JPH0242990A - 組換え融合タンパク質および組換えベクター - Google Patents
組換え融合タンパク質および組換えベクターInfo
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- JPH0242990A JPH0242990A JP1062346A JP6234689A JPH0242990A JP H0242990 A JPH0242990 A JP H0242990A JP 1062346 A JP1062346 A JP 1062346A JP 6234689 A JP6234689 A JP 6234689A JP H0242990 A JPH0242990 A JP H0242990A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は組換え融合タン、ｅり質に関し、高純度タンパ
ク質およびポリペプチド生成物の製造へのそれらの使用
に関する。本発明は更に宿主細胞中で複製できる組換え
ベクターおよび所望のタンパク質、オリゴまたはポリペ
プチドの精製・単離方法にも関する。更に詳細には本発
明は、所望のタンパク質が選択的結合能を有する２つの
タンパク質、オリゴまたはポリベデチＰ断片の間に融合
し【成るデュアル・フランキング・アフイニテイ（ｄｕ
ａｌ ｆｌａｎｋｉｎｇａｆｆｌｎｔｔｙ）融合タンパ
ク質、オリゴまたはボリペデチＰＶＣ関する。
ク質およびポリペプチド生成物の製造へのそれらの使用
に関する。本発明は更に宿主細胞中で複製できる組換え
ベクターおよび所望のタンパク質、オリゴまたはポリペ
プチドの精製・単離方法にも関する。更に詳細には本発
明は、所望のタンパク質が選択的結合能を有する２つの
タンパク質、オリゴまたはポリベデチＰ断片の間に融合
し【成るデュアル・フランキング・アフイニテイ（ｄｕ
ａｌ ｆｌａｎｋｉｎｇａｆｆｌｎｔｔｙ）融合タンパ
ク質、オリゴまたはボリペデチＰＶＣ関する。
遺伝子融合とは２以上の遺伝子のコーティング配列を一
緒に継ぎ合わせて、組み合わせ遺伝子を形成させ、それ
は適当な宿主生物中で発現させたとき、融合生成物を生
じるよ５に、そして各々の遺伝子によりコ−Ｐされた別
々のタンパク質またはポリペグチＰが共に融合して単一
の分子となるようにする手法である。
緒に継ぎ合わせて、組み合わせ遺伝子を形成させ、それ
は適当な宿主生物中で発現させたとき、融合生成物を生
じるよ５に、そして各々の遺伝子によりコ−Ｐされた別
々のタンパク質またはポリペグチＰが共に融合して単一
の分子となるようにする手法である。
本明細書中で定義されるところのデュアル・フランキン
グ・アフイニテイ遺伝子融合は組換えタンパク質をコー
ドする遺伝子融合であり。
グ・アフイニテイ遺伝子融合は組換えタンパク質をコー
ドする遺伝子融合であり。
簡略的に、下記式
（式中Ｘは１個または数個の所望のタンツク質またはポ
リペグチＰであり、セしてＡおよびＢは選択結合能のあ
る２個の異なるまたは同一のオリゴまたはポリペプチド
である） で表わすことができる。それら３つの部分は以下に説明
されるような遺伝子融合技術により継ぎ合わせられる。
リペグチＰであり、セしてＡおよびＢは選択結合能のあ
る２個の異なるまたは同一のオリゴまたはポリペプチド
である） で表わすことができる。それら３つの部分は以下に説明
されるような遺伝子融合技術により継ぎ合わせられる。
本発明は、所望のタンｌクジ質およびポリペプチドを極
めて高い純度をもって生産することを可能にする組換え
ＤＮＡ技術に基づく方法により、タンパク質の固定およ
び精製を容易にする手段を提供する。本発明によれば、
これはＡおよびＢ断片の特異リガンドに対する特異結合
を利用することにより達成される。生産されたＡ−Ｘ−
Ｂ融合タンパク質またはポリ−（グチドは適当な担体に
固定されたそれぞれＡおよびＢに選択的に結合する適当
なすｌｆンＰを利用した慣用のアフイニテイクロマトグ
ラフイにより高い効率をもって容易に単離することがで
きる。精製は融合タンパク質をますＡ結合性担体により
、次いでＢ結合性担体くより、あるいはその逆の順序で
アフイニテイ精製する二段階法によって達成することが
できる。このように精製融合タンツク質は、所望のタン
ツク質またはポリペプチドのＣ末端およびＮ末端の両側
からの選択的結合性部分によって精製され、これｋより
その所望のタンパク質またはポリペプチドを含む生成物
が保証される。従ってこの手屓を用いることにより、所
望のタンパク質またはポリペグチｒを一部または全部欠
く精製融合タン／臂り質を生じるという組換えタンツク
質のタンツク加水分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）に伴
う問題を大幅に解決することができる。かかる分解生成
物は唯一のりがンＰを用いた従来の遺伝子融合技術忙よ
り同時精製され（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ） （Ｎｉ１
ｓｓｏｎらＥＭＢＯＪ、 ４ 。
めて高い純度をもって生産することを可能にする組換え
ＤＮＡ技術に基づく方法により、タンパク質の固定およ
び精製を容易にする手段を提供する。本発明によれば、
これはＡおよびＢ断片の特異リガンドに対する特異結合
を利用することにより達成される。生産されたＡ−Ｘ−
Ｂ融合タンパク質またはポリ−（グチドは適当な担体に
固定されたそれぞれＡおよびＢに選択的に結合する適当
なすｌｆンＰを利用した慣用のアフイニテイクロマトグ
ラフイにより高い効率をもって容易に単離することがで
きる。精製は融合タンパク質をますＡ結合性担体により
、次いでＢ結合性担体くより、あるいはその逆の順序で
アフイニテイ精製する二段階法によって達成することが
できる。このように精製融合タンツク質は、所望のタン
ツク質またはポリペプチドのＣ末端およびＮ末端の両側
からの選択的結合性部分によって精製され、これｋより
その所望のタンパク質またはポリペプチドを含む生成物
が保証される。従ってこの手屓を用いることにより、所
望のタンパク質またはポリペグチｒを一部または全部欠
く精製融合タン／臂り質を生じるという組換えタンツク
質のタンツク加水分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ）に伴
う問題を大幅に解決することができる。かかる分解生成
物は唯一のりがンＰを用いた従来の遺伝子融合技術忙よ
り同時精製され（ｃｏ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ） （Ｎｉ１
ｓｓｏｎらＥＭＢＯＪ、 ４ 。
１０７５〜１０８０．１９８４）、そして以後の精製段
階で相当する問題を生じる可能性がある。
階で相当する問題を生じる可能性がある。
所望のタンパク質またはポリペグチＰｘは、同一のまた
は異なる１個または数個の部分から成っていてもよい。
は異なる１個または数個の部分から成っていてもよい。
好ましくは、これらの部分は全長融合タン、Ｒり質を精
製後、化学的または酵素的方法により分断することがで
きる。これにより、組換え融合タン／Ｊり質１モルあた
りの所望の生成物のモル量を高めることができるという
長所が得られる。
製後、化学的または酵素的方法により分断することがで
きる。これにより、組換え融合タン／Ｊり質１モルあた
りの所望の生成物のモル量を高めることができるという
長所が得られる。
特異結合性断片ＡおよびＢは適当な担体に選択的に結合
し得る任意のオリゴまたはポリペプチドであってよい。
し得る任意のオリゴまたはポリペプチドであってよい。
かかる断片の例としてはブドウ球菌プロティンＡ （Ｎ
ｉ１ｓｓｏｎらＥＭＢＯ，Ｔ 、 ４ 。
ｉ１ｓｓｏｎらＥＭＢＯ，Ｔ 、 ４ 。
１０７５〜１０８０．１９８５）、連鎖球菌プロティン
Ｇ （ＧｕＢＢらＥＭＯＢＪ、 ４ 、１５６７〜１
５７５ 、１９８５）オヨび合成断片Ｚ （Ｎｉｌｓｓ
ｏｎら、 Ｐｒｏｆ、 Ｅｎｇ、 １１０７，１１３．
１９８７）およびそれらの誘導体が挙げられすべてリガ
ン）”ＩｇＧに選択的に結合し得るものである。その他
の適当な断゛片には連鎖球菌プロティンＧからのヒト血
清アルブミン結合性断片、ストレプトマイセス・アビシ
イ（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｉ）からの
ストレプトアビジンおよびめんどりアビジン（いずれも
ビオチンおよびビオチンのアナローブに結合する）、フ
ィブロネクチン結合性断片（炭水化物結合性断片）など
が含まれる。更Ｋ、１個または数個のシスティンを含み
従ってチオール含有マトリクスに選択的に結合するオリ
ジペプチドも使用できる。取り扱おうとする所望のタン
パク質またはポリペプチドに対して最適な断片としてＡ
およびＢを選択するのは多くの要因、例えば宿主細菌、
安定性、フォールディング（ｆｏｌｄｔｎｇ） 、分泌
、部位特異的分解方法などに依存する。
Ｇ （ＧｕＢＢらＥＭＯＢＪ、 ４ 、１５６７〜１
５７５ 、１９８５）オヨび合成断片Ｚ （Ｎｉｌｓｓ
ｏｎら、 Ｐｒｏｆ、 Ｅｎｇ、 １１０７，１１３．
１９８７）およびそれらの誘導体が挙げられすべてリガ
ン）”ＩｇＧに選択的に結合し得るものである。その他
の適当な断゛片には連鎖球菌プロティンＧからのヒト血
清アルブミン結合性断片、ストレプトマイセス・アビシ
イ（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｉ）からの
ストレプトアビジンおよびめんどりアビジン（いずれも
ビオチンおよびビオチンのアナローブに結合する）、フ
ィブロネクチン結合性断片（炭水化物結合性断片）など
が含まれる。更Ｋ、１個または数個のシスティンを含み
従ってチオール含有マトリクスに選択的に結合するオリ
ジペプチドも使用できる。取り扱おうとする所望のタン
パク質またはポリペプチドに対して最適な断片としてＡ
およびＢを選択するのは多くの要因、例えば宿主細菌、
