JPH0242359A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １及上二且月至１ 本発明は、酵素などで標識した標識抗体と、担体に吸着
可能にせしめた抗体で、該抗体を吸着可能な担体の存在
下に、これらの抗体で抗原をサンドインチするか、また
は、該抗体で抗原をサンドインチ後に、該抗原抗体複合
体を担体に吸着きせることを特徴とする免疫測定法に関
する。即ち、溶液状態で抗原抗体反応せしめることを特
徴とするサンドイッチ免疫測定法に関する。さらに本発
明は、上記測定法において、同一のエピトープを認識す
る抗体で抗原をサンドインチすることを特徴とするサン
ドインチ免疫測定法に関し、末法は、多量体となる抗原
、例えば、α−ＡＮＰの逆平行２量体であるβ−ＡＮＰ
などの特異的な測定に有効である。また、本発明は、β
−心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（β−ＡＮＰ）の
免疫測定法に関する。詳細には、同一のエピトープを認
識する抗α−ＡＮＰ抗体でβ−ＡＮＰをサンドイッチす
ることを特徴とする免疫測定法に関し、心、肺、泌尿器
疾患の診断に有用である。

え米立韮盗 従来のサンドイッチ免疫測定法においては、酵素やラジ
オアイソトープで標識した抗体と、担体に固定化した固
定化抗体とで、抗原がサンドイッチされる。

また、従来のサンドイッチ免疫測定法において同一のエ
ピトープを認識する抗体を用いる方法としては、同一の
モノクローナル抗体を用いてＩＦＮ−７を測定し、ＩＦ
Ｎ−７が多量体であることが示きれた例がある（　Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓｅａｒ
ｃｈ　５：４４５−４５３　（１９８５）　）　、但し
、この系においては、ラジオアイソトープ標識抗体と担
体に固定化された抗体が用いられている。即ち、同一の
エピトープを認識する遊離の溶液状態の抗体を用いて抗
原をサンドインチする方法は、全く知られていなかった
。

心房中で利尿作用、ナトリウム利尿作用、血管緊張低下
作用を有するポリペプチドが見出され、α−１β−１７
−心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（α−ＡＮＰ、β
−ＡＮＰ、７−ＡＮＰ）と呼ばれている（　Ｒｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒａｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ。

（以下ＢＢＲＣと略記）　１１８．１３１−１３９　（
１９ｇ４）　；Ｎａｔｕｒｅ　３１３．３９７−４００
　（１９８５）　）　、α−ｈＡＮＰは２８アミノ酸残
基からなり（第１図参照）、Ｎ端から７番目のＣｙ　ｓ
　［７］と２３番目のＣｙ　ｓ　［２３］がジスルフィ
ド結合しており、その間の配列がリング状構造をなして
いる。α−ｒＡＮＰ（ラットα−ＡＮＰ）は、α−ｈＡ
ＮＰ（ヒトα−ＡＮＰ）ではＮ端から１２番目の残基が
Ｍｅｔであるのに対し、α−ｒＡＮＰではＩｌｅである
点でのみ異なっている（ＢＢＲＣ１１７，８３９−８６
５，１９８３）、β−ｈＡＮＰは、２分子のα−ｈＡＮ
Ｐがジスルフィド結合した、いわゆるα−ｈＡＮＰの逆
平行二量体である（特開昭６Ｏ−１８４０９８）、７−
ｈＡＮＰは１２６アミノ酸残基からなり、そのＣ端にα
−ｈＡＮＰ配列を有する。７−ｈＡＮＰは心房中に保存
されているものであり、血液中でα−ｈＡＮＰとＮペプ
チドに分割される（　Ｈｙｐｅｒ−ｔｅｎｓｉｏｎ　８
　（ｓｕｐｐｌ、　　１＞、　　ｌ−１５１−１５５（
１９８６））。α−ｈＡＮＰとβ−ｈＡＮＰは、心臓、
肺または泌尿器に疾患のある患者の血漿中で増加するこ
とが示された（　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃ
ａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ。

印刷中）。

α−ＡＮＰの測定法としては既に抗血清を用いたラジオ
イムノアッセイが確立きれている＜５ｃｉｅｎｃｅ　２
２ｇ、３２３−３２５．１９８５ｉ　Ｎａｔｕｒｅ　３
１４．２６４−２６６、ｔ９ｓｓ；　ＢＢＲＣ１２４，
８１５−８２１，１９８４；　ＢＢＲＣ１２杢、６６３
−６６８．１９８４；　ＢＢＲＣ１２５，３１５−３２
３，１９８４）。

また、α−ｈＡＮＰを認識するモノクローナル抗体とし
ては１１Ａ−Ａｌ　ｌが知られている。該抗体はラット
のＡＮＰの一種であるアトリオベブチン■を抗原として
得られたもので、そのエピトープはジスルフィド結合を
含むＣｙｓ［７］−３ｅｒ　［２５］の間に存在し、即
ちＡＮＰのリング構造の一部であろうと考えられている
。但し、該抗体の親和性はＭｅｔ［１２、ヒトコと１１
ｅ［１２、ラットコ間で差がなく、ｒＡＮＰとｈＡＮＰ
を認識する（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ、　３８．１９
９１−１９９７．１９８６）。

