JPH02426A - 交雑細胞株 - Google Patents
交雑細胞株Info
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- JPH02426A JPH02426A JP63276369A JP27636988A JPH02426A JP H02426 A JPH02426 A JP H02426A JP 63276369 A JP63276369 A JP 63276369A JP 27636988 A JP27636988 A JP 27636988A JP H02426 A JPH02426 A JP H02426A
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- cell
- theophyline
- cells
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、テオフィリン（ｌ、３−ジメチルキサンチン
）に対する単クローン抗体の生産のための交雑細胞株、
均質で単一特異性の抗体、およびそれらのテオフィリン
に対する免疫定量法（イムノアッセイ）への利用に関す
る。
）に対する単クローン抗体の生産のための交雑細胞株、
均質で単一特異性の抗体、およびそれらのテオフィリン
に対する免疫定量法（イムノアッセイ）への利用に関す
る。
１９７５年にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ両氏
は、マウスの骨髄腫細胞を羊の赤血球に対するす単クロ
ーン抗体を分泌する免疫処置されたマウス脾臓細胞に融
合させることに由来する継続的な交雑細胞株（ハイブリ
ドーマ）の確立を報告しｌ；（ｒ ＮａＬｕｒｅＪ第２
５６巻第４９５頁（１９７５年）〕。それ以来、他の抗
原およびハプテンに対する単クローン抗体の生産につい
て多数の雑文が提出された。例えばＦｏＭｅｌｃｈｅｒ
ｓ Ｍ、ＰｏｔｔｅｒおよびＮ６Ｗａ ｒ ｎ ｅ ｒ
氏ら編［ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ１ｏｇｙＪ第
８１巻（１９７８年刊行）および同書中の引用文献、ま
たＲ、 Ｋｅｎｎｅｔ、 Ｔ、Ｍ：Ｋｅａｒｎおよびに
、Ｂｅｃｈｔｏ１氏ら編「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓＪ（１９８０年刊行）および同書中の
引用文献を参照されたい。
は、マウスの骨髄腫細胞を羊の赤血球に対するす単クロ
ーン抗体を分泌する免疫処置されたマウス脾臓細胞に融
合させることに由来する継続的な交雑細胞株（ハイブリ
ドーマ）の確立を報告しｌ；（ｒ ＮａＬｕｒｅＪ第２
５６巻第４９５頁（１９７５年）〕。それ以来、他の抗
原およびハプテンに対する単クローン抗体の生産につい
て多数の雑文が提出された。例えばＦｏＭｅｌｃｈｅｒ
ｓ Ｍ、ＰｏｔｔｅｒおよびＮ６Ｗａ ｒ ｎ ｅ ｒ
氏ら編［ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏ１ｏｇｙＪ第
８１巻（１９７８年刊行）および同書中の引用文献、ま
たＲ、 Ｋｅｎｎｅｔ、 Ｔ、Ｍ：Ｋｅａｒｎおよびに
、Ｂｅｃｈｔｏ１氏ら編「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｉｅｓＪ（１９８０年刊行）および同書中の
引用文献を参照されたい。
ハイブリドーマを生成する一般的技術は周知され且つ理
解されているが、望ましい特性を揃えて有する抗体を分
泌するノ・イブリドーマ細胞株の調製および選別にはい
まだ多大の困難がある。
解されているが、望ましい特性を揃えて有する抗体を分
泌するノ・イブリドーマ細胞株の調製および選別にはい
まだ多大の困難がある。
欧州特許出願第２５，７２２号（１９８１年３月２５日
公告）は、人体Ｔ−淋巴球細胞表面抗原に対する単クロ
ーン抗体の生産を開示している。
公告）は、人体Ｔ−淋巴球細胞表面抗原に対する単クロ
ーン抗体の生産を開示している。
心臓のグリコシドであるジゴキシンに対する単クローン
抗体の生産は［Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ Ｊ第３９巻第９２８頁（１９８０第）および
「５ｃａｎｄ 、Ｊ 、Ｃ１１ｎ 。
抗体の生産は［Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ Ｊ第３９巻第９２８頁（１９８０第）および
「５ｃａｎｄ 、Ｊ 、Ｃ１１ｎ 。
Ｌａｂ 、Ｉｎｖｅｓ ｔ 、Ｊ第４巻第７５頁（１９
８１年）において報告された。
８１年）において報告された。
体液中の各種の治療薬剤のしくルをモニターするために
使用可能な臨床診断的定量法の需要が速やかに増加して
いる。ぜんそく治療剤であるテオフィリンは、その有効
範囲が非常に狭い薬剤である。テオフィリンに対する免
疫定量法には高度に特異的な抗体を必要とする。それは
体液中にはテオフィリンと構造的、掟類似す−る他のキ
サンチン化合物が存在し、もしそれらが抗テオフィリン
抗体により認識されれば分析対象となるテオフィリン濃
度の誤った値をもたらすからである。テオフィリンは１
．３−ｕメチルキサンチンであり、交差反応性を有する
最も屡々出現する４徨のキサンチン化合物は、カフェイ
ン（１，３，７−ドリメチルキサンチン）、テオブロミ
ン（３，７−シメチルキサンチン）、キサンチンおよび
ヒポキサンチンである。最も頻繁に出現するキサンチン
化合物はカフェインであり、日常の飲料のいたるところ
