻、８２７−８４２頁］がベクターとして用いら
れ、染色体ＤＮＡフラグメントのライブラリーを構築す
るために、ピー・クリゾゲヌム Ｃ！１１１３１４６５
２の染色体ＤＮＡをサイズ分画してえたフラグメントを
、そのＢａｎ旧部位に挿入しｆこ。
ｓｔ、４：フリソンヤウフら（Ｆｒｉｓｃｈａｕｒｅｔ
ａｌ）、Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏ１、、１９８３年、
１７０巻、８２７−８４２頁］がベクターとして用いら
れ、染色体ＤＮＡフラグメントのライブラリーを構築す
るために、ピー・クリゾゲヌム Ｃ！１１１３１４６５
２の染色体ＤＮＡをサイズ分画してえたフラグメントを
、そのＢａｎ旧部位に挿入しｆこ。
上記のすべてのＤ Ｎ Ａ処理に；ｉ標準の方法を用い
ろことができろ［マニアティス；ｌＩ（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓｅｔ ａｌ）、＋＼Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、 ＡＬａｂｏｒａ。１０ｒｙＭａｎｕａｌ” 、
１９３２年、Ｃ５ＨＬ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク］。
ろことができろ［マニアティス；ｌＩ（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓｅｔ ａｌ）、＋＼Ｉｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ、 ＡＬａｂｏｒａ。１０ｒｙＭａｎｕａｌ” 、
１９３２年、Ｃ５ＨＬ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク］。
便ｆりないずれの宿主らライブラリー構築に用いること
ができろ。好ましい宿主には、イー・コリ例えばイー・
コリＤＨＩが含まれ、この宿主は、ハナハン（Ｈａｎａ
ｈａｎ）の方法（Ｊ、 Ｍｏ！、 Ｂｉｏｌ。
ができろ。好ましい宿主には、イー・コリ例えばイー・
コリＤＨＩが含まれ、この宿主は、ハナハン（Ｈａｎａ
ｈａｎ）の方法（Ｊ、 Ｍｏ！、 Ｂｉｏｌ。
１９３３年、１６６＠、５６７〜５８０頁）によって形
質転換することができる。
質転換することができる。
オリゴマイシン耐性をコートするＤＮＡ配列を含むライ
ブラリー内のクローンは、適切なプローブを用いる標準
の雑種形成法（マニアティスら、前記文献 参照）によ
り同定できる。
ブラリー内のクローンは、適切なプローブを用いる標準
の雑種形成法（マニアティスら、前記文献 参照）によ
り同定できる。
プローブとしては、少なくとら１３の塩基を有するオリ
ゴデオキシヌクレオチドが適切であり、その配列は、オ
リゴマイシン耐性をコードする遺伝子の公知の配列の一
部分に相捕的もしくは部分的に相捕的である。
ゴデオキシヌクレオチドが適切であり、その配列は、オ
リゴマイシン耐性をコードする遺伝子の公知の配列の一
部分に相捕的もしくは部分的に相捕的である。
オリゴマイシン耐性をコードするＤＮＡ配列が、ＡＴＰ
−シンターゼの変化されｆニデユランス−９蛋白質をコ
ードする遺伝子を有する際、プローブとしては、エイ、
ニデユランスのオリゴマイシン耐性遺伝子（ｏｌｉＣ３
１）の公知の配列の一部と相捕的であるものが適切であ
る（ワードおよびターナ、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、 、 １１８６年、２０５巻、３３１〜３３８頁
）。一方ブローブは、適切なベクターに任意に取りこま
れうる全ｏ１ｉＣ３１遺伝子を含んでいてもよい。
−シンターゼの変化されｆニデユランス−９蛋白質をコ
ードする遺伝子を有する際、プローブとしては、エイ、
ニデユランスのオリゴマイシン耐性遺伝子（ｏｌｉＣ３
１）の公知の配列の一部と相捕的であるものが適切であ
る（ワードおよびターナ、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎ
ｅｔ、 、 １１８６年、２０５巻、３３１〜３３８頁
）。一方ブローブは、適切なベクターに任意に取りこま
れうる全ｏ１ｉＣ３１遺伝子を含んでいてもよい。
好ましいプローブは、エイ・ニデユランスのプレサブユ
ニット９ＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＹ１１である
（ワードら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 。
ニット９ＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＹ１１である
（ワードら、Ｍｏ１． Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 。
１９８６年、２０２巻、２６５−２７０頁）。
このプローブは、相補ＤＮＡを含有するライブラリィ中
のクローンが容易に同定できるように標識をつけること
は理解されるであろう。
のクローンが容易に同定できるように標識をつけること
は理解されるであろう。
通常プローブは放射性標識がなされ、例えば３２ｐが用
いられる。
いられる。
放射性標識は、標準の方法、例えばニックトランスレー
ジタン法を含む５゛−未満または３″−末端の標識法が
ある。
ジタン法を含む５゛−未満または３″−末端の標識法が
ある。
ライブラリー内のクローンで”正の”
（“ｐｏｓｉｔｉｖｅ”Ｊと称呼されるもの（すなわち
、そのコビイはプローブと雑種形成することが見出され
ている）は単離することができるが、オリゴマイシン耐
性をコードするＤＮＡは、これから、１以上の適切な制
限酵素で切り出すことによって得られろ。
、そのコビイはプローブと雑種形成することが見出され
ている）は単離することができるが、オリゴマイシン耐
性をコードするＤＮＡは、これから、１以上の適切な制
限酵素で切り出すことによって得られろ。
この発明の態様を、下記図面を参照してさらに明確にす
る。
る。
第１ （ａ）図は、ＤＮＡ（Ｔ）［ビー・クリゾゲヌム
ＣＭｌ ３１４６５２の染色体ＤＮＡの１片＋ラムダ
ＥＭＢＬ４ベクターＤＮＡ（全長４５ｋｂ）コの制限酵
素地図・ 第１（ｂ）図は、ＤＮＡ（ＩＩ）［ＤＮＡ（１）由来の
、１２．８ｋｂ Ｈｉｎｄ ｍフラグメント］の制限酵
素地図：第１ （Ｃ）図は、ＤＮＡ（ＩＩＩ）［ＤＮＡ
（ＩＩ）由来の９．３ｋｂの旧ｎｄ ＩＩ［−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメント］の制限酵素地図： 第１ （ｄ）図は、ＤＮＡ（ｆｆ）［ＤＮＡ（［１）ま
たはＤ Ｎ Ａ （Ｉ］Ｉ）由来の３．８ｋｂの旧ｎｄ
Ｉ［ｒ−Ｒａｍ旧フラフラグメンの制限酵素地図； 第１ （ｅ）図は、ＤＮＡ（［［）とｐＵＣ９から構築
されたプラスミドｐＰＯＬｌの制限酵素地図：第１（ｒ
）図は、ＤＮＡ（［［）とｐＵＣ９テ構築されたプラス
