JPH1084945A - 特定部位での染色体の分断化を利用した有用酵母の解析、育種法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】有用形質に対する従来の酵母遺伝学による解析
手法には限界があり、これらの問題を解決しうる新規な
解析技術を提供する。 【解決手段】染色体の任意の部位で一本の染色体を二本
あるいはそれ以上の数に分断し、分断染色体を保持した
一倍体酵母を作成する技術の開発。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、人工的に染色体が
分断された酵母の製造法、分断された染色体の一方が脱
落した酵母の製造法、目的の形質を獲得した酵母の製造
法、目的形質を支配する染色体上の領域を同定する方
法、染色体の一部が重複した酵母の製造法、及び上記方
法によって得られた酵母を用いた飲食品の製造法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ）は日本酒、ビール、ワイン、パンなどの発酵食品の
製造において、古来より重要な役割を果たしてきた。そ
して各々の食品において、食品の品質向上、製造工程で
の使いやすさ等の観点から実用酵母とよばれる優秀な生
理機能を持つ酵母が分離、育種されてきた。

【０００３】しかし、従来の実用酵母は、目的の実用形
質がどのような生理機能に由来するかが分からないもの
が多く、分離、育種に長い歳月を必要とするものであっ
た。近年、遺伝子工学の進歩により、酵母の細胞機能が
遺伝子レベルで急速に明らかになってきた。さらに、こ
れら基礎原理の解明により、遺伝子操作技術を用いて実
用酵母の育種を行った例も報告されつつある（Ｎａｋａ
ｚａｗａ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂ
ｉｏｅｎｇ．，７８巻，６−１１頁，１９９４年）。

【０００４】そして近年、実用酵母研究に最新の技術が
導入されるようになって大きく注目されるようになった
のが、酵母の有用形質を支配する遺伝子は何か？という
視点である。

【０００５】実用酵母の有用形質は人類が長年に渡って
選りすぐってきた貴重な遺伝子資源であり、実用面での
興味に加え、基礎生物学的観点からも大きな可能性を秘
めている。ある有用形質を支配する遺伝子が同定されれ
ば、これまで行われてきたランダムな変異処理や交雑に
よる育種に比べ、その遺伝子を直接標的とした効率のよ
い育種系が設定できる事になり、このことによってもた
らされる時間、労力面でのメリットは計り知れない。

【０００６】１９９６年４月、出芽酵母染色体の全塩基
配列が決定された。その結果、酵母染色体上には６００
０を超える遺伝子が同定されたが、これまで発見されて
いなかった遺伝子が約２０００存在することが分かっ
た。この中には未だ解明されていない有用形質を支配す
る遺伝子も多く含まれていることが予想され、その機能
には大きな関心が寄せられている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかし、全ゲノム塩基
配列が明らかにされた現在でも、有用形質を支配する遺
伝子の解明にはまだまだ大きな障害がある。

【０００８】それは、一般に有用形質には多くの遺伝子
の関与が考えられ、従来の遺伝学的手法や遺伝子クロー
ニング技術では支配遺伝子の同定が困難な場合が多いこ
とである。有用形質に対する従来の酵母遺伝学による解
析手法には限界があり、これらの問題を解決しうる何ら
かの新規な解析技術が求められている。

【０００９】そうした技術の一つとして、近年、酵母細
胞を染色体レベルで改変し、有用性質を解析しようとす
る染色体工学技術の開発が行われている（川崎ら，日本
生物工学会誌，第７４巻，１１−１６頁，１９９６
年）。

【００１０】この技術は一つの染色体を丸ごと消去する
という点で、遺伝子の大規模な改変が行えることや、表
現系を相補する遺伝子のクローニングの場合に問題とな
る大量の形質転換体を取得する必要のないこと、そして
減数分裂を介さずに酵母細胞の改変、解析が行えるな
ど、上記の問題点に解決策を与えうる一つの手法として
注目されている。

【００１１】しかし、この方法は染色体全体を対象とす
ることから有用形質と染色体の特定領域との関連がつき
にくいこと、また有用形質をもたらす染色体上の特定領
域をしぼり込むための解析手段としては充分ではない。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく、染色体の任意の部位で一本の染色体を二本
あるいはそれ以上の数に分断し、分断染色体を保持した
一倍体酵母を作成する技術の開発に成功した。本願発明
は同技術に基づくものであり、以下にこれを示す。

