JPH03500241A - 遺伝子工学的に得られた融合タンパク質をコラゲナーゼによつて特異的に分解することによつてペプチドを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

遺伝子工学的に得られた融合タンパク質をコラゲナーゼによって特異的に分解す ることｊこよってペプチドを製造する方法 背景技術 遺伝子工学によって、特に比較的長いアミノ酸配列の場合には従来の化学的合成 法よりもはるかに優れている、ペプチド及びタンパク質の新規製造方法が開発さ れた。これによって初めて、かつては入手し難かった物質、例えば成長ホルモン 、インターフェロン及び多数のペプチドホルモンが十分な量で利用されうる［Ｅ 、　Ａ、　Ｏ，Ｍａｒｓｔｏｎ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ、　Ｊ　、２４０．　１〜 １２（１９８６）］。 ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法は、製造すべきアミノ酸配列のコドンを有 する適当なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を、新しく導入される遺伝子情報の複製 及び発現を可能にする形で、適当な宿主細胞に移すことを基礎にしている。宿主 細胞としては、小乃至中の大きさのペプチド（約１００個未満のアミノ酸）の場 合には、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのような細菌を使用する 。 ところで、前記範囲の大きさのポリペプチドは、顕著な三次構造によって保護さ れていないために、細胞内ノ細菌プロテアーゼによって極めて容易に攻撃される ことが判明した。この事実は、発現が製造すべきポリペプチドが直接最終的な形 で又は場合によってハ付加的なＮ末端メチオニン基をもって形成される（所謂直 接発現）ように制御される場合には、著しい収量の減少又は−凍土合成生成物の 多大な損失をもたらす。 これに対して所望のアミノ酸配列は、先づはるかに大きい先駆物質分子、所謂融 合タンパク質として合成される場合Ｊこは一般Ｉこ良好な収量で製造することが できる。 従って小さい及び中等大のペプチドを製造するためには、良好に発現可能であり 、またできるだけ調節可能でもある細菌遺伝子と製造すべきペプチドのＤＮＡ配 列七から試験管内の新しい結合によってプラスミドベクター上にハイブリッド遺 伝子を形成することより成る変法が有利になる。前記ハイブリッド遺伝子は、細 菌の原調節要素（プロモーター、リポソームの結合位置及びターミネータ−）な らびに細菌の遺伝子生成物のＮ末端アミノ酸のコドンのできるだけ大きい部分を 有し、その後に新しいペプチドのコドン及び終結コドンが続く。プラスミドベク ターを適当な細菌宿主細胞中に移した後形質転換によって、ハイブリッド遺伝子 は、相応の細菌タンパク質から誘導されるＮ−末端部分及び製造すべきペプチド のアミノ酸配列から成るＣ−末端部分を有する融合タンパク質の生合成を制御す るゎこの融合タンパク質は形質転換された細胞の発酵によって容易に多量に製造 され、単離されうる。ハイブリッド遺伝子を形成するためには種々の細菌遺伝子 が使用されｔ：、しかし好ましくは酵素、すなわちβ−ガラクトシダーゼ、β− ラクタマーゼ、アントラニル酸シシテターゼ、アルカリ性ホスファターゼ及びク ロルアンフェニコール−アセチルトランスフェラーゼの遺伝子が使用された。 前記方法によりペプチドを製造する場合の最終段階は、融合タンパク質の正確な 分解である。このような分解を可能にするためには、ハイブリッド遺伝子は、後 期の融合タンパク質の細菌部分と新しく製造すべきペプチド配列との間に、容易 にかつ選択的に分解できるペプチド結合が存在するよう＋：　＠成されなければ ならない、小さい及び中等大のペプチドを遺伝子工学的に製造する場合、融合タ ンパク質を分解するための、できるだけ広範囲に適用できる特異的方法の開発は 、従来は、十分に満足のいくように解決されない大きな問題でありた。 本発明の対象は、Ｎ末端に不所望な余分のアミノ酸を残すことなく、所望なペプ チドの正確なアミノ酸配列を供給する、融合タンパク質を分解するだめの一般に 適用できる特異的方法である。 遺伝子工学的Ｊこ製造された最初のペプチド、例えば１０５６〜１０６３．１９ ７７）又はヒトインシュリンのＡ鎖及びＢ　鎖（Ｄ、　Ｖ、　Ｇｏｅｄｄａｌ等 、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＴＪＳＡ　７６、　１０６−１１０．　１９７９）は、 β−ガラクトシダーゼから誘導される相応の融合タンパク質からブロムシアン分 解によって遊離された。ブロムシアンは、メチオニンと次のカルボキシル位のア ミノｌｌ［Ｎｅｔ−Ｘ、この際Ｘは遺伝コードによって固定され７２２０個の何 らかのアミノ酸であってよい］との間の結合を選択的に分解する。この方法は、 当然メチオニンすら有しないペプチドに関して適用できるにすぎない。これは前 記３種のペプチドに関しても該当する。 同様な制限は、個々のアミノ酸の認識を基礎とする、すべての融合タンパク質分 解方法について認められる。さて、Ｎ末端部分とＣ末端部分との間の結合として リシン、アルギニン又はグルタミン酸を含有する融合タンパク質が製造される。 この分解のためには、酵素トリプシン（Ｊ、　５ｈｉｎｅ等、　Ｎａｔｕｒｅ　 ２８５　、４５６−４６１．１９８０）及びクロストリパイン（Ａ、　Ｄ。 Ｂｅｎｎｅｔｔ等、ＥＰＡ　Ｃｚ３１３６３）Ｃ両酵素ともＬｙｓ−Ｘ　と　Ａ ｒｇ　−Ｘとの間の結合を開く）、ならびにＧｌｕ−Ｘの結合を切断するエンド プロテイナーゼＧｌｕ　−Ｃ（Ａ、　Ｄ、　Ｂｅｎｎｅｔｔ等、ＥＰＡＯ１３１ ３６３）を使用する。同様に、リジンの後を特異的に分解するエンドプロテイナ ーゼ　Ｌｙｓ　−Ｃ（Ｃｈｅｍ、　Ｈｏｐｐｅ　−Ｓｅｙｌｅｒ３　６　７　． ５ｕｐｐ１．　Ａｕｇ、ｌ　９　８　６　、Ｓ−１６２、Ａｂｓｔｒ。 ＋９．０１．０３）も使用された。 正確に定義さＪ］た数個のアミノ酸の配列内部の特異的結合を切断する方法があ るならば、はるかに特異的となり、ひいてはより広範囲に適用することができる 。そこでＰ、　Ｒ，５ｚｏｋａ等（ＤＮＡ５．ｌ　１−２０．１９８６）は、ア ントラニル酸シンテターゼ及びラン成長ホルモンからの部分配列がＡｓｐ　−Ｐ ｒｏ配列を介して相互に結合されている融合タンパク質を、　Ａｓｐ−Ｐｒｏ結 合が極めて酸不安定であるから酸を作用させて前記同成分に分解することに成功 した。