ミドｐＰＯＬ６の制限酵素地図：第１（ｇ）図は、ＤＮ
Ａ（ＩＶ）とｐＵＣ９で構築されたプラスミドｐ［！ｃ
８の制限酵素地図：第２図は、五つのρＰＯＬＩ形質
転換細胞（１〜５号レーン）と、ＥｃｏＲＩで切断され
ｐＵＣ９でプローブされたピー・クリゾゲヌム ＣＭｌ
３１７７３４ （６号レーン）との全Ｄ Ｎ Ａのサ
ザン法による泳動パターン図； 第３（ａ）図は、染色体のＢａｎ旧部位（垂直矢印）と
コーディング領域（水平矢印）を示すイソペニシリンＮ
シンテターゼ遺伝子（Ｖ）の染色体領域の制限酵素地図
： 第３（ｂ）図は、（Ｖ）の３．２ｋｂのＸｂｏｌフラグ
メントをｐｕｃ ９の５ａｌｒ部位にクローン化するこ
とによって構築したプラスミドｐＣＹＸ４の制限酵素地
図；第３（Ｃ）図は、ｐＰＯＬ６にサブクローン化され
たｐＣＹＸ４挿入部のＲｃｏＲＩフラグメントから構築
し几プラスミドｐｐｏ＋＋の制限酵素地図： 第４図は、下記の各種試料のサザン法による電気泳動パ
ターン図 （以下余白） ＰＰ０１１形質転換細胞＋ｌ１４８ 〃〃コ１１４４ 〃〃：１１４３ ／／ ／／ ： ｈＩ１１旧で
切断さｈたＩ １４２” ” ：Ｘｈｏｌで
切断さ猷１２４２１〃〃： ＢａｍＨＩ ’
Ｅ ２４２１〃 〃 ： Ｅ’ｃｏ
ＲＩ ’ Ｉ ２４２１ＸｈｏＩで切断
さ８たビー・クリゾゲスムＣ旧３１７７３４Ｄ Ｎ Ａ
ＢａｍＨＩ ／／ ／／ ｔｔＥ
ｃＯＲＩ 〃 ／／
／／以上は第３（ａ）図に示すイソペニシリ
ンシンテターゼをコードする領域（Ｖ）を含有するｐＣ
ＹＸ４ ＥｃｏＲＩフラグメントでプローブされた。
ＣＭｌ ３１４６５２の染色体ＤＮＡの１片＋ラムダ
ＥＭＢＬ４ベクターＤＮＡ（全長４５ｋｂ）コの制限酵
素地図・ 第１（ｂ）図は、ＤＮＡ（ＩＩ）［ＤＮＡ（１）由来の
、１２．８ｋｂ Ｈｉｎｄ ｍフラグメント］の制限酵
素地図：第１ （Ｃ）図は、ＤＮＡ（ＩＩＩ）［ＤＮＡ
（ＩＩ）由来の９．３ｋｂの旧ｎｄ ＩＩ［−ＥｃｏＲ
Ｉフラグメント］の制限酵素地図： 第１ （ｄ）図は、ＤＮＡ（ｆｆ）［ＤＮＡ（［１）ま
たはＤ Ｎ Ａ （Ｉ］Ｉ）由来の３．８ｋｂの旧ｎｄ
Ｉ［ｒ−Ｒａｍ旧フラフラグメンの制限酵素地図； 第１ （ｅ）図は、ＤＮＡ（［［）とｐＵＣ９から構築
されたプラスミドｐＰＯＬｌの制限酵素地図：第１（ｒ
）図は、ＤＮＡ（［［）とｐＵＣ９テ構築されたプラス
ミドｐＰＯＬ６の制限酵素地図：第１（ｇ）図は、ＤＮ
Ａ（ＩＶ）とｐＵＣ９で構築されたプラスミドｐ［！ｃ
８の制限酵素地図：第２図は、五つのρＰＯＬＩ形質
転換細胞（１〜５号レーン）と、ＥｃｏＲＩで切断され
ｐＵＣ９でプローブされたピー・クリゾゲヌム ＣＭｌ
３１７７３４ （６号レーン）との全Ｄ Ｎ Ａのサ
ザン法による泳動パターン図； 第３（ａ）図は、染色体のＢａｎ旧部位（垂直矢印）と
コーディング領域（水平矢印）を示すイソペニシリンＮ
シンテターゼ遺伝子（Ｖ）の染色体領域の制限酵素地図
： 第３（ｂ）図は、（Ｖ）の３．２ｋｂのＸｂｏｌフラグ
メントをｐｕｃ ９の５ａｌｒ部位にクローン化するこ
とによって構築したプラスミドｐＣＹＸ４の制限酵素地
図；第３（Ｃ）図は、ｐＰＯＬ６にサブクローン化され
たｐＣＹＸ４挿入部のＲｃｏＲＩフラグメントから構築
し几プラスミドｐｐｏ＋＋の制限酵素地図： 第４図は、下記の各種試料のサザン法による電気泳動パ
ターン図 （以下余白） ＰＰ０１１形質転換細胞＋ｌ１４８ 〃〃コ１１４４ 〃〃：１１４３ ／／ ／／ ： ｈＩ１１旧で
切断さｈたＩ １４２” ” ：Ｘｈｏｌで
切断さ猷１２４２１〃〃： ＢａｍＨＩ ’
Ｅ ２４２１〃 〃 ： Ｅ’ｃｏ
ＲＩ ’ Ｉ ２４２１ＸｈｏＩで切断
さ８たビー・クリゾゲスムＣ旧３１７７３４Ｄ Ｎ Ａ
ＢａｍＨＩ ／／ ／／ ｔｔＥ
ｃＯＲＩ 〃 ／／
／／以上は第３（ａ）図に示すイソペニシリ
ンシンテターゼをコードする領域（Ｖ）を含有するｐＣ
ＹＸ４ ＥｃｏＲＩフラグメントでプローブされた。
第１図と３図において、制限部位の全部は示していない
。
。
上記のことから、この発明の特に好ましい態様として、
ビー・クリゾゲヌム ＣＭ＋ ３１４６５２染色体ＤＮ
ＡのラムダＥＭＢＬ４ライブラリーがｐＭｆｌｌでプロ
ーブされるということが分かる。その方法で得られろ価
値のある１片のＤＮＡはｏｆ ｉＣ３と命名され、第１
（ａ）図に示す制限部位の配置を育する。
ビー・クリゾゲヌム ＣＭ＋ ３１４６５２染色体ＤＮ
ＡのラムダＥＭＢＬ４ライブラリーがｐＭｆｌｌでプロ
ーブされるということが分かる。その方法で得られろ価
値のある１片のＤＮＡはｏｆ ｉＣ３と命名され、第１
（ａ）図に示す制限部位の配置を育する。
したがって、この発明は、他のｇｌとして、ＤＮＡ（ｔ
）の１片、またはオリゴマイシン耐性をコードする完全
な遺伝子を含有するＤＮＡ（［）の制限フラグメント（
但しこのＤＮＡは第［（ａ）図に示す制限部位の配置を
有する）を提供する乙のである。
）の１片、またはオリゴマイシン耐性をコードする完全
な遺伝子を含有するＤＮＡ（［）の制限フラグメント（
但しこのＤＮＡは第［（ａ）図に示す制限部位の配置を
有する）を提供する乙のである。
この発明の方法において、オリゴマイシン耐性をコード
するＤＮＡとして、第１ （ａ）図に示す全長のＤＮＡ
（１）を用いることは不便なことが多いと考えられる。
するＤＮＡとして、第１ （ａ）図に示す全長のＤＮＡ
（１）を用いることは不便なことが多いと考えられる。
したがって、オリゴマイシン耐性をコードする完全な遺
伝子をもっているならば、ＤＮＡ（ｒ）の制限フラグメ
ントを用いるのが好ましい。
伝子をもっているならば、ＤＮＡ（ｒ）の制限フラグメ
ントを用いるのが好ましい。
好ましい制限フラグメントとしては、第１ （ｂ）図に
示す制限部位の配置を有する１２．８ｋｂの旧ｎｄ■フ
ラグメント（ＩＩ）、第１ （ｃ）図に示す９．３ｋｂ
の）ｆｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、およ
び第１（ｄ）図に示す３．８ｋｂの旧ｎｄ ｌ−Ｂａｍ
旧フラグメントが挙げられる。
示す制限部位の配置を有する１２．８ｋｂの旧ｎｄ■フ
ラグメント（ＩＩ）、第１ （ｃ）図に示す９．３ｋｂ
の）ｆｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント、およ
び第１（ｄ）図に示す３．８ｋｂの旧ｎｄ ｌ−Ｂａｍ
旧フラグメントが挙げられる。
さらにこの発明の別の１３様として、この発明：よ、Ｄ
ＮＡ（ｒ）、またはオリゴマイシン耐性をコードする完
全な遺伝子を有するＤＮＡ（１）の制限フラグメントか
らなる組換え体ベクターを提供するものである。
ＮＡ（ｒ）、またはオリゴマイシン耐性をコードする完
全な遺伝子を有するＤＮＡ（１）の制限フラグメントか
らなる組換え体ベクターを提供するものである。
この発明の組換え体ベクターの個々の例：土次のとおり
である。
である。
（ａ）ｐＰＯＬｌ ： ｐＵＣ９の旧ｎｄｌ１１部泣に
上記定義のようにクローン化されたＤＮＡフラグメント
（ＩＩ）で構築された１５．５ｋｂのプラスミド［第１
