JPH0228558A - 超高感度特異的抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗原特異抗体の超高感度測定法に関する。

〔従来の技術〕

抗体の測定は感染症、自己免疫疾患等の検査に広く用い
られておシ、また、既に被検液中で抗原抗体複合体を形
成させた成分の測定は自己免疫疾患等の検査において重
要である。

従前、前述のごとき抗体の微量測定は、免疫学的測定に
よって行われている。近年、免疫学的測定法において、
担体を用いる方法が広く行われている。ＥＬＩＳＡ法、
ＩＲＭＡ法のごときサンドイタチ型測定法や競合型測定
法がある。

従来性われている抗体測定法は、抗原を不溶化した担体
の上に、被検液中の特異抗体をトラップし、これを標繊
抗イムノグロブリン抗体によシ測定する方法がある（第
１の技術）。まｆｃ。

抗イムノグロブリン抗体を不溶化した担体の上に特異抗
体をトラップし、これを標識抗凍を用いて測定する方法
がある（第２の技術）。

〔発明が解決しようとする課題〕

第１の技術の例としては、抗インスリン抗体の測定にお
けるり、Ｊ、ネル（Ｌ、Ｊ、Ｎｅｘｘ　）ら〔ダイアビ
ーチス（Ｄｉａｂｅｔｅｓ　）第５４巻、第６０頁（１
９８５））のインスリンを不溶化した担体に被検体液を
加え、結合したヒト抗インスリン抗体を酵素標識抗ヒト
イムノグロブリン抗体を用いて定量した報告がある。第
２の技術として、抗トキソグラズマＩｇＭ抗体の測定に
おける、Ａ、Ｍ、ジョンソン（Ａ、Ｍ、Ｊｏｂｎｓｏｎ
　）ら〔バソロジ−（Ｐａｔｈｏ’ｌｏｇｙ　）第１７
巻、第５８６頁（１？　８５　）”、）の抗ＩｇＭ抗体
不溶化同相を用すた報告があ゛る。

第１の技術では、被検体液中に通常多量の非特異イムノ
グロブリンが含まれており、これが同相に非特異的に吸
着するため標識イムノグロブリン抗体が結合し、測定の
バックグラウンドが高くなり測定感度が悪くなるという
欠点がある。第２の技術では、抗イムノグロブリン抗体
不溶化固相のイムノグロブリンをトラップする能力に限
定がある。もし％担体の能力を大きくすれば、その結果
、バンクグラウンドが大きくなる。いずれにしても高感
度化が困難である。

本発明の目的は、このような状況下、従前にない高感度
の測定法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は以下のいへの】、（Ｃ）及び（至）工程を包含
する仁とを特徴とする超高感度特異的抗体の測定法であ
る。

工程（Ａ）：次の（１り又は（ｂ）工程。

（＾、）被検液の測定すべき特異的抗体と、活性成分と
から構成される複合体を形成させた後、この複合体を担
体に結合させる工程。

（ｂ）　当該複合体を担体上で形成させる工程。

工程（ハ）：複合体が結合した担体を洗浄した後、担体
から前記複合体を解離させる工程。

工程（Ｃ）：この複合体を他の担体に結合させた殻、と
の担体を洗浄する工程。

工程（Ｄ）　：　（Ｃ）に記載の担体上の複合体を測定
する工程。

以下本発明について工程順に従い説明する。

工程（８）について 被検液としては、例えば、血清、血漿、髄液、唾液、尿
等の体液、緩衝液が挙げられる。測定すべき特異的抗体
としては、実質上、従来の免疫学的測定法で測定し得た
すべての抗体が挙げられる。例を挙げれば、抗核抗体、
抗ＤＮＡ抗体、抗ＥＮＡ抗体、リウマトイド因子、抗赤
血球抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗筋抗体、抗甲状腺
抗体（抗ミクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、
抗Ｔ８Ｈレセプター抗体）、抗インスリン抗体、抗イン
スリンレセプター抗体、抗アセチルコリンレセプター抗
体等の自己抗体やウィルス、微生物に対する抗体、イン
ターフェロンやヒト成長ホルモン等の蛋白製剤に対する
抗体、アレルギー疾患におけるアレルゲン抗体等である
。こ、ｈ。ら抗体は被検液中で遊離した状態のみではな
く免疫複合体、結合蛋白と結合した状態でも測定可能で
ある。

活性成分とけ、下記の１又は、１及び２である。

１、　抗原。ここで言う抗原とは、測定すべき抗体と抗
原抗体反応を生じさせる特異抗原、イブイオタイブ抗体
の様な成分をいう。

λ　上記抗原と抗原抗体反応を生じさせる成分。

（例えば測定すべき抗体とエビドーグの異なる抗体等） これらの活性成分は通常、工程内又は／及び工８（Ｃ）
での複合体と担体との結合に関与する官能基の１種又は
２種以上を結合させて用いても良い。

ここで官能基としては、例えば、ジニトロフェニル基又
はトリニトロフェニル基等のハプテン、ビオチン、　　
−８−８−結合を介して結合した測定すべき抗体及び対
応する抗原以外の抗体又は抗原、前記ハプテン又は前記
ビオチン、等が挙げられる。

官能基は、工程（８）で被検液中の成分で担体との結合
を阻害されず、工程（Ｂ）の洗浄で脱離しにくく、解離
の際には容易に解離するものが好ましい。工程（Ｃ１の
結合に関与する官能基は、工程の）で解離した溶液中か
ら効率良く他の担体に結合しうる官能基が好ましい。

また、これらの活性成分の一つは、工程（Ｊ））の測定
の際に利用される標識を結合させて用いても良い。標識
としては免疫学的測定において測定に利用されるいずれ
の物質でも良く、酵素、放射性物質、発光物質、蛍光物
質、金属化合物等が挙げられる。

例えば、酵素ではペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクト
シダ・−ゼ、アルカリホスファターゼ、放射性物質とｔ
ｙてはヨウ素、水素、蛍光物質としてはフルオレセイン
インチオシアネート、発光物質とし、ては、アクリジウ
ム塩等が挙げられる。

標識は必ずしも必要ではないが工程（ロ）の測定が簡単
にできるので望ましい。

これらの官能基、標識は、（Ａ）から（ト）の工程に影
４１を及ぼさないキャリヤーを介在させて抗原に結合さ
せても良い。活性成分が低分子の場合には、特にこの様
な介在が好ましい。キャリヤーとｊ−では、例えば非特
異ウサギＩｇＧ、ウシ血清アルブミン、デキストラン等
が挙げられる。

標識を結合させる方法としては、従来免疫学的測定法に
おいて抗体、抗原に標識を結合するいずれの結合方法で
も良い。

抗体と活性成分から構成される複合体の形成は、被検液
に１種又は２種以上の活性成分を加えて、通常の抗原抗
体反応に用いられる条件下に行われる。

一般には０〜４５℃、数時間〜数１０時間、好ましくは
、２０〜５７℃、１〜６時間で形成される。

このようにして形成された複合体は、担体に結合される
。

担体としては、従来の免疫学的側定法において使用され
ている物すべてを使用Ｉ〜うる。例えば、ポリスチレン
、ポリアクリル、テフロン、紙、ガラス、アガロース等
が挙げられる。１だ、その形状はどのようなものであっ
ても良い。

担体は、工程（Ａ）で形成される複合体を結合する丸め
、又は、担体上で複合体を形成さぜる／こめの、反応基
を有する必要がある。

担体に結合する反応基は、複合体中の測定すべき抗体、
活性成分、官能基、標識又は、複合体形成により新たに
生じた免疫活性部位に結合するものなら、いずれも反応
基として用いられる。

反応基としては、工程書）で複合体を容易に解離し得る
反応基が好ましい。

仁の様な反応基としては官能基に対応した通常のものが
挙げられるが、例えば、 １）官能基がジニトロフェニル基又はトリニトロフェニ
ル基等のハプテンのときは、これらに対する抗体が挙げ
られる。

２）官能基がビオチンのときは、アビジン又はストレプ
トアビジンが挙げられる。

５）官能基が一計Ｓ−結合を介した抗原又は抗体のとき
は、対応する抗体ヌは抗原が挙げられる。

反応基の担体への結合は、免疫学的測定における担体作
成の公知の方法で行われる。

複合体の担体への結合は、担体を用いる前記免疫学的測
定に通常用いられる条件が採用される。

被検液中に活性成分と、担体を同時に加えて、複合体形
成を担体上で行わせることは、工程を簡略にできるので
望塘しい。

工程中】について 洗浄は担体を用いる免疫学的測定に通常用いられる条件
が採用される。複合体の解離は、複合体を分解させずに
行つことが好ましく、複合体と担体との結合が抗原抗体
反応による時は、該抗原抗体反応の結合定数を複合体形
成の結合定数より小さくすることにより、酸、アルカリ
、高濃度無機塩等で複合体を解離することができる。

複合体を分解させずに担体より解離するより好ましい方
法は、複合体と担体との結合に関与する官能基と同一反
応部位を有する物質を加えることである。

例えば、官能基がジニトロフエ；ルの時には、ジニトロ
フェニルアミノ酸（例ニジニトロフェニルリジン）、官
能基がビオチンの時はビオチン、官能基が一〇−８−を
介して結合した抗原、又は抗体、ハプテン又はビオチン
等の時は−５−Ｓ−を切断する試薬が用りられる。

工程（Ｃ）　Ｋついて 担体は工程囚で挙げたものを用いる。

担体に結合する反応基は、複合体中の測定すべき抗体、
活性成分、官能基、標識又は、複合体形成によシ新たに
生じた免疫活性部位に結合するものなら、ｂずれも反応
基として用いられる。好ましい反応基としては、工程囚
で示した反応基の＃１か複合体中の測定すべき抗体、活
性成分、標識又は、複合体形成により新たに生じた免疫
活性部位に結合する反応基が挙げられる。