しかしこの方法は、酸の作用時にまたその他のペプチド結合の切断も副反 応として考慮しなければならないという事実の他に、特に、結合配列から該ペプ チドのＮ末端にプロリンが残っていて、これが多くの場合不利であるという欠点 を有している。融合タンパク質の配列Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ −Ｖａｌ−Ｔｙｒ内で２個のロイシン張基の間の結合を選択的に切断するために 使用したレニンとの反応の場合にも同様な限界を設けざるを得ない（Ｊ、　Ｓ。 Ｂｏｇｅｒ等、ＦＰＡＯ１６３５７３）、この場合には、しばしば不所望の余分 の３個のアミノ酸が残る。 λｃｌｌタンパク質の３１個のアミノ酸から成るＮ末端部分を有する融合タンパ ク質からヒトβ−グロビンを遊離するために、Ｋ、　Ｎａｇａｉ及びＨ，Ｃ，Ｔ ｈｇｅｒｓｅｎはＸａ因子、つまり通常、プロトロンビンからトロンビンへの変 換を作用する血漿グロテアーゼを使用した。 同様にしてＴ、　１ｍａｉ等は、９個の付加的Ｎ末端アミノ酸を有する融合タン パク質を介してヒトプロレニンを製造するために、Ｉｖ記酵素を使用した。両者 の場合ともＮ及びＣ末端部分の間の移行部として、Ｘａ因子によって認識されか つＡｒｇ−Ｘ（Ｘはヒトタンパク質の一番目のＮ＊端アミノ酸である）の結合に おいて切断される配列＋　１ｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−Ｘが存在した。 従ってＸａ因子は、融合タンパク質の分解のために使用スべき酵素に対する必須 の要件を満足させるようｌ；思われる。しかしまた、前記認識配列を有する融合 タンパク質の分解はＸａ因子によって不可能である２例も報告された（に、　Ａ １１ｅｎ等、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）Ｉｏｐｐｅ　−５ｅｙｌｅｒ３６７ 　、５ｕｐｐｌ　、Ａｕｇ、］　９８６　、５．１６２　、　Ａｂｓｔｒ。 １９　、０１−０３　；　Ｈ，ｈｌａｙｅｒ等、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｈ ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ　３６７　、５ｕｐｐ１．　Ａｕｇ、１９８６　、Ｓ　 ２８５、　Ａｂｓｉｒ、　０５．　０１−５０）　。従ってＸａ因子を用いる方 法を一般的に適用することは不可能である。 また、（Ａｓｐ）　ａ　Ｌｙｓ　−Ｘの配列においてＬｙｓとＸとの間の結合を 分解する酵素エンテロキナーゼの場合にも同様な制限を設けざるを得ない。Ｒ， Ｍ、　Ｂｅｌａｇａｊｅ等（ＤＮＡユ、１２０．１９８４）は、確かに、前記配 列がＮ末端部分から遠く離れて存在する融合タンパク質から、エンテロキナーゼ の天然基質であるトリプシノーゲンの場合と同様にこのエンテロキナーゼを用い てヒト成長ホルモンを遊離した。しかしアルカリ性ホスファターゼき副腎皮質刺 戟ホルモンとが前記配列を介して結合された融合タンパク質をエンテロキナーゼ で分解する実験は成功しなかった。 ＥＰ２０２９０には、相応の構造を有する融合タンパク質を分解するためにコラ ゲナーゼの高い特異性を利用する方法が記載されている。コラゲナーゼは、Ｐｒ ｏ−ＹＪ：　１ｙ−Ｐｒｏの配列（Ｙは遺伝暗号の２０種のアミノ酸の任意のも のであってよい）を認識し、ＹとＧａｙとの間の結合を分解する。前記配列を有 する融合タンパク質から、Ｎ末端部にざらにコラゲナーゼ配列から由来するアミ ノ酸たるＧｌｙ及びＰｒｏを有するペプチドが遊離される。これらのアミノ酸は 、他の酵素、すなわちボストープロリンージペプチジルーアミノベプチダーゼ（ ＰＰＤＡ）を用いてジペプチドとして除去することができる。 ところで、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列を有するペプチド及びタンパク質を 、クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃ１ｏｓ　ｔｒｉｄｉｕｍ　ｈｉｓｔｏ ｌｙｔｉｅｕｍ）　（ＥＣ３，４，２４，３）からのコラゲナーゼであるクロス トリジオペプチターゼＡで分解する実験によって、前記の反応順序を適用して融 合タンパク質を介してペプチドを製造することは極めて限定された程度でしか行 い得ないことが判明した。なるほど、Ｎ１丁ｏｅｐｅｒｔ等（第１４回ＦＥＢＳ 会議の報告、１９８１）は、比較的小さい、半合成的モデルペプチド、厳密言え ば化合物：Ｃｂｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−インシュリンＡ 鎖（ウシ）が前記図式に従ってクロストリジオベプチターゼＡ及びＰＰＤＡと反 応し、期待された反応生成物が良好な収量で得られることを証明することができ た。またＥ。 Ｗｕｅｎｓｃｈ等（Ｈｏｐｐａ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ。 ３６２．１２８５−１２８７．１９８１）も、他のモデルペプチドの反応の場合 に同様な結果を得た。しかるに、Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列を宵する４１ １の天然タンパク質に関しては、２種のみにューロフインン■及びランカタラー ゼ）がクロストリジオペプチターゼＡで特異的に分解され、この分解はまｔ；シ スティン側鎖がＳ−スルホネートに変換した後のみであった。しかも酵素の比較 的大きい過剰でも、定量的反応は達成され得なかった（　Ｍ、　Ｔｏｅｐｅｒｔ 等、第１４回ＦＥＢＳ会議報告、１９８１）。 西独国特許出願第Ｐ３７３１８７５．６号明細書には、Ｅ、　ｃｏｌｉのアルカ リ性ホスファターゼから得られる融合タンパク質を介して、副腎皮質刺戟ホルモ ンを製造するための方法が記載されている。この場合にも、細菌タンパク質配列 と目標ペプチドとの間にテトラペプチド配列Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　（Ｙ は遺伝暗号の２０種のアミノ酸の任意のものを表わす）を有する融合タンパク質 が、なるほど所定の位置でクロストリジオペプチターゼＡで特異的に分解されう るけれども、反応速度が極めて低いことが判った。 Ｊ、　Ｇｅｒｍｉｎｏ及びり、　Ｂａ５ｔｉａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ。 Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１．４６９２〜４６９６．．１９８４）は、Ｎ及びＣ末端部 の間の結合部分としてＰｒｏａ　−２−コラーゲンからの約６０個のアミノ酸か ら成る配列を有する融合タンパク質を製造した。