に存在する。それはまた新生児におけるテオフィリン代
謝の産物であり、カフェインのレベルがテオフィリンの
しはルに接近することもあり得る。それゆえ、テオフィ
リンに対する診断的免疫定量法に用いろ抗テオフィリン
抗体はカフェインと交差反応をしないことが必須の要件
である。
使用可能な臨床診断的定量法の需要が速やかに増加して
いる。ぜんそく治療剤であるテオフィリンは、その有効
範囲が非常に狭い薬剤である。テオフィリンに対する免
疫定量法には高度に特異的な抗体を必要とする。それは
体液中にはテオフィリンと構造的、掟類似す−る他のキ
サンチン化合物が存在し、もしそれらが抗テオフィリン
抗体により認識されれば分析対象となるテオフィリン濃
度の誤った値をもたらすからである。テオフィリンは１
．３−ｕメチルキサンチンであり、交差反応性を有する
最も屡々出現する４徨のキサンチン化合物は、カフェイ
ン（１，３，７−ドリメチルキサンチン）、テオブロミ
ン（３，７−シメチルキサンチン）、キサンチンおよび
ヒポキサンチンである。最も頻繁に出現するキサンチン
化合物はカフェインであり、日常の飲料のいたるところ
に存在する。それはまた新生児におけるテオフィリン代
謝の産物であり、カフェインのレベルがテオフィリンの
しはルに接近することもあり得る。それゆえ、テオフィ
リンに対する診断的免疫定量法に用いろ抗テオフィリン
抗体はカフェインと交差反応をしないことが必須の要件
である。
テオフィリンその他の化合物で一般に化学式Ｑ （ｆｏ
ｒｍｕｌａ ｗｅｉｇｈｔ） １．０００以下のものは
、それ自体が免疫原化を有する担体に結合されなければ
免疫原とならない〔例えばＨ，Ｎ、Ｅｉｓｅｎ 代著
「Ｉ＋ｎｍｕｎｏｌｏｇｙＪ （ノー−〕ξ−・アンド
・ロウ社）１９８０佐版参照〕。このような化合物は・
・ブテンと呼ばれ、ノ・ブテンを免疫原化するために担
体に結合させる各種の方法が当業界に知られている。
ｒｍｕｌａ ｗｅｉｇｈｔ） １．０００以下のものは
、それ自体が免疫原化を有する担体に結合されなければ
免疫原とならない〔例えばＨ，Ｎ、Ｅｉｓｅｎ 代著
「Ｉ＋ｎｍｕｎｏｌｏｇｙＪ （ノー−〕ξ−・アンド
・ロウ社）１９８０佐版参照〕。このような化合物は・
・ブテンと呼ばれ、ノ・ブテンを免疫原化するために担
体に結合させる各種の方法が当業界に知られている。
担体およびノ・ブテンを担体に結合させる部位の選択が
７・ブテン−担体複合体の免疫原特性ならびに産生され
る抗体の特異性に影響することが知られている〔例えば
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏＬｏｇｙ Ｊ第
７０巻第８５頁（１９８０年）参照〕。
７・ブテン−担体複合体の免疫原特性ならびに産生され
る抗体の特異性に影響することが知られている〔例えば
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥｎｚｙｍｏＬｏｇｙ Ｊ第
７０巻第８５頁（１９８０年）参照〕。
米国特許第４，１５６，０８１号明細書は、３−位置置
換のテオフィリン誘導体の合成およびカフェインと交差
反応しない抗体を産生ずるための免疫原としてのそれら
の利用を記述している。しかしながらそれらは１−メチ
ルキナノーテンと交差反応する。さらにまた、商業的免
疫定量実施のためには多量の抗血清を要し、また動物の
免疫処置による抗体の産生は遅く、手間がかかり、そし
て動物の種類によりまた同種の動物でも飼育系統が異な
れば必ずしも再現性がよくない。
換のテオフィリン誘導体の合成およびカフェインと交差
反応しない抗体を産生ずるための免疫原としてのそれら
の利用を記述している。しかしながらそれらは１−メチ
ルキナノーテンと交差反応する。さらにまた、商業的免
疫定量実施のためには多量の抗血清を要し、また動物の
免疫処置による抗体の産生は遅く、手間がかかり、そし
て動物の種類によりまた同種の動物でも飼育系統が異な
れば必ずしも再現性がよくない。
欧州特許出願第４４，４４１号（１９８２年１月２７日
公告）は、薬剤に対する単クローン抗体の産生を開示し
ている。しかしそれはカフェインに対する交差反応性を
全く欠如するようなテオフィリンに対する単クローン抗
体を開示してはいない。
公告）は、薬剤に対する単クローン抗体の産生を開示し
ている。しかしそれはカフェインに対する交差反応性を
全く欠如するようなテオフィリンに対する単クローン抗
体を開示してはいない。
本発明の細胞株（セルライン）は、３種の連続的交雑単
クローン細胞株であシ、それぞれテオフィリンに対する
新規な単クローン抗体を産生ずる能力を有する。細胞株
は、８−位置置換テオフイリン−担体複合体（免疫原）
を用いて免疫処置されたマウスからの脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞の交雑体である。本発明による抗体のそれぞ
れは、テオフィリンに対する粒子促進濁度阻害免役定量
法〔米国特許出願第３１５，９２２号（１９８１年１０
月２８日付〕および特開昭５８−４７２５８号公報参照
〕に参照側定したときＫはカフェインとの交差反応性は
５％以下でらる。テオフィリンに対する免疫定量法、特
に粒子により促進される濁度阻害免疫定量法へのこれら
の抗体の利用も期待される。
クローン細胞株であシ、それぞれテオフィリンに対する
新規な単クローン抗体を産生ずる能力を有する。細胞株
は、８−位置置換テオフイリン−担体複合体（免疫原）
を用いて免疫処置されたマウスからの脾臓細胞とマウス
骨髄腫細胞の交雑体である。本発明による抗体のそれぞ
れは、テオフィリンに対する粒子促進濁度阻害免役定量
法〔米国特許出願第３１５，９２２号（１９８１年１０