【００１３】（発明１） 酵母セントロメア、酵母細胞
内で発現するマーカー遺伝子、及び、末端が向き合うよ
うに配置された２つのテロメアが、酵母染色体上への組
み込み標的ＤＮＡ断片が切断されて得られる２つのＤＮ
Ａに挟まれた構造を有する直鎖上ＤＮＡを一倍体酵母細
胞内に導入し、前記酵母染色体上への組み込み標的ＤＮ
Ａ断片と該ＤＮＡと相同な染色体上の領域との相同組み
換えが生じてさらに前記染色体上での末端側が向き合う
ように配置された２つの酵母テロメアの解離が生じた酵
母を選択することを特徴とする酵母の製造法。 （発明２） 発明１記載の工程に加え、分断された染色
体の一方が脱落した酵母を選択することを特徴とする酵
母の製造法。 （発明３） 発明２記載の工程に加え、目的の形質を獲
得した酵母を選択することを特徴とする酵母の製造法。 （発明４） 発明２記載の工程に加え、分断された染色
体のうち脱落した一方を同定することを特徴とする目的
形質を支配する染色体領域を同定する方法。 （発明５） 発明４記載の方法によって同定された分断
染色体の一方を、酵母に導入することを特徴とする酵母
の製造法。 （発明６） 発明１記載の工程に加え、選択された酵母
を異なる接合型の一倍体酵母と交雑させて二倍体酵母を
得、分断された染色体の一方が脱落した酵母を選択する
ことを特徴とする酵母の製造法。 （発明７） 発明６記載の工程に加え、目的の形質を獲
得した酵母を選択することを特徴とする酵母の製造法。 （発明８） 発明６記載の工程に加え、分断された染色
体のうち脱落した一方を同定することを特徴とする目的
形質を支配する染色体領域を同定する方法。 （発明９） 発明８記載の方法によって同定された分断
染色体の一方を、酵母に導入することを特徴とする酵母
の製造法。 （発明１０）発明１、２、３、５、６、７又は９記載の
方法によって製造される酵母。 （発明１１）発明１０記載の酵母を用いた飲食品の製造
法。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下に本願発明について説明す
る。

【００１５】（１）一倍体酵母における染色体の分断 セントロメアとは、有糸分裂時の染色体の移動の際、紡
錘糸が結合する部分で、細胞分裂時の染色体の正常な複
製と分配に重要な役割を果たす。本特許における酵母セ
ントロメアに該当する遺伝子は、実施例に示したプラス
ミド上のＣＥＮ４に限らず、酵母染色体の複製と分配時
にそれぞれセントロメアとしての機能を発揮しうる遺伝
子部分であれば、全て該当する（参考文献：Ｈｉｅｔｅ
ｒら、Ｃｅｌｌ、４２巻、９１３−９２１頁、１９８５
年）。

【００１６】本特許における酵母細胞内で発現するマー
カー遺伝子に該当する遺伝子は、実施例に示される遺伝
子に限らず、酵母で用いられる抗生物質耐性付与遺伝
子、酵母で用いられるアミノ酸、核酸代謝系遺伝子、さ
らには宿主の温度感受性を相補する遺伝子等、遺伝子の
発現によって、非形質転換株に対し表現型において差異
を生じせしめるものであればすべて該当する。

【００１７】テロメアとは、直鎖状染色体の末端部分に
存在する領域で、染色体複製の際に染色体の長さの維持
に重要な役割を果たしている。本特許におけるテロメア
に該当する遺伝子は、実施例に示したテトラヒメナ由来
テロメアに限定されるものでなく、酵母染色体複製時に
テロメアとしての機能を発揮しうる遺伝子部分であれば
全て該当する（参考文献：Ｓｚｏｓｔａｋら、Ｃｅｌ
ｌ、２９巻、２４５−２５５頁、１９８２年）。

【００１８】組込みの際の標的ＤＮＡ断片に該当するＤ
ＮＡは、酵母の染色体由来であればどのような領域のＤ
ＮＡでも全て該当する。前述したように現在では酵母染
色体の全塩基配列が解明されているので、分断化を試み
る標的遺伝子領域は全てＰＣＲ等の方法で増幅し、分断
化プラスミドに組み込めば染色体上の任意の部位で分断
化が可能である。但し分断化標的遺伝子の取得法はこの
方法に限られたものではなく、標的遺伝子も、酵母染色
体上の全ての遺伝子若しくは酵母遺伝子と相同組み換え
を起こしうる程度に塩基配列の相同性があるものも該当
する。