このタンパク質は、コラゲナー ゼによって相応のコラーゲン自体と同様ｊ二良好に分解された。しかし、該融合 タンパク質は約６０個のアミノ酸の配列内のどの位置で正確に分解されるのか判 らない。また、この配列の程度の差こそあれ大きい残分が、Ｃ末端分解生成物の Ｎ末端部になお存在していることも判明した。従ってこの変法は、正確に規定さ れｆ−Ｎ末端部を有するポリペプチドを製造するためには不適である。 発明の開示 本発明の本質は、式Ｉ： Ｈ，Ｎ−Ｚ、−χ−（Ｐｒｏ−Ｙ−（、Ｉｙ）、−Ｐｒｏ−Ｚ、−ＣｏｏＨ（Ｉ 　）［式中、ｎ　＞　２であり、Ｘ及びＹは遺伝暗号によって決定される２０種 のアミノ酸の任意のものを表わし、２、は細菌のアミノ酸配列を表わし、２．は 遺伝暗号による任意のアミノ酸から成る目探ペプチドを表すすｊで示される融合 タンパク質から、アミノ酸配列−Ｘ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｓ−Ｐｒｏ−（こ こでＸ及びＹは遺伝的にフード可能の７ｉ）酸の任意のものを表わし、ｎ〉２で ある）の後に絖〈Ｃ末端タンパク質配列を、コラゲナーゼ及びポストプロリンジ ベチジルアミノペグチダーゼ（ＰＰＤＡ）で酵素的に分離することを特徴とする 、目標ペプチドの製造方法にある。 まに本発明は、請求の範囲第１項から第６項までに記載の式■で示される融合タ ンパク質及びその製造方法、式１で示される融合タンパク質をコードする遺伝子 構造、反復コラゲナーゼ切断位置のコドンを有し、従って式Ｉの融合タンパク質 の製造のために適当なプラスミド又は比較可能なベクター（例えばフフージベク ター）に関する 細菌のアミノ酸配列２．としては、アルカリ性ホスファターゼ、アントラニル厳 シンテターゼ、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコー ル−アセチルトランスフェラーゼ等が該当する。 次の反応図式は、コラゲナーゼ及びポストプロリンージペプチジルーアミノベブ チダーゼ（ＰＰＤＡ）による融合タンパク質の加水分解を説明する：細菌　ペプ チド ＮＨｘ−−−−−−−−−−−−−−Ｘ−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）、−Ｐｒｏ　 −−−−Ｃ００ＨＮＨ３−−−＝−−−−−−−−−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｙ＋（Ｇｌｙ −Ｐｒｏ−Ｙ）ａ−＋タンパク質配列 ペプチド ＋　に１ｙ−Ｐｒｏ−−−−−−−−−−ＣＯＯＨＸ及びＹは遺伝暗号で決定さ れる２０種のアミノ酸の任意のものを表わし、ｎは好ましくは２〜１０である。 融合タンパク質の新規分解方法の利点は、ヨーロッパ特許第２０２９０号記載の 方法と比べて、例えばクロストリジオペグチダーゼＡによる反応速度が数オーダ ーも増大されうる点にある。コラゲナーゼの認識配列を反復形で含有する融合タ ンパク質は、コラゲナーゼの単一の分解位置を有する相応の融合タンパク質より もはるかに良好に分解されうる。 本発明による方法を説明するために、例１〜３で、コラゲナーゼによって分解可 能の配列を有する３種のモデルタンパク質の製造及び酵素的分解を記載する。 これらのタンパク質のアミノ酸配列を表１に総括しである。これらのタンパク質 は、大腸菌に１２株（Ｅ。 ｃｏｌｉ　Ｋ　］　２）からのプレホスファターゼ、つまり４７１個のアミノ酸 から成るアルカリ性ホスファターゼの生合成の中間生成物から誘導される。この プレホスファターゼは、アミノ１１２２個のＮ末端のシグナル配列の分離によっ て活性酵素・に変えられる。これに対して修飾されたホスファターゼの場合には アミノ酸２２個のシグナル配列は注目すべき程度には分離されないアルカ５り性 ホスファターゼのアミノ酸配列（Ｒ，Ａ。 Ｂｒａｓｈａｖ　等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　８ 　１　＊４６９２−４６９６．１９８１）及びＥ、　Ｃｏ１１　Ｋ　１２からの 相応の遺伝子（ｐｈｏＡ）のヌクレオチド配列は公知である（Ｍ、　Ｓｉｍｏｎ ｉｓ、　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、　ＦｒｅｉｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ　 Ｂｅｒｌｉｎ、　ｌ　９８３　；　Ｃ，Ｎ、　Ｃｈａｕｌ等。 Ｇｅｎｅ　４４．１２１〜１２５．１９８６）、まｔ：　７　ルカリ性ホフ７ア ターゼをベースとする融合タンパク質の構成のために使用されうるベクターも記 載されている（　Ｗ、　Ｂｏｉｄｏ１等＋　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　にｅｎｅｔ、 　１８５　＋　５１０−５１２．　ｌ　９３２；　Ｗ、　Ｂｏｉｄｏｌ、　Ｄｉ ｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。 Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ　Ｂｅｒｌｉｎ、１９８４　 ）　ａ　ｐＳＢ９４の名称を有する、これらのプラスミドの１種から出発して、 試験管内の新しい結合及びＤＮＡクローニングの自体公知の方法（Ｔ、　Ｍａｎ ｉａｔｉｓ等、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、　、　ＵＳＡ、１９８２）を用いて、Ｅ、　ｃｏｌｉ宿主細 胞への導入後表１に記載したタンパク質の生合成をもたらす修飾ベクターを製造 した。このたメニｐＳＢ　４９上のｐｈｏ　Ａ遺伝子の２つの位置に、つまりＮ ｅｏ　Ｉ−及びＳｐｈ　Ｉ配列に、條飾遺伝子でコラゲナーゼによって認識され うるアミノ酸配列のコドンを形成するオリゴヌクレオチドを導入した。第１図乃 至第４図には、ｐＳＢ９４及び同プラスミドから誘導されたプラスミドｐＳＡ３ ０２、ｐＳＡｓ　０６及びｐＨ５４１３３の制限酵素切断地図を図示しである。 ３種のモデルタンパク質とクロストリジオペブチダーゼＡとの反応の結果は、第 ３８頁及び第３９頁ならびに表２に示しである。 第３８頁は、所期の分子量を有する分解生成物の形成、従って所定の位置におけ る特異的分解を裏付けるゲル電気泳動分離を示す。 第３９頁には、生成物形成のインキュベーション時間及び使用酵素量に対する依 存関係を示しである。これらの曲線から得られた生成物形成速度（表２に総括さ れている）は、二重切断位置（Ｈ５４１３３／ｌ）及び二重切断位置（Ｓ　Ａ　 ５０６　／　１　）がコラゲナーゼＩ：対する反応能力を単一の切断位置（ＳＡ ３０２／１）と比べてどの程度高めるかを明らかにしている。 