複合体中の測定すべき成分、活性成分と抗原抗体反応で
結合する反応基は官能基の導入を１つ省略できるので特
に好ましい。

反応基の選択は、工程（Ａ）で用いる反応基と同一の反
応基を用いた場合は、工程い）で解離した溶液から複合
体を分離する必要があり、この分離操作を省略するため
には工程（８）と異なる反応基を用いるのが好ましい。

この場合は（Ａ）の解離させる工程と（ｑの担体に結合
させる工程を同時に行うことができる。

複合体の担体への結合に際しては、工程い２と同様、担
体を用いる前記免疫学的測定に通常用いられる電性が採
用される。

上記のの）と（Ｃ）の工程に関しては、必要に応じて繰
返してもよい。

工程（１）ｌについて 担体上の複合体を測定するＫは、複合体中の測定すべき
抗体、活性成分、官能基、標識、複合体形成により新た
に生じた免疫活性部位に着目し既知の方法で測定する。

例えば、複合体中の測定すべき抗体、活性成分、官能基
に対するｅ、素、放射性物質、蛍光物質等を標識した抗
体を加え、洗浄後標識を測定する方法。

工程（８）で記した活性成分に導入した標Ｒを測定する
方法。

等が挙げられる。

後者の方法は操作が簡略で好まｊ７い。

以上、説明したように本発明は従来の免疫学的測定法で
測定しうる抗体を従来より＾感度で測定しうる。

代表的な実施の態様として次のものが挙げられる。

１、　活性成分として抗原を用いて、２種の官能基を結
合させておき、工程（Ａ）で官能基により担体に結合さ
せ、工程（Ｃ）で別の官能基で担体に結合させることに
より、非特異イムノグロブリンの担体への非特異結合を
、従来法よ多少なくし、工程（功で担体上の複合体中の
抗体を標識した抗抗体によって測定する。この時抗抗体
をイムノグロブリンのクラスを昭識できるものにすると
、抗体のイムノグロブリンのクラスを区別して測定でき
る。

λ　活性成分として抗原を用いて、官能基と標識を結合
させておき、工程（Ａ）で官能基にょシ担体に結合させ
、工程（ｑで抗抗体が結合した担体を用いることにより
、標識を結合した抗原の担体への非特異結合を少なくｌ
、、工程（Ｄ）で担体上の複合体中の標識を測定する。

この時抗抗体をイムノグロブリンのクラスを［＆できる
ものにすると、抗体のイムノグロブリンのクラスを区別
して測定できる。

五　抗体の一部が被検液中で抗原−抗体複合体を形成１
〜でいる時は１、活性成分として抗原と抗体を用いる。

抗原を加え遊離の抗体も含めて抗原−抗体複合体を形成
せしめ、官能基と標識を結合した抗体を加えて抗体−抗
原−抗体複合体を形成せしめ、工程（８）で官能基によ
り担体に結合させ、工程（ｃ）で測定すべき抗体に対す
る抗抗体を結合した担体を用いることにより、標識を結
合した抗体の担体への非特異結合を少なくし、工程の）
で担体上の複合体中の標識を測定する。

この時抗抗体をイムノグロブリンのクラスｔｇ魔できる
ものにすると、抗体のイムノグロブリンのクラスを区別
して測定できる。

また、被検液中の抗原−抗体複合体のみを測定したい場
合、抗原を加えずに上記の操作を行えは良い。

〔実施例〕 以下、本発明を実施例で説明するが、 はこれに限られるものではない。

実施例−１ 本発明 ＋ｌ）　　マレイミド−非特異ウサギＩｇＧの磨製非特
異ウサギＩｇＧ　ＫＮ−サクシニミジル−６−マレイミ
ドヘキサノエートを用い、公知の方法〔橋田ら、ジャー
ナル・オブ・アプライド・バイオケミストリー（Ｊ、　
Ａ、ｐｐｌ、　Ｂｊ、ｏ−ｃｈｅｍ　）第６巻、第５６
頁（１９８４））に従って、マレイミド基を導入した。

導入されたマレイミド基の数は、非特異ウサギＩｇ０１
分子当シ１６個であった。

（２）Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミンの
調製 ４４　ｍＭ　　ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
〔ザイムド　ラボラトリーズ社（ＺｙｍｅａＬａｂｏｒ
ａｔｏｒ−ｊ、ａｓ　Ｉｎｃ、　）、す／７２ンシスコ
、カリフォルニア州〕Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド液
Ｑ、ｌｄど４４ｍＭ２−メルカプトエチルアミンとＳ　
ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
、ｐＨ７ｏ、ｔｏ−とを５０℃、３０分反応させ、ＩＭ
Ｆリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７，０、ａ、、１ゴを加えた
。

（３）　　ビオチニル−非特異ウサギＩｇＧの調製（１
）で調製したマレイミド−非特異ウサギＩｇＧ１０１１
１９とＳ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む、［１１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨＡ、ｏ、２．０−に（２）で調製し
たＮ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミン液０．
２２−を加えて、５０℃、５０分反応させた。更に、［
１１Ｍ２−メルカプトエチルアミンα０５−を加え、セ
ファデックスＧ、　−２５（ファルマシア社）によシケ
ルろ過を行った。

マレイミド基の減少から導入されたビオチン分子の数を
計算すると、ＩｇＧ　１分子当り９．７個であった。

（Ａ）　　メルカプトサクシニル−ビオチニル−非特異
ウサギＩｇＧの調製 （３）で調製したビオチニル−非特異ウサギＩｇＧにＳ
−アセチルメルカプトサクシニック・アンハイドライド
（牛丼化学、京都）を用いて、公知の方法〔石川ら、ジ
ャーナル・オブ・イムノアッセイ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｅａｙ　）第４巻、第２０９頁（＋Ｓ＋Ｓ５）］に
従ってチオール基を導入した。導入されたチオール基の
数は、ビオチニル−非特異ウサギＩｇＧ　１分子当シ１
７個であった。

（Ａ）　　マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン
の調製 ５、５　ｍＭ　ジニトロフェニル−Ｌ−リジン塩酸塩（
東京化成、東京）を含む０．１ＭＩＪン酸ナトジナトリ
ウム緩衝液７．０．１．０　ｄと５゜５ｍＭ　Ｎ−サク
シニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを溶かし九
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド［Ｌｌ−とを５００．５
０分反応させた。

（６１ジニトロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩ
ｇ（）の調製 （Ａ）で調製したマレイミド−ジニトロ７エ二ルーＬ−
リジンＱ、５９１Ｒｔと（Ａ）で調製したメルカプトサ
クシニルービオチニルー非特異ウサギＩｇＣ）　４．４
　Ｉｎ９とＳ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む、［１１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨＡ０、五１−とを５０℃、５０
分反応させた後、セファデックスＧ−２５を用いてゲル
ろ過を行った。

導入されたジニトロフェニル基の数は、非特異ウサギＩ
ｇ（）　１分子当り７．５個であった。

（７）　　マレイミド−インスリンの調製＋１１と同様
にして調製した。

（８）　　ジニトロフェニル−ビオチニル−非特異ウサ
ギＩｇＧ−インスリン結合物の調製（））で調製したマ
レイミド−インスリン（１，２〜）とＳｍＭＥＤＴＡを
含む、ＣＬＩＭリン酸ナトジナトリウム緩衝液　　６．
０、α５−と（６）で調製したメルカプトサクシニル−
ジニトロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩｇＧ（
［１７５１９）と５ｍＭｇＤＴＡを含むＯＩＭすｙａナ
ト・リウム緩衝液、ｐＨ＆０、［Ｌ２＋ｄとを４℃、２
００時間反応せて、ウルトロゲルＡｃＡ　５４（ＬＫＢ
社製、スエーデン）によシゲルろ過を行った。

Ｂ１本発明方法による抗インスリン抗体の測定ウサギ（
抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブン）　ＩｇＧ不溶
化ポリスチレンボール（直径５２ｍ１＝グレシジヨｙ社
、シカゴ、イリノイ州）を従来法〔石川ら、スカンジナ
ビアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ａｃａｎａ
、　ｔＴ、Ｉｍｍｕ、ｎｏＬ　）第８巻（補７）、第４
５頁（１９７Ｂ））に従って調製し、これを非特異ウサ
ギＩｇＧ　２〜／−１＋１７１　　ウシ血清アルブミン
、Ｑ、Ｉ　Ｍ　　ＮａＣ１゜１　ｔ　／　ｌ　　ＮａＮ
１を含む（１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，
０（Ａ液）中に、２０℃、５時間放置した。このポリス
チレン・ボールを、ヒト血清（検体）（ＬＯｌｄ、ジニ
トロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩｇＧ−イン
スリン結合物５０　ｆｍｏｌと非特異ウサギＩｇＧα５
〜・を含む上記Ａ液０．０９ｍ／、ＩＭＮａＣｔと１２
／ｌウシ血清アルブミンとを含む０．０１Ｍリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ７，０、Ｑ、０５７！とを２０ｃ。

４時間反応させた。その後、ポリスチレン・ボールをｃ
ＬＩ　Ｍ　　ＮａＣｔを含む０．０１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐａ；ｙ、ｏ（Ｂ液）で２回洗浄しｆｔ−後
、　　１　ｍＭ　ジニトロフェニル−Ｌ　−リシンと非
特異ウサギＩｇＧ　ｌ　５　ｒｎｇｆ含むＡ液Ｑ、１５
−を加えて室温で一夜放置した。ボリスチレ／・ボール
を除去した後の液に、上記と同様に′Ａ製したアビジン
不溶化ポリスチレン・ボールを入れて、２０℃、５時間
反応させた。その後、ポリスチレン・ボールをＢ液で２
回洗浄した。この固相に結合した抗インスリンＩｇＧを
西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒ）　Ｉｇ
Ｇ　Ｆａｂ’を用いて測定した。標ＲＦａ、ｂ’　５０
　ｎｆ、ＣＬｌＭＮａＣｔ、　１　ｔ　／　ｌウシ血清
アルブミンを含む（１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、
ｐＨ７，０、α１５−中で２０℃、５０分反応させた後
、Ｂ液で２回洗浄して、同相に結合したペルオキシダー
ゼ活性を従来法〔今月ら、アナリテイカル・レターズ（
Ａｎａｌ、　Ｌｅｔｔ。）第１６巻、第１５０？頁（１
９８５））により測定した。結果を第１図に示す。