【００１９】酵母セントロメア、酵母細胞内で発現する
マーカー遺伝子、及び、末端が向き合うように配置され
た２つのテロメアが、酵母染色体上への組込み標的ＤＮ
Ａ断片が切断されて得られる２つのＤＮＡに挟まれた構
造を有する直鎖状ＤＮＡを調製するには、該直線上ＤＮ
Ａを搭載する環状プラスミドベクターを作製して、これ
を例えばエシェリヒア属細菌細胞内で増幅した後制限酵
素で切断する。具体的には、後述の実施例に示されるよ
うにプラスミドｐＤＷ１０及びｐＤＷ１８を制限酵素で
切断することによって調製できる。

【００２０】上記直鎖状ＤＮＡが導入される一倍体酵母
とは、実施例に述べた実験室酵母ＹＰＨ８０に限定され
るものでなく、ａ、αの接合型、酵母の由来他に関わり
なく一倍体であれば全て該当する。

【００２１】上記直鎖状ＤＮＡを一倍体酵母細胞内に導
入する方法は、従来の酢酸リチウム法をはじめ、エレク
トロポレーション、パーティクルガン他の方法でもよ
い。

【００２２】染色体の分断化が生じた酵母を選択するに
は、分断化プラスミドのマーカー遺伝子の性質に応じた
選択培地に蒔き、マーカー遺伝子の発現しているクロー
ンを単離する。その後染色体が目的の位置で正確に分断
化されたことを、単離株から調製した染色体のパルスフ
ィールド電気泳動、サザンブロット解析等で確認すれば
よい。

【００２３】一倍体酵母細胞中に存在する分断化染色体
の一方に酵母の生育に必須な遺伝子が存在しない場合に
は、その分断された染色体が、継代培養途上等生育の過
程に酵母細胞から脱落してもその酵母は生存可能であ
る。その結果、染色体の特異的領域が脱落した酵母をこ
の方法を用いて取得することができる。

【００２４】染色体の特異的領域が脱落した酵母を得る
方法を応用して、酵母の育種を行うこともできる。すな
わち、染色体の特異的領域の脱落によって酵母の形質が
変化し、有用な形質を持つ株が出現することが予想され
る。このことを利用して、様々な部位で染色体が分断化
された酵母を、目的の有用形質を持つ酵母をスクリーニ
ングする評価系にかけて、優秀な酵母を取得するという
ものである。この際の有用形質は発酵能、冷凍耐性、ア
ルコール産生能他様々な有用形質が対象となりうる。

【００２５】染色体の特異的領域が脱落した酵母を得た
結果、優秀な有用形質を持った一倍体酵母の該有用形質
の性能が低下する場合もありうる。その際に脱落した分
断化染色体上には有用形質発現のカギを握る遺伝子があ
る。この原理に基づき、着目する有用形質をもたらす遺
伝子を同定することができる。この技術により、実用酵
母のもつ有用形質をもたらす遺伝子が存在する染色体領
域の大まかな同定、絞り込みが可能になり、従来の酵母
遺伝学手法による実用酵母の有用形質同定にかかる労力
が大幅に軽減される。

【００２６】後述の実施例に示されるとおり、一倍体酵
母において、通常の染色体の他に、特定領域の染色体部
分をミニ染色体として持つ酵母の作成も可能である。従
って、例えば上述の方法で同定、取得された優秀な性質
をもたらす染色体の特異的領域を通常の性能の一倍体酵
母に導入することにより、有用形質の性能の向上した酵
母を育種できる。該染色体特定領域を二倍体または、そ
れ以上の倍数性を有する酵母に導入することもできる。

【００２７】上記技術を応用すべき酵母は例えばサッカ
ロマイセス・セレビシエであり、実験室酵母はもとよ
り、清酒、ワインなどの実用アルコール酵母、実用パン
酵母他発酵食品に利用される酵母、さらには新たに自然
界から取得した酵母であってもよい。