副腎皮質刺戟ホルモン及びそれから誘導されたペプチドの製造方法を対象とする 西独国特許出願第Ｐ３７３１８７５．６号明細書には、ホルモン配列が単−及び 反復コラゲナーゼ切断位置を介してＥ、　ｃｏｌｉからのアルカリ性ホス７７タ ーゼの部分配列に結合された融合タンパク質が記載されている。この融合タンパ ク質とクロストリジオペブチダーゼＡとを反応させる１；めの、同明細書に記載 された実験は、本発明で記載された結果を十分に保証している。表２には極めて 重要なＡＣＴＨ融合タンパク質の生成物形成速度も所載されている。単一コラゲ ナーゼ切断位置をタンパク質（ＳＡ１８６／］）からは、ペプチドホルモンは不 完全にして、しかも実際の裂取的適用には不適当な条件下でしか遊離され得なか ったのに、二重切断位置を有する相応のタンパク質（ＳＡ３４３／］）は、すで に少な切断位置（ＳＡ３４１／１及び５Ａ３６０／１）ｔ−使用することによっ て反応速度はさらに増大された。 ＡＣ丁Ｈ融合タンパク質５Ａ３４１／ｌの配列は表１に示しである。第３８頁の ゲル電気泳動による分離は、５Ａ３４］／１とクロストリジオペブチダーゼＡと の反応の生成物３種をバンドで示しである。 上記図式に相応するＰＰＤＡによる反応は、反復クラゲナーゼ切断位置を使用す る場合には、反復切断位置内で、該ペプチドのＮ末端に最も近いＹ−Ｇｌｙ結合 も切断される場合のみ、Ｎ末端に正確なアミノ酸配列を有する標準ペプチドを形 成しうる。ゲル電気泳動法及びＨＰＬＣによる分析テストによって、反復フラゲ ナーゼ切断位置を有する融合タンパク質からの分解生成物の異質性は認識されな い。これは、クロストリジオペブチダーゼＡによる反応の際に反復配列のすべて のｙ−ｃ＋ｙ結合が切断されることを示す。これは、西独国特許出！ｌＩ第Ｐ３ ７３１８７５．６号明細書に記載されているように、５Ａ３４１／１からの相応 の分解生成物の例では、Ｎ末端の部分配列の決定によって証明された：エドマン 分解法はＧｌｙ　−Ｐｒｏ　−ＡＣＴＨの初めの７個のアミノ酸に関して予想さ れＩ；配列を明らかにした。一つの反復配列内で初めの結合を切断することによ って、他の切断位置が、露出及びより良好になる作用容易性によって、初めの切 断位置よりもはるかに迅速に反応するように活性化されることは明らかであり、 その結果不完全な切断による中間生成物は検出され得ない。 該方法の特異性は、反復コラゲナーゼ切断位置を使用することによって明らかに 高められ、偶然Ｐｒｏ　−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ配列を有するペプチドすら、この 配列の反応性が小さいためにここで使用される条件下で製造することができた。 従って該製造方法は、事際に任意のすべてのペプチドにとって適しており、ま！ ；宿主系／ベクター系の選択に関しても及びは様な特異性を有する他のコラゲナ ーゼ及びアミノペプチジル−ジペプチダーゼを使用する場合にも制限は存在しな い。 本発明による方法はもちろんまた１段階でも、つまりコラゲナーゼ及びＰＰＤＡ との同時反応の場合にも実施することができる。 プラスミドｐＢＲ３２２：　ＵＳＡの　Ｒｏｃｋｅｖｉｌｌｅ、　Ｍｄ。 在　Ａｍｅｒｉｃａｎ　丁ｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ ＡＴＣＣ）で１９７９年７月１６日に寄託（ＡＴＣＣ４００１５）。 大腸ＷＳＢ４４：ゲッチンゲン在ＤｓＭ、ｒ１９７９年７月１６日に寄託１５Ｍ １．６０６）。 大腸菌に１２野生型・ＤＳＭで１９７３年１１月２６日以来寄託（ＤＳＭ４９８ ．）。 発明を実施するために最良の形態 例： １、　ホス７アターゼタンパク質ＳＡ、３０２／１．ＳＡ５０６／Ｉ及びＨ５４ １３３／１の遺伝子を有する新組換えプラスミドの製造 前記３種のタンパク質の生合成を、適宜形質転換された細菌細胞において新組換 えプラスミドｐＳＡ　３０２、　ｐｓＡ　５０６及びｐＨ３４１３３によって決 定する。これらのプラスミドはベクタープラスミドｐＳＢ　９４から形成された 。ｐＳＢ　９４はプラスミドｐＳＢ　５３　（寄託番号ＡＴＣＣ４００２０で１ ９７９年７月１６日に寄託）から公知方法（Ｌ　Ｂｏｉｄｏｌ、　Ｄｉｓｓｅｒ ｔａｔｉｏｎ。 Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ　Ｂｅｒｌｉｎ、１９８４　 ；また米国特許第４．３７５．５１４号明細書）により誘導したプラスミドｐＳ Ｂ　９４の製造［Ｗ、　Ｂｏｉｄｏｌ、　Ｄｉｓｓｅｒ−ｔａｔｉｏｎ、　ＴＵ −Ｂｅｒｌｉｎ　Ｄ８３／、Ｆ　Ｂ　Ｉ　３．　Ｎｒ、１５８（１９８４）］ニ グラスミドｐＳＢ５３［ヨーロッパ特許第２３８８２号、ＡＴＣＣ４００２０（ １９７９年７月１６日）］から出発して、プラスミドｐＳＢ９４を次のように製 造したｐＳＢ５３　（２０５，ｃ＋９／ｍＭ）６０μｆｆ、反応緩衝液６０ｉｉ Ｑ　ＣトリスＨＣＩ　２０　ｍＮ、　ＭｇＣ１＊　２０　ｍＷ、　ＮａＣ＋１５ ０ｍＭ、　メルカプト玉タノール２０ｍＭ、　ｐＨ７−５）、ウシ血清アルブミ ン（ｌ　ｔａｇ／ｌｎＱ’）　１８　ｉｔ　Ｑ　、　５ａＩ５μｇ％Ｘｈｏ１５ μｇ及び）１，０１２μ０かも成る反応混合物中でｐＳＢ５３−ＤＮＡを３７℃ で３時間インキュベートとした。制限エンドヌクレアーゼ５ａｌＩ　及［ｘｈＯ ＩはＢｉｏｌａｂｓ社（Ｕ　Ｓ　Ａ）から取得しｔ；。 ｐＳＢ５３　（ゲル電気泳動により分子量を測定）を２２５５ｂｐ及び６４５４ ｂｐ（配列分析により分子量を測定）の断片に定量的に分解する反応条件を予備 試験で確定した・ 両断片の分離は寒天ゲル電気泳動によって行なった６　４５４　ｂｐ断片は、０ ．７％寒天ゲルから電気溶離１：ヨッて単離し［丁、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、 　Ｆｒ１ｔｓｅｈ、　ｊ。 Ｓ！＋ｏｂｒｏｃｋ；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、１　６４　１　 ６５　＋Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂ−Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ 　（１９８２）］　、リガーゼ溶液中で一本鎖の相補的５′−突出端を介して結 合して環状分子を形成した。Ｔ、リガーゼ（ＬＴＳＡ　Ｂｉｏｌｐｂｓ製）との りガーゼ反応は、トリスＨＣ１５０ｍＭ、　ｌＬｇｃＩ２１０　ｍＭ、ジチオト レイトール２Ｃ１ｍＬ　ウシ血清アルブミン５０μｇ／ｒｎＱ％ＡＴＰ　１＋ｎ Ａ　（ｐＨ７，８）を含有する緩衝反応液中で行なった。