血漿α−ｈＡＮＰの高感度なサンドインチ酵素免疫測定
法が報告されており（特願昭６２−２１８６６２）、そ
の検出限界は０．６ｎｇ／ｌである。

これは、フロセミド投与後の血液量減少状態における血
漿α−ｈＡＮＰの測定さえも可能にした。

しかし、この測定法はβ−ｈＡＮＰと交差反応性を示す
、また、血漿β−ＡＮＰの測定を可能にする特異的なβ
−ＡＮＰの免疫測定法は未だ報告されていない。本発明
は血漿中のβ−ＡＮＰの新規で特異的なサンドイッチ酵
素免疫測定法を提供するものである。

明が　　しようとする 従来の同相化抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法にお
いては、固相化抗体を用いるがゆえに、その抗原抗体反
応における立体障害などにより反応効率が低下する場合
がある。

また、同一のモノクローナル抗体を用いて多量体を測定
しようとする試みは成きれているが、固定化抗体が用い
られており、本実施例で示されるとおり、固定化抗体を
用いると、本発明の測定法に較べて測定限界が高くなる
ことがある。

α−ＡＮＰの測定に関しては、上記のように様々な報告
が成されており、これらの測定系がβ−ＡＮＰと交差反
応性を示すことが明らかにされている。しかしこれらは
α−ＡＮＰを測定しようとするものであり、β−ＡＮＰ
に特異的な系ではなく、これまでβ−ＡＮＰに特異的な
測定系は全く知られていなかった。

−を　　するための　段 本発明は、酵素などで標識した標識抗体と担体に吸着可
能にせしめた溶液状態の抗体で、該抗体を吸着可能な担
体の存在下に、抗原をサンドイッチするか、または、該
抗体で抗原をサンドインチ後に、該抗原抗体複合体を担
体に吸着させることを特徴とする免疫測定法に関し、即
ち、溶液状態で抗原抗体反応せしめることを特徴とする
サンドインチ免疫測定法に関する０本法は、溶液状態で
抗原抗体反応がなされるために、固相化抗体を用いた場
合の立体障害など、反応効率を低下させる因子を減少さ
せることができ、測定感度が向上される。この測定法は
、従来用いられていた固相化抗体の代わりに、担体に吸
着可能にせしめた遊離の抗体を使用するだけでよい。よ
って、従来の同相化抗体を用いるサンドイッチ免疫測定
法によって測定されていた抗原は全て、本測定法により
測定できる。

本発明はまた、同一のエピトープを認識する、標識抗体
および担体に吸着可能にせしめた遊離の抗体を用いて抗
原をサンドイッチし、該抗原抗体複合体を担体に吸着さ
せる、または、担体の存在下にサンドイッチすることを
特徴とするサンドイッチ免疫測定法に関する。即ち、本
発明は、同一のエピトープを認識する抗体で、特定物質
の多量イ本（オリゴマーやポリマー）をサンドイッチす
ることを特徴とする。単量体は同一のエピトープを認識
する抗体ではサンドインチきれないため、同一のエピト
ープを認識する抗体を用いるサンドインチ法では、多量
体を特異的に測定することが可能であり、単量体とは全
く交差反応性を示さない。

本発明に用いる抗体としては、特定の抗原を認識するモ
ノクローナル抗体および抗血清いずれでも使用できる。

単量体である抗原を測定しようとする場合には、異なる
エピトープを認識する異なる抗体を使用すべきである。

同一のエピトープを認識する抗体を用いて、特定抗原の
多量体を測定しようとする場合には、その単量体を認識
する抗体を使用することができ、モノクローナル抗体や
抗血清などいずれでも使用できる。この測定系では、全
く同一のモノクローナル抗体を用いるのが好ましいが、
同一のエピトープを認識する抗体、および、その認識す
るエピトープに重なる部分がある抗体であればよい、即
ち、この方法は多量体を測定しようとするものであり、
単量体には同時に結合できない抗体を２１用いれば多量
体を特異的に測定することができる。よって、本明細書
において同一のエピトープを認識する抗体とは、エピト
ープに重なる部分があり、同時に単量体には結合できな
い抗体をも意味する。

本発明の測定法に用いられる抗体としては、モノクロー
ナル抗体を産生ずるハイブリドーマをマウス腹腔中で増
殖させ得られた腹水や抗血清をＤＥＡＥ−セルロースカ
ラムやプロティンＡ−セファロースカラムに付すことに
より得られる精製イムノグロブリン、さらにペプシンで
消化して得られるＦ（ａｂ’）を断片、また、さらに２
−メルカプトエチルアミンなどで還元して得られるＦａ
ｂ°断片などを用いることが可能である。ＩｇからのＦ
ａｂ’の調製については、ジャーナル・才ブ・イムノア
ッセイ［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙコ、土、２０９
〜３２７（１９８３）に詳細な説明があり、本発明にお
いても、同様の手法を利用することができる。

本発明の測定法のサンドイッチに用いる抗体の一方は、
発光物質、螢光物質、ラジオアイソトープまたは酵素に
よる標識抗体とする。標識には発光物質、螢光物質、ラ
ジオアイソトープを用いることも可能であるが、測定の
安全性、簡便き、施設などの点から、酵素による標識が
好ましい。抗体（精製イムノグロブリン、Ｆ（ａｂ’）
ｍｌＦｒ片、Ｆａｂ’断片などを含む）は、架橋剤を介
して酵素で標識する。抗体の標識酵素としては、アルカ
リ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ペル
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが利用可能
である。また、架橋剤としては、Ｎ、Ｎ’−ｏ−フェニ
レンジマレイミド、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、６−マレ
イミドヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸・Ｎ−スクシンイ
ミドエステル、４．４’−ジチオジピリジン、その他公
知の架橋剤が利用可能である。これらの架橋剤と酵素お
よび抗体との反応は、それぞれの架橋剤の性質に応じて
、既知の方法に従って行なえばよい。