Ｃ０従来法による抗インスリン抗体の測定既報〔河野ら
、ジャーナル・オプ・バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｅｈｅｍ、　）　　第９８巻、第５７９頁、（１９８
５）］の方法に従い、インスリン−ウシ血清アルプミン
不溶化ボリスチ１／ン・ボール（直径工２鰭、プレシジ
ョン社、シカゴ、イリノイ州）と検体血清とを５７℃、
５時間反応させ、洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ標識（抗ヒトＩｇＧ　）　Ｆａｂ’と反応させて測
定した。結果を第１図に示す。

すなわち第１図はインスリンによる治療を受けた患者の
血清を健常者の血清で希釈して、本発明方法及び従来法
で抗インスリン抗体を測定した結果を、健常者血清によ
るインスリ／治療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に
結合したペルオキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）
との関係で示すグラフである。

第１図に示すように、本発明方法では前述の第１の技術
による従来法に比べ、約１千倍の超高感度で抗インスリ
ン抗体の測定が可能である。

実施例−２ ＩｇＧは硫酸ナトリウムによる塩析どＤＥＡＥセルロー
ズを用い、Ｆ（ａｂ’）ｓはＩｇＧのベズシン消化によ
り、Ｆａｂ’はＦ（ａｂ’）１の還元により、それぞれ
公知の方法〔（石川ら、ジャーナル・オブ・イムノアッ
セイ（前出）〕により調製した。

ペルオキシダーゼ活性の測定 ペルオキシダーゼ活性は、５−（Ａ−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオン醗を基質として、公知の方法で蛍光光学
的に測定した〔今月ら、アナリテイカル・レターズ（前
出）〕。蛍光光度は、５０ｍＭ＠酸に溶解した１■／ｌ
キニーネを標準として測定した。

１、　マレイミド−非特異ウサギＩｇＣ１＋７）調製非
特異ウサギＩｇＧ　１２〜を溶解したロ、ＩＭ！、１ン
酸ナトリウム酸部トリウム緩衝液、１０ｄと２７．５ｍ
ＭＮ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエート
（前出）を含むＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド０．２１
ＩＩ７！とを３０℃、５０分反応させた。反応後セファ
デックスＧ−２５（ファルマシア社）によシゲルろ過を
行った。カラムサイズは１．　ＯＸ　５０　ｃｍ、溶出
液にはＳ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１　Ｍ　リン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ４０を用いた。導入されたマレイ
ミド基の数は、非特異ウサギＩｇＧ　１分子当シ１６個
であった。

２、Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミンの調
製 ４４　ｍＭ　　ピオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシミド（
ザイムド　ラボラトリ−社（Ｚｙｍｅｃｌ　Ｌａｂｏ−
ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、　）、す／７ランシスコ、
カリフォルニア州）を含むＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド液ａ１−と４４ｍＭ２−メルカプトエチルアミン、５
　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む（ＬＩＭリン酸すトリウム緩
衝液、ｐＨ７，０１１６０ｄとを５θＣ％５０分反応さ
せ、Ｉ　Ｍ　）　＋７ス・塩酸緩衝液、Ｘ）Ｉ（ＺＯ。

Ｑ、１ゴを加えた。

五　ビオチニル−非特異ウサギＩｇＧの調製１４で調製
したマレイミド−非特異ウサギＩｇ０１０〜を溶解した
５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨｔｏ、ＺＯ献に２−で調製し九Ｎ−ビオチニル
ー２−メルカグトエチ／Ｉ／アミン液０６２２ゴを加え
て５０℃、５０分反応させた。史に、０．１Ｍ２−メ／
＋７カブトエチルアミンと５ｍＭＥＤＴＡを含ｂ　ＣＬ
　Ｉ　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，０、Ｏ，０
５ゴを加え、セファデックスＧ−２５（ファルマシア社
）によシゲルろ過を行った。カラムサイズは１．０Ｘ５
Ｑｔｙｓ、溶出液にはＱ、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
、　ｐＨ７，５を用いた。Ｖレイミド基の減少から導入
されたビオチン基の数を計算すると、非特異ウサギＩｇ
０１分子当り９．７個であった。

歳　メルカプトサクシニルービオチニルー非特異ウサギ
ＩｇＧの調製 五で調製したビオチニル−非特異ウサギＩＥＧＫ８−７
セチルメルカプトサクシニツク・アンハイドライド（牛
丼化学、京都）を用いて、公知の方法〔石川ら、ジャー
ナル・オブ・イムノアッセイ（前出）〕に従ってチオー
ル基を導入した。導入されたチオール基の数は、ビオチ
ニル−非特異ウサギＩｇＧ　１分子当り１７個であった
。

５、　マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ　−ＩＪ　シ
ンの１４表 ５、５　ｍＭ　ジニトロフェニル−Ｌ−リジン塩酸塩（
東京化成、東京）を含む０．１　Ｍ　１７ン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７，０，１，０−とａ５ｍＭＮ−サクシ
ニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを含むＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミド（Ｌｉｗｔとを５０℃、３０分
反応させた。

＆　メルカプトサクシニル−ジニトロフェニル−ビオチ
ニル−非特異ウサギＩｇＧの調製＆で調製したマレイミ
ド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジン［１Ｌ５９−と屯で
調製したメルカグトザクシニルービオチニルー非特異つ
サギＩｇＧ４．４ηを溶解した５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを
含む１１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４０％　Ａｌ
ＩＭｌとを５０℃、５０分反応させた。反応後セファデ
ックスＧ−２５（７アルマシア社）によシゲルろ過を行
った。カラムサイズは１、Ｑｘ５０１Ｍ、溶出液には５
　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む（ＬＩＭリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨｔｏを用いた。導入されたジニトロ７エ二ル基
の数は、メルカグトサクシニルービオチニルー非特異つ
サギＩｇＧ　１分子当り７．５個であった。ジニトロフ
ェニル基の数は、５６０　ｎｍ　での吸光度から、モル
吸光係数１７．４００　ｍｏｌ−”　、　ｔ、ｃｍ’″
ｌとして求めた。

Ｚ　マレイミド−インスリンの調製 ブタインスリン（Ａ０ＩＵ／ｄ、アクトラピドＭＣ，ノ
ボ社）１−と４．４＋ｎＭＮ−サクシニミジル−６−マ
レイミドヘキサノエートを含むＮ。

Ｎ−ジメチルホルムアミドＣＬｔ−とを５０℃、５０分
反応させた。反応後セファデックスＧ　−２５（ファル
マシア社）によりゲルろ過を行つた。カラムザイズはｊ
、　Ｄ　Ｘ　５０ｃｍ、溶出液には５　ｍＭ　　ＥＤＴ
Ａを含むｒＪ、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，
［］を用いた。導入されたマレイミド基の数は、ブタイ
ンスリン１分子当すＯ，２５個であった。インスリンの
数は、２８０ｎｍでの吸光度から、吸光係数０．９ｆ−
１−４−１１、分子量５，７７８として求めた。

ａ　ジニトロフェニル−ビオチニル−□　非％Ｍ　ウサ
ギＩｇＧ−インスリン結合物の調製 ｌで調製したマレイミド−インスリン１．２■を溶解し
た５ｍＭＥＤＴＡを含む１１１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ６，０，１１５Ｔｎｌと＆で調製したメルカプ
トサクシニル−ジニトロフェニル−ビオチニル−非特異
ＩｇＧ　（１分子当ジチオール基７個）［１，７５■を
溶解した５　ｍＭ　ｇＤＴＡを含むα１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ＆０、α２−とを４Ｃ，２０時間反応
させた。反応後、ウルトロゲルＡＣＡ５４（ＬＫＢ、ス
トックホルム、スエーデ／）によりゲルろ過を行った。

力２ムサイズはｔ　５　Ｘ　４５　ｃｍ、溶出液は［１
１Ｍリン酸すトリウム緩衝液、ｐＨ６，５を用いた。導
入されたインスリンはジニトロフェニル−ビオチニル−
非特異ウサギＩｇＧ　を分子５９５８個であった。ジニ
トロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩｇＧの数は
５６０　ｎｍの吸光度から、インスリ／の数は２８０　
ｎｍ　の吸光度から求めた。

ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　
ＩｇＧ溶液（Ｑ、１ｆ／ｌ）又はアビジン溶液（口、ｌ
ｆ／／、）を用いてポリスチレンボール〔直径Ａ　２　
ｖｍ　（プレシジョン・プラスチックボール社、シカゴ
）〕表面上に公知の方法で〔石川ら、スカンジナビャン
・ジャーナル・オブ・イムノロジー（前出）〕物理的吸
着により不溶化した。

不溶化同相の前処理 不溶化同相は公知の方法〔河野ら、ジャーナル・オブ・
バイオケミストリー（前出）〕で非特異ウサギＩｇＧで
前処理して用いた。

ウサギ（抗ヒトＩｇＧγ鎖）　Ｆａｂ’は、Ｎ−サクシ
ニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを架橋剤とし
て、公知の方法で〔橋田ら、ジャーナル・オブ・アプラ
イド・バイオケミストリー（前出）〕ペルオキシダーゼ
標識した。

デキストラン・チャーコールの調製 デキストラン・チャーコールの調製は、デイクソンの方
法〔デイクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ　）　、クリニカル　
ケミストリー（Ｃｈｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　）　　第２０
巻、第１２７５頁（＋９７４））に以下の改良を加えて
調製したヒト血Ｙｇアルブミン及びノーリットＮＫ’ｉ
、それぞれウシ血清アルブミン及びノーリットＡ（半片
化学、京都）に変更した。