安定性、フォールディング（ｆｏｌｄｔｎｇ） 、分泌
、部位特異的分解方法などに依存する。
従って本発明の基本的解釈としては、ＡおよびＢ部をコ
ードするＤＮＡ配列に機能的Ｋ （ｏｐｅｒａ−ｔｉｖ
ｅｌｙ）連結された、所望のタンパク質またはポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列より成り、それらＤＮＡ配
列が全体としてＡ−Ｘ−Ｂ融合生成物をコードするよう
Ｋした組換えクローニングビークルまたはベクターの提
供である。宿主生物を前記融合生成物を産生ずるように
形質転換する（これはベクターがバクチリオファージま
たはウィルスである場合も包含する意味で用いである）
ことを可能にすべく、そのベクターは常法により更に、
組合せ融合生成物をコードするＤＮＡ配列に対するプロ
モーターを含む。以下に更に説明される諸口的に対して
は前記ＤＮＡ配列は、融合分子のＡおよびＢ部のいずれ
かまたは両方を前述の如く分解除去できるように、所望
のタンパク質とＡおよびＢ部をコードするＤＮＡ配列の
間にそれぞれ適宜の部位で分解するためのコード配列を
含んでい【もよい。
ードするＤＮＡ配列に機能的Ｋ （ｏｐｅｒａ−ｔｉｖ
ｅｌｙ）連結された、所望のタンパク質またはポリペプ
チドをコードするＤＮＡ配列より成り、それらＤＮＡ配
列が全体としてＡ−Ｘ−Ｂ融合生成物をコードするよう
Ｋした組換えクローニングビークルまたはベクターの提
供である。宿主生物を前記融合生成物を産生ずるように
形質転換する（これはベクターがバクチリオファージま
たはウィルスである場合も包含する意味で用いである）
ことを可能にすべく、そのベクターは常法により更に、
組合せ融合生成物をコードするＤＮＡ配列に対するプロ
モーターを含む。以下に更に説明される諸口的に対して
は前記ＤＮＡ配列は、融合分子のＡおよびＢ部のいずれ
かまたは両方を前述の如く分解除去できるように、所望
のタンパク質とＡおよびＢ部をコードするＤＮＡ配列の
間にそれぞれ適宜の部位で分解するためのコード配列を
含んでい【もよい。
コンパチブルな宿主生物を前記ベクターで形質転換して
前記組合せＤＮＡ配列の発現を可能にし、その宿主を栄
養培地で培養することにより、相当するＡ−Ｘ−Ｂ融合
タンパク質またはポリペプチドが産生されることＫなる
。細菌宿主、例えばエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ）、桿菌風（Ｂａｃｉ−１１ｕａ）およびゾｒつ
球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌａｃｏｃｃｕｓ）などが本発明
の目的にとり好ましいがもちろん、その他の宿主、例え
ば酵母およびその他の真菌（ｆｕｎｇｉ）、培養植物細
胞および晴乳動物細施などを用いることも本発明の範囲
に包含される。宿主の形質転換は周知の方法により行う
ことができる。
前記組合せＤＮＡ配列の発現を可能にし、その宿主を栄
養培地で培養することにより、相当するＡ−Ｘ−Ｂ融合
タンパク質またはポリペプチドが産生されることＫなる
。細菌宿主、例えばエシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ）、桿菌風（Ｂａｃｉ−１１ｕａ）およびゾｒつ
球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌａｃｏｃｃｕｓ）などが本発明
の目的にとり好ましいがもちろん、その他の宿主、例え
ば酵母およびその他の真菌（ｆｕｎｇｉ）、培養植物細
胞および晴乳動物細施などを用いることも本発明の範囲
に包含される。宿主の形質転換は周知の方法により行う
ことができる。
培養宿主生物により主意された融合分子の特異的Ａおよ
びＢ結合性断片により完全長融合分子を、２個の適当な
担体に固定されたすｆｆンＰによって細胞培養物から極
めて効率的に単離することができる。融合生成物が周囲
の媒質に分泌されているときは、第１の担体への結合を
その媒質から直接行ってもよい。一方、融合生成物が細
胞内にとどまっているときは後者を破砕してからかかる
結合を行うことができる。細胞壁の破砕は常法により、
例えば高圧、超音波、ホモジナイゼーション、ガラスピ
ーズとの振盪などによって行うことができる。生成物が
例えばダラム陰性細菌などのように、２つの細胞膜間の
ベリプラズマ空間内にドラッグされているときは、浸透
圧ショック手法を用いて生成物を懸濁液媒質中に放出さ
せることができる。もちろん、融合生成物のアフイニテ
イ単離の前に培養細胞または増殖培地のいかなるその他
の処理を行なうことも本発明の範囲に包含される。
びＢ結合性断片により完全長融合分子を、２個の適当な
担体に固定されたすｆｆンＰによって細胞培養物から極
めて効率的に単離することができる。融合生成物が周囲
の媒質に分泌されているときは、第１の担体への結合を
その媒質から直接行ってもよい。一方、融合生成物が細
胞内にとどまっているときは後者を破砕してからかかる
結合を行うことができる。細胞壁の破砕は常法により、
例えば高圧、超音波、ホモジナイゼーション、ガラスピ
ーズとの振盪などによって行うことができる。生成物が
例えばダラム陰性細菌などのように、２つの細胞膜間の
ベリプラズマ空間内にドラッグされているときは、浸透
圧ショック手法を用いて生成物を懸濁液媒質中に放出さ
せることができる。もちろん、融合生成物のアフイニテ
イ単離の前に培養細胞または増殖培地のいかなるその他
の処理を行なうことも本発明の範囲に包含される。
常法に従って、固定化方法は適当な媒質中でスラリー化
されたりボンド結合担体を用いて、または活性化された
担体のカラムを用いて回分式に行うことができる。リガ
ンドが本発明の目的に対し十分に結合され得るものであ
ればいずれの慣用の担体材料を用いてもよい。かかる担
゛体材料にすがンＰを結合または固定化する方法は周知
であり、ここで詳述する必要はない。コーティング手段
として微量定量ウェルの表面へのりガンＰ吸着を用いる
こともできる。
されたりボンド結合担体を用いて、または活性化された
担体のカラムを用いて回分式に行うことができる。リガ
ンドが本発明の目的に対し十分に結合され得るものであ
ればいずれの慣用の担体材料を用いてもよい。かかる担
゛体材料にすがンＰを結合または固定化する方法は周知
であり、ここで詳述する必要はない。コーティング手段
として微量定量ウェルの表面へのりガンＰ吸着を用いる
こともできる。
すがンＰ担体に結合した融合タンパク質またはポリペブ
チｒの放出または脱着は選択したりがンＰ結合に依存す
る。通常はアルブミン結合性断片およびプロティンＡ由
来断片の場合などのよ５Ｋ、これは慣用の方法、例えば
−の低下（例えば酢酸緩衝液（−２゜７）Ｋよる）、高
塩濃度またはカオトロフイック（ｃｈａｏｔｒｏｐｈｉ
ｃ）イオンによる処理、または過剰の可溶性Ｈ８Ａまた
はＩｇＧを用いて融合タンパク質またはポリペプチドを
Ｈ８Ａ−または工ｇＧ−担体吸着剤から排除する拮抗的
溶出により行うことができる。もちろん、個々の所望の
タンＡり質またはポリペプチドに関してその所望の活性
がそれによつ【失われないかまたは大きく低下しないよ
５に脱着方法の選択を行うべきである。得られた溶出液
から融合タンパク質またはポリペプチドを容易に単離す
ることができ、そして所望により更なる精製段階、例え
ばゲルー過、イオン交換などＫかけることもできる。
チｒの放出または脱着は選択したりがンＰ結合に依存す
る。通常はアルブミン結合性断片およびプロティンＡ由
来断片の場合などのよ５Ｋ、これは慣用の方法、例えば
−の低下（例えば酢酸緩衝液（−２゜７）Ｋよる）、高
塩濃度またはカオトロフイック（ｃｈａｏｔｒｏｐｈｉ
ｃ）イオンによる処理、または過剰の可溶性Ｈ８Ａまた
はＩｇＧを用いて融合タンパク質またはポリペプチドを
Ｈ８Ａ−または工ｇＧ−担体吸着剤から排除する拮抗的
溶出により行うことができる。もちろん、個々の所望の
タンＡり質またはポリペプチドに関してその所望の活性
がそれによつ【失われないかまたは大きく低下しないよ
５に脱着方法の選択を行うべきである。得られた溶出液
から融合タンパク質またはポリペプチドを容易に単離す
ることができ、そして所望により更なる精製段階、例え
ばゲルー過、イオン交換などＫかけることもできる。
後述の如く得られた精製タンパク質またはボ１７−ｅプ
チドはそれ自体で価値ある生成物であり得る。従って本
発明のもう一つの面は、前記ベクターでコンパチブルな
宿主を形質転換し、該宿主を栄養培地で培養し、該融合
タンパク質またはポリペブチｒをそれらをリガンド支持
担体に選択的に結合させることによって前記宿主培地か
ら単離し、そして所望によりその融合タンツク質または
ポリペプチドを担体から放出させる段階より成る高度精
製融合タンパク質またはポリペプチド生成物の製造方法
、およびそれによって得られる単離した融合生成物の提
供である。
チドはそれ自体で価値ある生成物であり得る。従って本
発明のもう一つの面は、前記ベクターでコンパチブルな
宿主を形質転換し、該宿主を栄養培地で培養し、該融合
タンパク質またはポリペブチｒをそれらをリガンド支持
担体に選択的に結合させることによって前記宿主培地か
ら単離し、そして所望によりその融合タンツク質または
ポリペプチドを担体から放出させる段階より成る高度精
製融合タンパク質またはポリペプチド生成物の製造方法
、およびそれによって得られる単離した融合生成物の提
供である。
融合タンノぞり質またはポリペブチｒｆ）ＡおよびＢ結
合性断片は一定の条件下に分解除去でき、それによって
純粋な所望のタンパク質またはポリペプチドが得られる
。従ってもう一つの面において本発明は、前記ベクター
でコンパチブルな宿主を形質転換し、該宿主を栄養培地
で培養し、融合タンパク質またはポリペプチドを１また
は２個のりガント支持担体に選択的に結合することによ
り細旭培養から単離し、モして担体結合した融合生成物
から直接的に、または担体からそれを脱着した後該融合