リガーゼ溶液（容量１ ００μＱ）を１３℃で１６時間インキュベートしｔ二。 反応をフェノール抽出によって停止し、エタノ−１ヲ用いる３回のエーテル抽出 によりＤＮＡを水相から沈殿させた。遠心分離後にＤＮＡａｍ殿物をＤＮＡ緩衝 液　［ト　リ　ス　）ＩＣ＋　４　５＋ｏＭ％　ＥＤＴＡ　Ｏ−１ｗＭ　％　ｐ Ｈ７−９］５０μｇ中に溶かし、大腸ＷＳＢ４４株の適格細胞の形質転換のため に使用した（適格細胞２００μｇ＋リガーゼ溶液からのＤＮＡ２５μＱ）。 適格細胞の製造及び形質転換条件はヨーロッパ特許第２３８８２号に記載された 方法及び条件と同様である。 得られた形質転換細胞（アンピシリン耐性細胞）からプラスミドＤＮＡを単離し 、側照分析によってプラスミドの構造を確認しｔ；。 第１図にはグラスミドｐｓＢ９４の制限酵素切断地図を図示しである（個々の制 限酵素配列の間の間隔には塩基対（Ｂｐ）が記載してあり、全塩基対は６４５４ 個である）。該プラスミドはｐＢＲ３２２からのβ−ラクタマーゼの遺伝子（ア ンピシリン耐性）及びＥ、　ｃｏｌｉＫ１２からのアルカリ性ホスファターゼの 遺伝子を有する。　ｐＳＡ３０２及びｐＳ＾５０６の製造のためには、相応のオ リゴヌクレオチドを、ｐｈｏＡ遺伝子内に存在するｆｌｌ限エンドヌクレアーゼ Ｎｅｏ　１及びＳｐｌの認識配列中に導入した。次にｐｓＡ５０６から２７塩基 対のＰｓＬＩ断片を除去することによってｐＨ５４１３３を製造した、第２図乃 至第４図には３種の新組換えプラスミドの制限酵素切断地図を図示しである： 第２図について二アミノ酸部分配列上の２９７及び２９８アミノ酸はプレホスフ ァターゼのアミノ酸の特性を示しており、タンパク質５Ａ３０２／ｌにおいては これら２個のアミノ酸の間にさらに６個のアミノ酸が導入されている。 第３図について二アミノ酸部分配列上の４４７及び４４８アミノ酸はプレホスフ ァターゼのアミノ酸の特性を示しており、タンパク質５Ａ５０６／ｌにおいては 、これらの２個のアミノ酸の間にさらに１５個のアミノ酸が導入されている。 第４図について二アミノ酸部分配列上の４４７及び４４８アミノ酸はプレホスフ ァターゼのアミノ酸の特性を示しており、タンパク質）！５４１３３／１ではこ れら２１′ｉ！１のアミノ酸の間にさらに６個のアミノ−が導入されている。 新組換えプラスミドの製造の場合には、ＤＮＡクローニングの文献公知の方法を 適用しｊ；。これらの方法は、Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ等によって（Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　 ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎ、　Ｙ、　、　ＵＳＡ　［１９８２］　）詳細 かつ総括的に記載された。宿主細胞としてはＥ、ｃｏｌｉ　５Ｂ４４株を使用す る（　Ｗ、　Ｂｏｉｄｏｌ、　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。 Ｔｅｃｈｎｉｓｃｂｅ　１Ｊｎｉｙｅｒｓｉｔａｅｔ　Ｂｅｒｌｉｎ　ｆ　１９ ８４　］　；　Ｇ−５ｉｅＷｅｒｔ等、米国特許第４，３７５．５１４号［１９ ８３］）。これは、広く普及されたクローリング株Ｅ。 ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（ＤＳＭ１６０７の番号で１９７９年７月１６５に寄託 ）のホスファターゼ員突然変異体（ｐｈｏＡ）である。 オリゴヌクレオチドは、自動ＤＮＡ合成装置

【Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍ社（８５０ＬｉｎｃｏＩｎ　ＣｅｎｔｅｒＤｒｉｖｅ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ １ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆ、　９４４０４　、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）製３８１Ａ型］によ って装置メーカーの指示に従って合成し、ゲル電気泳動によって精製した。 ＤＮＡの配列決定は、−木調ファージベクターＭ１３＋＋＋ｐ１８及びＭ　１３ 　ｍｐｌ　９　（Ｃ，Ｙａｎｉｓｅｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ等、Ｇｅｎｅ３３．１０ ３−１１９　Ｎ９８５］）を使用してジデソキシ法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ等、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ｔＪｓＡ　７４．５４６３−５４６７　［１９７７］）によ り行なった。前記ファージベクターは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　（Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ　）、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　−Ｌ　Ｋ　Ｂ　Ｇｍｂ）ｌ及び他の多くの提 供者から入手できる。 放射性標識のためには、デソキシアデノンン−５−［ａ　−３＆　ｓ　］　チオ トリホスフェートを使用した（　ｌｉｌ、Ｄ。 ＢｉｇＨｉｎ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ４．　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　 Ａ　−８０＋３９６３−３９６５　［９８３］　）。 制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ　、　ＰｓｔＩ　、　５ｐｈｌ及びＨａｅ　 ｍならびにＤＮＡリガーゼ（７４）ｉ：ｔ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　（Ｍａｎｎ ｈｅｉｍ）社から入手した。ＮｃｏＩはＮｅｖｉ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ　Ｇｍｂ）ｌ　（６２３１５ｃｈｖａｌｂａｃｈ　）から、ポリヌクレオチ ド−キナーゼ（Ｔ４）はＰｈａｒｍａｃｉａ／Ｐ−Ｌ　（７８００Ｆｒｅｉｂｕ ｒｇ　ｉ、　Ｂｒ、）から入手した。 １．１　ｐＳＡ３０２の製造 プラスミドｐＳＢ９４を制限エンドヌクレアーゼＮｅｏ　Ｔで線状化した。