テキストラン・チャーコール　サスペンション１−には
乾燥１薫６０〜のデキストラン・チャーコールを含んで
いた。

インスリンによる治療を受けた糖尿病患者血清を健常者
の血清で撞々の倍率に希釈した検体Ｑ、０７５−にＣＬ
２Ｍ　　ＨＣｔ、　ＣＬＯ１５−を加えてｐＨ＆ｏに調
製した。デキストラン・チャーコール　サスペンション
α０５７５　ｓｇｅ加、ｔ、　５分かくはん後、５０ｍ
Ｍ　ＮａＯＨ１１０ｔ　５ゴを加えて中和した。反応液
を１，５００ｘ９，１５分遠心分離した。その後、上澄
液を同様の条件で遠心分離した。

抗イ／スワン抗体の測定 デキストラン・チャーコール処理した検体α０９５−を
、ｌ　５　％　ＮａＮ３、五１ＭＮａＣｔ、α５ラウシ
崩清アルブミンを含む１１０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７Ｏ１（１０１５−と、１，５チ非特異つサギ
ＩｇＧ％　α１　％　ＮａＮ３．０．１ＭＮａＣ１，及
びａ１％ウシ血清アルブミンを含むαＯＩＭリン酸ナト
リウム緩衝液、ｐＨ７，０゜１０２１Ｒｔと、ジニトロ
フェニル−ビオチニル非特異ウサギＩｇＧ−インスリン
結合物５０ｆｍＯ１を溶解した１１％ＮａＮ３　％Ｑ、
　Ｉ　Ｍ　　ＮａＣ１及びα１うウシ血清アルブミンを
含む１１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，０、
α口２ｗｄ、と共に５７℃、８時間反応後、更に室温で
一夜放置した。

ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　
ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボールを加えて更に２０℃、
４時間反応させた。その後ポリスチレンボールを２４の
ＣＬ　Ｉ　Ｍ　ＮａＣｔを含む１０１Ｍ　リン酸ナトリ
ウム緩衝液、　　ｐＨ７，０にて２度洗浄した後、α１
％ＮａＮ３、（ＬＩＭＮａＣ２％（Ｌ２チ非特異ウウサ
ギｇＧ及び１１１％ウシ血清アルフミンを含む（ＬＯ’
ｉＭリン酸ナトリタナトリウム緩衝液、０、（Ｌ１５ｓ
ｄ！に溶解したジニトロ７エ二ルーＬ　　ＩＪレジン　
５０　ｎｍｏｌを加え室温で一夜放置した。ポリスチレ
ンボールを除去した後の液に、アビジン不溶化ポリスチ
レンボールを入れて、２０℃、５時間反応させた。その
後、ポリスチレンボールを２−のα１Ｍ　　ＮａＣ１を
含ｔｒαＤＩＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐａｚｏにて
２度洗浄した。（ＬＩＭＮａＣｔ及び１１チウシ血清ア
ルブミンを含むＣＬＯ１Ｍリン酸ナトリタナトリウム緩
衝液Ｏ１０，１５−に溶解したウサギ（抗ヒトＩＥＧ　
ｒ鎖）　Ｆａｂ’−ペルオキシダーゼ５０　ｎｆ　を加
えて２０Ｃにて５時間反応させた。上述と同様にボリス
チｌ／ンボールを洗浄後、ポリスチレンボールに結合し
たペルオキシダーゼ活性を５０℃にて１０分反応後測定
した。　１０３倍希釈まで測定可能であった。結果を第
２図に示す。

比較例−２ ペルオキシダーゼ活性の測定、ウサギ（抗ヒト１ｇＧｒ
鎖）　Ｆａｂ’−ペルオキシダーゼの調製、被検血清の
デキストラン・チャーコール処理は実施例−２の方法に
従った。

インスリン−ウシ血清アルプミン不溶化固相の調製 実施例−２の方法と同様の方法でウシ血清アルブミン（
１，Ｏｆ／ｌ）をポリスチレンボールに不溶化し、グル
タルアルデヒドを用いる公知の方法〔河野ら、ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（前出）で活性化した後
、インスリｙ′ｔＣ反応させて′ｆＡ製した。

抗インスリン抗体の測定 実施例−２でデキストラン・チャーコール処理した検体
を、（Ｌ　１　％　ＮａＮ３．　ｌ　Ｊ　Ｍ　　ＮａＣ
１、及び１１％ウシ血清アルブミンを含む１３１Ｍリン
酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０で５．５　Ｘ　１０’
倍希釈した。この希釈血清［Ｌｔ５７！と、インスリン
−ウシ血清アルブミン不溶化ポリスチレンボールとを５
７℃、５時間反応させた。次に、ポリスチレンボールを
２−のαＩ　Ｍ　　ＮａＣ１を含む［１０１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７，０にて２度洗浄した後、ｌ　
ｌ　Ｍ　　ＮａＣｔ、及びｒＬ１チウシ血清アルブミン
を含む［１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ７，
０に溶解したウサギ（抗ヒトＩｇＧ　ｒ鎖）　Ｆａｂ’
−ペルオキシダーゼ５０ｎｆ　　を加えて５７℃にて５
時間反応させた。上述と同様にポリスチレンボールを洗
浄後、ポリスチレンボールに結合したペルオキシダーゼ
活性を５０℃にて１０分反応後測定した。１倍希釈まで
測定可能であった。結果を第２図に示す。

すなわち第２図は本発明方法及び従来法で抗インスリン
抗体を測定した結果を、健常者血清によるインスリン治
療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペルオ
キシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示す
グラフである。

血清中の抗イ／スリン抗体の測定において本発明による
実施例−２Ｆｉ、従来法である比較例−２よυ高感度で
測定可能である。

実施例−５ ペルオキシダーゼ活性の測定、ＩｇＧ不溶化固相の調製
、不溶化固相の前処理、デキストランーチャーコ・−ル
の調製は実施例−２の方法に従った。

ｔ　メルカプトサクシニル−ウシ血清アルブミンの調製 ウシ血清アルブミン（フラクション■、アーマ−社、カ
ンカキ−イリノイ州）に８−アセチルメルカプトサクシ
ニック・ア／／−＝イドライドを用いる公知の方法〔（
石川ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（前出）〕
によりチオール基を導入した。ウシ血清アルブミン１分
子当り導入された、チオール基の数は８．２個であった
。

λ　マレイミド−ジニトロフェニル−Ｉ、　＋　ＩＪリ
ジン調製 ５５　ｍＭ　ジニトロフェニル−Ｌ　−＋）　シン塩酸
塩、５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む１１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７，０，１，５−と１５ｍＭＮ−サクシ
ニミジル−６−マレイミドヘキサノエートを含むＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミドα、　１５　ｖｘｌとを５０℃
、５０分反応させた。

五　ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミンの調製 メルカプトサクシニルーウシ血清アルブミン５■、５ｍ
ＭＥＤＴＡを含むｃＬ１Ｍリン酸ナトジナトリウム緩衝
液＆ｏ、１．０　ｍとマレイミド−ジニトロフェニル−
Ｌ−リジン溶液１．５−とを５０ｃ、５０分反応させた
。反応液をセファデックスＧ−２５カラムによりゲルろ
過した。力２ムサイズは、ｔ５Ｘ４５ｉｙｍ、溶出液は
０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ＰＨ７，５を用いた
。

ウシ血清アルブミン１分子当シ導入されたシェド・ロフ
ェニル基の数は５５個であった。

４、メルカプトサクシニルージニトロフェニルーウシ血
清アルブミンの調製 Ｓ−アセチルメルカプトサクシニック・アンハイドライ
ドを用いる公知の方法〔石川ら、ジャーナル・オブ・イ
ムノアッセイ（前出）〕にヨリ、ジニトロフェニル−ウ
シ血清アルブミンにチオール基を導入した。導入したチ
オール基の数はウシ血清アルブミン１分子当り７．０個
であった。

１　マレイミド−インスリ／とマレイミド−ペルオキシ
ダーゼの調製 Ｎ−サクシニミジル−６−−ｆレイミドヘキサノエート
を用いる公知の方法〔橋Ｈ３ら、ジャーナル・オブ・ア
プライド・バイオケミストリー（前出）により、インス
リン（アクト２ビドＭＣ，、ノボ社、コペンハーゲン、
デンマーク）及び西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（グレ
ード！、ベーリンガ・−・マンハイム社、マンハイム、
西ドイツ）にマレイミド基を導入した。導入されたマレ
イミド基の数は、インスリン１分子当り（Ｌ？個、ペル
オキシダーゼ１分子当り、１．１個であった。

＆　ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン−インスリ
ン−ペルオキシダーゼ結合物の調製メルカプトサクシニ
ルージニトロフエニ）１１−ウシ血清アルブミン１．９
〜．５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含むα１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＩ（＋＆０１１１５ｍ！とマレイミド−イン
スリンｔ７１１１！ｉｉ＋、５ｍＭＥＤＴＡを含む１１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＆０、α５ｔｒｔとマ
レイミド−ペルオキシダーゼ１．７〜．５　ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡを含む［１１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＆
０、ＩＩＬ２−とを５０℃、２時間反応させた。反応液
をウルトロゲルＡｃＡ　４４のカラムによりゲルろ逼し
た。カラムサイズは１．５　Ｘ　４５ｍ、溶出液は（１
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，５を用いた。ウシ
血清アルブミン１分子当勺導入されたインスリン分子及
びペルオキシダーゼ分子の数はそれぞれ五８個と２．０
個であった。

蛋白−セファローズ４Ｂの調製 ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン及びヒトｘｇＧ
（ｖｏＷ１９）各々は、ファルマシアの手引ｆＫ従って
ＣＮＢｒ−活性化上７アローズ４Ｂ（１ｆ）に不溶化し
た。

ＩｇＧのアフィニティー精製 ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）　
ＩｇＧ　（マイルズ社、エルクルト、インデイアナ州）
及びウサギ（抗ヒトＩｇＧγ鎖）ＩｇＧ　（医学生物学
研究所）はそれぞれジニトロフェニル−ウシ血清アルブ
ミン及びヒトエｇＧ不溶化セファローズ４Ｂカラムを用
い、ｐＨ２，５で溶出する公知の方法〔何針ら、ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー、第１００巻、第１２
４７頁（１９Ｂ６））によりアフイニティ−精製した。