タンパク質またはポリペプチドのＡおよび／またはＢ部
から所望のタンツク質またはポリペプチドを離断する段
階より成る高純度の所望のタンパク質またはポリペプチ
ドの製造方法を提供する。
合性断片は一定の条件下に分解除去でき、それによって
純粋な所望のタンパク質またはポリペプチドが得られる
。従ってもう一つの面において本発明は、前記ベクター
でコンパチブルな宿主を形質転換し、該宿主を栄養培地
で培養し、融合タンパク質またはポリペプチドを１また
は２個のりガント支持担体に選択的に結合することによ
り細旭培養から単離し、モして担体結合した融合生成物
から直接的に、または担体からそれを脱着した後該融合
タンパク質またはポリペプチドのＡおよび／またはＢ部
から所望のタンツク質またはポリペプチドを離断する段
階より成る高純度の所望のタンパク質またはポリペプチ
ドの製造方法を提供する。
もちろん、融合タンパク質またはポリペプチドのこのよ
うな分解が可能となるのに必要な条件は、それが適当な
手段により認識されそして分解され得る分解部位を含有
することである。
うな分解が可能となるのに必要な条件は、それが適当な
手段により認識されそして分解され得る分解部位を含有
することである。
このような分解部位は、化学的または酵素的手段により
認識可能で所望のタンパク質またはポリペプチドと融合
生成物の側部アフィ二ティ部分との間に存在するアミノ
酸配列であってよい。
認識可能で所望のタンパク質またはポリペプチドと融合
生成物の側部アフィ二ティ部分との間に存在するアミノ
酸配列であってよい。
このような特異的アミノ酸配列は、所望のタンパク質ま
たはポリペプチド内に存在してはならず、また、好まし
くは融合生成物の結合性部分に存在してはならない。酵
素剤の例としては、プロテアーゼ、例えば場合によりア
ミノ酸配列ＮＨ２−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ＣＯＯＨを認識する第Ｘａ因子；Ｍｅｔ−Ｐｈｅ 結合
ヲ分解スるキモシン（レンニン）；Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−ＹのＡｒｇのカルボキシル側で分解するカリクレイン
Ｂ；配列Ｘ−（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｙ （式中ｎ ＝
２〜４）を認識し、そしてそれをＬｙｅのカルボキシ
ル側で分解するエンテロキナーゼ；特異的アルイニル結
合を分解するトロンビンなどが包含される。化学剤の例
としては、Ｍｅｔの後で分解する臭化シアン（ｃＮＢｒ
） ； Ａｓｎ−Ｇｌｙ結合を分解スるヒＰロキシルア
ミン；高濃度（〜・７０％）で特異的Ｋ Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏを分解する蟻酸などが包含される。
たはポリペプチド内に存在してはならず、また、好まし
くは融合生成物の結合性部分に存在してはならない。酵
素剤の例としては、プロテアーゼ、例えば場合によりア
ミノ酸配列ＮＨ２−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ＣＯＯＨを認識する第Ｘａ因子；Ｍｅｔ−Ｐｈｅ 結合
ヲ分解スるキモシン（レンニン）；Ｘ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ
−ＹのＡｒｇのカルボキシル側で分解するカリクレイン
Ｂ；配列Ｘ−（Ａｓｐ）ｎ−Ｌｙｓ−Ｙ （式中ｎ ＝
２〜４）を認識し、そしてそれをＬｙｅのカルボキシ
ル側で分解するエンテロキナーゼ；特異的アルイニル結
合を分解するトロンビンなどが包含される。化学剤の例
としては、Ｍｅｔの後で分解する臭化シアン（ｃＮＢｒ
） ； Ａｓｎ−Ｇｌｙ結合を分解スるヒＰロキシルア
ミン；高濃度（〜・７０％）で特異的Ｋ Ａｓｐ−Ｐｒ
ｏを分解する蟻酸などが包含される。
前記かられかるように、本発明の重要な部分の一つは本
発明の融合タンパク質またはポリペプチドをコードする
組合せ遺伝子を含み、そして宿主細胞をその発現および
融合生成物の産生が可能となるように形質転換できる組
換えＤＮＡ構造またはベクターの提供である０本発明は
、例えば当業者に周知の様々な制限酵素切断、連結、形
質転換および検索技術および任意の適宜のベクター材料
および宿主生物を用いてどのようにして得たかによらず
、あらゆるそのようなベクターを包含するものである。
発明の融合タンパク質またはポリペプチドをコードする
組合せ遺伝子を含み、そして宿主細胞をその発現および
融合生成物の産生が可能となるように形質転換できる組
換えＤＮＡ構造またはベクターの提供である０本発明は
、例えば当業者に周知の様々な制限酵素切断、連結、形
質転換および検索技術および任意の適宜のベクター材料
および宿主生物を用いてどのようにして得たかによらず
、あらゆるそのようなベクターを包含するものである。
すなわち、所望のタンパク質またはポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を適当なベクター中に挿入し、そして
次いでＡおよびＢ断片をコードするＤＮＡ配列を拝する
か、またはその逆であってもよい。あるいは３つのＤＮ
Ａ配列をベクターに同時に導入することもできる。更に
それぞれのＤＮＡ配列をそれを部分に分けてベクターに
挿入することもできる。適切な制限部位の提供を含め、
正しい解読枠の維持されたかかる挿入および組合せを行
うための特別な技術は自体当業者に周知である。
ドするＤＮＡ配列を適当なベクター中に挿入し、そして
次いでＡおよびＢ断片をコードするＤＮＡ配列を拝する
か、またはその逆であってもよい。あるいは３つのＤＮ
Ａ配列をベクターに同時に導入することもできる。更に
それぞれのＤＮＡ配列をそれを部分に分けてベクターに
挿入することもできる。適切な制限部位の提供を含め、
正しい解読枠の維持されたかかる挿入および組合せを行
うための特別な技術は自体当業者に周知である。
更に本発明は、前述の如き組換えＤＮＡ配列を含みそし
てＤＮＡレベルで生産遺伝子を融合した組換えＤＮＡ分
子を包含する。このアレンジにより、かかる分子は融合
タンパク質を適当な宿主中で発現する能力を獲得する。
てＤＮＡレベルで生産遺伝子を融合した組換えＤＮＡ分
子を包含する。このアレンジにより、かかる分子は融合
タンパク質を適当な宿主中で発現する能力を獲得する。
そのような生産遺伝子は、ソマトメジン、例えば成長ホ
ルモンまたは因子、例えばｈｏＨ（ヒト成長ホルモン）
。
ルモンまたは因子、例えばｈｏＨ（ヒト成長ホルモン）
。
ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩ、ＮＧＦ （神経成長因子）
、ＥＧＦ（表皮成長因子）およびＰＤＧＦ （血小板由
来成長因子）などの遺伝子であってよい。生産遺伝子は
またインターフェロン、インターロイキン−２、インシ
ュリン、ニューロペグチｙ、 胃ｈヘプチド、セクレチ
ン組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）および
その活性誘導体などをコードするものであってよい。更
に生ｆ＃着伝子は酵素またはその一部の構造遺伝子をコ
ードしていてもよい。
、ＥＧＦ（表皮成長因子）およびＰＤＧＦ （血小板由
来成長因子）などの遺伝子であってよい。生産遺伝子は
またインターフェロン、インターロイキン−２、インシ
ュリン、ニューロペグチｙ、 胃ｈヘプチド、セクレチ
ン組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）および
その活性誘導体などをコードするものであってよい。更
に生ｆ＃着伝子は酵素またはその一部の構造遺伝子をコ
ードしていてもよい。
本発明のもう一つの面によれば、前記定義に係る組換え
ＤＮＡ分子により生物学的システム中で発現された融合
タンノＲり質の分解方法が提供される。
ＤＮＡ分子により生物学的システム中で発現された融合
タンノＲり質の分解方法が提供される。
最後に、本発明は前述の如き組換えＤＮＡ分子を含むシ
ラスミ）％ベクターを包含する。更に本発明は前記定義
に係る組換えＤＮＡ分子を取り込んだ（ｈａｒｂｏｕｒ
ｉｎｇ）細菌または真核細胞にまでも及ぶものである。
ラスミ）％ベクターを包含する。更に本発明は前記定義
に係る組換えＤＮＡ分子を取り込んだ（ｈａｒｂｏｕｒ
ｉｎｇ）細菌または真核細胞にまでも及ぶものである。
その分子は細胞の染色体に挿入できるがプラスミドベク
ター中に含めることもできる。
ター中に含めることもできる。
宿主細胞は例えばダラム陰性細菌であり、特に大腸菌（
Ｅ、 Ｃ０１ｉ）より成る。
Ｅ、 Ｃ０１ｉ）より成る。
本発明を以下、添付図面を参照しつつ実施例により更に
説明するが、これに限定されるものではない。
説明するが、これに限定されるものではない。
本発明の特定実施例を詳細に説明する。
出発材料
この実施例には、大腸菌株ＲＲ１ｄｅｌ ＭｌＢ （Ｌ
ａｎ−ｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７２．１２５
４〜１２５７ （１９７５） ）、ＨＢｌ ０１ （Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、 Ｉ、 ｅｔ ａｌ、、Ｍｏ１ｅ−ｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、 ａ １ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ Ｌ＋ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ、 ＮＹ）およびＲＶ３０８（Ｍａｕｒｅｒ、 Ｒ
，ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｍｏｌ：Ｂｉｏｌ−１３９、１４