その ために、プラスミドＤＮＡ１４μ９及び反応緩衝液（トリスＨＣＩ　５０　ｍＭ 、　ＭｇＣｌ２１０　ｍＭ、　ＮａＣｌ２１００　ｍＭ、ジチオトレイトール１ ｍＭ、　ｐＨ７，５）　５０　ｐ　（ｌ中のＮｃｏｌ　１７単位を含有する反応 混合物を３７℃で７時間インキュベートした。反応混合物を）二ノールで抽出し た後エタノールでＤＮＡを沈殿し、乾燥し、ＴＥ緩衝液（トリスＨＣｌ４５　ｍ ＆ｉ、　ＥＤＴＡＩ　ｉＭ、　ｐＨ７，５）中で溶かした。 ５’　−ＯＨ基で加リン酸分解さねなかった２種の１８ｆｆｌｅｒ合成オリゴヌ クレオチド：５　’　−ＣＡＴ　ＧＧＣＣＣＴ　にＣＡ　ＧにＡ　ＣＣＣ−３’ ５　’　−ＣＡＴＧ　ＧＧＧ　丁ＣＣＴＧＣＡＧＧ　にＣ−３’各１μｇを水性 溶液中で混合し、３７℃で１５分前保温した。次に両オリゴヌクレオチドを、線 状化されたｐＳＢ９４　３−５μ９及びリガーゼ反応緩衝液（トリスＨＣＩ　２ ０　＋ｎＭ、　ＭｇＣＬ　１０　ｍ１ｌＩ、ジチオユリトリット１０＋ｎｌＪ、 ＡＴＰ’０．６ｍＭ、ｐＨ７，６）　５０ｐＯ中（’）ＤＮＡリガーゼ４単位と ２０℃で２．５時間反応させた。ＤＮＡを前記のようにフェノール抽出及びエタ ノール沈殿ｔ：よって後処理し、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＳＢ４４株の形質転換のため に使用した。適格細胞の製造及び形質転換を賢。 Ｄａｇｅｒｔ及びＳ、　Ｄ、　Ｅｈｒｌｉｃｈの方法（Ｇｅｎｅ　６．２３−２ ８Ｎ９７９］）により行なった。 形質転換細胞を塗布して単一コロニーを形成させた。前記オリゴヌクレオチド配 列を有するプラスミドＤＮＡを含むコロニーをコロニーハイブリッド形成によっ て同定した。コロニーハイブリッド形成は、Ｔ。 Ｍａｎｉａ【ｉｓ等（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇｌ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ’、　Ｎ　、Ｙ　、　。 ＵＳＡ　［９８２］　）によって記載された基礎記録に従ってＪ、　Ｐ、　’Ｇ ｅｒｇｅｎ等（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ　ヱ　２１１５’ −２１３６［１９７９］）によって記載された変法で実施した。放射性ハイブリ ッド形成試薬としては、γＰ　”−Ａ　Ｔ　Ｐ及びポリヌクレオチドキナーゼ（ Ｔ、）との反応によって予め５′＝ｐ＄２−ホスフェートで標識された前記オリ ゴヌクレオチドを使用した。 正のクローンの新組換えプラスミドにおいて、１８塩基対の合成Ｎｃｏｌ断片の 定位を制限分析によって確認した。このためにプラスミドＤＮＡを標準方法によ り単離し、制限エンドヌクレアーゼＨａｅＤＴと反応させた。生成された断片混 合物をゲル電気泳動によって分析した（８％ポリアクリルアミドゲル中のＨａｅ 　ｍ切断ＰＢＲ３２２との比較によって分子量を測定）。 １８塩基対の合成断片の組込みのために使用したＮｃｏ　Ｉ切断位置は、ｐＳＢ ９４の３８５塩基対のＨａｅ　ｍ断片上に局在している。この断片は新組換えプ ラスミドにおいては欠けていて、２側の新しい断片と交換されていなければなら ない。それというのも１８塩基対断片はＨａｅ　ｍ配列さえ有しているからであ る。２個の新しい断片の大きさは、１８塩基対の断片の定位に依存している：第 ２図に図示した所望の定位の場合Ｉ：は３４２塩基対及び６１塩基対の断片が期 待されるし、他方逆の定位は３３０塩基対及び７３塩基対の断片を与える。両定 位を有する数個のプラスミドが見出された。第２図に図示したｐＳＡ３０２は所 望の定位を有するプラスミドの１つである。 クロニーングによって導入された合成りＮＡを含む、’　ｐＳＡ３０２からの塩 基対３４９のＥｃｏＲＩ断片を、配列決定ベクターＭ１３ｍｐ１９にクローニン グシ、前記のように配列決定しＩ；。第２図に図示した、両ＥｃｏＲ１切断位置 の間のｐＳＡ３０２の部分配列は完全に立証された。 １．２　ｐＳＡ５０６の製造 この製造もｐＳＡ３０２の製造と同様に行なった。　ｐＳＢ９４を’＃Ｉ＠エン ドヌクレアーゼｓｐｈ　Ｉで線状化した。 反応条件及び後処理はｐＳＡ３０２に関して記載したとおりである。 ２個の４５ｍａｒオリゴヌオリゴヌクレオチド配列ＴＣＣＴＧＣＡＧ（、ＣＣＣ ＧＧＣＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＧＣＣＣ丁ＧＣＡＧＧＴＣＣＧＣＡＴＧ−３′　 及び ５　’　−ＣＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＧＡ　ＣＣＣＧＣＣＧＧ 　ＧＣＣＴ　ＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧ−３′ を、ｐＳＡ３０２の場合に記載したのと同一の条件下でＳｐｈ　Ｉ線状化ｐＳＢ ９４及びＤＮＡリガーゼと反応させて後処理したａ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＳＢ４４ の形質変転後に正のコロニーを、Ｐ３″末端標識４５ｍｅｒオリゴヌクレオチド によるコロニーハイブリッド形成によって同定しｔ；。 このようにして得られた新組換えプラスミドは、２個の４５ｍｅｒオリゴヌクレ オチドから形成されｆ；Ｄ　Ｎへ部分の片側にのみ完全なＳｐｈ　Ｉ配列を有す る。これは請求められたプラスミドにおいて次に位置するＥｃｏＲＩ配列（第３ 図参照）から２５７塩基対の距離を有し、他方この距離は逆定位のプラスミドに おいてはｐＳＢ９４の場合と全く同じように僅かに２１２塩基を有する。 新組換えプラスミドと制限配列ＥｃｏＲＩ及びｓｐｈ　Ｉとの反応によって得ら れたＤＮＡ断片の、ゲル電気泳動による大きさ決定によって、ｐｓＡｓ　０６が 合成りＮＡ断片の所望の定位を有するプラスミドの１つであることが判った。第 ３図で示した配列を立証するために、２５７塩基対のＥｃｏＲＩ　／　Ｓｐｈ　 Ｉ断片を配列決定ベクターにクローリングし、配拘決定した。 １．３　ｐＨ５４１３３の製造 プラスミドｐＳＡ５０６のＤＮＡ３μ９と反応緩衝液（１，１と同様）５０μａ 中の制＠酵素Ｐｓｔｌの５単位とから成る反応混合物を、３７℃で２時間インキ ュベートし、例１．１で記載したように後処理した。これによって１％寒天ゲル における電気泳動によって相互に分離された３個のＤＮＡ断片（２７塩基対、２ ４２０塩基対及び４００７塩基対）が生じた。２（１の大きい方の断片を電気溶 離によってゲルから単離し、精製し、例１．１と同様の反応条件下でＤＮＡリガ ーゼ（Ｔ４）と反応させ、後処理し、Ｅ、ｃｏｌｉＳＢ４４の形質転換のため１ ：使用した。若干のアンピシリン耐性クローンからプラスミドＤＮＡを単離した 。