被検血清のデキストラン・チャーコール処理インスリン
による治療を受けた糖尿病患者血清を健常者の血清で種
々の倍率に希釈した検体１．０−に［Ｌ２ＭＨＣｔ　α
２−を加えてｐＨ４０に調製した。デキストラン・チャ
ーコール　サスペンションｃＬ５−を加え、５分かくは
ん後、５０　ｍＭ　ＮａＯＨα２−を加えて中和した。

反応液を、１，５００ｘｆ、１５分遠心分離した。その
後、上澄液を同様の条件で遠心分離した。

抗インスリ／抗体の測定 デキストラン・チャーコール処理した検体１０１９ｄ’
ｉジニトロフエニル−ウシ血清アルブミン−インスリン
−ペルオキシダーゼ結合物１５ｆｍＯ１とα５７％非特
異ウサギＩｇＧを溶解したαＩＭＮａＣｔ、及びα１％
ウシ血清アルブミンを含む（１０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７，０、（ＬＯ８１−と、ＩＭＮａＣｔ、
及びＣＬ１％ウシ血清アルブミンを含むＣＬ　０１　Ｍ
　ＩＪン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，０，１０５ｄと
、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロ７エ；ルーウ
シ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール
２個と共に２０℃、３時間反応させた。ポリスチレンボ
ー　ル′ｆ：１１１　Ｍ　　ＮａＣ１を含む１１０１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、　ｐＨ７，１１，２ｍで２回
洗浄した後、［１１Ｍ　ＮａＣＺ　ｓ及びα、１％ウシ
血清アルプミ／余含む［ＬＯＩＭリン酸すトリウＡ緩衝
液、ｐＨ７，０，％［）、１５ｄｌｃ溶解したジニトロ
フェニル−Ｌ　−ｉ　シンＩ　５０ｏｍｏｌ　ドア　フ
イニテイー精製つサギ（抗ヒトエｇａ　ｒ　＠）　Ｉｇ
Ｇ不溶化ポリスチレンボール２個と共に：ｚｏ℃、５時
間反応させた。アフィニティ・−精製ウサギ（抗ヒトＩ
ｇＧ　）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボールを上述と同
様に洗浄後、ポリスチレンボ・−ルに結合したペルオキ
シダーゼ活性を、５０Ｃ，１０分反応後測定した。１０
３倍希釈まで測定可能であった。結果を第５図に示す。

比較例−５ ペルオキシダーゼ活性の測定、ＩｇＧ不溶化固相の調製
は実施例−２の方法に従った。ウサギ（抗ヒトＩｇＧ　
ｒ鎖）　ＩＥＧの７フイニテイー精製、被検血清のデキ
ストラン・チャーコール処理は実施例−５の方法に従っ
た。

インスリン−ペルオキシダーゼの調製 １、　メルカプトサクシニルーインスリンの調製インス
リンに、Ｓ−アセチルメルカプトサクシニック・アンハ
イドライドを用いて実施例−２と同様の方法で、チオー
ル基を導入した。導入したチオール基はインスリン１分
子に１４６個であった。

Ｚ　インスリン−ペルオキシダーゼの調製５　ｍＭ　　
ＥＤＴＡを含む０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＆
０，５．７４に溶解したメルカプトサクシニル−インス
リン４１９ト、　　Ｓ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＆０１ＩＩＬ６−に溶解
した、実施例−５で調製したマレイミド−ペルオキシダ
ーゼ２．４■を４℃、２００時間反応せた。反応混合物
をウルトロゲルＡｃＡ　４４のカラムによフゲルろ過し
た。カラムサイズは２．ＯＸ　４０ｃｙ、溶出液はαＩ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，５を用いた。ペル
オキシダーゼ１分子に１．６個のインスリンが結合した
。

抗インスリン抗体の測定 実施例−５でデキスト２／・チャーコール処理した検体
を、０．１％ＮａＮ３．０１ＭＮａＣ４，及びα１％ウ
シ血清アルブミンを含む［１，０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝ｍ１ｐＨ７，０で２．６Ｘ＋０４倍希釈した。この
希釈血清［１１５−と、アフィニティー精製ウサギ（抗
ヒ）　ＩｇＧγ鎖）馳Ｇ不溶化ポリスチレンボールと共
に５７℃、５時間反応させた。ポリスチレンボール’ｉ
０．１ＭＮａＣＬ　を含むαＯｔＭすｙＩ！Ｉ！ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ７ｏ、２−で２回洗浄した後、ＣＬＩ
ＭＮａＣｌ　、及びα１チウシ血清アルブミンを含むα
０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，１１５１
１Ｉｔに溶解したインスリン−ペルオキシダーゼ結合物
５０　ｎｆ　を加えて５７℃、３時間反応させた。ポリ
スチレンボールを上述と同様に洗浄後、ポリスチレンボ
ールに結合したベルオキシグーゼ活性をＳａＣにて１ｎ
分反応後測定した。５×１０倍希釈まで測定可能であっ
た。

結果を第５図に示す。

すなわち第Ｓ図は本発明方法及び従来法で抗インスリン
抗体全測定した結果を、健常者血清によるインスリン治
療患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペルオ
キシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示す
グラブである。

血清中の抗インスリン抗体の測定において本発明による
実施例−５は、従来法である比較例−２，５より高感度
で測定可能である。

実施例−４ ペルオキシダーゼ活性の測定、　　ＩｇＧ不溶化固相の
調製、不溶化同相の前処理、ｌ　ｇＯ、Ｆ（ａｂ’）ｔ
　５Ｆａｂ’のルしＬ　ウサギ（抗ヒトＩｇＧ　γ鎖）
　Ｆａｂ’　−ペルオキシダーゼの調製は実施例−２の
方法に従ツタ。ジニトロフェニル−ウシ血清アルブミン
の調製、蛋白−七７アローズ４Ｂの調製、ＩｇＧのアフ
ィニティー精製は実施例−５の方法に従った。

サイログロブリンの精製 粗精製サイログロブリンは甲状腺より、硫酸アンモニウ
ムによる塩析〔ロイット（ＲＯｌｔｔ　）ら、ランセッ
ト（Ｌａｎｃｅｔ　）第１５巻、第１０２７頁（１９５
Ｂ））とＤＥＡＥセルローズによる〔火源ら、ジャーナ
ル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジー・アンド・
メタポライド（Ｊ。

Ｃ１ｎ、　ＥｎｃｌｃｒｉｎｏＬ　Ｍｅｔａｂ。）第５
２巻、第２５９頁（１９８１））にて精製した。

更に上述の精製サイログロブリン五〇■をウサギ（抗ヒ
トＩｇＧγ鎖）　ＩｇＧ不溶化セファローズ４Ｂカラム
（（Ｌ９ｘ５．５ｃｍ）’に用いて、α１チＮａＮ３を
含むＱ、ＩＭリン酸ナトリウム緩衝ｌＩ！ｊ、、ｐＨ７
，０で溶出した。次いでウルトロゲルＡｃＡ２２　（１
，５ｘ　４５　ｃｍ　）を用い、同様の緩備液で溶出し
た。精製の純度は、尿素を含むＳＤ８ポリアクリルアミ
ド電気泳動で確認した。サイログロブリン含ｔは、２８
０ｎｍ　での吸光度から、吸光係数１．　Ｏｆ−”　・
ｔ−ｃｍ−’として求めた。

ジニトロフエ二ルーサイログロプリンの調製１、　メル
カプトサクシニル−サイログロブリンの調製 ＃Ｉ製プサイログロブリン８−アセチルメルカプトサク
シニック・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石川
ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（前出）〕によ
りチオール基を導入した。１分子当り導入された、チオ
ール基の数は２０個であった。

Ｚ　マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンの調製 実施例−５と同様の方法で調製した。

五　ジニトロフェニル−サイログロブリンの調製 メルカプトサクシニル−サイログロブリン１５ｍ９を溶
解した５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むＣＬ１Ｍリン酸ナト
ジナトリウム緩衝液＆０．１０−と、マレイミド−ジニ
トロフェニル−Ｌ−リジン溶液（１０！ｌ−とを５０℃
、３０分反応させた後、同緩衝液に溶解し九（ＬＩＭ　
　Ｎ−エチルマレイミド５μｔを加えて５０℃１５分保
温した。反応液をセファデックスＧ−２５カラムにより
ゲルろ過し九。カラムサイズは、ｔＯｘ３１］画、溶出
液は（１１％Ｎａ馬を含む［ＬＩＭリン酸ナトリウム緩
衝液ｐＨ７，０を用いた。サイログロブリン１分子当り
導入されたジニトロフェニル基の数は１６個であった。

抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で種
々の倍率に希釈した検体ａ０２７！を、１５７５％非特
異ウサギＩｇＧ％　（１１％ＮａＮ３．０１Ｍ　　Ｎａ
Ｃ！及び１１％ウシ血清アルブミンを含む（１０１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０、Ｃ０８−に溶解し
たジニトロフェニルーサイロノロプリｙ　５０ｆｍｏｌ
と、１１％ＮａＮ３．　Ｉ　ＭＮａＣｌ、及び１１％ウ
シ血清アルブミンを含む１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７，０、α０５−と、アフィニティー精製ウサ
ギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミン）ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンボールｌｔ＝に２０℃、２０時間反
応させた。その後ポリスチレンポール奮２−のαＩ　Ｍ
　　ＮａＣ１を含む１０１　Ｍ　ＩＪン酸ナナトリウム
緩衝液ｐＨ７，０にて２度洗浄した。ｕ２チ非特異ウウ
サギｇＧ、［１１チＮａＮ５％（ｌ　ｌ　ＭＮａＣｌ、
及び１１％ウシ血清アルブミンを含む（１０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨｚｏ、０．１５−に溶解したジ
ニトロフェニル−Ｌ−リジン１５０ｎｍｏｌを加え２０
℃、５時間反応させた。ポリスチレンボールを除去した
後の液に、ウサギ（抗サイログロブリン）　ＩｇＧ不溶
化ポリスチレンボールを入れて、２０℃、５時間反応さ
せた。その後、ポリスチレンボールを上述と同様に洗浄
した。［１１Ｍ　　ＮａＣ１，及びａ、、１％ウシ血清
アルブミンを含む１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７，０，０，１５−に溶解したウサギ（抗ヒトＩｇＧ
　γ鎖）　Ｆａｂ’−ペルオキシダーゼ５０ｎｒｉ加え
て２０℃、５時間反応させた。