月２８日付〕および特開昭５８−４７２５８号公報参照
〕に参照側定したときＫはカフェインとの交差反応性は
５％以下でらる。テオフィリンに対する免疫定量法、特
に粒子により促進される濁度阻害免疫定量法へのこれら
の抗体の利用も期待される。
第１図、第２図および第３図は、それぞれ細胞株１／１
５．１７／１４、および６１／７により産生されるテオ
フィリンに対する単クローン抗体を用いる粒子により促
進される濁度阻害免疫定量法により得られる標準検量曲
線である。
５．１７／１４、および６１／７により産生されるテオ
フィリンに対する単クローン抗体を用いる粒子により促
進される濁度阻害免疫定量法により得られる標準検量曲
線である。
単クローン抗体は、所望の抗原またはハプテン（本発明
の場合にはテオフィリン）を用いて免疫処置されたマウ
スからの脾臓細胞をマウスの骨髄腫細胞に融合させるこ
とにより産生される。単クローン抗体の対象にしようと
する化合物がハプテンである場合には、最初に免疫原性
能を得るためにそのハプテンを高分子量担体と結合させ
ることが必要である。このような担体には、蛋白質、多
糖質、および各種のラテンクス粒子が含まれる。本発明
の目的のために、テオフィリンをその８−位置を介して
陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）のアミノ基に結合剤とし
てカルボジイミドを用いて結合させ、そしてテオフイリ
ン−８−ＫＬＨを得る。
の場合にはテオフィリン）を用いて免疫処置されたマウ
スからの脾臓細胞をマウスの骨髄腫細胞に融合させるこ
とにより産生される。単クローン抗体の対象にしようと
する化合物がハプテンである場合には、最初に免疫原性
能を得るためにそのハプテンを高分子量担体と結合させ
ることが必要である。このような担体には、蛋白質、多
糖質、および各種のラテンクス粒子が含まれる。本発明
の目的のために、テオフィリンをその８−位置を介して
陣笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）のアミノ基に結合剤とし
てカルボジイミドを用いて結合させ、そしてテオフイリ
ン−８−ＫＬＨを得る。
実施にあたっては、数週間ないし数ケ月の期間をかけて
間隔をおいて数回の免疫処置を行う。
間隔をおいて数回の免疫処置を行う。
免疫処置されたマウスのごとき動物から毎回注射の時に
採血し、そして血清中に所望の抗体の存否を検査する。
採血し、そして血清中に所望の抗体の存否を検査する。
適当な検査定量法のどれでもよいが、放射免疫定食法お
よび酵素にリンクした免疫吸着定量法がしばしば用いら
れる。血清中に抗体が検出されれば、その動物を殺し、
脾臓を細胞融合操作のために無菌的に取り出す。
よび酵素にリンクした免疫吸着定量法がしばしば用いら
れる。血清中に抗体が検出されれば、その動物を殺し、
脾臓を細胞融合操作のために無菌的に取り出す。
数種類のマウス骨髄腫細胞株が融合のノミ−トナーとし
て有用であることが知られている。
て有用であることが知られている。
これらの細胞株の特徴は、上記の引用文献ずなわち「ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕ−ｎｏｌｏｇｙＪに記述さ
れている。一般的に、骨髄腫細胞株でそれ自体の免疫グ
ロブリン産物を分泌しない株を選ぶことが好ましい。
ｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕ−ｎｏｌｏｇｙＪに記述さ
れている。一般的に、骨髄腫細胞株でそれ自体の免疫グ
ロブリン産物を分泌しない株を選ぶことが好ましい。
融合操作は、融合促進剤としてポリエチレングリコール
を用いて行われることが最も多い。
を用いて行われることが最も多い。
センダイウィルスのごとき融合促進剤を用いてもよい。
脾臓細胞の骨髄腫細胞に対する比率は場合により異なる
が、５〜１０：１の比率が最も多く用いられる。
が、５〜１０：１の比率が最も多く用いられる。
融合の後に、細胞を希釈し、ヒポキサンチン／アミノプ
テリン／チミジン（ＨＡＴ ）培地のごとき選択培地に
培養する。融合しない脾臓細胞は有限回数の分裂の後に
死滅する。また骨髄腫細胞は、それが有するヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）遺伝子の突然変異のためにＨＡＴ培地中では
生存不能で死滅する。交雑体および融合しない細胞の懸
濁液を、容器１個当りの細胞数を限定するために、培養
前に希釈する。通常微量力価検定用プレートのくぼみ孔
１個につき細胞数１〜５個にまで希釈する。
テリン／チミジン（ＨＡＴ ）培地のごとき選択培地に
培養する。融合しない脾臓細胞は有限回数の分裂の後に
死滅する。また骨髄腫細胞は、それが有するヒポキサン
チン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈ
ＧＰＲＴ）遺伝子の突然変異のためにＨＡＴ培地中では
生存不能で死滅する。交雑体および融合しない細胞の懸
濁液を、容器１個当りの細胞数を限定するために、培養
前に希釈する。通常微量力価検定用プレートのくぼみ孔
１個につき細胞数１〜５個にまで希釈する。
細胞の堆層が認め得られるに至れば、培養上清液を、固
相放射免疫定量法またはその他の適当な検定法により、
所望の抗体の存否について検定する。対象となる抗体の
産生が認められるくぼみ孔の細胞をクローンとして軟寒
天に採取するか、または希釈を限定して単クローン性を
保証する。
相放射免疫定量法またはその他の適当な検定法により、
所望の抗体の存否について検定する。対象となる抗体の