その中の１つがｐＨ５４１３３であって、その制限酵素切断地図は第４図に示 しである。ｐＨ５４１３３は、ｐＳＡ５０６から、２５７塩基対のＥｃｏＲＩ　 ／　Ｓｐｈ　Ｉ断片の２３０塩基対への太きさの低減をもたらす欠失によって誘 導される。この断片を例１．２と同様にＭ１３ｍｐ１ｇにクローニンクシ、配列 決定した。これによって第４図で示したヌクレオチド配列が立証された。 ２、　タンパク質５Ａ３０２／１．５Ａ５０６／ｌ及びＨ３４１３３／ｌの製造 前記３種のタンパク質は例１で記載した株：Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｓ　Ｂ　４４　（ ｐＳＡ３０２）、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＳＢ４４　（ｐＳＡ５０６）　及びＥ、　ｃ ｏ目　ＳＢ４４　（ｐＨＳ４１３３）の発酵によって得られた。それらの生合成 は、アルカリ性ホスファターゼの生合成と同様にして調節する。 該生合成は無機ホスフェートによって再開始され、逆にホス７工−ト不足の培地 では誘導される（　Ａ。 Ｔｏｒｒｉａｎｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　３８　ｅ 　４６０−　’４６９　［１９６０］　）。 ホス７７ターゼ誘導体の同定のためｌこは、就中Ｈ８Ｔｏｗｂｉｎ等による抗原 プロット検出法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６、４３５０　４３５４　［１９７９］）を 適用した。このために必要な抗血清は、標準条件（Ｄ、　Ｌ　Ｗｅｉｒ、　Ｈａ ｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏ ｌ、　ｎｉ　、　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌ。 ０ｘｆｏｒｄ　１９７８　）下で精製されたＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２度アルカ リ性ホスフェートでウサギを免疫することによって製造しｔ：。免疫のために使 用したホスフェートは１公知法（Ａ、丁ｏｒｒｉａｎｉ　：　’　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ７’　、Ｖｏｌ、ｎｌＢ、２　１　２　２　１　８ ．　Ｌ。 Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｋ、Ｍｏ１ｄａｖｅ　（Ｅｄｓ、）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ　［１９６８］　）により単離した。第二抗体としては 、指標酵素としてアルカリ性ホスファターゼが結合されたウサギＩｇＧに対する ヤギの抗血清を用いた（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｅａｌ　Ｉｎｃ、、　Ｍ ａｌｖｅｒｎ、　Ｕ　Ｓ　Ａ　）　ｅ呈色試薬としては５−ブロム−４−クロル −３−１ン）’！Ｊルホスフェートを使用した。 ３種のタンパク質及びこれらのタンパク質が生産される前記３種の菌株は、すべ での同じ発酵法及び単離法に関して適用されうるように相互を二類似している。 ２．１　発酵 付加的にインピシリン１００μｇ／＋ａＱを含有するし一培地（、Ｅ、　Ｓ、　 Ｌｅｎａｏｘ　、　Ｖｉｒｏｉｏｇｙ上、１９０−２０６　Ｅｌ　９５５］　） 　２ｏｍｕ：、単一””二−ヲ接種Ｌ、３７℃で２４時間振盪し、次１：同−培 地８００＋ｍＱ中に移し、これをさらに３７℃で１６時間振盪した。この予備培 地を、低ホスフエート培地（Ｋ、Ｋｒｅｕｚｅｒ等によるＬＰ培地：　Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ　１３ユ、、４５９−４６８［１９７５］　）９．２Ｑがその中に存在 する２０１２ガラス発酵檀に移した。発酵槽を３７℃で、１０ｆｆ／ｗｉｎの通 気（２２０＋ｎ１ｎ）下で６時間撹拌した。次に流動遠心分離機で細胞を得た。 約３０ｇの湿潤細胞物質が得られた。 ２．２　増量されたタンパク質抽出物の単離２．１からの湿潤細胞３０ｇを分解 緩衝液（トリスＨＣｌ５０ｍＭ、　ＮａＣ１ｌ　６０ｍＭ、　ｐＨ８−０）　４ ００ｙａＱ中で懸濁した。フェニルメチルスルホニルフルオリド（最終濃度１０ ｍＭ）及びＤＮＡ５ｅ（ウシ膵臓からのＤ　Ｎ　Ａ　ｓｅｌ　、　Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ／　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、純度１：１０ｐｙ／９湿潤細胞）を加えた後 、該懸濁液を低温室（４℃）において細胞ホモジナイザー（Ｍａｎｔｏｎ　−Ｇ ａｕｌｉｎ）で圧力６５０〜７００ｋｙ／ｃｔｎ”（１００００Ｐｓｉ）で分解 した。分解を２回反復し、各通過後に懸濁液を水中で冷却した。不溶細胞成分を 遠心分離によって分離しく１１００００ｘ及び４℃で２０分）、分解緩衝液で２ 回洗浄し、トリスＨＣ１５０ｍＭ（ｐＨ８，０）　／尿素８Ｍ（６０ｗＱ）中に 溶かした。この溶液から遠心分離によって不溶成分を除去し、勾配クロマトグラ フィーによるさらなる精製まで水中に保管した。 ２．３　ホスファターゼ誘導体の同定 ２．２で得られｔ：タンパク質抽出物の尿素緩衝液中の主要タンパク質成分（約 ５０〜７０％）がその都度ホスファターゼ誘導体である。タンパク質混合物を、 標準条件（Ｌｌ、　Ｋ、　Ｌａａｎ＋ｍｌｉ　、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　、６ ８０−６８５　［９７０］　）下？５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動 することによって分離した後、相応のタンパク質バンドを次の基準により同定し た：ａ）タンパク質混合物の最も太いバンドは表１で記載したアミノ酸配列に相 応する分子量を有する。 ｂ）　このタンパク質はホスフェートによって再開始可能である、つまり細胞を ２．１で記載したように、しかし１０倍のホスフェート濃度で発酵した場合には 該バンドは現われない。 Ｃ）該バンドはプラスミド特異的であって、２．１と同じ条件下で製造されＩ； 、プラスミドを含まないＥ。 ｃｏｌｉｓ８４４株の細胞では現われない。 ｄ）該バンドは、抗原プロット検出法では特異的にＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　１２産 精製アルカリ性ホスフアターゼに対する抗血清と反応する。 