【００２８】上記方法で育種された酵母は、酵母を利用
する産業すべてに使用され、日本酒、ビール、ワイン、
発泡酒その他アルコール発酵を用いるすべての産業にお
いて使用可能である。また、パンなどの発酵食品にも使
用される。さらに、酵母そのものを用いた栄養食品、す
なわち酵母エキス、パウダーその他の食品でも使用でき
る。

【００２９】（２）染色体が分断された一倍体酵母を掛
け合わせて得られる二倍体酵母 ある優秀な実用形質をもつ一倍体酵母において染色体を
特定な部位で分断化し、これを異なる接合型を有する染
色体が分断されていない一倍体酵母と掛け合わせる。あ
るいは、ある優秀な実用形質をもつ一倍体酵母で異なる
接合型を有する２種を使って、それぞれの染色体を分断
化し、得られる２種の一倍体酵母を掛け合わせる。その
ようにして得た二倍体酵母の分断された染色体の少なく
とも一つを脱落させ、目的の有用形質をスクリーニング
する系にかければ、所望の有用形質を保持するようなっ
た株が現れる可能性がある。この方法は、一倍体酵母で
染色体の特定部分を脱落させたときに懸念される生育に
必須な遺伝子の脱落による酵母の致死化を懸念しなくて
良い点でより優れた育種法である。

【００３０】またこの考え方をさらに進めて、部分染色
体の交換、”シャッフリング”も可能になる。その方法
は、２種の一倍体酵母について一つ以上の部位で染色体
の分断化を行い、それらを交雑後、様々な組み合わせで
染色体領域の脱落した株を選択し、有用形質の向上した
株を選択する育種法である。

【００３１】分断された染色体の一部が脱落することに
より有用形質が失われたクローンを選び出せば、有用形
質をもたらす遺伝子が脱落染色体領域上にある事が分か
る。また、逆に有用形質の発現を抑制する染色体領域の
同定にも用いることができる。即ちこの方法は交雑能を
もつ一倍体酵母で染色体分断化が成功したことにより可
能になった新しい遺伝学的解析法であり、実用酵母のも
つ有用形質をもたらす遺伝子の大まかな同定、絞り込み
を可能にし、従来の酵母遺伝学手法を用いた実用酵母の
有用形質同定にかかる労力を大幅に軽減できる可能性が
ある。さらに該方法は、二倍体酵母において減数分裂を
介さずに行える解析法であることに大きな意義があると
考えられる。従来の二倍体酵母の遺伝学的解析法では、
ある形質がどのような遺伝子に支配されているかを解析
する際に、四分子分析を行う。しかしその際に取得する
酵母の胞子株は減数分裂による大規模な染色体上遺伝子
の再構成を経てしまっており、胞子株の染色体遺伝子構
成はその親株と程遠いものに変化してしまっている。こ
のことから実用上の酵母有用形質のように多くの遺伝子
の関与が想定される遺伝形質の解析において、四分子分
析を主体とする従来の遺伝学的解析法が適切であるかは
これまで大いに疑問視されてきた。本方法はそのような
懸念を解消しうる方法として非常に意義深い。

【００３２】上記の方法で同定された有用染色体領域を
一倍体、二倍体もしくはそれ以上の倍数性をもつ酵母に
導入し、有用形質の付与された酵母を育種できる。この
技術を応用すべき酵母は例えばサッカロマイセス・セレ
ビシエであり、実験室酵母はもとより、清酒、ワインな
どの実用アルコール酵母、実用パン酵母他発酵食品に利
用される酵母、さらには新たに自然界から取得した酵母
であってもよい。

【００３３】上記方法で育種された酵母は、酵母を利用
する産業すべてに使用され、日本酒、ビール、ワイン、
発泡酒その他アルコール発酵を用いるすべての産業にお
いて使用可能である。また、パンなどの発酵食品にも使
用される。さらに、酵母そのものを用いた栄養食品、す
なわち酵母エキス、パウダーその他の食品でも使用でき
る。