産生が認められるくぼみ孔の細胞をクローンとして軟寒
天に採取するか、または希釈を限定して単クローン性を
保証する。
バイブ、リドーマを容器中で培養して培養上清液を収穫
するか、またはハイブリドーマをマウスに注射するかに
よって多量の抗体が得られる。
するか、またはハイブリドーマをマウスに注射するかに
よって多量の抗体が得られる。
抗体はハイブリドーマをブリスタンで前処置した同系統
または同種のマウスの腹腔内に注射することにより腹水
液中から得られる。抗体はハイブリドーマを静脈内に注
射することにより血清中から得られる。抗体の１１ｎｔ
当りの量は差異があり、通常培養上清液中で最も少なく
、腹水液中で最も多い。
または同種のマウスの腹腔内に注射することにより腹水
液中から得られる。抗体はハイブリドーマを静脈内に注
射することにより血清中から得られる。抗体の１１ｎｔ
当りの量は差異があり、通常培養上清液中で最も少なく
、腹水液中で最も多い。
かくして造出された単クローン抗体はその免疫グロブリ
ン類および豆類により、またその等電点決定パターンに
より特徴づけられる。親和性定数が得られ、そして抗体
は関連性のある一連の抗原（）・ブテン）との反応性を
もとにして％像づけられる。
ン類および豆類により、またその等電点決定パターンに
より特徴づけられる。親和性定数が得られ、そして抗体
は関連性のある一連の抗原（）・ブテン）との反応性を
もとにして％像づけられる。
本発明は、テオフィリンに対する単クローン抗体よりな
る。３種の異なるクローンタイプすなわち３０／１５．
１７／１４、および６１／７が、Ｂａｌｂ／Ｃ系統のマ
ウスをテオフイリ／−８−ＬＫＨを用いる免疫処置によ
って誘導された。三者はすべて１回の融合の生成物であ
る。三者はすべて同じ重い（Ｈ）および軽い（Ｌ）鎖の
群に属するが、等電点決定、ｏターンはそれぞれ著明に
異なる。
る。３種の異なるクローンタイプすなわち３０／１５．
１７／１４、および６１／７が、Ｂａｌｂ／Ｃ系統のマ
ウスをテオフイリ／−８−ＬＫＨを用いる免疫処置によ
って誘導された。三者はすべて１回の融合の生成物であ
る。三者はすべて同じ重い（Ｈ）および軽い（Ｌ）鎖の
群に属するが、等電点決定、ｏターンはそれぞれ著明に
異なる。
三者はすべてテオフィリンと結合し、テオフィリン量測
定のための免疫定量法に利用することができる。用いら
れる免疫定量法の一つは、粒子により促進される濁度阻
害免疫定量法である。
定のための免疫定量法に利用することができる。用いら
れる免疫定量法の一つは、粒子により促進される濁度阻
害免疫定量法である。
これらのクローンタイプのうちで、テオフィリンに対す
る免疫定量法への主要な妨害物質であるカフェインと交
差反応するものはない。また他のキサンチン化合物との
交差反応性も低い。
る免疫定量法への主要な妨害物質であるカフェインと交
差反応するものはない。また他のキサンチン化合物との
交差反応性も低い。
３種類のハイブリドーマ細胞株すなわち３０／１５．１
７／１４および６１／７は米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ
）に１９８２第８月５日に寄託され、それぞれＨＢ８１
５２号、ＨＢ８１５３号、およびＨＢ８１５４号のＡＴ
ＣＣ保存番号を与えられている。
７／１４および６１／７は米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ
）に１９８２第８月５日に寄託され、それぞれＨＢ８１
５２号、ＨＢ８１５３号、およびＨＢ８１５４号のＡＴ
ＣＣ保存番号を与えられている。
本発明のハイブリドーマ細胞株は、マウスの骨髄腫細胞
株Ｐ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１ （ＮＳ−１と称する
）とＢａｌｂ／ｃ牌臓細胞との交雑体である。ｌ５−１
細胞株自体もＢａ ｌ ｂ／ｃ系統マウスに由来し、に
Ｌ（軽）鎖を合成するが、それは分泌されない。ＮＳ−
１は、ターン研究所細胞分譲センター（米国カリフォル
ニア州う・ホヤ市所在）から得られる。
株Ｐ３−ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１ （ＮＳ−１と称する
）とＢａｌｂ／ｃ牌臓細胞との交雑体である。ｌ５−１
細胞株自体もＢａ ｌ ｂ／ｃ系統マウスに由来し、に
Ｌ（軽）鎖を合成するが、それは分泌されない。ＮＳ−
１は、ターン研究所細胞分譲センター（米国カリフォル
ニア州う・ホヤ市所在）から得られる。
本発明のハイブリドーマ細胞株は交雑体であり、このこ
とはそれぞれの交雑体クローン中における双方の親株の
遺伝子産物の存在によって立証される。それぞれの細胞
株は、産生ずる抗体およびその他の定量検定法における
反応成績についてみれば、少なくとも１年間安定な挙動
をすることが示された。
とはそれぞれの交雑体クローン中における双方の親株の
遺伝子産物の存在によって立証される。それぞれの細胞
株は、産生ずる抗体およびその他の定量検定法における
反応成績についてみれば、少なくとも１年間安定な挙動
をすることが示された。
３０／１５ 細胞株は、凍結した材料から２度の機会に
再クローニングされ、１７／１４株は凍結した材料から
１回再クローニングされた。６１／７株は再クローニン
グされたことがない。
再クローニングされ、１７／１４株は凍結した材料から
１回再クローニングされた。６１／７株は再クローニン
グされたことがない。
実施例 １
単りローン性抗テオフィリン細胞株の生成Ａ・ テオフ
イリン−８−ＫＬＨの調製８−（３−カルボキシプロピ