上述と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリスチレ
ンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を５０℃にて
１０分反応後測定した。１０ｓ倍希釈まで測定可能であ
った。結果ｆｊ：第４図に示す。

比較例−４ ベルオキシダ・−ゼ活性の測定、ＩｇＧ不溶化固相の調
製、ウサギ（抗ヒ！−ＩｇＧγ鎖）　Ｆａｂ’−ペルオ
キシダーゼの調製は実施例−２の方法に従った。サイロ
グロブリンの調製は実施例−４の方法ＣＣ従った。

サイロクロブリ／不溶化固相の調製 サイログロブリン（ｏ、ｉｒ／ｚ）を用いて実施例−２
と同様に、ポリスチレンボ・−ルに物理的吸着によｐ不
溶化した。

抗サイログログリン抗体の測定 抗ザイロクロプリン抗体を含む血清を健常者の血清で種
々の倍率に希釈した検体’ｘ、”ｔ％ＮａＮ３１．０１
ＭＮａ、Ｃｔ、及びＱ、１％ウシ血清アルブミンを含む
αＯＩＭリン酸ナトリウム緩′Ｏｉｉ液、ｐＨ７，Ｄで
ｔｘｔｏｌ’倍希釈した。この希釈血清１１５−ど、サ
イログロブリンネ清化ポリスチレンボールとを３７℃、
Ｓ時間反応させた。次に、２ｒＲｔの０．１ＭＮａＣｔ
を含むα、０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐｎｚｏに
て２度洗浄した後、（Ｌ　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１，及び（１
１％ウシ血清アルブミンを含むＣＬＯＩＭリン酸ナトリ
タナトリウム緩衝液７０（ＣＬ１５ｍ／）に溶解したウ
サギ（抗ヒトＩｇＧγ鎖）　Ｆａｂ’−ペルオキシダー
ゼ５０ｎ２を加えて５７℃にて５時間反応させた。上述
と同様にポリスチレンボールを洗浄後、ポリスチレンボ
ールに結合したペルオキシダーゼ活性を５０℃にて１０
分反応後測定した。５×１０倍希釈まで測定可能であっ
た。結果を第４図に示す。

すなわち第４図は本発明方法及び従来法で抗サイログロ
ブリン抗体を測定し九結果金、健常者血清によるバセド
ー病患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（縦軸）との関係で示
すグラフである。

実施例−５ ペルオキシダーゼ活性の測定、　ＩｇＧ不溶化固相の調
製、ビオチニノ・−非特異ウサギＩｇＧの調製、ウサギ
（抗ヒトＩｇＧ　γ鎖）　Ｆａｂ’−ベルオキシダ・−
ゼの調製は実施例−２の方法に従った。

蛋白−セファローズ４Ｂの調製、ＩｇＧの７フイニテイ
ー精製は実施例−５の方法に従った。サイログロブリン
の精製は実施例−４の方法に従った。

１、　メルカプトザクシニルー非特異ウサギＩｇＧの調
製 ０１１Ｍす／酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，５（１，５
−）に溶解した非特異ウサギＩｇＧ　（Ａ，０〜）にＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド（１１５−）に溶解し九〇
、１１Ｍ　　Ｂ−アセチルメルカプトサクシニック・ア
ンハイドライド（牛丼化学、京都）を添加し、５０℃に
て５０分間保温した。

保温後、１１１１Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，０（
［ｌ＋ｓ−）、１１１　Ｍ　ＥＤＴＡ％ＰＨ７，０（住
１−）及び１Ｍヒドロキシルアミン、　　ｐＨ７，０（
Ｃｌ３５ｄ）を添加し、５０℃にて１５分間保温したの
ち、５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１　Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ＆ｏにて平衡化した゛セファデックス
Ｇ−２５カラム（ｔ　ＯＸ　５０５！ｌ）を用いたゲル
ろ過を行い、メルカプトサクシニル−非特異ウサギＩｇ
Ｇｆ：、得た。導入されたチオール基は、非特異ウサギ
ＩＥＧ、　１分子当り１６個であった。

λ　マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−リジンの調製 ５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む［１１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７，０に溶解したａ　８　ｍＭ　ジニトロ
フェニル−Ｌ−リジン（ｔ５＝ｉ）（、ＩＩＥＸ化成、
Ｘｌ）ＫＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したａ８
ｍＭＮ−サクシニミジル−６−マレイミドヘキサノエー
ト（αｔ５ｍｇ）（同位化学、熊本）を加え、５０℃に
て３０分間保温し、マレイミド−ジニトロフェール−Ｌ
−リジンを調製した。

Ｓ　ジニトロフェニル−非特異ウサギＩｇＧの調製 ５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むα、１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ４０（ｔ８ｄ）に溶解したメルカプトサク
シニル−非特異ウサギＩｇＧ　（！ｈ　０ｍ９　）にマ
レイミド−ジニトロフェニル−Ｔ、　−１７ジン（１，
５＋ｄ）を加え５０℃にて５０分間保温した。

保温後Ｅｌ　Ｉ　Ｍ　リ：／酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７，ｒｌにて平衡化し念セファデックス０−２５カラム
（ｔ　ｏ　Ｘ　５０　ｃｍ　）を用いたゲルろ過を行い
、ジニトロフェニル−非特異ウサギＩｇＧを得た。導入
されたジニトロフェニル基は、非特異ウサギＩｇＧ　１
分子当５１１．９個であった。なお、ジニトロフェニル
基の定量は、分光光学的に行った。

４□　マレイミド−ジニトロフェニル−非特異ウサギＩ
ｇＧの調製 １１Ｍす／醒ナトリウム緩衝液、　　ｐＨ７，０（五ａ
＠／）に溶解したジニトロフェニル−非特異ウサギＩｇ
Ｇ　（２−４■）にＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（［
Ｌ３ｄ）Ｋ溶解した８８ｍＭＮ−サクシニミジル−６−
マレイミドヘキサノエートを添加し、５０℃にて５０分
間保温したのち、Ｓ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む（１１Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＆ｏにて平衡化したセファ
デックスＧ−２５カラム（１，Ｏｘ５０ｃｍ）を用いた
ゲルロ過ヲ行い、マレイミド−ジニトロ７二二ルー非特
異ウサギＩｇＧを得た。導入されたマレイミド基は、ジ
ニトロフェニル−非特異ウサギＩｇ０１分子当り１８個
であった。

５、Ｎ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミンの調
製 Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ａ２ｍｇ）に溶解した
４　４　ｍＭ　　ビオチン−Ｎ−ハイドロキシサクシミ
ド（ザイムド　ラボラトリ−社、サンフランシスコ、カ
リフォルニア州）に５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む（１１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０に溶解した４、　
４　ｍＭメルカグトエチルアミン（２，０＋ｄ）を加え
、５０℃にて５０分間保温し、Ｎ−ビオチニル−２−メ
ルカプトエチルアミンを調製した。

６、　マレイミド−ジニトロフェニル−ビオチニル−非
特異ウサギＩｇＧの調製 ５　ｍＭ　ＥＤＴ’Ａを含むＩＩＬ１Ｍリン酸ナトリタ
ナトリウム緩衝液ａｏ（五２１１！／）に溶解したマレ
イミド−ジニトロフェニル−非特異ウサギＩｇＧ（２，
０■）にＮ−ビオチニル−２−メルカプトエチルアミン
（０，１１−）を加え、５０℃にて５０分間保温した。

保温後、５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む（ｌＩＭす／酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ＆０にて平衡化したセファデック
スＧ−２５カラム（１，Ｏｘ　５０　ｃｍ　）を用いた
ゲルろ過を行い、マレイミド−ジニトロフェニル−ビオ
チニル−非特異ウサギＩｇＧを得た。マレイミド−ジニ
トロフェニル−非特異ウサギＩｇＧのマレイミド基の減
少より算出して、導入されたビオチニル基はマレイミド
−ジニトロフェニル−非特異ウサギＩｇＧ　１分子当り
１４．４個でおった。

２　ジニトロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩｇ
Ｇ−ウサギ抗サイログロブリンＦａｂ’複合体の調製 ５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ６、口（１１１ｍ／　）に溶解したマレイ
：：）’−ジニトロフェニルービオチニル−ＩＦ＝　％
　ＡウサギエＥＧ　（ｔ　５ダ）に同緩衝液（１１ｍ）
に溶解したウサギ抗サイログロブリンＦａｂ’（口、４
ｑ）を加え４℃にて２０時間保温した。保温後、０．１
％ＮａＮｇ、　０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐ
ｌ（７，０にて平衡化したウルトロゲルＡｃＡ　２２カ
ラム（１，５Ｘ　４５　ｃｍ　）を用いたゲルろ過を行
い、ジニトロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩｇ
Ｇ−ウサギ抗すイロノロブリンＦａｂ’複合体を得た。

導入されたウサギ抗ザイロノロプリンＦａｂ′ハ、ジニ
トロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩｇ０１分子
当シａ８個であった。

ａ　ジニトロフェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩｇ
Ｇ−７フイニテイー精製つサギ抗すイロノロブリンＦａ
ｂ’複合体の調製 ＋１１　’％　ＮａＮ３を含む１１１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７，０（（Ｌ５ｄ）に溶解したジニトロ
フェニル−ビオチニル−非特異ウサギＩＥＧ−ウサギ抗
ザイログロブリンＦａｂ’（０，５１＋１！；７）を同
緩衝液にて平衡化したサイログロブリンネ溶化−七７７
０−ズ４Ｂカラム（Ａ，５Ｘ　２．６四）に結合させた
後、五２　ｍＭ塩酸、ｐＨ７−５にて溶出してジニトロ
フェニル−ビオチニル−ウサギ非特異工ｇＧ−アフィニ
ティー精製つサギ抗ザイロノロプリンＦａｂ’（１１０
６叩）を得た。