サンドインチに用いる他方の、担体に結合可能にせしめ
た遊離の抗体としては、適切なハブテンで標識した抗体
、抗原で標識した抗体、抗体で標識した抗体、アビジン
またはビオチンで標識した抗体などが挙げられる。ハブ
テンや抗原で標識された場合には、それらを認識する抗
体で担体をコートし、抗体で標識した場合にはそれと結
合する抗原で、アビジンで標識した場合にはビオチンで
、ビオチンで標識した場合にはアビジンで、それぞれ担
体をコートすればよい、上記のハブテンのうちでは、ジ
ニトロフェノールなどが好ましい。該抗体と結合可能な
担体の存在下に、上記標識抗体および担体と結合可能な
抗体と特定物質を反応せしめ、または、該反応後に抗原
抗体複合体を担体に吸着せしめ、該担体に結合した酵素
活性を測定することにより特定抗原またはその多量体を
特異的に測定することができる。

固定化に用いる担体としては、通常の免疫測定法に使用
きれる市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスまた
は合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボー
ル）、チューブ、プレートなどを用いることができる。

吸着は、通常、リン酸緩衝液中、ｐＨ６〜１０、好まし
くは中性付近で室温下に一夜放置することにより行なう
。

実施例に示されるとおり、本測定法は、従来の固定化抗
体を用いるサンドイツチ法よりも感度が高い。

きらに本発明は、血液中のβ−心房性ナトリウム利尿ポ
リペプチド（β−ｈＡＮＰ、α−ｈＡＮＰの逆平行二量
体）の新規で特異的なサンドインチ免疫測定法に関する
。即ち、本発明は、同一のエピトープを認識する抗α−
ＡＮＰ抗体でβ−ＡＮＰをサンドイッチすることを特徴
とする。α−および７−ＡＮＰは単量体であるため同一
のエピトープを認識する抗体ではサンドイッチされない
、よって、同一のエピトープを認識する抗体を用いるサ
ンドインチ法では、β−ＡＮＰを特異的に測定すること
が可能であり、α−および７−ＡＮＰとは全く交差反応
性を示きない。

本発明に用いる抗体としては、α−ＡＮＰを認識するモ
ノクローナル抗体を使用することができ、例えば前記の
１１Ａ−Ａｌ　ｌ、α−ｈＡＮＰのリング構造部分を認
識するＫＹ−ＡＮＰ−１（特願昭６２−２１８６６２）
、およびα−ＡＮＰのＮ端部分を認識するＫＹ−ＡＮＰ
−Ｉ（特願昭６３−４７２８０）などが挙げられるが、
これらに限定されるものではなく、例えばα−ＡＮＰの
Ｃ末端を認識するものなど、α−ＡＮＰ（α−ｒＡＮＰ
、α−ｈＡＮＰを含む）を認識するものであれば何れも
使用可能である。また、α−ＡＮＰを認識する抗血清を
用いることも当然可能である。本発明の測定系では、全
く同一のモノクローナル抗α−ＡＮＰ抗体を用いるのが
好ましいが、同一のエピトープを認識する抗体、および
、その認識するエピトープに重なる部分がある抗体であ
ればよい。即ち、本発明の方法は多量体を測定しようと
するものであり、単量体には同時に結合できない抗体を
２種用いれば多量体を特異的に測定できる。よって、本
明細書において同一のエピトープを認識する抗α−ＡＮ
Ｐ抗体とは、エピトープに重なる部分があり、同時にα
−Ａ、Ｎ　Ｐには結合できない抗体をも意味する。

上記のモノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−１を産生ずる
ハイプリドーマＫＹ−ＡＮＰ−Ｉは１９８７年８月２０
日から英国Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ。

５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　ＳＦ３０ＪＧ、のＰＨＬＳ　Ｃ
ｅｎｔｒｅ　ｆｏｒＡｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ　＆　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃａ１ｌ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　（ＥＣＡＣＣ）に受託番号８７０
８２００１としてブダペスト条約に基づき寄託されてい
る。モノクローナル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉを産生するハ
イプリドーマＫＹ−ＡＮＰ−１［は１９８８年２月２日
から茨城系つくば南東１丁目１番３号の工業技術院微生
物工業技術研究所にＭｏｕｓｅ　ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　
ＫＹ−ＡＮＰ−ｎ、微工研条寄第１６９５号（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−１６９５）としてブダペスト条約に基づき寄
託されている。

１１Ａ−Ａｌ　ｌおよびＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩは、ヒトお
よびラットのα−ＡＮＰ（α−ｒＡＮＰおよびα−ｈＡ
ＮＰ）と結合するので、これらのモノクローナル抗体を
本発明に適用すれば、β−ｒＡＮＰおよびβ−ｈＡＮＰ
の測定が可能である。ＫＹ−ＡＮＰ−１はα−ｈＡＮＰ
を特異的に認識するため、β−ｈＡＮＰの特異的な測定
に適している。即ち、用いるモノクローナル抗体の選択
により、ヒトおよびラットのみならず、すべてのタイプ
のβ−ＡＮＰの測定が可能である。

本発明の測定法に用いられる抗体としては、モノクロー
ナル抗体を産生ずるハイプリドーマをマウス腹腔中で増
殖させ得られた腹水や抗血清をＤＥＡＥ−セルロースカ
ラムやプロティンＡ−セファロースカラムに付すことに
より得られる精製イムノグロブリン、さらにペプシンで
消化して得られるＦ（ａｂ’）、断片、また、きらに２
−メルカプトエチルアミンなどで還元して得られるＦａ
ｂ′断片などを用いることが可能である。１ｇからのＦ
ａｂ’の調製については、ジャーナル・オブ・イムノア
ッセイ［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　］、４．２０
９〜３２７（１９８３）に詳細な説明があり、本発明に
おいても、同様の手法を利用することができる。