７〜１６１（１９８０））を用いた。使用したクローニ
ングビークルはｐＥＺＺ８ （Ｌ３ｗｅｎａｄｌｅｒ、
Ｂ、 ｅもａｌ、 、 Ｇｏｎｅ ５８ 。
ａｎ−ｇｌｅｙ ｅｔ ａｌ、、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔ
ｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ７２．１２５
４〜１２５７ （１９７５） ）、ＨＢｌ ０１ （Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、 Ｉ、 ｅｔ ａｌ、、Ｍｏ１ｅ−ｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、 ａ １ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ Ｌ＋ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ、 ＮＹ）およびＲＶ３０８（Ｍａｕｒｅｒ、 Ｒ
，ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｍｏｌ：Ｂｉｏｌ−１３９、１４
７〜１６１（１９８０））を用いた。使用したクローニ
ングビークルはｐＥＺＺ８ （Ｌ３ｗｅｎａｄｌｅｒ、
Ｂ、 ｅもａｌ、 、 Ｇｏｎｅ ５８ 。
８７〜９７（１９８７））およびｐＥＺＺ ＢＩＢ２
、 （４ｐ２）であった。
、 （４ｐ２）であった。
前記の菌株およびベクターはすべてスエーチン国ストッ
クホルムの王立技術研究所（ＲｏｙａｌＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）生化学部（Ｔｈｅ
Ｄｅｐａｒｔ−ｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）で入手できる。プラスミＰベクターｐＮＰ−２
はＰイッ連邦共和国ブラウンシュパイク（Ｂｒａｕｎｓ
ｃｂｙｅｉｇ）のＰイツ微生物収集機関（Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｅ ８ｄｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ、略称Ｄ８Ｍ ）に１９８８年２月３日に
ムＤ８Ｍ−４３８７として寄託されている。
クホルムの王立技術研究所（ＲｏｙａｌＩｎｓｔｉｔｕ
ｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）生化学部（Ｔｈｅ
Ｄｅｐａｒｔ−ｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）で入手できる。プラスミＰベクターｐＮＰ−２
はＰイッ連邦共和国ブラウンシュパイク（Ｂｒａｕｎｓ
ｃｂｙｅｉｇ）のＰイツ微生物収集機関（Ｄｅｕｔｓｃ
ｈｅ ８ｄｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｅｎ、略称Ｄ８Ｍ ）に１９８８年２月３日に
ムＤ８Ｍ−４３８７として寄託されている。
緩衝液および媒質
ＴＳＢ ： ５０ ｆのトリプデック・ソイ・ブロス（
Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）を全量１ノとし
、オートクレーブ処理したもの。
Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）を全量１ノとし
、オートクレーブ処理したもの。
ＴＮＴ ： ＴＲｌ８ （２５ｍＭ）およびＩ（ｃ２（
ｐＨ７，４にするため）、２００ ｍＭ ＮａＣＡ 、
Ｑ、０５％Ｔｗｅｅｎ ２０゜慣用の方法 分子生物学で慣用されている方法は説明しない（例えば
市販の制限酵素の使用、ＤＮＡ連結、Ｂａｌ ３１エク
ソヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼおよびクレノー（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼ、大腸菌の形質転換およびグ
ラスミドＤＮＡの単離など）。
ｐＨ７，４にするため）、２００ ｍＭ ＮａＣＡ 、
Ｑ、０５％Ｔｗｅｅｎ ２０゜慣用の方法 分子生物学で慣用されている方法は説明しない（例えば
市販の制限酵素の使用、ＤＮＡ連結、Ｂａｌ ３１エク
ソヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼおよびクレノー（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼ、大腸菌の形質転換およびグ
ラスミドＤＮＡの単離など）。
Ｎｏ５ｓａｌおよびＨｅｐｐｅｌ 、 Ｊ、 ｏｆ Ｂ
ｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ｖｏｌ。
ｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、 、 ｖｏｌ。
２４４．４１３．ｐｐ３０５５〜３０６２（１９６６’
））Ｉｃ記載の浸透圧ショック法は細抱をα１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ含有２０％シュクロースに晒し、次いで冷５．１
０ モルＭｇＣＬ２中に分散させてペリプラズマ内容
物を遊離させることより成る。
））Ｉｃ記載の浸透圧ショック法は細抱をα１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ含有２０％シュクロースに晒し、次いで冷５．１
０ モルＭｇＣＬ２中に分散させてペリプラズマ内容
物を遊離させることより成る。
ＰＨＡＳＴ−システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（スエー
チン国つプサラ））を用いた８ＤＳ−ＰＡＧＥによりタ
ン／９り質画分を分析するＫはサンプルを負荷用緩衝液
（２，５％ＳＤＳ、５％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
および０．０１％ブロモフェノールブルー〕Ｋ溶解した
。５％ＳＤＢ含有濃度勾配（８〜２５％）ポリアクリル
アミＰゲルを１０ｍＡで約３０分試験にかけ、セして次
にクーマシーーブル−（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ｂｌｕｅ
）で染色した。
チン国つプサラ））を用いた８ＤＳ−ＰＡＧＥによりタ
ン／９り質画分を分析するＫはサンプルを負荷用緩衝液
（２，５％ＳＤＳ、５％ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
および０．０１％ブロモフェノールブルー〕Ｋ溶解した
。５％ＳＤＢ含有濃度勾配（８〜２５％）ポリアクリル
アミＰゲルを１０ｍＡで約３０分試験にかけ、セして次
にクーマシーーブル−（ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ｂｌｕｅ
）で染色した。
ＩＧＦ −Ｉｆラジオレセグターアツセイ（ＲＲＡ）は
Ｔａｈａｎｏら（Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、 １０
７ 、１６ｊｌ−１７０、１９８０）の記載と同様にし
て行った。
Ｔａｈａｎｏら（Ａｃｔａ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、 １０
７ 、１６ｊｌ−１７０、１９８０）の記載と同様にし
て行った。
実施例
融合タンツク質のクローニングと発、現、および引き続
いての、そのＩｇＧ−およびアルブミン−結合活性の両
方を利用した前記タンＡり質の精製 ヒト自然ＩＧＦ −ｎのアミノ酸配列に基づいて。
いての、そのＩｇＧ−およびアルブミン−結合活性の両
方を利用した前記タンＡり質の精製 ヒト自然ＩＧＦ −ｎのアミノ酸配列に基づいて。
平均１９塩基長の２２個のオーバーラッピングオリゴヌ
クレオチＰを合成し、そして第１図に図示される如く遺
伝子を構築した。大腸菌において最も豊富なｔＲＮＡに
よりｇ識されるコドンを用いたが多重の相補を有する配
列は避けた。遺伝子の５′および５′末端は、クローニ
ングおよび発現ベクターへの挿入を容易にするためにそ
れぞれＥｃｏＲＩおよびＨｌｎｄ ｍ粘着末端で設計し
た。
クレオチＰを合成し、そして第１図に図示される如く遺
伝子を構築した。大腸菌において最も豊富なｔＲＮＡに
よりｇ識されるコドンを用いたが多重の相補を有する配
列は避けた。遺伝子の５′および５′末端は、クローニ
ングおよび発現ベクターへの挿入を容易にするためにそ
れぞれＥｃｏＲＩおよびＨｌｎｄ ｍ粘着末端で設計し
た。
Ｎ−末端メチオニンコドンを含めて、融合タンパク質が
ＣＮＢｒにより部位特異的に分解して自然ＩＧＦ −ｆ
ｆを生成できるよ５）２：した。二重のＴＡＡ翻訳停止
コＰンを構造遺伝子の３７−末端に取り込んだ。
ＣＮＢｒにより部位特異的に分解して自然ＩＧＦ −ｆ
ｆを生成できるよ５）２：した。二重のＴＡＡ翻訳停止
コＰンを構造遺伝子の３７−末端に取り込んだ。
遺伝子合成
固相化学シよびＮ−保護ヌクレオシｒクロロホスファイ
トを用い既に報告されているように（Ｎｉ１ｓ＋ｓｏｎ
Ｂ、らＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｓａ、 １３ ＋
１１５１〜１１６１（１９８５））ＫａｂｉｇｅｎＡ
Ｂ社により開発された自動装置で前記オｙ−ｒマー（第
１図）を合成した。
トを用い既に報告されているように（Ｎｉ１ｓ＋ｓｏｎ
Ｂ、らＮｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｓａ、 １３ ＋
１１５１〜１１６１（１９８５））ＫａｂｉｇｅｎＡ