ル）−テオフィリンを、米国特許出願第３１５，９２２
号（１９８１年１０月２８日付）（特開昭５８−４７２
５８号公報参照）の記述に従い合成した。この化合物１
５■をＮ−ヒドロキシサクシニシド７■とジメチルホル
ムアミド２ゴ中で４℃において１８時間反応させた。こ
の時間の終りに、ｐＨ８，５の０．１Ｍ炭酸ナトリウム
１５ｔｎｌに溶解したＫＬＨ２００Ｎｉを加えた。反応
混合液を１８時間４℃で攪拌した。反応しなかったテオ
フィリンを透析により除去した。
イリン−８−ＫＬＨの調製８−（３−カルボキシプロピ
ル）−テオフィリンを、米国特許出願第３１５，９２２
号（１９８１年１０月２８日付）（特開昭５８−４７２
５８号公報参照）の記述に従い合成した。この化合物１
５■をＮ−ヒドロキシサクシニシド７■とジメチルホル
ムアミド２ゴ中で４℃において１８時間反応させた。こ
の時間の終りに、ｐＨ８，５の０．１Ｍ炭酸ナトリウム
１５ｔｎｌに溶解したＫＬＨ２００Ｎｉを加えた。反応
混合液を１８時間４℃で攪拌した。反応しなかったテオ
フィリンを透析により除去した。
Ｂ、免疫処置
Ｂａｌｂ／ｃ系統のマウスに完全な７０インド氏補助剤
０，３−中に乳化したテオフイリン−８−口（上記Ａに
従って調製）３００μｇを注射した。上記と同様にして
、２１日間隔で３回追加増量注射を行った。最後の追加
注射の７日後にマウスから採血し、工１２５標識付プロ
ティンＡを用いる固相放射免疫定量法および粒子により
促進される濁度阻害免疫定量法により血清を循環性抗テ
オフィリン抗体について検定した。マウスには腹腔内に
最後の追加注射を行い、その４日後に融合のために膵臓
を取り出した。
０，３−中に乳化したテオフイリン−８−口（上記Ａに
従って調製）３００μｇを注射した。上記と同様にして
、２１日間隔で３回追加増量注射を行った。最後の追加
注射の７日後にマウスから採血し、工１２５標識付プロ
ティンＡを用いる固相放射免疫定量法および粒子により
促進される濁度阻害免疫定量法により血清を循環性抗テ
オフィリン抗体について検定した。マウスには腹腔内に
最後の追加注射を行い、その４日後に融合のために膵臓
を取り出した。
Ｃ０粒子により促進される濁度阻害免疫定量法この定量
法はつぎのようにマウス血清のスクリーニングに用いら
れた。すなわちマウス血清５μｔをｐＨ７，８、全量１
−中にテオフイリ／−ＢＳＡで被覆したラテックス粒子
〔米国特許出頭第３１５．９２２号（１９８１年１０月
２８日付）および特開昭５８−４７２５８号公報参照）
１２．５μｔ、ポリエチレングリコール（５０００２，
５チ（Ｖ／Ｖ、最終濃度）を含む０．１５Ｍの燐騒塩緩
衝液の測定容器に加えた。
法はつぎのようにマウス血清のスクリーニングに用いら
れた。すなわちマウス血清５μｔをｐＨ７，８、全量１
−中にテオフイリ／−ＢＳＡで被覆したラテックス粒子
〔米国特許出頭第３１５．９２２号（１９８１年１０月
２８日付）および特開昭５８−４７２５８号公報参照）
１２．５μｔ、ポリエチレングリコール（５０００２，
５チ（Ｖ／Ｖ、最終濃度）を含む０．１５Ｍの燐騒塩緩
衝液の測定容器に加えた。
抗体により媒介されるラテックス粒子の凝集による濁度
を自記分光光・変針を用いて３４０ ｎｍで３７℃にお
いて測定した。血清５μｔにつき濁度形成率が０．２吸
光度単位に達するマウスを選んで後にその膵臓を融合に
用いた。
を自記分光光・変針を用いて３４０ ｎｍで３７℃にお
いて測定した。血清５μｔにつき濁度形成率が０．２吸
光度単位に達するマウスを選んで後にその膵臓を融合に
用いた。
Ｄ、融合
膵臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調製
した。それらの細胞をＮＳ−１骨髄腫細胞と５＝１の比
率で３０％（Ｖ／Ｖ ）の、Ｎ ＩＪエチレングリコー
ル０．２ ｒｎｔを用いて無血清培地中で融合させた。
した。それらの細胞をＮＳ−１骨髄腫細胞と５＝１の比
率で３０％（Ｖ／Ｖ ）の、Ｎ ＩＪエチレングリコー
ル０．２ ｒｎｔを用いて無血清培地中で融合させた。
融合した細胞を無血清培地中で洗浄し、無血清培地３０
ｒｎｔに懸濁し、マウスの腹腔マクロファージ食細胞層
を含む９６孔の微量力価検定用プレートに接種した（孔
１個につき約５０μｔ）。
ｒｎｔに懸濁し、マウスの腹腔マクロファージ食細胞層
を含む９６孔の微量力価検定用プレートに接種した（孔
１個につき約５０μｔ）。
ＨＡＴ選別培地を１８時間後に加えた。５日後かから隙
日に各孔中の交雑細胞コロニーを検査した。
日に各孔中の交雑細胞コロニーを検査した。
交雑体が検出された場合（融合後約２週間）には、その
孔をマークし、細胞の増殖がさらに多量に拡大すること
が望ましくなる時点に達するまで観察を続けた。この時
点において交雑細胞を含む孔の培養上清液を収穫し、細
胞を２４孔のプレートに移して拡大培養した。３週間後
に交雑細胞をＨＴ培地（ヒボキサンチンおよびチミジン
を含有する）で培養した。この段階においてマクロファ
ージ食細胞層は培養から死細胞および残骸を除去したの
で使用を止めた。
孔をマークし、細胞の増殖がさらに多量に拡大すること
が望ましくなる時点に達するまで観察を続けた。この時
点において交雑細胞を含む孔の培養上清液を収穫し、細
胞を２４孔のプレートに移して拡大培養した。３週間後
に交雑細胞をＨＴ培地（ヒボキサンチンおよびチミジン
を含有する）で培養した。この段階においてマクロファ
ージ食細胞層は培養から死細胞および残骸を除去したの
で使用を止めた。
Ｅ、スクリーニング
上記の収穫した培養上滑液中の抗テオフィリン抗体につ
いて固相放射免疫定量法によりスクリーニングを行った
。スクリーニングに用いられた抗原は、上記のテオフイ