本発明の測定法のサンドイッチに用いる抗α−ＡＮＰ抗
体の一方は、発光物質、螢光物質、ラジオアイソトープ
または酵素による標識抗体とする。標識には発光物質、
螢光物質、ラジオアイソトープを用いることも可能であ
るが、測定の安全性、筒便さ、施設などの点から、酵素
による標識が好ましい。抗体（精製イムノグロブリン、
Ｆ（ａｂ’）、断片、Ｆａｂ’断片などを含む）は、架
橋剤を介して酵素で標識する。抗体の標識酵素としては
、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが
利用可能であるが、本発明においては、特にホースラデ
イツシュペルオキシダーゼ（西洋わさびペルオキシダー
ゼ）が好ましく用いられる。また、架橋剤としては、Ｎ
、Ｎ’−〇−フェニレンジマレイミド、４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン酸−Ｎ−スクシンイミド
エステル呟　６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシン
イミドエステル、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル、４．４’−ジチオ
ジピリジン、その他公知の架橋剤が利用可能である。こ
れらの架橋剤と酵素および抗体との反応は、それぞれの
架橋剤の性質に応じて、既知の方法に従って行なえばよ
い。

サンドインチに用いる他方の、担体に結合可能にせしめ
た抗α−ＡＮＰ抗体としては、次式で示される官能基： 式中Ｒ，およびＲ２は、Ｎｏ、、ＣＨ，Ｏ，Ｃ８Ｈ，、
ＦｌＣｌ、Ｂｒ、　ＬまたはＨｌＹはｃｏ、　ｏｃｏ、
　ｓｏ２または単結合を表わす。

なとの適切なハプテンで標識した抗体、抗原で標識した
抗体、抗体で標識した抗体、アビジンまたはビオチンで
標識した抗体などが挙げられる。ハプテンや抗原で標識
された場合には、それらを認識する抗体で担体をコート
し、抗体で標識した場合にはそれと結合する抗ぶで、ア
ビジンで標識した場合にはビオチンで、ビオチンでｍ識
した場合にはアビジンで、それぞれ担体をコートすれば
よい、上記のハプテンのうちでは、ジニトロフェノール
が最も好ましい、該抗体と結合可能な担体の存在下に、
上記標識抗体および担体と結合可能な抗体とβ−ＡＮＰ
を反応せしめ、担体に結合した酵素活性を測定すること
によりβ−ＡＮＰを測定することができる。

また、サンドイッチに用いる他方の抗α−ＡＮＰ抗体と
しては、当然、従来からよく用いられている、担体に固
定化した、固定化抗α−ＡＮＰ抗体を用いることもでき
る。即ち、酵素などで標識した抗α−ＡＮＰ抗体と固定
化抗α−ＡＮＰ抗体でβ−ＡＮＰをサンドイッチして、
担体に結合した酵素活性を測定することによりβ−ＡＮ
Ｐを測定することができる。

本発明においては、前者の測定法の検出限界は後者のも
のの１／３〜１／１０程度であり、感度が高かった。

固定化に用いる担体としては、通常の免疫測定法に使用
される市販の抗原抗体反応用担体、例えば、ガラスまた
は合成樹脂製の粒状物（ビーズ）あるいは球状物（ボー
ル）、チューブ、プレートなどを用いることができる。

吸着は、通常、リン酸緩衝液中、ｐＨ６〜１ｏ、好まし
くは中性付近で室温下に一夜放置することにより行なう
。

本発明においては、α−ｈＡＮＰのＭｅｔ［１２コ残基
を含むリング構造のＮ端側半分を認識するモノクローナ
ル抗体ＫＹ−ＡＮＰ−１が用いられた。β−ｈＡＮＰは
、精製抗（ジニトロフェニル化牛血清アルブミン）Ｉｇ
Ｇでコートされたポリスチレンボールの存在下に、ジニ
トロフェニル化抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’とペルオキ
シダーゼ標識抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’と反応きせ、
ポリスチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を
螢光法で測定した。この測定法はβ−ｈＡＮＰに特異的
で、α−ｈＡＮＰおよびｙ−ｈＡＮＰに交差反応性を示
さない。この系におけるβ−ｈＡＮＰの検出限界は、６
０　ｆｇ　（１０ａｍｏｌ）であり、３０μｍの血漿を
用いる場合には２　ｎｇ　（０，３３ｐｍｏｌ）／１で
あった。この値は、β−ｈＡＮＰを抗α−ｈＡＮＰ　　
ＩｇＧ、でコートしたポリスチレンボールとペルオキシ
ダーゼ標識α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ′と反応させる従来
のサンドイッチ酵素免疫測定法と比べてかなり低いもの
であった。

また、本発明には、上記と全く同様にして、ＫＹ−ＡＮ
Ｐ−１ｔも適用できることが示された。

牛血清アルブミン（１００ｍｇ、　ｆｒａｃｔｉｏｎ　
Ｖ、Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃ
ｏ、、Ｋａｎｋａｋａｅ。

１１１ｉｎｏｉｓ　）を２　ｍｌの０．１　ｍｏｌ／１
のリン酸ナトノウム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、１
００　ｍｍｏｌ／１のＮ−エチルマレイミドを含む２ｍ
ｌのＯ，１ｍｏｌ／１リン酸ナトリウム糧衝液（ｐＨ６
，０）と共に、３０℃で３０分間インキュベートする。