Ｂ社により開発された自動装置で前記オｙ−ｒマー（第
１図）を合成した。
１ ｎ ｍｏｌｅ （六）そル）脱保護オリゴマーを５
０ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＨＣＡ （ｐＨ７，６）、１０ ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２．２ ｎ ｍｏｌｅＡＴＰ 、 ７
ｐ ｍｏｌｅ （ピコモル）ｒ−３２Ｐ−ＡＴＰ（３０
００ａｔ／ｎ ｍｏｌｅ ）および１０μで４ポリヌク
レオチドキナーゼと共に３７℃で１時間インキエペーシ
ョンすることＫより賦活化した。そのホスホリル化オリ
ゴマーを結合させて６個のオリゴマーより成る３個のブ
ロック、および４個のオリゴマーより成る１個のブロッ
クを形成した。すべてのブロックにおいて重合を避ける
ために突出５’末端を形成するオリゴマーはホスホリル
化しなかった。
０ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＨＣＡ （ｐＨ７，６）、１０ ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ２．２ ｎ ｍｏｌｅＡＴＰ 、 ７
ｐ ｍｏｌｅ （ピコモル）ｒ−３２Ｐ−ＡＴＰ（３０
００ａｔ／ｎ ｍｏｌｅ ）および１０μで４ポリヌク
レオチドキナーゼと共に３７℃で１時間インキエペーシ
ョンすることＫより賦活化した。そのホスホリル化オリ
ゴマーを結合させて６個のオリゴマーより成る３個のブ
ロック、および４個のオリゴマーより成る１個のブロッ
クを形成した。すべてのブロックにおいて重合を避ける
ために突出５’末端を形成するオリゴマーはホスホリル
化しなかった。
その混合物を５０ ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＨＣＡ（ｐＨ７，
６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびα５ｍＭＡ’ｒＰに
調節し、そして９０℃で５分間インキュベートした後、
徐々に１０℃に冷却した。ＤＴＴの濃度なｉＱｍＭに調
節し、そして１０μのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、そ
してその混合物を４℃で２０時間インキュベートシタ。
６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２およびα５ｍＭＡ’ｒＰに
調節し、そして９０℃で５分間インキュベートした後、
徐々に１０℃に冷却した。ＤＴＴの濃度なｉＱｍＭに調
節し、そして１０μのＴ４ＤＮＡリガーゼを添加し、そ
してその混合物を４℃で２０時間インキュベートシタ。
サンプルをエタノールで沈殿させ、そして連結生成物を
１５％ポリアクリルアミＰゲルで単離した（ Ｍａｎｉ
ａｔｉｅ、 ｌ 、 ｅｔ ａＬ 、 Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 ａ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍ
ａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、 ＮＹ ）。
１５％ポリアクリルアミＰゲルで単離した（ Ｍａｎｉ
ａｔｉｅ、 ｌ 、 ｅｔ ａＬ 、 Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣｌｏｎｉｎｇ、 ａ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍ
ａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ、 ＮＹ ）。
前記ＤＮＡの４個のブロックを前述の如くホスホリル化
しそして連結し、また２１５ｂｐ断片を１５％ポリアク
リルアミｒゲルから単離した。この断片をｇｃｏＲｌお
よびＨｌｐｄｎＩで制限された７ア一ジＭ１５ ｍｐ
１９中に連結し、そしてＤＮＡ配列決定により白色プラ
ークを分析した（ ０１ｓｓｏｎ、 Ａ、ら。
しそして連結し、また２１５ｂｐ断片を１５％ポリアク
リルアミｒゲルから単離した。この断片をｇｃｏＲｌお
よびＨｌｐｄｎＩで制限された７ア一ジＭ１５ ｍｐ
１９中に連結し、そしてＤＮＡ配列決定により白色プラ
ークを分析した（ ０１ｓｓｏｎ、 Ａ、ら。
４５．１７５〜１８１（１９８６））。
大腸菌での発現
ＩＧＦ −ＩＩ遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＨｌｎｄ ｍ
部位間の融合ベクターｐＥＺＺ中に挿入することにより
分泌ベクターを構築した。得られたデラスミＰ１）ＲＩ
Ｔ１９ （第２図）は、ＳＰＡのシグナル配列、２個の
合成ＩｇＧ結合性領域（２２） 、独特のメチオニン残
基、およびそれに続く主要形態のヒ） ＩＧＦ−■の６
７個のアミノ酸残基をコーｒする。
部位間の融合ベクターｐＥＺＺ中に挿入することにより
分泌ベクターを構築した。得られたデラスミＰ１）ＲＩ
Ｔ１９ （第２図）は、ＳＰＡのシグナル配列、２個の
合成ＩｇＧ結合性領域（２２） 、独特のメチオニン残
基、およびそれに続く主要形態のヒ） ＩＧＦ−■の６
７個のアミノ酸残基をコーｒする。
大腸菌株ＲＶ３０８をデラスミｒで形質転換し、そして
−夜振盪したフラスコ内での発現により得られたタンパ
ク質を分析した。
−夜振盪したフラスコ内での発現により得られたタンパ
ク質を分析した。
細胞培養液を交叉流（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ ）マイク
ロフィルトレージョンにより清澄化し、そしてその媒質
をＩｇＧ Ｆａｓｔ ＦＩＯＷ ５ｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムに通した。結合物質を溶出しそして前述の如く凍結
乾燥した（Ｍｏｋｓ、Ｔ、ら、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ５．３７９〜３８２（１９８７））。
ロフィルトレージョンにより清澄化し、そしてその媒質
をＩｇＧ Ｆａｓｔ ＦＩＯＷ ５ｅｐｈａｒｏｓｅカ
ラムに通した。結合物質を溶出しそして前述の如く凍結
乾燥した（Ｍｏｋｓ、Ｔ、ら、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ５．３７９〜３８２（１９８７））。
アフイニテイ精製され凍結乾燥した物質の純度を還元条
件下に分析した。コントロールとして、Ｉ（）Ｆ −Ｉ
Ｉと同様の構造と大きさをもったアフイニテイ精製ヒト
ＩＧＦ−１融合タンツク質（Ｍｏｋｓ、 Ｔ、ら、阻ｏ
／’Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、互、３７９〜３８２（１９
８７））を含めた（第３図、レーン２）。
件下に分析した。コントロールとして、Ｉ（）Ｆ −Ｉ
Ｉと同様の構造と大きさをもったアフイニテイ精製ヒト
ＩＧＦ−１融合タンツク質（Ｍｏｋｓ、 Ｔ、ら、阻ｏ
／’Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、互、３７９〜３８２（１９
８７））を含めた（第３図、レーン２）。
このゲルかられかるようＫＩｇＧ−ＩＩ（レーン３）は
ＩＧＦ −１と同じ条件下に増殖するものの非常に分解
されている。ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）を用
いて、ＣＮＢｒ処理による分解生成物を分析しても、生
物学的活性は全く認められなかつた。
ＩＧＦ −１と同じ条件下に増殖するものの非常に分解
されている。ラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）を用
いて、ＣＮＢｒ処理による分解生成物を分析しても、生
物学的活性は全く認められなかつた。
異種的に（ｈｅ ｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）分解する
遺伝子生産物の取扱いに伴う課題を解決するべく、ＩＧ
Ｆ−１の生産には新しい策を用いた。デラスミ）’ｐＲ
ＩＴ１９を制限酵素ＮｏｔＩおよびＨｐａ Ｕで消化し
、切り詰められた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ） ＩＧＦ −
１［遺伝子を含む断片を放出させた。合成リンカ−（５
’−ＣＧＧＣ−ＧＡＡＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧ、 Ｋａ
ｂｉｇｅｎ社、スエーチン国ストックホルム）およびそ
の相補配列をリゲーションにより付加した。ＥｃｏＲｌ
で消化した後、この断片を予めＥｃｏＲｌおよびＢａｍ
Ｈｌで消化しおいたｐＺＺＢＩＢ２に挿入した。このｐ
ＮＰ−２と称される構築物（第４Ａ図）は従って、ブｒ
つ球菌プロティンＡＫ由来する合成ＩｇＧ結合性領域、
Ｚｚ、はぼ自然のヒトインシュリン様成長因子■および
最後に連鎖球菌プロティンＧのアルブミン結合性部分よ
り成る融合タンパク質をボードする。
遺伝子生産物の取扱いに伴う課題を解決するべく、ＩＧ
Ｆ−１の生産には新しい策を用いた。デラスミ）’ｐＲ
ＩＴ１９を制限酵素ＮｏｔＩおよびＨｐａ Ｕで消化し
、切り詰められた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ） ＩＧＦ −
１［遺伝子を含む断片を放出させた。合成リンカ−（５
’−ＣＧＧＣ−ＧＡＡＡＴＣＴＧＡＡＡＴＧＧ、 Ｋａ
ｂｉｇｅｎ社、スエーチン国ストックホルム）およびそ
の相補配列をリゲーションにより付加した。ＥｃｏＲｌ
で消化した後、この断片を予めＥｃｏＲｌおよびＢａｍ
Ｈｌで消化しおいたｐＺＺＢＩＢ２に挿入した。このｐ