リン−８−ＫＬＨと同様にして合成されたテオフイリン
−８−ＢＳＡ （１モルのＢＳＡにつきテオフィリン２
０モル）であった。第２の抗体は１１２５標識性の山羊
の抗マウスＩｇであった。
いて固相放射免疫定量法によりスクリーニングを行った
。スクリーニングに用いられた抗原は、上記のテオフイ
リン−８−ＫＬＨと同様にして合成されたテオフイリン
−８−ＢＳＡ （１モルのＢＳＡにつきテオフィリン２
０モル）であった。第２の抗体は１１２５標識性の山羊
の抗マウスＩｇであった。
総数５６個の陽性の孔が放射免疫定量法により検出され
た。これらの孔は工１２５標識付のプロティンＡを用い
て再びスクリーニングを行った。
た。これらの孔は工１２５標識付のプロティンＡを用い
て再びスクリーニングを行った。
この試薬はＩｇＧ類に属する抗体のみを検出する。
５６の陽性培養上清液中細胞株３０／１５．１７／１４
、および６１／７を含む２８はＩｇＧ類に属することが
証明された。
、および６１／７を含む２８はＩｇＧ類に属することが
証明された。
これら２８の培養上清液を遊離のテオフィリンを結合す
る能力についてスクリーニングを行った。遊離のテオフ
ィリン（最終濃度１０μｙ−ｔ＞を固態放射免疫定量法
にとりこませ、遊離のテオフィリンを結合する能力は、
固定化されたテオフイリン−８−ＥＳＡ抗原に結合され
る本発明の抗体の減少によって立証された。
る能力についてスクリーニングを行った。遊離のテオフ
ィリン（最終濃度１０μｙ−ｔ＞を固態放射免疫定量法
にとりこませ、遊離のテオフィリンを結合する能力は、
固定化されたテオフイリン−８−ＥＳＡ抗原に結合され
る本発明の抗体の減少によって立証された。
表１は、３種類の細胞株により産生される杭木に関する
これらの定量検定の結果を示す。データ九みられる通り
、これらの抗体の固定化されたテオフイリン−８−ＢＳ
Ａへの結合は遊離のテオフィリンにより阻害されろが、
その５倍量の遊離のカフエイ／によって阻害されない。
これらの定量検定の結果を示す。データ九みられる通り
、これらの抗体の固定化されたテオフイリン−８−ＢＳ
Ａへの結合は遊離のテオフィリンにより阻害されろが、
その５倍量の遊離のカフエイ／によって阻害されない。
表 Ｉ
単クローン抗体
３０／１５
１７／１４
６１／７
対照（遊離のテ
オフィリンなし）
テオフィリン添加
カフェイン添加 １３１６ １２６５
１４８３Ｆ、半限界的希釈によるクローニング 関心の対象となる細胞株（３０／１５．１７／１４１．
５１／７）を、半限界的希釈すなわち微量力価検定孔１
個につき細胞約３個におけるクローニングが可能な数に
なるまで拡大培養した。また−定量の細胞を喪失に対す
る安全保障として、生きたまま液体窒素で凍結保存した
。腹腔マクロファー、ジ食細胞層を再び用いた。孔中に
充分な数の細胞が存在する場合には、培養上清液を固相
放射免疫定量法を用いて再びスクリーニングを行った。
１４８３Ｆ、半限界的希釈によるクローニング 関心の対象となる細胞株（３０／１５．１７／１４１．
５１／７）を、半限界的希釈すなわち微量力価検定孔１
個につき細胞約３個におけるクローニングが可能な数に
なるまで拡大培養した。また−定量の細胞を喪失に対す
る安全保障として、生きたまま液体窒素で凍結保存した
。腹腔マクロファー、ジ食細胞層を再び用いた。孔中に
充分な数の細胞が存在する場合には、培養上清液を固相
放射免疫定量法を用いて再びスクリーニングを行った。
陽性を示す孔を拡大培養および再クローニングのために
選んだ。
選んだ。
Ｇ、限界的希釈におけるクローニング
選んだ孔について、厳密なボアンンン統計による限界的
希釈におけるクローニングを行った。
希釈におけるクローニングを行った。
この場合孔の％は増殖を示すことが期待され、それぞれ
の孔中で増殖した細胞はただ１個のハイブリドーマ細胞
の子孫である確率は非常に高い。孔中に充分な数の細胞
が存在する場合には、その培養上滑液を単クローン抗体
の存在について再び試験した。細胞株三者はすべて所望
の抗体を産生し続けた。
の孔中で増殖した細胞はただ１個のハイブリドーマ細胞
の子孫である確率は非常に高い。孔中に充分な数の細胞
が存在する場合には、その培養上滑液を単クローン抗体
の存在について再び試験した。細胞株三者はすべて所望
の抗体を産生し続けた。
Ｈ１鎖の組成
３種類の細胞株すなわち３０／１５．１７／１４、およ
び６１／７に由来するすべての単クローン抗体は寒天ゲ
ル二重拡散法により検定したところ、ガンマ重（Ｈ）鎖
（第１亜類）およびカッノミ経（ｇ鎖よりなっていた。
び６１／７に由来するすべての単クローン抗体は寒天ゲ
ル二重拡散法により検定したところ、ガンマ重（Ｈ）鎖
（第１亜類）およびカッノミ経（ｇ鎖よりなっていた。
実施例 ２
腹水癌中における単クローン抗体の産生大量の抗テオフ
ィリン単クローン抗体を産生させるために、約１０６個
のハイブリドーマ細胞をプリスタンで前処置した同系統
のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。採取された腹
水液は高濃度の抗テオフィリン活性を有することが固態
放射免疫定量法および粒子により促進される濁度阻害免
疫定量法の両方により下記のごとく明示された。
ィリン単クローン抗体を産生させるために、約１０６個
のハイブリドーマ細胞をプリスタンで前処置した同系統
のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。採取された腹
水液は高濃度の抗テオフィリン活性を有することが固態
放射免疫定量法および粒子により促進される濁度阻害免
疫定量法の両方により下記のごとく明示された。