その反応溶液を、０．１　ｍｏｌ／１のリン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，０）に対して４℃で一夜透析する。

牛血清アルブミンの量は、２８０　ｎｍにおける吸光度
から求めた。

星よ」口１１直Ａ 測定に使用きれた緩衝液Ａは、上記の１ｇ／ＩＮ−エチ
ルマレイミド処理牛血清アルブミン、０゜３　ｍｏｌ／
１塩化ナトリウム、０．２　ｍｍｏｌ／１システィン、
１　ｍｍｏｌ／Ｉ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび百方ＫＩＵ／
　ｌのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｉ　）を含む１０　ｍｍｏｌ／１　リン
酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１７．０）である。

抗α−ｈＡＮＰ　　Ｉ　　Ｇ。

モノクローナル抗α−ｈ　Ａ　Ｎ　Ｐ　　１　ｇ　Ｇ　
ｌとして、ＫＹ−ＡＮＰ−１が用いられた一１ｇＧ＋は
、プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ、　Ｕ
ｐｐｓａｌａ。

５ｗａｄ＠ｎ　）を用いて調製した。得られたＩ　ｇ　
Ｇ　＋を酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，２，０，１ｍ
ｏｌ／ｌ）　１ｍｌに対して５℃で透析する。透析した
ＩｇＧ＋溶液に、０．０５ｍ１（容量１／２０）の塩化
ナトリウム水溶液（２ｍｏｌ／１）を加える。この溶液
に、ブタ胃粘膜由来のペプシン（０，２ｍｇ／１０　ｍ
ｇ　ＩｇＧ　）を加え、溶解する。混合物を３７℃で１
５〜２４時間反応させる０次いで、水酸化ナトリウム水
溶液（１ｍｏｌ／１）でｐＨ８に調整し、セファデック
スＧ−１５０のカラム（１，０〜１．５　ｍｌに対して
１，５ｘ４５　ｃｍ、　２．０〜２．５　ｍｌに対して
２．Ｏｘ　４５　ａｍ）にかけ、ホウ酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ８，０，０，１ｍｏｌ／１）で溶出し、Ｆ（ａ
ｂ’）ｔを得る。

Ｆ（ａｂ’）ａをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０
゜０゜Ｌ　ｍｏｌ／１）　０．４５　ｍｌに溶解する。

コレニ用時調製した５　ｍｍｏｌ／１のＥＤＴＡを含む
２−メルカプトエチルアミン／リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６，０，０，１ｍｏｌ／１）　０．０５　ｍｌを
加え、３７℃で１．５時間反応きせる０次いで、反応混
合物をセファデックスＧ−２５のカラム（１ｘ３０ｃｍ
）にかけ、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０，Ｏｌ
ｌ　ｍｏｌ／１　；　　５　ｍｍｏｌ／１のＥＤＴＡ含
有）で溶出し、Ｆａｂ　’を得る（ジャーナル・才ブ・
イムノアッセイ［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙコ、　４
、２０９〜３２７（１９８３）参照）。

ジニトロフェニル化抗α−ｈＡＮＰ　　Ｉ　　Ｇ、＆Ｆ
　　ａｂ’ 、メルカプトスクシニル化抗α−ｈＡＮＰＩ　ｇ　Ｇ　
１およびＦ（ａｂ’）＊ Ｓ−アセチルメルカプトフハク酸無水物（牛丼化学）を
用いて抗α−ｈＡＮＰ　　ＩｇＧ、およびＦ（ａｂ’）
ａにチオール基を導入した。ｔ［ｃｌおよびＦ（ａｂ’
）ｔに導入されたチオール基の平均は、それぞれ、９．
９および８．９であった。

ｉ、マレイミド−ジニトロフェニル−し−リジン ５．５　ｍｍｏｌ／１ジニトロフェニル−し−リジン塩
酸塩（東京化成工業〉を含む０．１　ｍｏｌ／１リン酸
ナトリナナトリウム緩衝液７．０）　０．９　ｍｌを５
　ｍｍｏｌ／１６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スクシ
ンイミドエステルを含む０．１ｍｌのＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミドと共に３０℃で３０分間インキュベートし
た。

ｉ、ジニトロフェニル化抗α−ｈＡＮＰＩｇＧ、、Ｆ（
ａｂ’）、およびＦａｂ’０．４ｍｇの上記メルカプト
スクシニル化抗α−ｈＡＮＰ　　ＩｇＧ、またはＦ　（
ａ　ｂ　’　）　＊を、５ｍｏ１／Ｉ　ＥＤＴＡを含む
０．２ｍｌの０．１　ｍｏｌ／１リン酸ナトリナナトリ
ウム緩衝液、０）に溶解し、０５ｍ１の上記マレイミド
−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン溶液と、３０°Ｃで３
０分間反応させた０反応液を、０．１　ｍｏｌ／ｌ　リ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７０）を用いるセファデッ
クスＧ−２５カラム（１，ＯＸ　３０　ａｍ）によるゲ
ル濾過に付したｅＩｇＧ＋およびＦ（ａｂ’）ｍに導入
されたジニトロフェニル基の平均数は、それぞれ、６．
４および８．６であった。