ＮＰ−２と称される構築物（第４Ａ図）は従って、ブｒ
つ球菌プロティンＡＫ由来する合成ＩｇＧ結合性領域、
Ｚｚ、はぼ自然のヒトインシュリン様成長因子■および
最後に連鎖球菌プロティンＧのアルブミン結合性部分よ
り成る融合タンパク質をボードする。
この構築物を含有する大腸菌細胞のサンプルはブラウン
シュパイクのＤＳＭに寄託され、Ａ ＤＡＭ−４３８７
の受託番号を得ている。
シュパイクのＤＳＭに寄託され、Ａ ＤＡＭ−４３８７
の受託番号を得ている。
ｐＮＰ −２を含有する大腸菌）ＩＢ１０１細胞をアン
♂シリン（７ｏｗ／ｌ）を補給した２１のＴＳＢ中で３
７℃で一夜培養した。ペリプラズマ空間に局在したタン
パク質は、既知の技術に従って浸透圧ショック法を用い
て放出した。
♂シリン（７ｏｗ／ｌ）を補給した２１のＴＳＢ中で３
７℃で一夜培養した。ペリプラズマ空間に局在したタン
パク質は、既知の技術に従って浸透圧ショック法を用い
て放出した。
アフイニテイクロマトグラフイのために、ＩｇＧ−５ｅ
ｐｈａｒｏｓｓをＰｈａｒｍａｃｉａ社（スエーチン国
つプサラ）から入手し、またＨ８Ａ −５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅは精製Ｈ８Ａ （Ｋａｂｉ−Ｖｉｔｒｕｍ社、スエ
ーチン国ストックホルム）をＣＮＢｒ−活性化８ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｗｅｄｅｎ国
ウプサラ）ＶｃＡｘＩｅｎら（１９６７Ｎａｔｕｒｅ２
１４ 、１３０２〜１３０４ ）が報告した方法で結合
することにより調製した。Ｈ８Ａ−およびＩｇＧ −８
ｅｐｈａｒｏｓｓをカラムに充填した（ゲル量的４■）
。
ｐｈａｒｏｓｓをＰｈａｒｍａｃｉａ社（スエーチン国
つプサラ）から入手し、またＨ８Ａ −５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅは精製Ｈ８Ａ （Ｋａｂｉ−Ｖｉｔｒｕｍ社、スエ
ーチン国ストックホルム）をＣＮＢｒ−活性化８ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｓｗｅｄｅｎ国
ウプサラ）ＶｃＡｘＩｅｎら（１９６７Ｎａｔｕｒｅ２
１４ 、１３０２〜１３０４ ）が報告した方法で結合
することにより調製した。Ｈ８Ａ−およびＩｇＧ −８
ｅｐｈａｒｏｓｓをカラムに充填した（ゲル量的４■）
。
２−のＨ８Ａ −５ｅｐｈａｒｏｓｅを２ｄのＩｇＧ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅと混合することにより第３０カラ
ムを調製した。
−５ｅｐｈａｒｏｓｅと混合することにより第３０カラ
ムを調製した。
すべてのカラムをＴＳＴ−１を漬液で平衡させた。
ｐＮＰ −２を取り込んだ大腸菌細胞からのペリプラズ
マ画分を等しく二分割し、それぞれＩｇＧ−および）（
ＳＡ−カラムにかけた。次いでそれらカラムを１０カラ
ム容のＴＳＴ−緩衝液および１容のｓ ｍＭ ＮＨ４／
ｌＬｃ （ｐＨｓ、ｓ ）で洗浄した（後者は緩衝能を
低めて効率的溶出を可能にするため）、溶出はＩｇＧ−
およびＨ８Ａ−カラムに対しそれぞれ０、２ Ｍ ＨＡ
Ｃ（ＰＨ３，２’）および０．５Ｍ ＨＡＣ（ＰＨ２，
８）を用いて行い、そして１１１１ずつのフラクション
を集めたｅ ２８０ ｎｍにおけるＯＤを測定し、そ
して関連のフラクション（３および４）を集め、プール
しそして凍結乾燥した。
マ画分を等しく二分割し、それぞれＩｇＧ−および）（
ＳＡ−カラムにかけた。次いでそれらカラムを１０カラ
ム容のＴＳＴ−緩衝液および１容のｓ ｍＭ ＮＨ４／
ｌＬｃ （ｐＨｓ、ｓ ）で洗浄した（後者は緩衝能を
低めて効率的溶出を可能にするため）、溶出はＩｇＧ−
およびＨ８Ａ−カラムに対しそれぞれ０、２ Ｍ ＨＡ
Ｃ（ＰＨ３，２’）および０．５Ｍ ＨＡＣ（ＰＨ２，
８）を用いて行い、そして１１１１ずつのフラクション
を集めたｅ ２８０ ｎｍにおけるＯＤを測定し、そ
して関連のフラクション（３および４）を集め、プール
しそして凍結乾燥した。
凍結乾燥後、各種画分を負荷用緩衝液に溶解し、そして
Ｐｈａｓ を電気泳動（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スエー
チン国りデサラ）により５％Ｐデシル硫酸ナトリウム含
有２０％ポリアクリルアミＰゲル（８ＤＳ−ｐｏＧｍ）
で供給元の説明に従って分析した。
Ｐｈａｓ を電気泳動（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スエー
チン国りデサラ）により５％Ｐデシル硫酸ナトリウム含
有２０％ポリアクリルアミＰゲル（８ＤＳ−ｐｏＧｍ）
で供給元の説明に従って分析した。
ｐＮＰ −２含有大腸菌株については、精製前後の細胞
外タンツク質をＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分析した。第
２図にみられるよ５に組換え融合タンパク質は全細胞外
タンパク質の１０％以上を構成する（レーン１）。Ｉｇ
Ｇ −５ｅｐｈａｒｏｓｅ （レーン２）またはＨ８Ａ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅのいずれかを用いたアフイニテ
イクロマトグラフイにより分解率１０％以下の純製組換
えタンパク質が高収率で得られた。
外タンツク質をＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分析した。第
２図にみられるよ５に組換え融合タンパク質は全細胞外
タンパク質の１０％以上を構成する（レーン１）。Ｉｇ
Ｇ −５ｅｐｈａｒｏｓｅ （レーン２）またはＨ８Ａ
−５ｅｐｈａｒｏｓｅのいずれかを用いたアフイニテ
イクロマトグラフイにより分解率１０％以下の純製組換
えタンパク質が高収率で得られた。
Ｈ８Ａ −Ｅｌｅｐｈａｒｏｓｅカラムから溶出したタ
ンパクり質を凍結乾燥後ＴＮＴ緩衝液に再懸濁しそして
ＩｇＧ −８ｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。その第
２アフイニテイ精製段階から溶出されるタンノセク質、
および素通り分（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を凍結乾
燥しセしてＳＤＳ −ＰＡＧＥにかけた。
ンパクり質を凍結乾燥後ＴＮＴ緩衝液に再懸濁しそして
ＩｇＧ −８ｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。その第
２アフイニテイ精製段階から溶出されるタンノセク質、
および素通り分（ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）を凍結乾
燥しセしてＳＤＳ −ＰＡＧＥにかけた。
第２図（レーン４）においては、ＩｇＧ−およびＨ８Ａ
−Ｂｅｐｈａｒｏｓｏの両方と相互作用し得るタンツ
ク質は、ＩＧＦ −１部分の両側に１つずつの形でデュ
アル・アフイニテイ・テイル（ｄｕａｌ ａｆｆｉ−ｎ
ｉｔｙ ｔａｉｌ）を有する目的の完全長タンパク質に
相当することが明らかに示されている。ＩｇＧ結合能を
欠（Ｈ８Ａ−カラムから溶出されたタン・々り質の処置
（ｄｅｓｔｉｎｇ）は第２力２ム通過時の素通り分を分
析する際に確認される。
−Ｂｅｐｈａｒｏｓｏの両方と相互作用し得るタンツ
ク質は、ＩＧＦ −１部分の両側に１つずつの形でデュ
アル・アフイニテイ・テイル（ｄｕａｌ ａｆｆｉ−ｎ
ｉｔｙ ｔａｉｌ）を有する目的の完全長タンパク質に
相当することが明らかに示されている。ＩｇＧ結合能を
欠（Ｈ８Ａ−カラムから溶出されたタン・々り質の処置
（ｄｅｓｔｉｎｇ）は第２力２ム通過時の素通り分を分
析する際に確認される。
これらの結果はこの二段階アフイニテイ手順により高度
にｆｆ製された融合タン／＃り質を得ることができるこ
とを示している。
にｆｆ製された融合タン／＃り質を得ることができるこ
とを示している。
化学的分解
ＩＧＦ −ｆｆを放出させるために、まずＨＥＩＡ −
８ｅｐｈａｒｏｓｅ 、次いでＩｇＧ −８ｅｐｈａｒ
ｏｓｅでアフイニテイ精製して得られた完全長タンパク
質をＣＮＢｒ１Ｃよる特異的分解に付した。溶出された
両分な凍結乾燥し、そして７０％蟻酸に溶解した。ＩＧ
Ｆ−■部分の直前・直後の独特のＭｅｔ残基において分
解する臭化シアン、ＣＮＢｒをメチオニン基準計算で約
２００倍モル過剰となるよ５に添加した。
８ｅｐｈａｒｏｓｅ 、次いでＩｇＧ −８ｅｐｈａｒ
ｏｓｅでアフイニテイ精製して得られた完全長タンパク
質をＣＮＢｒ１Ｃよる特異的分解に付した。溶出された
両分な凍結乾燥し、そして７０％蟻酸に溶解した。ＩＧ
Ｆ−■部分の直前・直後の独特のＭｅｔ残基において分
解する臭化シアン、ＣＮＢｒをメチオニン基準計算で約
２００倍モル過剰となるよ５に添加した。
分解は室温で２４時間行い、次いで９容の水を添加した
。その溶液を凍結しそして凍結乾燥した。分解生成物を
ＨＡｃ中に溶解し、そして水で１０％まで希釈し、そし
てＮＨＪＡｃを１００ ｍＭ ＮＨａＭの最終濃度とな
るよう添加した。その混合物をＥｌｅｐｈａｄｅｘ （
） −２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スエーチン国）で
脱塩した。
。その溶液を凍結しそして凍結乾燥した。分解生成物を
ＨＡｃ中に溶解し、そして水で１０％まで希釈し、そし
てＮＨＪＡｃを１００ ｍＭ ＮＨａＭの最終濃度とな
るよう添加した。その混合物をＥｌｅｐｈａｄｅｘ （
） −２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スエーチン国）で
脱塩した。
分解前後における分解物質を２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥを
用いた分析にかけ、そしてその結果を第６図（レーン１
および２）に示す。分解により、アルブミン−結合性断
片（２５ｋＤａ）、２２−断片（１４ｋＤａ）およびヒ
トＩＧＦ −ＩＩ （７ｋＤａ）によく符合するいくつ
かの新しいパンｒが得られる（レーン２）。これを確認
するためＫ、分解物質をＩｇＧおよびＨ８Ａ両方を有す
る５ｅｐｈａｒｏｓｅを含有する混合アフイニテイクロ
マトグラフイカラムに通した。結合した物質、および結
合しなかった物質（素通り分）をＳＤＳ −ＰＡＧＥに
より分析した。
用いた分析にかけ、そしてその結果を第６図（レーン１
および２）に示す。分解により、アルブミン−結合性断
片（２５ｋＤａ）、２２−断片（１４ｋＤａ）およびヒ
トＩＧＦ −ＩＩ （７ｋＤａ）によく符合するいくつ
かの新しいパンｒが得られる（レーン２）。これを確認
するためＫ、分解物質をＩｇＧおよびＨ８Ａ両方を有す
る５ｅｐｈａｒｏｓｅを含有する混合アフイニテイクロ
マトグラフイカラムに通した。結合した物質、および結
合しなかった物質（素通り分）をＳＤＳ −ＰＡＧＥに
より分析した。
それらの結果は、２５ｋＤａ断片および１４ｋＤａ断片
はそのアルブミン−およびＩｇＧ−結合活性を通して混
合カラムに結合するが（レーン４）、低分子量物質（７
ｋＤａ）は結合されない（レーン３）ことを確認するも
のである。
はそのアルブミン−およびＩｇＧ−結合活性を通して混
合カラムに結合するが（レーン４）、低分子量物質（７
ｋＤａ）は結合されない（レーン３）ことを確認するも
のである。
生物学的活性
混合アフイニテイカラムからの素通り物質儂６図、レー
ン３）について精製ヒトＩＧＦ −Ｉｆを標準として用
いるラジオレセプターアッセイにより生物学的活性を分
析した。第７図に示される結果は得られた物質に活性が
あること、およびそれら２つの曲線がこのアッセイにお
いて並行していることを示している。
ン３）について精製ヒトＩＧＦ −Ｉｆを標準として用
いるラジオレセプターアッセイにより生物学的活性を分
析した。第７図に示される結果は得られた物質に活性が
あること、およびそれら２つの曲線がこのアッセイにお
いて並行していることを示している。
このことはデュアル・フランキング・アフイニテイ融合
方式（アグローチ）Ｋより生物学的活性を有するヒト成
長ホルモンが生産され得ることを示している。
方式（アグローチ）Ｋより生物学的活性を有するヒト成
長ホルモンが生産され得ることを示している。
第１図は、修飾前の合成ヒ） ＩＧＦ −ｆｆ遺伝子の
配列を示す。遺伝子の組立てに用いた２２個のオリゴヌ
クレオチＰの開始部（Ａ１−Ａ１１およびＢ１−Ｂ１１
）が演縄されたアミノ酸配列と共に示されている。融合
タンツク質の分解を可能にするため、構造遺伝子の前に
メチオニンが位置し、そして二重のＴＡＡコドンが翻訳
停止信号として挿入されている。遺伝子の側部にはＥｃ
ｏＲＩおよび阻ｎｄｌｉ制限部位が存在する。 第２図はヒトＩＣ）Ｆ −ＩＩ融融合タンパクセコード
する発現ベクターを図示したものである。いくつかの関
連制限部位が示されている。ボックスは、シグナル配列
（Ｓ）、合成ＩｇＧ結合性領域（ｚ） 、 ＩＣ）Ｆ
−Ｔｉ Ｃ１２＞およびβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）を
コードする遺伝子を示し【いる。大腸菌の複製開始点（
ｏｒｉＥ）も示されている。 第３図は、大腸菌で産生されたそれぞれ２２ＩＧＦ−Ｉ
およびＺＺ ＩＣ）Ｆ −ＩＩの示差安定性を示すクロ
マドグ２ムの写真である。レーン１．マーカータンパク
質； レーｙ ２ 、 ＺＺ ＩＧＦ−１（ＩｇＧ−Ｉ
５ｅｐｈａｒｏｓｅでアフイニテイ精製したもの）；
レーン３ 、 ＺＺ ＩＧＦ −ＩＩ、ＩｇＧ ５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅで精製したもの）。 第４Ａ図はデュアル・アフイニテイ融合タンパク質ＺＺ
工ＧＦ−ＩＩ ＢＩＢ２をコードする発現ヘクターを
図示したものである。ボックス（スケールをあわせて描
いたものではない）は、シグナル配列（Ｓ）、合成Ｉｇ
Ｇ−結合性領域（ｚ）、ヒトインシュリン様成長因子ｔ
ｌ （工ＧＦ−ＩＩ ’） 、アルブミン−結合性部分
（ＢＩＢ２）およびβ−ラクタマーゼ（ＡＭＰ）をコー
ドする遺伝子を表わす。 第４Ｂ図は、ＩＣ）Ｆ−ｎのＮ−末端側側部にＩｇＧ−
結合性領域ＺＺ、Ｃ−末端側側部にアルブミン−結合性
領域が結合したデュアル・アフィニテイ構成体を図示し
たものである。ＩＧＦ −ＩＩタンパク質の直前・直後
に位置する２個のメチオニン残基は遊離ＩＧＦ −ＩＩ
を放出するＣＮＢｒによる特異的分解部位を与える。 第３図はｐＮＰ −２構成体（第４ａ図）を含有する大
腸菌Ｅ（Ｂ１０１細胞により産生された４リプラズマタ
ンパク質のＳＤＳ −ＰＡＧＥによる分析結果を示すク
ロマトグラムの写真である。レーン１、全ベリプラズマ
含量；レーン２、ＩｇＣ）−７フイニテイ精製タンパク
質；レーン３、Ｈ８Ａ−７フイニテイ精製タンパク質：
レーン２４１、まずＨ８Ａ−アフイニテイにより、次い
で更にＩｇＧ−７フイニテイにより精製されたタンパク
質；レーン５、Ｈ８Ａ−アフィニテイ忙より精製された
が、次のＩｇＧ−アフイニテイを用いた精製では素通リ
スルタンノセク質：レーン５、マーカータンノｑり質。 第６図は、ＣＮＢｒ処理前および後の精製融合タンパク
質（第４ｂ図。ただしシグナル配列は生体内（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）分解されている）の５ＤＢ−ＰＡＧＥの分析結
果を示すクロマトグラムの写真である。 レーン１ 、 Ｈ８Ａ−およびＩｇＧ−アフイニテイの
両方を用いて精製された融合タンパク質；レーア２、Ｃ
ＮＢｒ処理後の精製融合タンパク質（全量）；レーン４
、混合ＩｇＧ−およびＨ８Ａ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ力ラ
ム使用時に素通りするタンパク質（綿製ｘＧＦ−Ｕ）；
レーン８、混合カラムから溶出されたタンパク質。 第７図は、デュアル・アフイニテイ融合タンパク質の化
学的分解後に得られた組換えＩＧＦ−ＩＩ（■）および
ヒト血清から精製されたヒトＩＧＦ −■コントロール
（ロ）についてのラジオレセプターアッセイの結果を示
す。表示された量の標準を用い組換えサンプルを１：１
０希釈ステツプで添加した。ヒト血清から精製された
Ｉ−ＩＧＦ−■の相対的抑制が示される。 特許出願人 セム・ビオテクニク・アクチェボラーグ 外２名 小コ Ｃ５ｕ ψｃＩＪＥ−１＜ 、−１ｔＪ ＣＪリ
配列を示す。遺伝子の組立てに用いた２２個のオリゴヌ
クレオチＰの開始部（Ａ１−Ａ１１およびＢ１−Ｂ１１
）が演縄されたアミノ酸配列と共に示されている。融合
タンツク質の分解を可能にするため、構造遺伝子の前に
メチオニンが位置し、そして二重のＴＡＡコドンが翻訳
停止信号として挿入されている。遺伝子の側部にはＥｃ
ｏＲＩおよび阻ｎｄｌｉ制限部位が存在する。 第２図はヒトＩＣ）Ｆ −ＩＩ融融合タンパクセコード
する発現ベクターを図示したものである。いくつかの関
連制限部位が示されている。ボックスは、シグナル配列
（Ｓ）、合成ＩｇＧ結合性領域（ｚ） 、 ＩＣ）Ｆ
−Ｔｉ Ｃ１２＞およびβ−ラクタマーゼ（ｂｌａ）を
コードする遺伝子を示し【いる。大腸菌の複製開始点（
ｏｒｉＥ）も示されている。 第３図は、大腸菌で産生されたそれぞれ２２ＩＧＦ−Ｉ
およびＺＺ ＩＣ）Ｆ −ＩＩの示差安定性を示すクロ
マドグ２ムの写真である。レーン１．マーカータンパク
質； レーｙ ２ 、 ＺＺ ＩＧＦ−１（ＩｇＧ−Ｉ
５ｅｐｈａｒｏｓｅでアフイニテイ精製したもの）；
レーン３ 、 ＺＺ ＩＧＦ −ＩＩ、ＩｇＧ ５ｅｐ
ｈａｒｏｓｅで精製したもの）。 第４Ａ図はデュアル・アフイニテイ融合タンパク質ＺＺ
工ＧＦ−ＩＩ ＢＩＢ２をコードする発現ヘクターを
図示したものである。ボックス（スケールをあわせて描
いたものではない）は、シグナル配列（Ｓ）、合成Ｉｇ
Ｇ−結合性領域（ｚ）、ヒトインシュリン様成長因子ｔ
ｌ （工ＧＦ−ＩＩ ’） 、アルブミン−結合性部分
（ＢＩＢ２）およびβ−ラクタマーゼ（ＡＭＰ）をコー
ドする遺伝子を表わす。 第４Ｂ図は、ＩＣ）Ｆ−ｎのＮ−末端側側部にＩｇＧ−
結合性領域ＺＺ、Ｃ−末端側側部にアルブミン−結合性
領域が結合したデュアル・アフィニテイ構成体を図示し
たものである。ＩＧＦ −ＩＩタンパク質の直前・直後
に位置する２個のメチオニン残基は遊離ＩＧＦ −ＩＩ
を放出するＣＮＢｒによる特異的分解部位を与える。 第３図はｐＮＰ −２構成体（第４ａ図）を含有する大
腸菌Ｅ（Ｂ１０１細胞により産生された４リプラズマタ
ンパク質のＳＤＳ −ＰＡＧＥによる分析結果を示すク
ロマトグラムの写真である。レーン１、全ベリプラズマ
含量；レーン２、ＩｇＣ）−７フイニテイ精製タンパク
質；レーン３、Ｈ８Ａ−７フイニテイ精製タンパク質：
レーン２４１、まずＨ８Ａ−アフイニテイにより、次い
で更にＩｇＧ−７フイニテイにより精製されたタンパク
質；レーン５、Ｈ８Ａ−アフィニテイ忙より精製された
が、次のＩｇＧ−アフイニテイを用いた精製では素通リ
スルタンノセク質：レーン５、マーカータンノｑり質。 第６図は、ＣＮＢｒ処理前および後の精製融合タンパク
質（第４ｂ図。ただしシグナル配列は生体内（ｉｎ ｖ
ｉｖｏ）分解されている）の５ＤＢ−ＰＡＧＥの分析結
果を示すクロマトグラムの写真である。 レーン１ 、 Ｈ８Ａ−およびＩｇＧ−アフイニテイの
両方を用いて精製された融合タンパク質；レーア２、Ｃ
ＮＢｒ処理後の精製融合タンパク質（全量）；レーン４
、混合ＩｇＧ−およびＨ８Ａ ５ｅｐｈａｒｏｓｅ力ラ
ム使用時に素通りするタンパク質（綿製ｘＧＦ−Ｕ）；
レーン８、混合カラムから溶出されたタンパク質。 第７図は、デュアル・アフイニテイ融合タンパク質の化
学的分解後に得られた組換えＩＧＦ−ＩＩ（■）および