実施例 ３
テオフィリンに対する免疫定量測定
細胞株３０／１５．１７／１４、および６１／７で前処
置したマウスからの腹水液を、ａｃａ 臨床分析器（
デュポン社製品）における粒子により促進される濁度阻
害免疫定量測定に用いた。テオフィリン０〜４０μｇ／
−を含有する血清をベースとするテオフィリン検量標準
液２０μｔか分析器の充填ステーション内の分析テスト
ノミツク中へ自動的に注入され、続いて３チ（容器中容
量）のポリエチレングリコール６０００．０．１チのＧ
ＡＦＡＣＲＥ−６１０、および０．１５Ｍの燐酸塩を含
有する緩衝ｉ４．９８０−が注入される。ノミツクは自
動的に３７℃に加温される。テオフイリン−ＢＳＡで被
覆したラテックス粒子〔米国特許出願第３１５，９２２
号（１９８１年１０月２８日付）および特開昭５８−４
７２５８号公報参照）４０ｍｌおよび７５０ ｍＭのジ
チオエリスＩＪ ）−ル溶液５０μがそれぞれ分析器の
ブレーカ−／ミキサー■の第２番および第３番のくぼみ
孔から加えられた。抗テオフィリン抗体は、無菌濾過し
た腹水液として（１７〜５０μｔ、細胞株により異なる
景）ブレーカ−／ミキサー■の第６番くぼみ孔から加え
られた。濁度の形成率はブレーカ−／ミキサー■におけ
る反応開始の約３９秒後に３４０ ｎｍにおいて自動的
に測定された。
置したマウスからの腹水液を、ａｃａ 臨床分析器（
デュポン社製品）における粒子により促進される濁度阻
害免疫定量測定に用いた。テオフィリン０〜４０μｇ／
−を含有する血清をベースとするテオフィリン検量標準
液２０μｔか分析器の充填ステーション内の分析テスト
ノミツク中へ自動的に注入され、続いて３チ（容器中容
量）のポリエチレングリコール６０００．０．１チのＧ
ＡＦＡＣＲＥ−６１０、および０．１５Ｍの燐酸塩を含
有する緩衝ｉ４．９８０−が注入される。ノミツクは自
動的に３７℃に加温される。テオフイリン−ＢＳＡで被
覆したラテックス粒子〔米国特許出願第３１５，９２２
号（１９８１年１０月２８日付）および特開昭５８−４
７２５８号公報参照）４０ｍｌおよび７５０ ｍＭのジ
チオエリスＩＪ ）−ル溶液５０μがそれぞれ分析器の
ブレーカ−／ミキサー■の第２番および第３番のくぼみ
孔から加えられた。抗テオフィリン抗体は、無菌濾過し
た腹水液として（１７〜５０μｔ、細胞株により異なる
景）ブレーカ−／ミキサー■の第６番くぼみ孔から加え
られた。濁度の形成率はブレーカ−／ミキサー■におけ
る反応開始の約３９秒後に３４０ ｎｍにおいて自動的
に測定された。
第１図２は３０／１５の腹水液２８μｔを用いて得られ
た典型的な標準曲線を示す。第２図は１７／１４の腹水
液１７μｔを用いて得られた典型的な標準曲線を示す。
た典型的な標準曲線を示す。第２図は１７／１４の腹水
液１７μｔを用いて得られた典型的な標準曲線を示す。
第３図２は、６１／７の腹水液を用いて得られた典型的
な標準曲線を示す。
な標準曲線を示す。
実施例 ４
細胞株３０／１５．１７／１４および６１／７のテオフ
ィリンに対する特異性 免疫定量測定においてテオフィリンを精密に測定するた
めには、試料中に存在する他のキサンチン化合物に対す
る抗テオフィリン抗体の交差反応性はごく少ないかまた
は皆無でなくてはならない。交差反応性は、テオフィリ
ン１０μｇ／ｍｔを含有する試料中に問題になる物質が
最終、負度１０μｇ／ｒｎｔＫ存在する場合に派生する
測定誤差のパーセントと定義される。
ィリンに対する特異性 免疫定量測定においてテオフィリンを精密に測定するた
めには、試料中に存在する他のキサンチン化合物に対す
る抗テオフィリン抗体の交差反応性はごく少ないかまた
は皆無でなくてはならない。交差反応性は、テオフィリ
ン１０μｇ／ｍｔを含有する試料中に問題になる物質が
最終、負度１０μｇ／ｒｎｔＫ存在する場合に派生する
測定誤差のパーセントと定義される。
表■はカフェイン、テオブロミン、１，７−シメチルキ
サンチン、３−メチルキサンチン、ヒポキサンチン、お
よびキサンチンに対する抗体３０／１５．１７／１４お
よび６１／７の交差反応性を２種類の家兎抗血清（９２
４ＰＯ２１３および９０４Ｐ０５１８）と比較する。２
種類の家兎抗血清はテオフイリン−８−ＢＳＡに対して
産生され、試験された１０種類以上の家兎抗血清中の典
型的なものである。
サンチン、３−メチルキサンチン、ヒポキサンチン、お
よびキサンチンに対する抗体３０／１５．１７／１４お
よび６１／７の交差反応性を２種類の家兎抗血清（９２
４ＰＯ２１３および９０４Ｐ０５１８）と比較する。２
種類の家兎抗血清はテオフイリン−８−ＢＳＡに対して
産生され、試験された１０種類以上の家兎抗血清中の典
型的なものである。
細胞株３０／１５．１７／１４および６１／７により産
生される本発明の単クローン抗体はテオフィリンに対し
て特異的であり、多クローン性の家兎抗血清よりも優れ
ている。
生される本発明の単クローン抗体はテオフィリンに対し
て特異的であり、多クローン性の家兎抗血清よりも優れ
ている。
ク ■
カフェイン
テオブロミン
サンチン
ヒボキサンチン
キサンチン
添付図面にお（・て、第１図、第２図および第３図は、
それぞれ細胞株３０／１５．
１７／１４、
および６１／７により産生されるテオフィリンに
対する単クローン抗体を用いる際の粒子促進濁夏阻害免
疫定量法により得られる標準検量曲線である。 特許出原人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモ アース・アンド・コンパニー 外１名 【 Ｇ。 テオフィリン＋ＩＪｇ／ｒｎＬ） Ｆ Ｉ Ｇ。 テオフィリン（ｐｇ／ｍＬｌ ＩＧ テオフィリン（νｇ／ｍＬ場