ジニトロフェニル化抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆ（ａｂ′）、
を還元してＦａｂ’を得た。そのＦａｂ　’　（０，３
ｍｇ＞を５　ｍｍｏｌ／Ｉ　ＥＤＴＡを含むＱ、１ｍｏ
ｌ／１リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）　０．１
　ｍｌに溶解し、上記マレイミド−ジニトロフェニル−
し−リジン溶液０．４ｍｌと３０℃で３０分間反応させ
た０反応溶液を、０．１　ｍｏｌ／ｌリン＃緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）を用いて、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　（Ｌ
ＫＢ、　Ｓｔｏｋｈｏｌｍ。

Ｓｗｅｄｅｎ）のカラム（１，Ｏｘ　３０　ｃｍ）によ
るゲル濾過に付した。Ｆａｂ’に導入されたジニトロフ
ェニル基の平均数は５．３であった。

ジニトロフェニル化　血清アルブミン−セファロース４
Ｂ 上記のジニトロフェニル化抗α−ｈＡＮＰ　　ＩｇＧ＋
の調製と同様にして、牛血清アルブミン（２０ｍｇ、　
ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ　、　Ａｒｍｏｕｒ　Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ、）にジニトロフェニル基を導
入した。牛血清アルブミン１分子当りに導入されたジニ
トロフェニル基の平均数は５．５であった。そのジニト
ロフェニル化牛血清アルブミン（１０ｍｇ）をシアン化
臭素活性化セファロース４　Ｂ　（１ｇ、　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　ＡＢ）に結合
させた。

抗（ジニトロフェニル化牛血清アルブミン　エＧの精製 ウサギ抗ジニトロフェニル化牛血清アルブミン抗血清（
ＩＣＮ　ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、　Ｌｉ
５ｌｅ。

１１１ｉｎｏｉｓ）から、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍ
ｍｕｎｏａｓｓａｙ　４．２０９−３２７　（１９８３
）に記載の方法に従って、ＩｇＧを調製した。そのＩｇ
Ｇ２７ｍｇを、１ｇ／ｌアジ化ナトリウムを含有する４
　ｍｌの０．１　ｍｏｌ／１リン酸ナトリナナトリウム
緩衝液７．０）に溶解し、ジニトロフェニル化牛血清ア
ルブミン−セファ０−ス４Ｂのカラム（０，５５ｘ　１
．７　ｃ＋ｎ）に、同緩衝液を流速１　ｍｌ／ｈで用い
てアプライする。特異ＩｇＧは、３．２　ｍｍｏｌ／１
塩酸（ｐＨ２，５）により流速６０ｍ１／ｈで溶出した
。溶出物に、１　ｍｏｌ／１　リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７゜０〉を直ちに加えて中和した。精製ＩｇＧの
量は２．３ｍｇであった。

！　Ｇ・コート・ポリスチレンボール ポリスチレンボール（３，２ｍｍ、　Ｐｒｅｃｉｓｉｏ
ｎＰｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１ｌ　Ｃｏ、　＞　５０個を０
．１　ｍｏｌ／１　リン酸ナトリウム緩衝液＜ｐ）１７
．０＞　１　ｍｌに入れ、精製抗（ジニトロフェニル化
牛血清アルブミン）ＩｇＧ　（０，１８／ｌ）またはモ
ノクローナル抗α−ｈＡＮ　Ｐ　　Ｉ　ｇ　Ｇ１（０，
１ｇ／ｌ）を加え、室温で一夜放置する。このポリスチ
レンボールを０．１　ｍｏｌ／１フン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７，０）で洗浄後、さらに０．１ｇ／ｌ牛血清
アルブミン、０．１　ｍｏｌ／１塩化ナトリウム、１ｇ
／ｌアジ化ナトリウムを含む１０　ｍｍｏｌ／１　リン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄し、冷蔵庫中
で保存する。

モノルローナル抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ”（ＫＹ−Ａ
ＮＰ−Ｉ　）を、６−マレイミドヘキサン酸・Ｎ−スク
シンイミドエステルを用いて、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで標識した。

西洋わさび・ペルオキシダーゼ２　ｍｇ　（５０ｎｍｏ
ｌ）をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０，０，１ｍ
ｏｌ／１）０．３ｍｌに溶かし、これに６−マレイミド
ヘキサン酸・Ｎ−スクシンイミドエステル０．３１　ｍ
ｇ（１０００ｎｍｏｌ）およびＮ、Ｎ−ジメチルホルム
アミド０．０３ｍ１からなる溶液を加え、３０℃でかき
まぜながら０．５〜１時間反応させる。次いで、上清液
をセファデックスＧ−２５のカラム（１，Ｏｘ　４５　
ａｍ）に通して、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０
，０，１ｍｏ　１／　１　）で、流速３０〜４０　ｍｌ
／ｈ、各フラクションの容量を０．５〜１．０ｍｌとし
て溶出する。底部にファインメツシュフィルターを有す
るセファデックスＧ　−５０（ｆｉｎｅ、　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）のカラム（１，Ｏｘ６゜４　ａｍ、　５　
ｍｌ）を上記緩衝液で平衡させ、試験管中で１１００Ｘ
で２分間遠心する。そのカラムに上記反応物（０，５ｍ
１）を付し、同様に遠心する。

得られたフラクションをマイクロコンセントレイター（
ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ−３０、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐ　
）中で、４℃、２０００Ｘｇで遠心することにより濃縮
する。