【００３４】以下に実施例にてさらに詳細に説明する。

【実施例】

（実施例１．ＧＣＮ３遺伝子を用いた第ＸＩ番染色体の
分断化）まず染色体分断化のためのプラスミドｐＣＳＶ
１の構築方法について述べる。まずＳＵＰ１１遺伝子を
含む制限酵素ＰｖｕＩ−ＳａｌＩ切断遺伝子断片（３．
６ｋｂｐ）をプラスミドｐ２３７（図１）から切り出
し、その代わりにＹＩｐ５（一般に用いられる酵母染色
体組込み用プラスミド、供給元：Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄ Ｂｉｏｌａｂs社）を制限酵素ＰｖｕＩ−ＳａｌＩ
で切断して得た遺伝子断片（２．４ｋｂｐ）を導入し
た。この操作によって、構築の最終目的とするプラスミ
ド上で不要なＳＵＰ１１遺伝子を除去した。続いてこの
プラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩで分
解してｐ２３７由来のＹ’ａとＹ’ｂ遺伝子（最終構築
プラスミドには不要の遺伝子部分）を含む遺伝子断片を
除去し、残った遺伝子断片の両端をクレノウ酵素で平滑
化後、ＸｈｏＩリンカーを導入し、両端を連結して再環
状化した。この際制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位が再生し
てしまい、後の操作に都合が悪いので、ＢａｍＨＩでこ
のプラスミドを分解後、切断末端をクレノウ酵素で平滑
化し、再環状化してＢａｍＨＩ認識部位を無くした。最
後にこのプラスミドのＸｈｏＩ認識部位に、ｐＹＡＣ４
より得た、ＨＩＳ３遺伝子を挟んで逆向きにテロメア末
端を持つ１．７ｋｂｐのＸｈｏＩ遺伝子断片を導入し、
これをｐＣＳＶ１とした（図１及び図２）。なおプラス
ミドｐＣＳＶ１で形質転換された大腸菌はｐＣＳＶ１／
ＨＢ１０１と命名されて、プライベート・ナンバーＡＪ
１３２２６が与えられている。ｐＣＳＶ１／ＨＢ１０１
（ＡＪ１３２２６）株は通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所（郵便番号３０５ 茨城県つくば市東１
丁目１番３号）に平成８年８月１９日付で寄託されてお
り、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５７８８である。

【００３５】このｐＣＳＶ１の制限酵素ＥｃｏＲＩ認識
部位に、ｐＤＷ１７由来のＧＣＮ３（第ＸＩ染色体上に
ある遺伝子、参考文献：Ｈａｎｎｉｎｇら、Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、８巻、４８０８−４８２０
頁、１９８８年）を含むＥｃｏＲＩ断片を導入したもの
がｐＤＷ１８（図１）である。

【００３６】ｐＤＷ１８をＢａｍＨＩで切断してＨＩＳ
３遺伝子部分を除去した遺伝子断片を単離し、Ｔ４リガ
ーゼによりＢａｍＨＩ末端を連結させると、テロメア末
端が向き合った形で再環状化する。この試料をＧＣＮ３
遺伝子内にある制限酵素ＸｂａＩ認識部位で切断し、一
倍体酵母ＹＰＨ８０（ｕｒａ３−５２)（参考文献：Ｇ
ｅｒｒｉｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、
１９４巻、５７−７７頁、１９９１年）の細胞内に酢酸
リチウム法で導入する。このプラスミドを用いると、形
質転換操作だけで染色体の分断化を起こすことができる
（図３Ａ）。染色体分断化に成功した酵母の選抜法であ
るが、一倍体酵母ＹＰＨ８０はＵＲＡ３（ウラシル生合
成系の酵素５ーフルオロオロチジンモノ燐酸デカルボキ
シラーゼをコードする遺伝子、文献：Ｒｏｓｅら、Ｇｅ
ｎｅ、２９巻、１１３−１２４巻、１９８４年）に欠損
があるため、ウラシルを含まない培地上では生育できな
い。しかしｐＤＷ１８上にはＵＲＡ３が組み込まれてい
るため、染色体の分断化が起こったクローンは、ｐＤＷ
１８由来のＵＲＡ３の作用により、ウラシル非存在培地
上でも生育できる。このような原理をもとに、染色体の
分断化が起こったクローンの候補株を、ウラシル欠損培
地上のコロニー形成能で選抜した。