（ｅ）図参照］： （ｂ）ｐＰＯＬ６ ： ｐＵＣ９のＥｃｏＲ１部位に上
記定義のようにクローン化されたＤＮＡフラグメント（
Ｉ［［）で構築された１２ｋｂのプラスミド［第１（「
）図参照］；および （ｃ）ｐＰＯＬ８ ： ｐＵＣ９のＥｃｏＲ１部位に上
記定義のようにクローン化されたＤＮＡフラグメント（
■）で構築された６、５ｋｂのプラスミド［第１ （ｇ
）図参照コ。
上記定義のようにクローン化されたＤＮＡフラグメント
（ＩＩ）で構築された１５．５ｋｂのプラスミド［第１
（ｅ）図参照］： （ｂ）ｐＰＯＬ６ ： ｐＵＣ９のＥｃｏＲ１部位に上
記定義のようにクローン化されたＤＮＡフラグメント（
Ｉ［［）で構築された１２ｋｂのプラスミド［第１（「
）図参照］；および （ｃ）ｐＰＯＬ８ ： ｐＵＣ９のＥｃｏＲ１部位に上
記定義のようにクローン化されたＤＮＡフラグメント（
■）で構築された６、５ｋｂのプラスミド［第１ （ｇ
）図参照コ。
ブダペスト条約の規定に基づいて、ｐｐｏｔ、ａで形質
転換されたイー・コリ（ＣＳＩ菌株）は、英国、スコツ
トランド、アバディーンにあるナシジナルコレクション
ズ オブ インダストリアル アンド マリン バクテ
リア（ＮａＬｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｒ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃ
ｊｅｒｉａ）に、１９８７年７月２２日付けで、寄託番
号： ＮＣＩＢ １２５１０号にて寄託した。
転換されたイー・コリ（ＣＳＩ菌株）は、英国、スコツ
トランド、アバディーンにあるナシジナルコレクション
ズ オブ インダストリアル アンド マリン バクテ
リア（ＮａＬｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｒ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ＭａｒｉｎｅＢａｃ
ｊｅｒｉａ）に、１９８７年７月２２日付けで、寄託番
号： ＮＣＩＢ １２５１０号にて寄託した。
オリゴマイシン耐性をコードする相同ＤＮＡ配列に加え
て、この発明の方法に使用する適切な組換え体ベクター
は、通常、形質転換されたビー・クリゾゲヌム宿主が産
出するのを望まれている１以上の蛋白質をコードする１
以上の別のクローン化された遺伝子を有している。この
ようなベクターはこの発明の別の態様を形成する。
て、この発明の方法に使用する適切な組換え体ベクター
は、通常、形質転換されたビー・クリゾゲヌム宿主が産
出するのを望まれている１以上の蛋白質をコードする１
以上の別のクローン化された遺伝子を有している。この
ようなベクターはこの発明の別の態様を形成する。
さらに別の態様としてこの発明は、下記の工程：
（ａ）ビー・クリゾゲヌム宿主と、
ｉ）外部の遺伝子とｉｉ）オリゴマイノン耐性をコード
する相同Ｄ Ｎ Ａ配列とからなる組換え体べフターと
を、形質転換条件下で混合し、（ｂ）オリゴマイシン耐
性コロニーを選択し、および （ｃ）前記遺伝子を、宿主内で発現させることからなる
ピー・クリゾゲヌム内で外部の遺伝子を発現させる方法
を提供するものである。
する相同Ｄ Ｎ Ａ配列とからなる組換え体べフターと
を、形質転換条件下で混合し、（ｂ）オリゴマイシン耐
性コロニーを選択し、および （ｃ）前記遺伝子を、宿主内で発現させることからなる
ピー・クリゾゲヌム内で外部の遺伝子を発現させる方法
を提供するものである。
（以下余白）
上記の“外部の遺伝子”という用語は、この明細書に記
載する形質転換法によってピー・クリゾゲヌムに導入さ
れる追加の遺伝子（相同もしくは異種の）を表示するの
に用いる。
載する形質転換法によってピー・クリゾゲヌムに導入さ
れる追加の遺伝子（相同もしくは異種の）を表示するの
に用いる。
追加のクローン化された遺伝子は、標準のクローン化技
術によって、この発明の方法に用いるのに適切な組換え
体ベクターに導入される。かような遺伝子は、オリゴマ
イシン耐性をコードするＤ Ｎ Ａ配列が取りこまれる
前に、前記のようにして適切なベクターにクローン化さ
れる。しかし、これらの１以上の追加のクローン化され
た遺伝子は、オリゴマイシン耐性をコードするＤＮＡ配
列を有する組換え体ベクターに導入するのが有利である
。
術によって、この発明の方法に用いるのに適切な組換え
体ベクターに導入される。かような遺伝子は、オリゴマ
イシン耐性をコードするＤ Ｎ Ａ配列が取りこまれる
前に、前記のようにして適切なベクターにクローン化さ
れる。しかし、これらの１以上の追加のクローン化され
た遺伝子は、オリゴマイシン耐性をコードするＤＮＡ配
列を有する組換え体ベクターに導入するのが有利である
。
上記の組換え体ベクター内に存在してもよい追加のクロ
ーン化された遺伝子の個々の例は、ビイ・クリゾゲヌム
のイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子である。
ーン化された遺伝子の個々の例は、ビイ・クリゾゲヌム
のイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子である。
イソペニシリンＮシンターゼ遺伝子を取込んでいる具体
的な組換え体ベクターは、ｐＰＯＩ ｌと命名され、第
３ （ｃ’）図に示す制限部位の配置を有する。
的な組換え体ベクターは、ｐＰＯＩ ｌと命名され、第
３ （ｃ’）図に示す制限部位の配置を有する。
このイソペニシリンＮシンターゼ遺伝子は、セファロス
ポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ
ｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ） ［サムソンら、（Ｓａ
ｍｓｏｎ ｅｔ ａｔ）、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、
３１８＠、１９１−１９４頁コまたはピー・クリゾゲヌ
ム［カールらＣＣａｒｒ ｅｔ ａｉ）、Ｇｅｎｅ、１
９８６年、４８巻、２５７−２６６頁］のイソペニシリ
ンＮ シンテターゼ遺伝子の公開された配列由来の合成
オリゴヌクレオチドを用いて、ピー・クリゾゲヌムＤＮ
Ａのライブラリィをプローブすることによって単離する
ことができる。
ポリウム・アクレモニウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ
ｕｍ ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ） ［サムソンら、（Ｓａ
ｍｓｏｎ ｅｔ ａｔ）、Ｎａｔｕｒｅ、１９８５年、
３１８＠、１９１−１９４頁コまたはピー・クリゾゲヌ
ム［カールらＣＣａｒｒ ｅｔ ａｉ）、Ｇｅｎｅ、１
９８６年、４８巻、２５７−２６６頁］のイソペニシリ
ンＮ シンテターゼ遺伝子の公開された配列由来の合成
オリゴヌクレオチドを用いて、ピー・クリゾゲヌムＤＮ
Ａのライブラリィをプローブすることによって単離する