このようにして調製したマレイミド・ペルオキシダーゼ
結合物１．８　ｒｎｇ　（４５ｎｍｏｌ）をリン酸ナト
ノウム緩衝液（ｐＨ６，０，０，１ｍｏｌ／））に溶か
し、これに、Ｆｅｂ　’約２．０　ｍｇ　（４３ｎｍｏ
ｌ）を５　ｍｍｏｌ／１のＥＤＴＡを含有するリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６，０，０，１ｍｏｌ／１　）　
０．２〜０．４　ｍｌに溶かした溶液を加え、４℃で２
０時間または３０°Ｃで１時間反応させる。反応混合物
中のマレイミド−ペルオキシダーゼ結合物およびＦａｂ
’の最終濃度を５０〜１００μｍｏｌ／１とする。この
反応混合物をウルトロゲルＡｃＡ　４４のカラム（１，
５ｘ　４５　ａｍ）に通し、リン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ６，５，０，１ｍｏｌ／１）で溶出する。流速は０
．３〜０．５　ｍｌ／ｍｉｎとし各フラクション約１．
０ｍｌとする。こうして目的の抗α−ｈＡＮＰ　Ｆａｂ
’−ペルオキシダーゼ標識体を得た（ジャーナル・才ブ
・イムノアッセイ［Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　］
　４．２０９〜３２７（１９８３）参照）。

血漿サンプル 健常人の肘前静脈から午前９〜１０時に血液を採取した
。冷却したプラスチックシリンジ中の血液を、１ｚ容量
の１億力すクレイン不活性化単位／１アプロチニン（Ｓ
ｉｇｍａ）、０．１　ｍｏｌ／Ｉ　ＥＤＩＡおよヒ０．
１　ｍｏｌ／Ｉ　Ｎ−エチルマレイミドを含む冷却シリ
コンガラスチューブに移し、５００　Ｘ　ｇで１０分間
遠心して血漿を分離した。その血漿を、４ｚ容量の４　
ｍａｔ／１塩化ナトリウムと混合し、−２０℃で保存し
た。

サンドイッチ酸　免疫側　法 （１）１ステツプ法 標準β−ｈＡＮＰまたは血漿サンプルに前記緩衝液Ａを
加えて最終容量を０．１ｍｌとした。これを、０．０５
ｍ１の緩衝液Ａに溶解した１００　ｆｍｏｌジニトロフ
ェニル化抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’（またはＩｇＧ＋
）と　１００　ｆｍｏｌペルオキシダーゼ標識抗α−ｈ
ＡＮＰ　　Ｆａｂ’および精製ウサギ抗（ジニトロフェ
ニル化牛血清アルブミン）ＩｇＧでコートしたポリスチ
レンボール２個と、４℃で２４時間反応許せた。溶液を
除去した後、０．１ｍｏｌ／１の塩化ナトリウムを含む
１０　ｍｍｏｌ／１リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
０）　２　ｍｌを添加除去することによりポリスチレン
ボールを２回洗浄した。結合したペルオキシダーゼ活性
は、基質として３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピ
オン酸を用いて、３０°Ｃで６０分間測定した。螢光強
度は、５０　ｍｍｏｌ／１硫酸中の０．２ｍｇ／ｌキニ
ンと比較して、励起に３２０　ｎｍ、発光に４０５　ｎ
ｍを用い、島津スペクトロフルオロフォトメーター（Ｒ
Ｆ−５１０、島津製作所）で測定した。

（Ｚｌ　　２ステツプ法 モノクローナル抗α−ｈＡＮＰ　　ＩｇＧ、でフートし
た１個のボリスチレンポールヲ、０．１５　ｍｌの緩衝
液Ａ中のβ−ｈＡＮＰと反応させた。反応溶液を除去し
た後、そのポリスチレンボールを上記の方法で２回洗浄
し、０．１５ｍ１の緩衝液Ａ中で１００　ｆｍｏｌペル
オキシダーゼ標識抗α−ｈＡＮＰＦａｂ’と４℃で２４
時間反応許せた。結合したペルオキシダーゼ活性は、上
記と同様にして測定した。

槍１１」界 β−ｈＡＮＰの検出限界は、β−ｈＡＮＰの非存在下で
非特異的に結合したペルオキシダーゼ活性（バックグラ
ウンド）よりも明らかに大きなペルオキシダーゼ活性を
もたらしたβ−ｈＡＮＰの最小量で表わした。バックグ
ラウンドとの差異はｔ検定（Ｐ　Ｏ，０１，ｎ＝５）で
確認シタ。

１Ａ昨 α−ｈＡＮＰは単一ポリペプチドであり、７−ｈＡＮＰ
はそのＣ末端にα−ｈＡＮＰ配列を有する単一ポリペプ
チドであるのに対して、β−ｈＡＮＰは２つの同一ポリ
ペプチドからなるα−ｈＡＮＰの逆並性二量体である。

このような構造の違いから予測される通り、ジニトロフ
ェニル化抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’（またはＩ　ｇ　
Ｇ　＋　）およびペルオキシダーゼ標識抗α−ｈＡＮＰ
　　Ｆａｂ’を用いる本発明のβ−ｈＡＮＰのサンドイ
ッチ酵素免疫測定法では、α−ｈＡＮＰおよび７−ｈＡ
ＮＰに対する交差反応性は全く見られなかった。

典」しΣＬ挟 ジニトロフェニル北枕α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’および
ペルオキシダーゼ標識抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’を用
いる本発明のβ−ｈＡＮＰのサンドイッチ酵素免疫測定
法における、１〜３０μｍの血漿に添力ａされたβ−ｈ
ＡＮＰの希釈曲線は血漿非存在下のβ−ｈＡＮＰの標準
曲線と並行であった（第２図）、また、３０μｍの血漿
に１０〜１０００　ｎｇ／ｌのβ−ｈＡＮＰを添加した
場合のβ−ｈＡＮＰ（７）回収率は、８７〜１０６　％
　テあった。