ヒト血清から精製されたヒトＩＧＦ −■コントロール
（ロ）についてのラジオレセプターアッセイの結果を示
す。表示された量の標準を用い組換えサンプルを１：１
０希釈ステツプで添加した。ヒト血清から精製された
Ｉ−ＩＧＦ−■の相対的抑制が示される。 特許出願人 セム・ビオテクニク・アクチェボラーグ 外２名 小コ Ｃ５ｕ ψｃＩＪＥ−１＜ 、−１ｔＪ ＣＪリ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）所望のタンパク質、オリゴまたはポリペプチドの両
側部に各々選択的結合能を有するアフィニテイ断片また
は部分を結合して成る組換え融合タンパク質。 ２）断片が相異なる請求項１記載の組換え融合タンパク
質。 ３）断片が免疫グロブリン−結合性、アルブミン−結合
性、ビオチン−結合性、チオール−結合性、炭水化物−
結合性および金属−結合性断片または部分より選択され
る請求項１または２記載の組換え融合タンパク質。 ４）断片がＩｇＧ−結合性およびアルブミン−結合性部
分より選択される請求項３記載の組換え融合タンパク質
。 ５）片方の断片がＩｇＧ−結合性であり、そして他方の
断片がアルブミン−結合性である請求項４記載の組換え
融合タンパク質。 ６）前記片方の断片がブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ
−結合性領域に関するものである、請求項５記載の組換
え融合タンパク質。 ７）前記他方の断片が連鎖球菌プロテインＧのアルブミ
ン−結合性領域に関するものである請求項５または６記
載の組換え融合タンパク質。 ８）選択的結合能を有する第１のアフイニテイ断片をコ
ードする第１ＤＮＡ配列と、それに機能的に連結された
所望のタンパク質、オリゴまたはポリペプチドをコード
する第２ＤＮＡ配列と更に該第２ＤＮＡ配列に機能的に
連結された選択的結合能を有する他方のアフイニテイ断
片をコードする第３ＤＮＡ配列とより成る宿主細胞中で
複製する能力を有する組換えベクター。 ９）第１および第３ＤＮＡ配列が異なるアフイニテイ断
片をコードする請求項８記載の組換えベクター。 １０）第１および第３ＤＮＡ配列がＩｇＧ−結合性およ
びアルブミン−結合性部分より選択される断片をコード
する請求項８または９記載の組換えベクター。 １１）第１ＤＮＡ配列がＩｇＧ−結合性断片をコードし
、そして第３ＤＮＡ配列がアルブミン−結合性断片をコ
ードする請求項１０記載の組換えベクター。 １２）第１ＤＮＡ配列がブドウ球菌プロテインＡのＩｇ
Ｇ−結合性領域に関する断片をコードする請求項１１記
載の組換えベクター。 １３）第３ＤＮＡ配列が連鎖球菌プロテインＧのアルブ
ミン−結合性領域に関する断片をコードする請求項１１
または１２記載の組換えベクター。 １４）次の諸段階、すなわち （ａ）所望のタンパク質、オリゴまたはポリペプチドの
両側部に異なるアフイニテイ断片 または部分を結合して成る組換え融合タン パク質を組換え宿主細胞中で発現させ； （ｂ）第１断片をそのための担体に結合された第１リガ
ンドとの相互作用により前記融合 タンパク質を選択的に固定し； （ｃ）その固定された融合タンパク質を、所望により前
記第１断片なしに、前記担体から 溶出し； （ｄ）第２断片をそのための担体に結合された第２リガ
ンドとの相互作用により段階（ｃ）で溶出して得られた
タンパク質を選択的に固 定し； （ｅ）その固定化されたタンパク質を、所望により前記
第２断片なしに、前記担体から溶 出し； （ｆ）段階（ｅ）で溶出されたタンパク質を回収する 段階より成る所望のタンパク質、オリゴまたはポリペプ
チドを精製・単離する方法。 １５）段階（ｃ）および（ｅ）において融合タンパク質
が溶出される請求項１４記載の方法。 １６）前記両側部に結合する断片を前記融合タンパク質
から除去して所望のタンパク質、オリゴまたはポリペプ
チドを形成し、そして同じものを混合物から回収すると
いう更なる段階を含む請求項１５記載の方法。 １７）前記回収が、前記混合物を前記断片を固定する混
合リガンド担体と接触させて所望のタンパク質、オリゴ
またはポリペプチドを回収のために遊離させることによ
り行われる請求項１６記載の方法。 １８）請求項８〜１３のいずれかに記載の組換えベクタ
ーにより形質転換された宿主生物。 １９）細菌宿主、例えばエシエリヒア属、桿菌またはブ
ドウ球菌属の菌株である請求項１８記載の宿主生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE8800981-6 | 1988-03-17 | ||
| SE8800981A SE8800981D0 (sv) | 1988-03-17 | 1988-03-17 | A recombinant fusion protein, its use and a recombinant vector |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0242990A true JPH0242990A (ja) | 1990-02-13 |
Family
ID=20371731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1062346A Pending JPH0242990A (ja) | 1988-03-17 | 1989-03-16 | 組換え融合タンパク質および組換えベクター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0333691A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0242990A (ja) |
| SE (1) | SE8800981D0 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5595887A (en) * | 1990-07-16 | 1997-01-21 | Bionebraska, Inc. | Purification directed cloning of peptides using carbonic anhydrase as the affinity binding segment |
| JPH04126092A (ja) * | 1990-09-14 | 1992-04-27 | Nippon Kayaku Co Ltd | 大腸菌由来蛋白の除去方法 |
| WO1996017941A2 (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Bionebraska, Inc. | Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60500480A (ja) * | 1983-02-09 | 1985-04-11 | フア−マシア、エイ．ビイ−． | 蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法 |
| JPS60214897A (ja) * | 1984-03-22 | 1985-10-28 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | タンパク質の製造法 |
| JPS62278986A (ja) * | 1986-05-15 | 1987-12-03 | スミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム | ハイブリツドポリペプチド |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8505922D0 (sv) * | 1985-12-13 | 1985-12-13 | Kabigen Ab | Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering |
-
1988
- 1988-03-17 SE SE8800981A patent/SE8800981D0/xx not_active Application Discontinuation
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1989
- 1989-03-16 JP JP1062346A patent/JPH0242990A/ja active Pending
- 1989-03-16 EP EP89850091A patent/EP0333691A3/en not_active Withdrawn
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60500480A (ja) * | 1983-02-09 | 1985-04-11 | フア−マシア、エイ．ビイ−． | 蛋白質とポリペプチドを製造及び分離する方法 |
| JPS60214897A (ja) * | 1984-03-22 | 1985-10-28 | バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト | タンパク質の製造法 |
| JPS62278986A (ja) * | 1986-05-15 | 1987-12-03 | スミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム | ハイブリツドポリペプチド |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0333691A2 (en) | 1989-09-20 |
| SE8800981D0 (sv) | 1988-03-17 |
| EP0333691A3 (en) | 1990-08-08 |
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