実施例−１と同様にしてビオチニル−非特異ウサギＩｇ
Ｇ　（Ｑ、　１　ｔ／ｌ　）’ｉポリスチレンボ・−ル
に物理的に吸着後ビオチニルー非特異ウサギ１ｇＧ不溶
化ポリスチレ／ボ・−ルとα１チアビジｙ、及び０．１
％ＮａＮｇを含む（ＬＩＭす／醒ナトリウム緩衝液、ｐ
Ｈ７，０とを５７℃、４時間反応させた。

抗ザイロクロプリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で種
々の倍率に希釈した検体［１，０２−と、αＮ　Ｍ　　
Ｎ＋ａＣ１，及び１１％ウシ血清アルブミンを含むＣＬ
ＯＩＭリン酸ナトリタナトリウム緩衝液１０１ＣＬＯ６
に溶解したサイログロブリン５０ｆｍｏ１．　　と、Ｉ
ＭＮａＣｔ及び１１％ウシ血清アルブミンを含むＱ、０
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，１０５−と
を、混合し５７℃、４時間反応させた。更にＣＬＩ　Ｍ
　　ＮａＣ１，及びｏ、１％ウシ血清アルブミンを含む
ｉｌｏ　１　Ｍ　！Ｊン酸ナナトリウム緩衝液ｐＨ７，
０，［１０ｊ−に溶解したジニトロフェニル−ビオチニ
ル−非特異ウサギＩＥＧ−アブイニティー精製ウサギ（
抗サイログロブリン）　Ｆａｂ’結合物１００ｆｍｏｌ
を加え５７℃、４時間反応後、更に４℃で一夜放置した
。その後、５％非特異ウつサＩｇＧ　、　０．１　Ｍ　
ＮａＣ１、及び１１％ウシ血清アルブミンを含む１０１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，１０１ｍを加
え、アフィニティーｎｌ製ウサギ（抗ジニトロフェニル
ーウシ血清アルブミン）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボ
ールを加えて、２４℃、４時間反応させた。その後、ポ
リスチレンボールｆｃ２ｄの１１１　Ｍ　　ＮａＣ１ｆ
含む（１，０１Ｍリン酸ナトリシム緩衝液、ｐＨ７，０
にて２度洗浄した後、ｎ、２囁非特異つサギＩｇＧ、　
Ｑ、　Ｉ　Ｍ　　ＮａＣｔ及びα１％クシ血清アルブミ
ンを含む１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０
、α１５−に溶解したジニトロフェニル−Ｌ−リジン１
５０　ｎｍｏｌを加え室温で一夜放置した。ポリスチレ
ンボールを除去した後の液に、アビジン−ビオチニル−
非特異ウサギ１ｇＧ不溶化ポリステレ／ボールを入れて
、２０℃、５時間反応させた。その後、ポリスチレンボ
ールｔ２−〇〇、　Ｉ　Ｍ　Ｎ＆Ｃｔを含む０．０１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０゜Ｋで２度洗浄し
た。［１１Ｍ　　ＮａＣｔ、及び（１１％ウシ血清アル
ブミンを含む（１０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７：０．０，１５−に溶解したウサギ（抗ヒ）　ＩｇＣ
）　ｉ鎖）　Ｆａｂ’−ペルオキシダーゼ（Ａ０ｎｆ）
を加えて２０℃にて５時間反応させた。上述と同様にポ
リスチレンボールを洗浄後、ポリスチレンボールに結合
し九ペルオキシダーゼ活性を５０℃にて１０分反応後測
定した。１０３倍希釈まで測定可能であった。結−ＩＪ
ｌ、を第５図に示す。

実施例−６ ペルオキシダーゼ活性の測定、　ＩｇＧ不溶化同相の調
製、ＩｇＧ不流不同化固相処理は実施例−２の方法に従
ったｅ、蛋白−セファローズ４Ｂの調製、ＩＥ（）の７
フイニテイー精製は実施例−５の方法に従った。サイロ
グロブリンの精製は実施例−４の方法に従った。

１、　メルカグトサクシニルーサイロノロプリンの調製 ＣＬＩＭリン酸ナトリウム緩衝液、　　ｐＨ７，５（Ｚ
Ｓ−）に溶解したサイログロブリン（１，４■）ＫＮ、
Ｎ−ジメチルホルムアミド（（１２８ｍ）に溶解した５
５ｍＭ５−アセチルメルカプトサクシニック・アンハイ
ド２イド（牛丼化学、京都）を加え５０℃にて３０分間
保温した。保温後５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む（１１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７ｏにて平衡化したセフ
ァデックスＧ−２５カラム（１，Ｏｘ５０ｍ）を用いた
ゲルろ過を行った。Ｓ−アセチルメルカブトサクシニル
ーサイロノロフ′す、／（１２ηンを含んだ分画（Ａ１
１１１／）を集め、１．０Ｍヒドロキシルアミン、ｐａ
　　７．ｏ（ｃＬ４−）を加え５０℃にて１５分間保温
し、５　ｍＭ　　ｇＤＴＡを含む０１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ＆ｏにて平衡化したセファデックスＧ−
２５カラム（１，ＯＸ　５０　ｃｍ　）を用いたゲルろ
過を行い、メルカプトサクシニル−サイログロブリンを
得た。導入されたチオール基は、サイログロブリン１分
子当ｐ２２個であった。

Ｚ　マレイミド−ジニトロフェニル−Ｌ−Ｂｌジンの調
製 実施例−５の方法に従った。

五　メルカプトサクシニルージニトロフェニルーサイロ
ノロプリンの調製 ５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ６，０（ａ５ｍ／）に溶解したメルカグトサク
シニルーサイロノロプリン（ｔ　０５１９）にマレイミ
ド−ジニトロ７エ二ルーＬ　ＩＪリジ（１１０５ｍ）を
加え、５０℃にて５０分間保温した。保温後、同緩衝液
にて平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（ｔｏｘ
５ｏｃＭ）１ｒ用いたゲルろ過を行い、メルカプトサク
シニルージニトロフェニルーサイロノロプリンを得た。

導入されたジニトロフェニル基は、メルカグトサクシニ
ルーサイロノロプリン！分子当り１１個でちった。

歳　ジニトロフェニル−サイログロブリン−ペルオキシ
ダーゼの調製 ５　ｍＭ　　ＥＤＴＡを含むＩＩＩＭす／酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ６，０（［１５ｓｄ）Ｋ溶解したメルカプ
トサクシニルージニトロフェニルーサイロノロプリン（
［Ｌ６ｒｖンに同緩衝液（ａｃｔ　３ｍ）に溶解した実
施例−５で調製したマレイミド−ペルオキシダーゼ（１
，０η）を加え、４℃にて２０時間保温し続いて同緩衝
液（Ａμｔ）に溶解した［ＬＩＭ　　Ｎ−エチルマレイ
ミドを加え５０℃、１５分間保温した。保温後ｎ１Ｍ１
．！ン酸ナトｖウム緩衝液、ｐＨ４５にて平衡化したウ
ルトロゲルＡａＡ　２２カラム（１，５Ｘ　４５備）を
用いたゲルろ過を行り、ジニトロフェニル−サイログロ
ブリン−ペルオキシダーゼ複合体を得た。導入されたペ
ルオキシダーゼは、ジニトロフェニル−サイログロブリ
ン１分子当り１．４個であった。

抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で種
々の倍率に希釈した検体１０１ｍと、ＩＩＬ５５５％非
特異ウサギエｇＧ％ＣＬＩ％ウシ血清アルブミン及び［
１＋　Ｍ　　ＮａＣ１を含むＣ１０１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＩ（７，０、α０９−に溶解したジニトロ
フェニル−サイログロブリン−ペルオキシダーゼ結合物
１５　ｆｍｏｌ、及び１．０　ＭＮａＣｌ　ｓ及び（Ｌ
１％ウシ血清アルブミンを含むＱ、０１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液、ｐＨ７，０゜［ＬＯ５−と、アフィニティ
ー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アルブミ
ン）ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボー・ル２個と共に２０
℃、５時間反応させた。ポリスチレンボールを１１ＭＮ
ａＣ１を含むＣＬＯＩＭリン酸ナトリタナトリウム緩衝
液、０．２−で２回洗浄した後、（ＬＩＭＮａＣｌ、及
び１１１％ウシ血清アルブミンを含む（１０１Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０，１１１１５−に溶解し
たジニトロフェニル−Ｌ　＋＋　ｌｊジンｔ　５０ｎｍ
ｏ’ｌとアフィニティー精製ウサギ（抗ヒ）　ＩｇＧγ
鎖）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール２個とを加えて
、２０℃、５時間反応させ光。

アフィニティー精製ウサギ（抗ヒトＩｇＧγ鎖）ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンボールを上述と同様に洗浄後、ポリ
スチレンボールに結合したペルオキシダーゼ活性を、５
０℃、１０分間反応後測定した。５ｘｌＯ’倍希釈まで
測定可能であつ九結果を第５図に示す。

すなわち第５図は本発明方法及び従来法で抗サイログロ
ブリン抗体を測定した結果を、健常者血清によるバセド
ー病患者血清の希釈倍率（横軸）と固相に結合したペル
オキシダーゼ活性を示す蛍光強度（Ｍ軸）との関係で示
すグラフである。