【００３７】選抜した酵母の染色体ＤＮＡをＣａｒｌｅ
らの方法（Ｃａｒｌｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２巻，３７
５６−３７６０頁，１９８５年）によってアガロースプ
ラグに包埋し、１％アガロースを含む０．５×ＴＢＥバ
ッファーで作成したゲルに埋め込んだ。このサンプルに
対しＣＨＥＦＦ ＤＲＩＩシステムを用いてパルスフィ
ールドゲル電気泳動を行い、染色体をゲル上で分離した
（バッファー：０．５×ＴＢＥバッファー、水温１４°
Ｃ、電圧２００Ｖでまず２４時間を４５秒のスイッチン
グで行った後、６時間を１５秒のスイッチングで行っ
た）。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色
し、ＤＮＡを観察した（図４）。図４左のレーン２がそ
の結果で、分断化前の第ＸＩ染色体（矢印ＸＩ）がレー
ン１に、分断化染色体（矢印ＸＩ’、ＸＩ’’）がレー
ン２に観察される。さらに目的染色体分断断片の確認の
ため、サザンブロッティングを行った。ゲルを０．２５
Ｎの塩酸に３０分間浸せきしたのち、０．５Ｍの水酸化
ナトリウムで変性させ、中和し、ナイロンメンブレンに
ＤＮＡをブロットした。このメンブレン上で、ＵＲＡ３
遺伝子断片（１．１ｋｂ）、またはＧＣＮ３遺伝子断片
（３．３ｋｂ）を「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰを用いてラン
ダムラベルを行ったプローブとハイブリダイゼーション
させ、目的のＤＮＡ断片の位置を確認した。図４におい
て、分断化前の第ＸＩ染色体を矢印ＸＩで、分断化後の
第ＸＩ染色体断片をそれぞれ矢印ＸＩ’、ＸＩ’’でし
めす。図４左はエチジウムブロマイド染色の結果、図４
中はＵＲＡ３遺伝子断片（１．１ｋｂ）をプローブにし
て行ったサザンブロッティングの結果、そして図４右は
ＧＣＮ３遺伝子断片（３．３ｋｂ）をプローブにして行
ったサザンブロッティングの結果である。

【００３８】この結果、取得した２９株のうち、８株が
目的の部位で第ＸＩ染色体が分断化して生じた二本の染
色体を保持している事が分かった。この第ＸＩ染色体分
断化酵母のうちの１株をＹＭＲ４３１と命名した。ＹＭ
Ｒ４３１株にはプライベート・ナンバー ＡＪ１４７１
９が与えられ、また、通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に平成８年８月１９日付で寄託されてお
り、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５７８９である。

【００３９】（実施例２．ＹＨＲ０８８遺伝子を用いた
第ＶＩＩＩ番染色体の分断化）ｐＣＳＶ１の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ認識部位に、ＹＨＲ０８８（第ＶＩＩＩ染色体
上にある遺伝子、参考文献：Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、２６５巻、２０７７ー２０８２頁、１９９
４年）を含むＥｃｏＲＩ断片を導入したものがｐＤＷ１
０である（図１）。ｐＤＷ１０を上述と同様の方法で処
理した後、ＹＨＲ０８８遺伝子内にある制限酵素Ｂｇｌ
ＩＩ認識部位で切断し、ｐＤＷ１８の場合と同じく酵母
ＹＰＨ８０に導入し、前出の原理でウラシル非要求性を
基に染色体分断化クローンを選抜した。図３ＢにｐＤＷ
１０を用いた染色体分断化機構を図示した。