疫定量法により得られる標準検量曲線である。 特許出原人 イー・アイ・デュポン・ド・ネモ アース・アンド・コンパニー 外１名 【 Ｇ。 テオフィリン＋ＩＪｇ／ｒｎＬ） Ｆ Ｉ Ｇ。 テオフィリン（ｐｇ／ｍＬｌ ＩＧ テオフィリン（νｇ／ｍＬ場
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）細胞株が８−位置置換テオフイリン−担体複合体を
用いて免疫処置されたマウス脾臓細胞とマウス骨髄腫細
胞との交雑体である、テオフィリンに対する抗体を産出
する継続的な交雑細胞。 ２）担体がＫＬＨである特許請求の範囲第１項記載の交
雑細胞。 ３）免疫処置されるべきマウスの系統がＢａｌｂ／ｃで
ある特許請求の範囲第１項記載の交雑細胞。 ４）骨髄腫細胞がＮＳ−１である特許請求の範囲第１項
記載の交雑細胞。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39368082A | 1982-06-30 | 1982-06-30 | |
| US393,680 | 1982-06-30 | ||
| US406,554 | 1982-08-09 | ||
| US06/406,554 US4524025A (en) | 1982-06-30 | 1982-08-09 | Hybridoma cell lines and monoclonal antibodies to theophylline |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58116233A Division JPS5920228A (ja) | 1982-06-30 | 1983-06-29 | テオフイリンに対する単クローン抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02426A true JPH02426A (ja) | 1990-01-05 |
| JPH0471516B2 JPH0471516B2 (ja) | 1992-11-13 |
Family
ID=27014403
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63276369A Granted JPH02426A (ja) | 1982-06-30 | 1988-11-02 | 交雑細胞株 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4524025A (ja) |
| EP (1) | EP0098179B1 (ja) |
| JP (1) | JPH02426A (ja) |
| CA (1) | CA1207250A (ja) |
| DE (1) | DE3379406D1 (ja) |
| DK (1) | DK299783A (ja) |
| GR (1) | GR78599B (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| KR100750859B1 (ko) * | 2005-06-13 | 2007-08-22 | 방기백 | 복분자 떡 및 그의 제조방법 |
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| US4789631A (en) * | 1984-02-17 | 1988-12-06 | Synbiotics Corporation | Immunoassay for anti-dirofilaria immitis antibody |
| US4804627A (en) * | 1985-05-09 | 1989-02-14 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Method for cloning lymphoblastoid cells |
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| RU2630296C2 (ru) | 2012-07-04 | 2017-09-06 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Антитела к биотину и способы их применения |
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| MX373856B (es) | 2014-01-03 | 2020-03-25 | Hoffmann La Roche | Conjugados helicoidales-anticuerpo anti-helicoidal unidos covalentemente y usos de los mismos. |
| ES2895752T3 (es) | 2014-01-03 | 2022-02-22 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos biespecíficos anti-hapteno/anti-receptor de la barrera hematoencefálica, complejos de los mismos y su uso como lanzaderas a través de la barrera hematoencefálica |
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