抗サイログロブリン抗体の測定において本発明の方法で
ある実施例４，５．６は従来の方法である比較例−４に
比べて高感度であった。

実施例−７ ＩｇＧの調製、アフィニティー精製ウサギ（抗ジニトロ
フェニルークシ血清アルフミン）　ＩｇＧ不溶化固相、
アフィニティー精製ウサギ（抗ヒ）　ＩｇＧγ鎖）　Ｉ
ｇＧ不溶化固相の調製は実施例−２の方法に従った。ペ
ルオキシダーゼ活性の測定は実施例−２の方法に準じて
行い、５０　ｍＭ硫［Ｃ溶解したα２ダ／ｌのキニーネ
を標準とした。ＩｇＧのアフィニティー精製、ウサギ（
抗ヒトＩｇＧ　γ鎖）　ＩｇＧ−セファローズ４Ｂの調
製は実施例−５の方法に従った。サイログロブリンの′
ＩｐｆｌＨ１シニトロフェニルーザイログロプリンの調
製は実施例−４の方法に従った。

サイログロブリン−ペルオキシダーゼの調製１、　メル
カプトサクシニル−サイログロブリンの調製 ′ｎｔｍサイログロブリンにＳ−アセチルメルカプトサ
クシニック・アンハイドライドを用いる公知の方法〔石
川ら、ジャーナル・オブ・イムノアッセイ（前出）〕に
よりチオール基を導入した。サイログロブリン１分子当
り導入されたチオール基の数は五８個であった。

ｌ　マレイミド−ペルオキシダーゼの調製Ｎ−サクシニ
ミジル−６−マレイミドヘキサノエートを用いる公知の
方法〔橋田ら、ジャーナル・オプ・アプライド・バイオ
ケミストリー（前出）〕によシ、西洋ワサビ・ペルオキ
シダーゼにマレイミド基を導入した。導入されたマレイ
ミド基の数はペルオキシダーゼ１分子当り１．５個であ
った。

五　サイログロブリンΦペルオキシダーゼの調製 メルカプトサクシニル−サイログロブリン［Ｌ５１１９
’ｉ溶解した５　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ＆０、α０７−とマレイミド−ペ
ルオキシダーゼ９５μ２　を溶解した５ｍＭＥＤＴＡを
含むＱ、ＩＭリン醒ナナトリウム緩衝液ｐＨ＆０、Ｑ、
００５−とを４℃にて２００時間反応せた。反応液はウ
ルトロゲルＡｅＡ２２（ＬＫＢ、ストックホルム、スウ
ェーデン）カラム（ｔ　５　ｘ　４５５１１　）　ｋ用
いゲルろ過を行った。溶出液は０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ＰＨ＆５を用いた。サイログロブリン１分子当
り導入されたペルオキシダーゼの数は１．７個であった
。

ヒト抗サイログロブリンＩｇＧの精製 バセドー病患者の血清をプールし、硫酸ナトリウムによ
る塩析とＤＥＡＲセルロースを用い、患者血清中のＩｇ
Ｇを精製した。ＩｇＧ　４■を０．１債のＮａＮ１を含
むｆｌ１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０、（Ｌ
５Ｍｔに溶解した。

実施例−３に準じ、サイログロブリン−セファローズ４
Ｂ（ＩＸ３■）を用いて、ｐＨ２−５で溶出する公知の
方法〔同封ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
、第１００巻、第１２４７頁（１９Ｂ６）］によタアフ
イニテイー精ＭＩを行い、ヒト抗すイロノロブリ；／Ｉ
ｇＧ５．１μ２　を得た。

と）ＫサイログロブリンＸｇ（）抗体の測定ヒト抗すイ
ロノロブリ／ＩｇＧを健常者の血清で種々の濃度に希釈
した検体ＣＬ０２ｍ、ジニトロフェニル−サイログロブ
リン複合体ｔｏ。

ｆｍｏｌ　、サイロクロブリ／−ペルオキシダーゼ複合
体１００　ｆｍｏｌ、［Ｌ４６ＭＮａｃｔ及び［１４％
ウシ血清アルブミンを含む［１０１Ｍリン酸ナトリウム
緩衝液、ｐＨ７，０，Ｑ１３ｓｅｌ！を２０１：、５時
間反応させた。次にアフィニティー精製ウサギ（抗ジニ
トロフェニルーウシ血清アルブミン）ＩｇＧ不溶不溶化
ポリスフレ／ボール個）と共に２０℃で３時間、４℃で
一夜反応させた。反応後、そのポリスチレンボールを２
−の（ＬＩＭＮａＣｌを含む（１０１Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７，０にて２回洗浄した後、（Ｌ　Ｉ　
Ｍ　　ＮａＣ１及びα１チウシ血清アルブミンを含む１
０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０、（１５−
に６％　Ｉ、ｆｔ　ジニトロフェニル−Ｌ　−＋）ジン
１５０ｎｍｏ１　　と７フイニテイー精製ウサギ（抗ヒ
トＩｇＧ　ｒ鎖）　Ｉｇ（）不溶化ポリスチレンボール
２個と共に２０℃、１時間反応させ７’ｃ、その後、ア
フィニティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血
清アルブミン）１ｇＧ不溶化ポリスチレンボールを除去
し、更に２０℃で２時間反応させたアフィニティー精製
ウサギ（抗ヒ）　ＩｇＧ１鎖）　ＩＥＧ不溶化ポリスチ
レンボールを上述と同様に洗浄後、ポリスチレンボール
に結合したペルオキシダーゼ活性を、３０℃、１５０分
反応後測定した。測定結果を第６図に示した。

比較例−５ 既知量のヒト抗サイログロブリン１ｇＧを健常者の血清
で、種々の濃度に希釈した検体を用いて、比較例−４と
同様にして、検体中のヒト抗すイロノロブリンＩｇＧ抗
体を測定した。結果を第６図に示した。

すなわち第６図は本発明方法及び従来法によるヒト抗す
イロノロブリンＩｇＧ抗体濃度（ｗ′ｚ。

横軸）と同相に結合し九ペルオキシダーゼ活性を示す蛍
光強度（縦軸）との関係を示すグラフである。

実施例−８ ペルオキシダーゼ活性の測定、ＩＥＧ不溶化同相のｉＡ
製及びウサギ（抗サイログｎプリン）Ｆａｂ’−ペルオ
キシダーゼの調製は実施例−２の方法に従った。ＩｇＧ
の７フイニテイ一！１１ｍは実施例−５の方法に従った
。サイログロブリンの精製、ジニトロフェニルーサイロ
クロブリ／の鉤裂は実施例−４の方法に従った。

抗サイログロブリン抗体の測定 抗サイログロブリン抗体を含む血清を健常者の血清で種
々の倍率に希釈した検体（α０２ｗＩｔ）、ジニトロフ
ェニル−サイログロブリン複合体１５ｆｍ０１．１１５
７５％非特異ウサギＩｇＧ％　（Ｌ１％ＮａＮ１％αＩ
ＭＮａＣｔ及びＩＩＬ１％ウシ血清アルブミンを含む１
０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０（０，０８
−）、（ＬＩＭ　　Ｎａ０２％（ｉｔ　％クシ血清アル
ブミン及びｎ１％　ＮａＮ＃を含む［１３１Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨＩＤ（ａ、ａ　５ｄ）とアフィニ
ティー精製ウサギ（抗ジニトロフェニルーウシ血清アル
ブミン）　ＩｇＧ不溶化ポリスチレンボール（２個）と
共に２０℃でＳ時間、４℃で一夜反応させた。このポリ
スチレンボールは実施例−２の方法で、非特異ウサギＩ
ｇＧにより前処理したものを用いた。反応後、ポリスチ
レンボールを２Ｗｔ（７）ａｆＭＮａＣｌ　を含むα０
１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０、にて２回洗
浄し、ｃＬＩ　Ｍ　　ＮａＣ１％１１％　ＮａＮ３及び
ＩＩＬ１％ウシ血清アルブミンに溶解したジニトロフェ
ニル−Ｌ−リジン１５０ｎｍＯ１と２ＤＣ，１時間反応
させた。ポリスチレンボール（２個）を除去し、アフィ
ニティー精製ウサギ（抗ヒ）　ＩｇＧ　ｒ鎖）　ＩｇＧ
不溶化ポリスチレンボールを加え、２０℃５時間反応さ
せた。反応後、ポリスチレンボールを２ｆｆ／のｃＬｌ
ＭＮａＣｌを含むａ１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
７，０で２回洗浄し、このポリスチレンボールにａ　Ｉ
　Ｍ　ＮａＣ！及び１１％ウシ血清アルブミンを含むＣ
ＬＯ１Ｍリン酸ナトリタナトリウム緩衝液、０（Ｑ１５
４）に溶解したウサギ（抗サイログロブリン）　Ｆａｂ
’−ペルオキシダーゼ（ｓ　ｏ　ｒ）を加え、２０℃、
５時間反応させた。上記と同様に洗浄後、ボリスチレ／
ボールに結合したペルオキシダーゼ活性を、５０℃、１
０分間の反応により測定した。１０”倍希釈まで測定可
能であった。

〔発明の効果〕

以上説明したように１本発明方法はどのようなハゲテン
、抗原に対する抗体をも超高感度で、しかもイムノグロ
ブリンのクラスを区別して測定できるので、Ｂ型肝炎、
ＡＴＬ％ＡＩＤＳなどの感染症における抗体、自己免疫
疾患における自己抗体、アレルギー疾患の原因となる抗
体などの測定を通じて各種疾患の診断に貢献するもので
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第５図は、本発明方法及び従来法でインスワン
抗体を測定した結果を示すグラフ、第４図及び第５図は
、本発明方法及び従来法で抗サイログロブリン抗体を測
定した結果を示すグラフ、第６図はヒト抗すイロクロブ
リンＩｇＧ抗体を測定した結果を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）工程を包
   含することを特徴とする特異的抗体の測定法。 工程（Ａ）：次の（ａ）又は（ｂ）工程。 （ａ）被検液の測定すべき特異的抗体と活性成分とから
   構成される複合体を形成させた後、この複合体を担体に
   結合させる工程。 （ｂ）当該複合体を担体上で形成させる工程。 工程（Ｂ）：複合体が結合した担体を洗浄した後、担体
   から前記複合体を解離させる工程。 工程（Ｃ）：この複合体を他の担体に結合させた後、こ
   の担体を洗浄する工程。 工程（Ｄ）：（Ｃ）に記載の担体上の複合体を測定する
   工程。