【００４０】選抜した酵母の染色体ＤＮＡをＣａｒｌｅ
らの方法（Ｃａｒｌｅ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２巻，３７
５６ー３７６０頁，１９８５年）によってアガロースプ
ラグに包埋し、１％アガロースを含む０．５×ＴＢＥバ
ッファーで作成したゲルに埋め込んだ。このサンプルに
対しＣＨＥＦＦ ＤＲＩＩシステムを用いてパルスフィ
ールドゲル電気泳動を行ない、染色体をゲル上で分離し
た（バッファー：０．５×ＴＢＥバッファー、水温１４
°Ｃ、電圧２００Ｖでまず２０時間を４５秒のスイッチ
ングで行った後、２４時間を２０秒のスイッチングで行
った）。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染
色し、ＤＮＡを観察した（図５）。図５左のレーン２が
その結果で、分断化前の第ＶＩＩＩ染色体（矢印ＶＩＩ
Ｉ）がレーン１に、分断化染色体（矢印ＶＩＩＩ’、Ｖ
ＩＩＩ’’）がレーン２に観察される。さらに目的染色
体分断断片の確認のため、サザンブロッティングを行っ
た。ゲルを０．２５Ｎの塩酸に３０分間浸せきしたの
ち、０．５Ｍの水酸化ナトリウムで変成させ、中和し、
ナイロンメンブレンにＤＮＡをブロットした。このメン
ブレン上で、ＵＲＡ３遺伝子断片（１．１ｋｂ）、また
はＹＨＲ０８８遺伝子断片（３．７ｋｂ）を｛α−
³²Ｐ｝ｄＣＴＰを用いてランダムラベルを行ったものと
ハイブリダイゼーションさせ、目的のＤＮＡ断片の位置
を確認した。図５において、分断化前の第ＶＩＩＩ染色
体を矢印ＶＩＩＩで、分断化後の第ＶＩＩＩ染色体断片
をそれぞれ矢印ＶＩＩＩ’、ＶＩＩＩ’’でしめす。図
５左はエチジウムブロマイド染色の結果、図５中はＵＲ
Ａ３遺伝子断片（１．１ｋｂ）をプローブにして行った
サザンブロッティングの結果、そして図５右はＹＨＲ０
８８遺伝子断片（３．７ｋｂ）をプローブにして行った
サザンブロッティングの結果である。

【００４１】この方法で取得した２９株のうち、５株が
目的の位置で第ＶＩＩＩ染色体が分断化されて生じた二
本の染色体を保持していた。この第ＶＩＩＩ染色体分断
化酵母の一つをＹＭＲ４３２と命名し、これにプライベ
ート・ナンバー ＡＪ１４７２０を与えた。ＹＭＲ４３
２（ＡＪ１４７２０）は通商産業省工業技術院生命工学
工業技術研究所に平成８年８月１９日付で寄託されてお
り、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１５７９０である。

【００４２】（実施例３。染色体分断酵母と親株との増
殖能の比較）さらに、染色体を分断することにより酵母
が受ける生理学的な影響について調べた。方法は、親株
（ＹＰＨ８０）、第ＸＩ染色体が分断化された形質転換
株（ＹＭＨ４３１）、及び第ＶＩＩＩ染色体が分断化さ
れた形質転換株（ＹＭＨ４３２）を３０°ＣでＹＰＤ培
地で一晩培養した後、１００ｍｌの同培地にＯ．Ｄ．６
００が０．２になるよう接種し、３０°Ｃで培養時の菌
体量の増加を調べた（図６）。その結果、染色体分断株
は二株とも親株よりやや増殖が盛んであった。この結果
より、本染色体分断化法は、細胞増殖の点では酵母の生
理状態に悪影響を与えないことが示唆された。

【００４３】

【発明の効果】本発明者らは染色体の任意の部位で一本
の染色体を二本に分断し、その両方の分断染色体を保持
した一倍体酵母を作成する技術の開発に成功した。この
技術は一倍体酵母における新規な育種法を提供するのみ
ならず、酵母の有用形質遺伝子の染色体上での位置の大
まかな絞り込みを可能にし、従来の遺伝学的解析手法に
かかる労力を大幅に軽減する可能性がある。また、この
ような染色体の分断化が一倍体酵母で成功した事によ
り、交雑株及びそれより生成する分断染色体の脱落株を
応用して、有用形質をもたらす染色体領域を同定し、こ
れを他に導入することにより、性能の向上した酵母を育
種できる。また一倍体細胞の染色体分断化技術は、染色
体の部分的交換、”シャッフリング”も可能にし、染色
体脱落とこの方法を組み合わせて実用酵母の新規スクリ
ーニング法としても応用可能である。この方法の利点
は、減数分裂を経ずに染色体の特定領域の再構成を行え
ることから、有用遺伝子の組み合わせを乱すことがな
い。このことは、一倍体酵母の有用形質をもとに部分染
色体レベルで二倍体酵母の目的形質を設計しつつ育種が
できることを意味しており、ポストシークエンシング時
代の実用酵母育種技術として大いに期待される技術であ
ると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】使用プラスミドの構造図