ことができる。
上記のことから明らかなように、この発明は、形質転換
された菌株のゲノムが、その中に、（ａ）オリゴマイシ
ン耐性をコードする遺伝子からなる相同ＤＮＡ配列と（
ｂ）ピー・クリゾゲヌム内で発現しうる追加の遺伝子と
を組込まれていることを特徴とする、オリゴマイシン含
有培地内で選択可能なピー・クリゾゲヌムの形質転換さ
れた菌株を提供するものである。
された菌株のゲノムが、その中に、（ａ）オリゴマイシ
ン耐性をコードする遺伝子からなる相同ＤＮＡ配列と（
ｂ）ピー・クリゾゲヌム内で発現しうる追加の遺伝子と
を組込まれていることを特徴とする、オリゴマイシン含
有培地内で選択可能なピー・クリゾゲヌムの形質転換さ
れた菌株を提供するものである。
追加遺伝子として好ましいのは、上記のように、適切に
単離され、ベクター内でクローン化されたピー・クリゾ
ゲヌムのイソペニシリンＮ シンテターゼ遺伝子である
。
単離され、ベクター内でクローン化されたピー・クリゾ
ゲヌムのイソペニシリンＮ シンテターゼ遺伝子である
。
この発明の方法に使用する適切な形質転換条件としては
、当該技術分野で知られた条件が挙げられる。例えば、
形質転換は、塩化カルシウムとポリエチレングリコール
を含有する培地中で適切に行うことができる。
、当該技術分野で知られた条件が挙げられる。例えば、
形質転換は、塩化カルシウムとポリエチレングリコール
を含有する培地中で適切に行うことができる。
形質転換されるべきピー・クリゾゲヌムの菌株は、一般
に、１μ９のＤＮＡ当り１〜５回の頻度でオリゴマイシ
ン耐性に形質転換される（生存プロトプラスト当りｌロ
ー５〜ｌ０−１形質耘換菌昧）。
に、１μ９のＤＮＡ当り１〜５回の頻度でオリゴマイシ
ン耐性に形質転換される（生存プロトプラスト当りｌロ
ー５〜ｌ０−１形質耘換菌昧）。
形質転換されたプロトプラストを選択するために、選択
は、生有するプロトプラストすべてを再生させるため、
通常、ブレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）してから約２
０時間後まで遅らせる。
は、生有するプロトプラストすべてを再生させるため、
通常、ブレーティング（ｐｌａｔｉｎｇ）してから約２
０時間後まで遅らせる。
次いで、選択が、オリゴマイシンを一般に約３μ９／Ｉ
Ｑの濃度で含有する培地で覆うことによって行われる。
Ｑの濃度で含有する培地で覆うことによって行われる。
培毘は、通常、約３０℃で５〜８日間続けられる。形質
転換菌株を選択し、才リゴマイシンの入ったプレートに
画線することによって精製する。
転換菌株を選択し、才リゴマイシンの入ったプレートに
画線することによって精製する。
（ニ）実施ρ１
下記実施例によってこの発明を説明するがこの発明を限
定する乙のではない。
定する乙のではない。
以下に述べる実施例で用いられるオ科と方法は次のとお
りである。
りである。
（ａ）菌株類
ピー・クリゾゲヌム ＣＭＩ ３１７７３４ ：オリゴ
マイシン感受性のニコチンアミド要求菌昧、ビー・クリ
ゾゲヌム ＣＭＩ ３１４６５２ ：ピー・クリゾゲヌ
ムＣＭ＋ ３１７７３４由来の核オリゴマイシン耐性突
然変位体、 エンエリヒア・コリ画法類： ＤＨＩ ｒｅｃＡ、 ｐ
ａ！Ａ１ｈｓｒ、 ｈｓｍ＋、ｅｎｄｏ １Ｂ、 ｒｅ
ｌ＾１がハナハンｄ（Ｊ、Ｍｏｌ。
マイシン感受性のニコチンアミド要求菌昧、ビー・クリ
ゾゲヌム ＣＭＩ ３１４６５２ ：ピー・クリゾゲヌ
ムＣＭ＋ ３１７７３４由来の核オリゴマイシン耐性突
然変位体、 エンエリヒア・コリ画法類： ＤＨＩ ｒｅｃＡ、 ｐ
ａ！Ａ１ｈｓｒ、 ｈｓｍ＋、ｅｎｄｏ １Ｂ、 ｒｅ
ｌ＾１がハナハンｄ（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏ１、１９８３年、１６６巻、５５７−５８０頁）
にしたがって形質転換された。ＭＣ１０２２ａｒａＤ１
３９、（ａｒａ １ｅｕ）７６９７、（ｌａｃＺ）Ｍ２
Ｓ、ｇａｌＶ、 ｇａｌＫ、５ＬｒＡ ［キャサダバン
とコーエン（Ｃａｓａｄａｂａｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ
）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１、。
にしたがって形質転換された。ＭＣ１０２２ａｒａＤ１
３９、（ａｒａ １ｅｕ）７６９７、（ｌａｃＺ）Ｍ２
Ｓ、ｇａｌＶ、 ｇａｌＫ、５ＬｒＡ ［キャサダバン
とコーエン（Ｃａｓａｄａｂａｎ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ
）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ１、。
１９８０年、１３８巻、１７９−２０７頁コはＰｕＯ２
ととらに用いた［ビエラとメシング、Ｇｅｎｅ、 １９
８２年、１９巻、２５９−２６８頁コ 。
ととらに用いた［ビエラとメシング、Ｇｅｎｅ、 １９
８２年、１９巻、２５９−２６８頁コ 。
（ｂ）プラスミド類
プラスミドｐ Ｗ Ｍ Ｉ Ｉをブロービングに用いた
が、これはアスペルギルス・ニデユランス（ワードら、
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 １９８６年、２０２巻
、２６５−２７０頁）のｏｌｉＣ３Ｌ遺伝子を含有する
ＤＮＡのフラグメントを持っている。
が、これはアスペルギルス・ニデユランス（ワードら、
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、 １９８６年、２０２巻
、２６５−２７０頁）のｏｌｉＣ３Ｌ遺伝子を含有する
ＤＮＡのフラグメントを持っている。
（ｃ）ＤＮＡの単離と処理
菌糸からのビー・クリゾゲヌムＤ Ｎ Ａの全抽出法お
よび大規模なプラスミド製造法は、バランスらＢｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、 、 １
９８３年、１１２巻、２８４２８９頁に記載されている
方法を用いた。ＤＮＡの処理には、小規模のプラスミド
単Ｍ法、アガロースゲルからのフラグメントの再単離法
、連結法、サザン法およびラムダライブラリィ・プラー
ク雑種形成法を含む標準法を用いた［マニアティスら−
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａ。１０ｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９ｇ２年］。
よび大規模なプラスミド製造法は、バランスらＢｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、 、 １
９８３年、１１２巻、２８４２８９頁に記載されている
方法を用いた。ＤＮＡの処理には、小規模のプラスミド
単Ｍ法、アガロースゲルからのフラグメントの再単離法
、連結法、サザン法およびラムダライブラリィ・プラー