α−および　−ｈＡＮＰの干渉 １００　ｆｍｏｌのジニトロフェニル北枕α−ｈＡＮＰ
　　Ｆａｂ’および１００　ｆｍｏｌのペルオキシダー
ゼ標識抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’を用いる本発明のβ
−ｈＡＮＰのサンドイッチ酵素免疫測定法においては、
β−ｈＡＮＰの標準曲線は、血漿中のｈＡＮＰの主要構
成成分であるα−ｈＡＮＰを１００　ｆｍｏｌまで添加
しても影響を受けなかった（第４図参照）、ｙ−ｈＡＮ
ｐはそのＣ末端にα−ｈＡＮＰ配列を有する構造である
ため、同様に、１００　ｆｍｏｌまでは影響を与えない
ものと推定できる。

血　β−ｈＡＮＰの′り　　囲 ジニトロフェニル北枕α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’および
ペルオキシダーゼ標識抗α−ｈＡＮＰ　　Ｆａｂ’を用
いる本発明のβ−ｈＡＮＰのサンドイッチ酵素免疫測定
法においては、β−ｈＡＮＰの検出限界は、６０　ｆｇ
　（１０ａｍｏｌ）／１ｕｂｅであり、３０μｍの血漿
を用いた場合には、２　ｎｇ　（０，３３ｐｍｏｌ）／
１であった（第２図）、希釈しない３０μｍの血漿を用
いた場合に測定し得る血漿β−ｈＡＮＰの最大量は、２
μｇ／ｌであった。ジニトロフェニル北枕α−ｈＡＮＰ
　　Ｆａｂ’の替わりにジニトロフェニル北枕α−ｈ　
Ａ　Ｎ　Ｐ　　１　ｇ　Ｇ　１を用いた場合には、β−
ｈＡＮＰの検出限界はやや高くなった。２ステツプによ
るサンドイッチ酵素免疫測定法におけるβ−ｈＡＮＰの
検出限界は、約３倍高くなった（０．１８９ｇ、　３０
μｍの血漿を用いた場合には６　ｎｇ／ｌ、第３図参照
）。

ＫＹ−ＡＮＰ−１［の適用 上記と全く同様にして、モノクローナル抗α−ＡＮＰ抗
体ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉを用いて、β−ｈＡＮＰを測定した
。その結果を第５図に示すが、明らかにＫＹ−ＡＮＰ−
ｍも本発明に適用することができる。ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ
Ｉを用いた場合にも、従来の２ステツプ法に較べて、１
ステツプ法の検出限界は約１０倍程低く、感度が高かっ
た。

【図面の簡単な説明】

第１図はα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列を示す。 第２図は、１ステツプ法によるβ−ｈＡＮＰの標準曲線
を示す。第３図は、２ステツプ法によるβ−ｈＡＮＰの
標準曲線を示す。第４図は、１ステツプ法におけるα−
ｈＡＮＰの干渉を示す、第５図は本発明の測定法にＫＹ
−ＡＮＰ−１１を適用した場合の標準曲線を示す。 光」しΣ級朱 本発明の測定法によれば、従来のサンドイツチ法よりも
高感度な測定が可能である。また、本発明は初めてβ−
ＡＮＰの特異的な測定を可能にするものであり、心臓、
肺、泌尿器疾患の診断に有用である。 第３図 （β−ｈＡＮＰ） β−ｈＡＮＰ　（ｆｍｏＪ／１ｕｂｅ）（β−ｈＡＮＰ
） Ｏｎｅ−５ｔｅｐ　（ＤＮＰ）　Ｒ−Ｒｏ、ｏ　ｉ ０．１　　　　　　１　　　　　　１０β−ｈＡＮＰ　
（ｆｍｏｊ／１ｕｂｅ）第４［器 ０．０１ ０．１　　　　　１　　　　　１０

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. （１）標識抗体および担体に吸着可能にせしめた抗体で
   抗原をサンドイッチすることを特徴とする免疫測定法。
2. （２）担体の存在下に該サンドイッチを行なうことを特
   徴とする請求項１に記載の測定法。
3. （３）該サンドイッチの後に抗原抗体複合体を担体に吸
   着させることを特徴とする請求項１に記載の測定法。
4. （４）同一のエピトープを認識する抗体を用いることを
   特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の測定法。
5. （５）該抗体がモノクローナル抗体であることを特徴と
   する請求項１〜４のいずれかに記載の測定法。
6. （６）該標識が酵素でなされることを特徴とする請求項
   １〜５のいずれかに記載の測定法。
7. （７）抗ジニトロフェノール抗体でコートした担体およ
   びジニトロフェニル化することにより担体に吸着可能に
   せしめた抗体を用いることを特徴とする請求項１〜６の
   いずれかに記載の測定法。
8. （８）該抗体が抗α−ＡＮＰ抗体であり、該抗原がβ−
   ＡＮＰであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか
   に記載の測定法。
9. （９）該抗α−ＡＮＰ抗体がＫＹ−ＡＮＰ−Ｉであるこ
   とを特徴とする請求項８に記載の測定法。
10. （１０）同一のエピトープを認識する、担体に固定化し
    た抗α−ＡＮＰ抗体と標識抗α−ＡＮＰ抗体でβ−ＡＮ
    Ｐをサンドイッチすることを特徴とするβ−ＡＮＰの免
    疫測定法。
11. （１１）該抗体がモノクローナル抗体であることを特徴
    とする請求項１０に記載の測定法。
12. （１２）該標識が酵素でなされることを特徴とする請求
    項１０に記載の測定法。