【図２】染色体分断化プラスミドｐＣＳＶ１の構築図

【図３】染色体分断化の機構図（Ａ：ｐＤＷ１８による
第ＸＩ染色体の分断、Ｂ：ｐＤＷ１０による第ＶＩＩＩ
染色体の分断）

【図４】ｐＤＷ１８による第ＸＩ染色体の分断染色体の
確認 左２レーンがエチジウムブロマイドによる染色体断片の
染色、右４レーンが サザンブロッティングの結果を使
用プローブ毎にまとめたもの。中２レーンはＵＲＡ３遺
伝子断片（１．１ｋｂ）をプローブにして行ったサザン
ブロッティングの結果、そして右２レーンはＧＣＮ３遺
伝子断片（３．３ｋｂ）をプローブにして行ったサザン
ブロッティングの結果である。左より２レーン毎に、レ
ーン１が親株、レーン２が染色体分断化クローンであ
る。

【図５】ｐＤＷ１０による第ＶＩＩＩ染色体の分断染色
体の確認 左２レーンがエチジウムブロマイドによる染色体断片の
染色、右４レーンがサザンブロッティングの結果を使用
プローブ毎にまとめたもの。中２レーンはＵＲＡ３遺伝
子断片（１．１ｋｂ）をプローブにして行ったサザンブ
ロッティングの結果、そして右２レーンはＹＨＲ０８８
遺伝子断片（３．７ｋｂ）をプローブにして行ったサザ
ンブロッティングの結果である。左より２レーン毎に、
レーン１が親株、レーン２が染色体分断化クローンであ
る。

【図６】染色体が分断化されたクローンと親株の増殖比
較 ○：ＹＰＨ８０（親株） △：ＹＭＨ４３１（第ＸＩ染色体分断化クローン） □：ＹＭＨ４３２（第ＶＩＩＩ染色体分断化クローン） 縦軸：培地の菌体濁度、横軸：培養時間

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【手続補正書】

【提出日】平成８年９月２０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 佐野 公一郎 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社食品総合研究所内 (72)発明者 脊黒 勝也 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社食品総合研究所内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵母セントロメア、酵母細胞内で発現す
   るマーカー遺伝子、及び、末端が向き合うように配置さ
   れた２つのテロメアが、酵母染色体上への組み込み標的
   ＤＮＡ断片が切断されて得られる２つのＤＮＡに挟まれ
   た構造を有する直鎖上ＤＮＡを一倍体酵母細胞内に導入
   し、前記酵母染色体上への組み込み標的ＤＮＡ断片と該
   ＤＮＡと相同な染色体上の領域との相同組み換えが生じ
   てさらに前記染色体上での末端側が向き合うように配置
   された２つの酵母テロメアの解離が生じた酵母を選択す
   ることを特徴とする酵母の製造法。
2. 【請求項２】 請求項１記載の工程に加え、分断された
   染色体の一方が脱落した酵母細胞を選択することを特徴
   とする酵母の製造法。
3. 【請求項３】 請求項２記載の工程に加え、目的の形質
   を獲得した酵母細胞を選択することを特徴とする酵母の
   製造法。
4. 【請求項４】 請求項２記載の工程に加え、分断された
   染色体のうち脱落した一方を同定することを特徴とする
   目的形質を支配する染色体領域を同定する方法。
5. 【請求項５】 請求項４記載の方法によって同定された
   分断染色体の一方を、任意の酵母菌株に導入することを
   特徴とする酵母の製造法。
6. 【請求項６】 請求項１記載の工程に加え、選択された
   酵母を異なる接合型の一倍体酵母と交雑させて二倍体酵
   母を得、その中から分断された染色体の一方が脱落した
   酵母を選択することを特徴とする酵母の製造法。
7. 【請求項７】 請求項６記載の工程に加え、目的の形質
   を獲得した酵母を選択することを特徴とする酵母の製造
   法。
8. 【請求項８】 請求項６記載の工程に加え、分断された
   染色体のうち脱落した一方を同定することを特徴とする
   目的形質を支配する染色体領域を同定する方法。
9. 【請求項９】 請求項８記載の方法によって同定された
   分断染色体の一方を、酵母に導入することを特徴とする
   酵母の製造法。
10. 【請求項１０】請求項１、２、３、５、６、７又は９記
    載の方法によって製造される酵母。
11. 【請求項１１】請求項１０記載の酵母を用いた飲食品の
    製造法。