ク雑種形成法を含む標準法を用いた［マニアティスら−
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂ
ｏｒａ。１０ｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（１９ｇ２年］。
遺伝子バンクの構築用に、ピー・クリゾゲヌムＣＭＩ
３１４６５２由来の全ＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分的に切
断し、大きさの分画を行い、１０〜２０ｋｂのフラグメ
ントを得た。これらのフラグメントをラムダベクターＥ
’１ｌＢＬ４のＢａｆｆ１旧クロ一ニング部位に挿入し
た（フリブシャウフら、Ｊ、３１ｏ１．８ｉｏ１． 、
１９８３年、１７０＠、８２７−８４２頁）。
３１４６５２由来の全ＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分的に切
断し、大きさの分画を行い、１０〜２０ｋｂのフラグメ
ントを得た。これらのフラグメントをラムダベクターＥ
’１ｌＢＬ４のＢａｆｆ１旧クロ一ニング部位に挿入し
た（フリブシャウフら、Ｊ、３１ｏ１．８ｉｏ１． 、
１９８３年、１７０＠、８２７−８４２頁）。
（ｄ）べ二ンリウム属菌株の培養と処理ペニシリウム属
菌株の標準培養基を、画法によって適当ζ栄養を補足し
て用いた。オリゴマイシン［ジグ７−ケミカル（昧）（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ＃１ｉｃａｌ Ｃｏ。
菌株の標準培養基を、画法によって適当ζ栄養を補足し
て用いた。オリゴマイシン［ジグ７−ケミカル（昧）（
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ＃１ｉｃａｌ Ｃｏ。
Ｌｔｄ、）、米国、セントルイス］は、エタノール中に
１０００ 音ａ縮したものを添加した。分生子のコレク
ションとアスペルギルス培地［完全アスペルギルス培地
（Ａ ＣＭ ）および最少アスペルギルス培地（ＡＭＸ
ｔ）］は、ローランズとターナ−がＭｏｌ。
１０００ 音ａ縮したものを添加した。分生子のコレク
ションとアスペルギルス培地［完全アスペルギルス培地
（Ａ ＣＭ ）および最少アスペルギルス培地（ＡＭＸ
ｔ）］は、ローランズとターナ−がＭｏｌ。
Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、 、 １９７２年、１５４巻、３
１１−３１７頁に記載したのとおζじらのである。
１１−３１７頁に記載したのとおζじらのである。
（ｅ）ペニシリウム属菌株の形質転換
新鮮なペニシリウム属菌株の胞子の懸濁液（２Ｒａ）を
、Ｉ（１！の：Ｔ：カルフラスコ内（Ｄ ２００ｚｆ！
〕Ａ ＭＭに添加し２５℃で約１６時間振盪した。得ら
れた発芽している分生子と若い菌糸を遠心分離法で集め
（卓上遠心分離器） 、０．９Ｍ ！１ａｃＩで洗浄し
、５Ｈ／ｚ（ｌのノボチム２３４ （Ｎｏｖｏｚｍ ２
３４） ［ノボ・インダストリーズ社（Ｎｏｖａ １
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＞、デンマーク、バグスパートコを
含有する１５．ｖｃの０．９ＭＮａＣＱ中に再度懸濁さ
せ、３０℃で１〜１．５時間ゆるやかに振盪し、その際
に、プロトプラスト化の程度を、浸透圧で溶菌された試
料の顕微鏡試験法によって測定した。十分ｍのプロトプ
ラスト（４０〜９０％）を形成させた後、ナイロンのフ
ィルタークロス［ギヤレンカンプ（Ｇａｌｌｅｎｋａｍ
ｐ）、ＧＭＸ−５００Ｊ］とシンタートガラス（多孔度
１）で濾過し、０．９ＭＮａＣＣで２回、ＩＭソルビト
ール＋５０ｍＭＣａＣＲｚで１回洗浄し、ＩＭソルビト
ール＋５０ｍＭＮａＣｔ！！中に０，５−５ｘ １０’
／ＭＱのａ変で可変＠濁し、５０μＱづつに分割した。
、Ｉ（１！の：Ｔ：カルフラスコ内（Ｄ ２００ｚｆ！
〕Ａ ＭＭに添加し２５℃で約１６時間振盪した。得ら
れた発芽している分生子と若い菌糸を遠心分離法で集め
（卓上遠心分離器） 、０．９Ｍ ！１ａｃＩで洗浄し
、５Ｈ／ｚ（ｌのノボチム２３４ （Ｎｏｖｏｚｍ ２
３４） ［ノボ・インダストリーズ社（Ｎｏｖａ １
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＞、デンマーク、バグスパートコを
含有する１５．ｖｃの０．９ＭＮａＣＱ中に再度懸濁さ
せ、３０℃で１〜１．５時間ゆるやかに振盪し、その際
に、プロトプラスト化の程度を、浸透圧で溶菌された試
料の顕微鏡試験法によって測定した。十分ｍのプロトプ
ラスト（４０〜９０％）を形成させた後、ナイロンのフ
ィルタークロス［ギヤレンカンプ（Ｇａｌｌｅｎｋａｍ
ｐ）、ＧＭＸ−５００Ｊ］とシンタートガラス（多孔度
１）で濾過し、０．９ＭＮａＣＣで２回、ＩＭソルビト
ール＋５０ｍＭＣａＣＲｚで１回洗浄し、ＩＭソルビト
ール＋５０ｍＭＮａＣｔ！！中に０，５−５ｘ １０’
／ＭＱのａ変で可変＠濁し、５０μＱづつに分割した。
ｌ−５μ９のＤＮＡ（１０ｍＭ）リス−塩酸＋１ｍＭＥ
ＤＴＡ、 ｐＨ７，５の５ｕＱまでに含有されている）
を添加し、次いで、２５％ＰＥＧ６０００＋５０ｍＭＣ
ａＣＬ÷ｌ０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７，５含有の新しく
作製し濾過滅菌された溶液１２．５μジを添加し、緩和
に混合した。水上で２０分間培養した後、訂記ＰＥＧ溶
液０．５；ｉ（ｌ添加した。室温で５分間培養した後、
ｌスｅのＩＭソルビトール＋５０１１１ＭＣａＣ（ｚを
添加し、反転させて混合した。各分割液を０．９ＭＮａ
Ｃ７７含佇の溶融Ａ ＣＭのｌＯスａと混合し、これで
ＡＣＭプレート上を覆った。
ＤＴＡ、 ｐＨ７，５の５ｕＱまでに含有されている）
を添加し、次いで、２５％ＰＥＧ６０００＋５０ｍＭＣ
ａＣＬ÷ｌ０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７，５含有の新しく
作製し濾過滅菌された溶液１２．５μジを添加し、緩和
に混合した。水上で２０分間培養した後、訂記ＰＥＧ溶
液０．５；ｉ（ｌ添加した。室温で５分間培養した後、
ｌスｅのＩＭソルビトール＋５０１１１ＭＣａＣ（ｚを
添加し、反転させて混合した。各分割液を０．９ＭＮａ
Ｃ７７含佇の溶融Ａ ＣＭのｌＯスａと混合し、これで
ＡＣＭプレート上を覆った。
３０°Ｃで２０時間培養後、プレートを３μ９／１シオ
リゴマイシン含宵のＡＣｈ・Ｅ２５ｘＱて覆った。培養
を３０℃でさらに５〜８時間続けた。その時形質転換さ
れたコロニイが寒天の表面に分生子を生成しはじめる。
リゴマイシン含宵のＡＣｈ・Ｅ２５ｘＱて覆った。培養
を３０℃でさらに５〜８時間続けた。その時形質転換さ
れたコロニイが寒天の表面に分生子を生成しはじめる。
形質転換細胞を、オリゴマイシン含有のプレート上に画
線することによって精製した。
線することによって精製した。
アスペルギルス・ニデユランス ブレーサブユニット９
ＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＹｌｌを、オリゴマイ
シン耐性ピー・クリゾゲヌム菌１４ ＣＭ＋３１４６５
２由来の全ＤＮＡのラムダＥＭＢＬ４ライブラリーのプ
ラークに対するプローブとして用いた。約７３％の相同
性を有する配列の雑種形成を許容するストリンジエンシ
イ（５ｔｒｉｒ＋ｇｅｎｃｙ） （５５℃、 ｌＸ５Ｓ
Ｃ＞を用いたところ、６箇のプラーク（全部で約２０，
０００６）が、均一な弱いバックグランドに対して強く
雑種形成した。なおこの頻度は、雑種形成が単一のコピ
イ核遺伝子に対する乙のであると仮定した場合に予想さ
れる頻度と一致している。
ＤＮＡを含有するプラスミドｐＭＹｌｌを、オリゴマイ
シン耐性ピー・クリゾゲヌム菌１４ ＣＭ＋３１４６５
２由来の全ＤＮＡのラムダＥＭＢＬ４ライブラリーのプ
ラークに対するプローブとして用いた。約７３％の相同
性を有する配列の雑種形成を許容するストリンジエンシ
イ（５ｔｒｉｒ＋ｇｅｎｃｙ） （５５℃、 ｌＸ５Ｓ
Ｃ＞を用いたところ、６箇のプラーク（全部で約２０，
０００６）が、均一な弱いバックグランドに対して強く
雑種形成した。なおこの頻度は、雑種形成が単一のコピ
イ核遺伝子に対する乙のであると仮定した場合に予想さ
れる頻度と一致している。
これらのクローンのうち一つのλｏｌｉＣ３について、
制限酵素地図を作成して分析した。この地図を第１ （
ａ）図に示す。
制限酵素地図を作成して分析した。この地図を第１ （
ａ）図に示す。
ラムダＤＮＡのセグメントを育する１２ｋｂの旧ｎｄ■
フラグメント［第１ （ｂ）図］を、ｐＵＣ９の中にサ
ブクローン化してｐＰＯＬｌ ［第１図（ｅ）図］を形
成さ仕た。より小さなプラスミドｐＰＯＬ６とＰＯＬ８
を、９．３ｋｂの旧ｎｄ ｍ −ＥｃｏＲＩフラグメン
ト［第１ （ｆ）図〕と３．１！ｋｂの旧ｎｄ ＩＩＩ
−Ｂａｍ旧フラグメント［第１（ｇ）図コそれぞれをサ
ブクローン化することによって作製した。
フラグメント［第１ （ｂ）図］を、ｐＵＣ９の中にサ
ブクローン化してｐＰＯＬｌ ［第１図（ｅ）図］を形
成さ仕た。より小さなプラスミドｐＰＯＬ６とＰＯＬ８
を、９．３ｋｂの旧ｎｄ ｍ −ＥｃｏＲＩフラグメン
ト［第１ （ｆ）図〕と３．１！ｋｂの旧ｎｄ ＩＩＩ
−Ｂａｍ旧フラグメント［第１（ｇ）図コそれぞれをサ
ブクローン化することによって作製した。
（ｂ）ペニシリウム属菌株の形質転換
ピー・クリゾゲヌムＣＭ＋ ３１７７３４が、１〜５７
μｇＤＮＡの頻度でオリゴマイシン含有にして形質転換
し、生育力のあるプロトプラスト当り１０−５−１０−
”の形質転換細胞を得た。試験された形質転換菌株はす
べて、選択した培地に継代培養した際、オリゴマインン
に対する耐性が増大した。
μｇＤＮＡの頻度でオリゴマイシン含有にして形質転換
し、生育力のあるプロトプラスト当り１０−５−１０−
”の形質転換細胞を得た。試験された形質転換菌株はす
べて、選択した培地に継代培養した際、オリゴマインン
に対する耐性が増大した。
形質転換されたプロトプラストの選択は、ブレーティン
グしてから約２０時間後まで遅らせて行い、オリゴマイ
シン含有の培地で覆う前に生育可能なすべてのプロトプ
ラストを再生させた。形質転換菌株は５〜８日後に現れ
始めた。
グしてから約２０時間後まで遅らせて行い、オリゴマイ
シン含有の培地で覆う前に生育可能なすべてのプロトプ
ラストを再生させた。形質転換菌株は５〜８日後に現れ
始めた。
再生されｆこプロトプラストのバックグランドの小さな
百分率の増殖は徐々に起こるが、ピー・クリゾゲヌムＣ
！Ｉ１１３１７７３４がｐＵＣ９で形質転換されたプレ
ートは、８〜ｌＯ日後に、分生子を生成したコロニイが
いくつか認められた。これらのコロニイは、オリゴマイ
シン含有培地で継代培養しても増殖で３ないか、ｐＰＯ
Ｌｌを形質転換を行うのに用いた際、類似のコロニイが
８〜１０日後に現れるのが認めろれた。
百分率の増殖は徐々に起こるが、ピー・クリゾゲヌムＣ
！Ｉ１１３１７７３４がｐＵＣ９で形質転換されたプレ
ートは、８〜ｌＯ日後に、分生子を生成したコロニイが
いくつか認められた。これらのコロニイは、オリゴマイ
シン含有培地で継代培養しても増殖で３ないか、ｐＰＯ
Ｌｌを形質転換を行うのに用いた際、類似のコロニイが
８〜１０日後に現れるのが認めろれた。
（ｂ）形質転換菌株の表現型
耐性遺伝子の単一コピーをゲノムに挿入した場合、野生
型の感受性対立遺伝子がまだ存在するので、半耐性の形
質転換菌株を産生ずると予想される。野生型遺伝子を取
換えるとか、耐性遺伝子の多数のコピーを挿入すれば完
全耐性を有する表現型が得られるであろう。試験した７
箇のｐＰＯＬｌ形質耘換菌昧のう画法計３箇が、オリゴ
マイシン含有プレートに継代培養しｆことき、ピー・ク
リゾゲヌムＣＭＩ ３１４６５２と類似の増殖速度を示
し８．残りの４箇は、半耐性の増殖速度を示した。完全
耐性のセクター（π状体）は、アスペルギルスの半耐性
形質転換菌株から生成するのがとめられたセクターと類
似のらのであり、遺伝子変換が起こっていると考えられ
るが（ワードら、５ｌｏ１．Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、。
型の感受性対立遺伝子がまだ存在するので、半耐性の形
質転換菌株を産生ずると予想される。野生型遺伝子を取
換えるとか、耐性遺伝子の多数のコピーを挿入すれば完
全耐性を有する表現型が得られるであろう。試験した７
箇のｐＰＯＬｌ形質耘換菌昧のう画法計３箇が、オリゴ
マイシン含有プレートに継代培養しｆことき、ピー・ク
リゾゲヌムＣＭＩ ３１４６５２と類似の増殖速度を示
し８．残りの４箇は、半耐性の増殖速度を示した。完全
耐性のセクター（π状体）は、アスペルギルスの半耐性
形質転換菌株から生成するのがとめられたセクターと類
似のらのであり、遺伝子変換が起こっていると考えられ
るが（ワードら、５ｌｏ１．Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、。
１９８６年、２０２巻、２６５−２７０頁）、こめ完全
耐性セクターはみとめられなかった。プラスミドｐＰＯ
Ｌ６は完全耐性の５７７の耐性の形質転換菌株を与え７
′：。
耐性セクターはみとめられなかった。プラスミドｐＰＯ
Ｌ６は完全耐性の５７７の耐性の形質転換菌株を与え７
′：。
ｐＰＯＬｌの組込みを証明するｆ二めに、いくつかの形
質゛転換細胞系をｐＵｃ９でプローブすることによって
外部の配列の存在を分析した（第２図）。試験された各
形質転換菌株は、ドナープラスミドｐＰＯＬｌ由来のＰ
ＵＣ配列を有している。
質゛転換細胞系をｐＵｃ９でプローブすることによって
外部の配列の存在を分析した（第２図）。試験された各
形質転換菌株は、ドナープラスミドｐＰＯＬｌ由来のＰ
ＵＣ配列を有している。
プラスミドｐＰＯＬ６は、ＥｃｏＲＩ部位を一つだけも
つ、ｐｐｏｔ、ｔの誘導体である［第１（「）図］。こ
の部位は、ビー・クリゾゲヌム イソペニシリン Ｎ
シンテターゼ（ＩＰＳ）遺伝子を含む３．２ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント（３，２ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ
ｌフラグメントを有する）を挿入してｐＰＯＩｌを作製
するのに使用した［第３（ｃ）図］。この遺伝子は、セ
ファロスポリウム・アクレモニウム遺伝子の配列由来の
合成オリゴヌクレオチド（サムソンら、Ｎａｔｕｒｅ、
１９８５年、３１８巻、１９１−１９４頁）を用いて
、ビー・クリゾゲヌムＤＮＡの遺伝子バンクをプローブ
することによって単離された。クローン化されたフラグ
メントが真正のものであるということを、カールら、Ｇ
ｅｎｅ％１９１１１６年、４８巻、２５７−２６６頁に
公表されたビー・クリゾゲヌムＩＰＳ遺伝子配列と比較
して確認した。Ｂａｍ１（ｌで切断した４箇のｐＰＯ１
１形質転換菌昧由来のＤＮＡを、ＩＰＳをコードする領
域二第３（ｂ）図コを有する３、２ｋｂＥｃｏＲ１フラ
グメントをサザン法（第４図）におけるプローブとして
用いて分析した。これらの形質転換細胞の内、＋１４４
（完全耐性、トラック２）は、野生型（トラック９）
内に存在するバンドだけを与えるが、恐らく感受性対立
遺伝子のドナーＤ Ｎ Ａによる相同的取替えで生成し
たものであろう。形質転換細胞１１４２゜１１４３およ
び＋１４８ （すべて半耐性）は、ｐＰＯＩＢ）組込み
によって導入されたｒＰＳ配列の別のコピーによって、
特定の雑種形成バンドを与える（トラック１．３および
４）。このプローブと１１形成すると予想されるｐＰＯ
Ｉ １のＢａｍＨ１フラグメントは１．３ｋｂと６．０
ｋｂのフラグメントである［第３（ｃ）図コ。この府者
の７ラグメントは、ｆＰｓをコードする領域中へのＢａ
ａ旧部位の組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を示ず三
つの形質転換細胞すべてに存在し、一方後者は４．５ｋ
ｂのバンドに縮小されてやはり三つの形質転換細胞すべ
てに存在する。これら二つのバンドは、野生型バンドよ
りも強く、マルチコピーインテグレーション（ｍｕｌｔ
ｉｃｏｐｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が起こった可能
性を示している。その上１１４２と１１４３は、予想で
きない大きさの弱い雑種形成バンドをもっている。別の
形質転換細胞＋２４２１由来のＤ Ｎ ＡをＸｈｏ１、
Ｂａｍ旧およびＥｃｏＲｌで切断すると（半耐性、５．
６および７号トラック）、野生型バンド（８，９および
１０号トラック参照）および池のバンドに加えて、ｐＰ
Ｏｌｌの地図から予想されるバンド［Ｘｈｏｌニア、Ｏ
ｋｂ、 ＥｃｏＲｌ：３．２ｋｂ、第３（ｃ）図コが得
られる。
つ、ｐｐｏｔ、ｔの誘導体である［第１（「）図］。こ
の部位は、ビー・クリゾゲヌム イソペニシリン Ｎ
シンテターゼ（ＩＰＳ）遺伝子を含む３．２ｋｂ Ｅｃ
ｏＲＩフラグメント（３，２ｋｂ ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ
ｌフラグメントを有する）を挿入してｐＰＯＩｌを作製
するのに使用した［第３（ｃ）図］。この遺伝子は、セ
ファロスポリウム・アクレモニウム遺伝子の配列由来の
合成オリゴヌクレオチド（サムソンら、Ｎａｔｕｒｅ、
１９８５年、３１８巻、１９１−１９４頁）を用いて
、ビー・クリゾゲヌムＤＮＡの遺伝子バンクをプローブ
することによって単離された。クローン化されたフラグ
メントが真正のものであるということを、カールら、Ｇ
ｅｎｅ％１９１１１６年、４８巻、２５７−２６６頁に
公表されたビー・クリゾゲヌムＩＰＳ遺伝子配列と比較
して確認した。Ｂａｍ１（ｌで切断した４箇のｐＰＯ１
１形質転換菌昧由来のＤＮＡを、ＩＰＳをコードする領
域二第３（ｂ）図コを有する３、２ｋｂＥｃｏＲ１フラ
グメントをサザン法（第４図）におけるプローブとして
用いて分析した。これらの形質転換細胞の内、＋１４４
（完全耐性、トラック２）は、野生型（トラック９）
内に存在するバンドだけを与えるが、恐らく感受性対立
遺伝子のドナーＤ Ｎ Ａによる相同的取替えで生成し
たものであろう。形質転換細胞１１４２゜１１４３およ
び＋１４８ （すべて半耐性）は、ｐＰＯＩＢ）組込み
によって導入されたｒＰＳ配列の別のコピーによって、
特定の雑種形成バンドを与える（トラック１．３および
４）。このプローブと１１形成すると予想されるｐＰＯ
Ｉ １のＢａｍＨ１フラグメントは１．３ｋｂと６．０
ｋｂのフラグメントである［第３（ｃ）図コ。この府者
の７ラグメントは、ｆＰｓをコードする領域中へのＢａ
ａ旧部位の組込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を示ず三
つの形質転換細胞すべてに存在し、一方後者は４．５ｋ
ｂのバンドに縮小されてやはり三つの形質転換細胞すべ
てに存在する。これら二つのバンドは、野生型バンドよ
りも強く、マルチコピーインテグレーション（ｍｕｌｔ
ｉｃｏｐｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）が起こった可能
性を示している。その上１１４２と１１４３は、予想で
きない大きさの弱い雑種形成バンドをもっている。別の
形質転換細胞＋２４２１由来のＤ Ｎ ＡをＸｈｏ１、
Ｂａｍ旧およびＥｃｏＲｌで切断すると（半耐性、５．
６および７号トラック）、野生型バンド（８，９および
１０号トラック参照）および池のバンドに加えて、ｐＰ
Ｏｌｌの地図から予想されるバンド［Ｘｈｏｌニア、Ｏ
ｋｂ、 ＥｃｏＲｌ：３．２ｋｂ、第３（ｃ）図コが得
られる。
これらのパターンは、組込まれたＩ）Ｐｏ１１配列と一
致し、再配列された単独のコビイ配列によって増殖して
配列される場合が多い。
致し、再配列された単独のコビイ配列によって増殖して
配列される場合が多い。
第１ （ａ）図、１ （ｂ）図、１ （ｃ）図および１
（ｄ）図は各種制限フラグメントの制限酵素地図、第１
（ｅ）図、Ｉ （１）図はおよびＩ （ｇ）図、は各
種プラスミドの制限酵素地図、第２図は各種細胞の全Ｄ
Ｎ Ａサザン法による泳動パターン図、第３（ａ）図
はＩＰＳ遺伝子の染色体領域の制限酵素地図、第３（ｂ
）図および第３（ｃ）図は各種プラスミドの制限酵素地
図、第４図は、各種形質転換細胞およびＤＮＡの電気泳
動パターン図。 □ −−Ｐ＋ Ｍ −一−−一鵬ココ
υ −口 ω −−Ｃ力２． 〜−−―−−−
− ゝ−ゝ′ 」・よ 一 ５６７ 己 ９１０ ２．０ − 一９− ・― Ｆｉｇ、Ａ 手続補正書 （方式） ％式％ ［ リシイ１１ の）２示 昭和６３年特許願第２３８６４８号 ｆこ明の名ゼド 形質転換／ステム ｈｌｉ＋１−、を４゛る台 ミドルセックス、ブレントフ十−ド、グレート・ウェス
ト・ロード、ビーチャム・ハウス（無番地）ヒーチャム
・グループ・ビーエルシー 代表各 デイヒツト・ロバーツ １ 代理人 １ｒ：、所 〒５３０ 大阪市北区西天満５丁目１ ３クオーター・ワンヒル ５、ｔ＋Ｉｉ市命令の［１付 昭４１１６３年１２月２０［１（発送ＩＥ）２、ｏ− １，０− 一 ′ Ｆｉｇ、４
（ｄ）図は各種制限フラグメントの制限酵素地図、第１
（ｅ）図、Ｉ （１）図はおよびＩ （ｇ）図、は各
種プラスミドの制限酵素地図、第２図は各種細胞の全Ｄ
Ｎ Ａサザン法による泳動パターン図、第３（ａ）図
はＩＰＳ遺伝子の染色体領域の制限酵素地図、第３（ｂ
）図および第３（ｃ）図は各種プラスミドの制限酵素地
図、第４図は、各種形質転換細胞およびＤＮＡの電気泳
動パターン図。 □ −−Ｐ＋ Ｍ −一−−一鵬ココ
υ −口 ω −−Ｃ力２． 〜−−―−−−
− ゝ−ゝ′ 」・よ 一 ５６７ 己 ９１０ ２．０ − 一９− ・― Ｆｉｇ、Ａ 手続補正書 （方式） ％式％ ［ リシイ１１ の）２示 昭和６３年特許願第２３８６４８号 ｆこ明の名ゼド 形質転換／ステム ｈｌｉ＋１−、を４゛る台 ミドルセックス、ブレントフ十−ド、グレート・ウェス
ト・ロード、ビーチャム・ハウス（無番地）ヒーチャム
・グループ・ビーエルシー 代表各 デイヒツト・ロバーツ １ 代理人 １ｒ：、所 〒５３０ 大阪市北区西天満５丁目１ ３クオーター・ワンヒル ５、ｔ＋Ｉｉ市命令の［１付 昭４１１６３年１２月２０［１（発送ＩＥ）２、ｏ− １，０− 一 ′ Ｆｉｇ、４
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、形質転換菌株のゲノムが、その中にオリゴマイシン
耐性をコードする相同ＤＮＡ配列を組込まれていること
を特徴とするオリゴマイシン含有培地内で選択可能なペ
ニシリウム・クリゾゲヌムの形質転換菌株。 ２、相同ＤＮＡ配列が、オリゴマイシン耐性を獲得した
ペニシリウム・クリゾゲヌムの突然変異菌株の染色体Ｄ
ＮＡの一部分である請求項１記載の形質転換菌株。 ３、前記ＤＮＡ配列が、ＡＴＰ−シリターゼの変えられ
たサブユニットをコードしている請求項１または２記載
の形質転換菌株。 ４、ＡＴＰ−シリターゼの変えられたサブユニットがサ
ブユニット−９蛋白質である請求項３記載の形質転換菌
株。 ５、前記ＤＮＡ配列が、ペニシリウム・クリゾゲヌムＮ
ＲＲＬ１９５１のニコチンアミド栄養要求株の突然変異
によって生成したペニシリウム・クリゾゲヌムのオリゴ
マイシン耐性菌株由来のＤＮＡ配列である請求項４記載
の形質転換菌株。 ６、前記ＤＮＡ配列が、ペニシリウム・クリゾゲヌムＣ
ＭＩ３１４６５２由来のＤＮＡ配列である請求項５記載
の形質転換細胞。 ７、形質転換菌株のゲノムが、さらに外部の遺伝子を有
する請求項１〜６のいずれか一つに記載の形質転換菌株
。 ８、前記遺伝子が、ペニシリウム・クリゾゲヌムのイソ
ペニシリンＮシンテターゼ遺伝子である請求項７に記載
の形質転換菌株。 ９、ｏｌｉＣ３と称呼されるＤＮＡセグメント、または
オリゴマイシン耐性をコードする完全な遺伝子を含むｏ
ｌｉＣ３の制限フラグメントを有する組換え体ベクター
。 １０、ｐＰＯＬ１、ｐＰＯＬ６およびｐＰＯＬ８からな
る群から選択される請求項９記載のベクター。 １１、追加のクローン化遺伝子を有する請求項９または
１０記載のベクター。 １２、追加のクローン化遺伝子が、ペニシリウム・クリ
ゾゲヌムのイソペニシリンＮシンテターゼ遺伝子である
請求項１１記載のベクター。 １３、請求項９〜１２のいずれか一つに記載のベクター
で形質転換されたペニシリウム・クリゾケヌムの菌株。 １４、ｉ）ペニシリウム・クリゾケヌム宿主生物と、オ
リゴマイシン耐性をコードする相同ＤＮＡ配列を有する
組換え体ベクターとを、形質転換条件下で混合し、およ
び ｉｉ）オリゴマイシン含有の培地内で培養すると増殖す
る１以上の生物を選択するという工程からなる、ペニシ
リウム・クリゾゲヌムを形質転換し生成した形質転換菌
株を選択する方法。 １５、ペニシリウム・クリゾゲヌム ＣＭＩ ３１４６
５２。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8722478 | 1987-09-24 | ||
| GB878722478A GB8722478D0 (en) | 1987-09-24 | 1987-09-24 | Process |
| GB8801766 | 1988-01-27 | ||
| GB888801766A GB8801766D0 (en) | 1988-01-27 | 1988-01-27 | Novel process |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02417A true JPH02417A (ja) | 1990-01-05 |
Family
ID=26292778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63238648A Pending JPH02417A (ja) | 1987-09-24 | 1988-09-22 | 形質転換システム |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0311273A1 (ja) |
| JP (1) | JPH02417A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003516112A (ja) * | 1999-05-06 | 2003-05-13 | アベンテイス・アニマル・ニユートリシヨン・エス・エー | 相同又は非相同タンパク質生産のための組換えペニシリウム フニクロスム |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4892819A (en) * | 1985-11-25 | 1990-01-09 | Eli Lilly And Company | Recombinant DNA expression vectors and DNA compounds that encode isopenicillin N synthetase from penicillium chrysogenum |
| DE3788764T2 (de) * | 1986-09-16 | 1994-06-23 | Gist Brocades Nv | Penicilliumtransformanten und Verfahren zu ihrer Herstellung. |
-
1988
- 1988-09-21 EP EP88308734A patent/EP0311273A1/en not_active Withdrawn
- 1988-09-22 JP JP63238648A patent/JPH02417A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0311273A1 (en) | 1989-04-12 |
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