探準タンパク質混合物（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製低分子量タンパク質）を用いる ゲル電気泳動分子量測定から、ホスファターゼ誘導体が所謂前駆形で存在する、 つまりさらにアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列も有することが認められ る。該タンパク質は希薄緩衝液中では比較的難溶である。従って細胞分解及び遠 心分離後に得られる上澄みでは僅少量しか検出することができない。 ２．４　ホスファターゼ誘導体の精製 ２．２で得られたタンパク質抽出物を分離して、中圧クロマトグラフィー装置（ ＦＰＬＣ）　（スウェーデン国つプサラ在Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いる勾配 クロマトグラフィーによって修飾ホスファターゼをさらに精製する。 前記メイ力−のアニオン交換カラム（Ｍｏｎｏ　Ｑ　−ＨＲ５１５型）を、緩衝 液Ａ（１−リスＨＣＩ　５０　＋ｎＭ、尿素８Ｍ、Ｉ））１８．０）で平衡化し 、２．１からのタンパク（質溶液を負荷し、最後に緩衝液Ａと緩衝液Ｂ（）リス ＭＣｌ５０　ｍＭ、　ＮａＣ１ｌ　Ｍ　、尿素８Ｍ、ｐＨ８，０）から形成され る、ＮａＣｌ　Ｏ−２００ｍ１Ｊの勾配を用いて、ｌ−０，ｆｌ／ｍｉｎの流量 で溶出を行なった。全勾配容量は２０ｒｎＱであり、１ｒｎＱのフラクションづ つ集めｔ；。 溶出液の２８０ｎｌｌｌでの吸光を流量プロットメーターで記録した。＠々のフ ラクションのタンパク質組成は５ＤＳ−ポリアクリルアミドーゲ・ルミ気泳動に よって分析した。ホスファターゼ誘導体は５０〜７０ｍＭのＮａＣｌで溶出され た。相応のフラクションを精製し、４００倍の容積の緩衝液（トリスＨＣ１５０ ｍＭ、　ＮａＣ１１５０ｍＭ、　ｐＨ８，０）に対して透析した。この条件下で 該タンパク質は溶解しており、この形で次のコラゲナーゼ分解のｔ：めに使用し た。ホスファターゼ製剤の純度を５ＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動に よってコントロールした（第３８頁、バンド４，６及８参照）。同純度は９０％ よりも高かった。タンパク質分はＷ、　Ｓｃｈａｆｆｍｅｒ等（Ａｒ＋ａ１．　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５６　、５０２−５１４　［１９７３］）によりアミドシュ ワルツ１０Ｂを用いて測定し、濃度は０．６〜０．７πｇ／１ｌ１１２であった 。１０１２の発酵から約１６０ｍ５のタンパク質が得られた。 ３、修飾ホスファターゼタンパク質のコラゲナーゼＬ：よる特異的分解 ３．１．　コラゲナーゼの精製 クロストリジウム・ヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｈｉｓｔｏｌｙｔ ｉｃｕｍ）　（ＥＣ３，４−２４，３）産クロストリジオペブチダーゼＡを、Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅ　ＧｍｂＨ社（Ｄ　−８０２４Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ 、　Ｇｒｕｅｎｗａｌｄａｒ　Ｗｅｇ　３０　）から入手した（　Ｔｙｐ■、　 Ｂｅ５ｔ、−Ｎｒ、　ＣＯ７７３）。 この酵素を、ＦＰＬＣ装置及び例２．４．記載のものと同じアニオン交換カラム の使用下に勾配クロマトグラフィーによってさらに精製した。コラゲナーゼ２ｔ ａｇを使用し、緩衝液Ａ（トリスＨＣＩ　Ｉ　ＯｍＭ、　ＣａＣ１ｚ　５ｍＭ、 　ｐＨ８。 ０）と緩衝液Ｂ（）リスＨＣＩ　］　Ｏ０＋ｎＭ、　ＣａＣ１＝　５　ｍＭ。 ＮａＣ１ｌ　ｍＭ、　ｐＨ８−０）とから成る、ＮａＣ１０−２００ｍＭの勾配 を用いて流出速度０　、５　ｍ１２／ｍｉｎで流出させた。勾配の全容量は２０ 凋Ωであっｔ；。フラゲナーゼ活性はＥ＋Ｗｕｅｎｓｃｈ等（Ｆｌｏｐｐｅ−５ ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。 Ｃｈｅｍ、３３３，１４９　１５１　［１９６３］）によって記載されたテスト によって測定した。極めて活性のある７ラクシ謬ンは０．８１１ｇ／ｒｎＱのタ ンパク質分及び２５００単位／ｖｎｙの特異活性を有していた。次に記載する分 解実験は、−２０℃で保管し！：前記フラクシｎンを用いて実施した。 １２　ＨＳ４１３３／１の分解 一木調タンパク質は４７７個のアミノ酸（分子量４９９１９）の長さを有してい る。該タンパク質は、コラゲナーゼによって切断可能の配列ニ ー〇ｌｙ　−（Ｐｒｏ　−Ｙ　−Ｇｌｙ　）！　−Ｐｒｏ　−［前記配列中Ｙは １回は旧ｓ、１回はＡｈａを表わす（表１参照）］を有している。２つのＹ　− Ｇｌｙ結合を切断することによって、４４７アミノ酸（分子量４６８８０）及び ２７アミノ酸（分子量２８３２）を有する２種のタンパク質ならびにトリペプチ ドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａが形成される。種々のホスファターゼ誘導体のコラゲ ナーゼに対する反応性を相互に比較するために、最大分解生成物の形成を反応時 間及び酵素量に依存して測定し１；。 反応緩衝液（トリスＨＣＩ　９０　ｍＭ、　ＣａＣｌ２５　ｍＭ、　ＮａＣ１１ ２０！ＩＩＭ、　ｐｌ（８，０）中にＨ３４１３３／１　５３　μ９及びクロス トリジオペブチダーゼＡ０．１単位を含有する反応混合物を、３７℃で２．５時 間インキュベートした。１５〜３０分の時間間隔で各１０μＱの試料を取り出し 、試料緩衝液（１０％サッカロース、１０％ナトリウムドデシルスルフェート、 ジチオトレイトール１ｍＭ、　ＥＤＴＡ　２ｍＭ）　３μＱを加え、９５℃に５ 分加熱することによって直ちに停止しｔ：。 試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミド−勾配ゲル（定数０．３３％ビスアクリルア ミドを有する１２．５〜２５％アクリルアミドの勾配）で電気泳動することによ って分離した。同ゲルをクーマシーブリリアントブルーＧで染色しｌ：後、タン パク質バンドに従って細片状１：切断し一ゲルスキャナー（ＩＳＣＯ社製、光学 装置６型、吸収モニターＵ　Ａ　−、５）を用いて２８０ｎｍで定量的に評価し た。精製されたホスファターゼタンパク質を用いて得られた相応の校正曲線によ ってピークの高さから、最大分解生成物のバンドのタンパク質含分を確定した。 この結果は第３８頁に総括しである。これらのデータからＨ５４１３３／ｌの生 成物形成速度２１　、０　ｐＭｏｌ／功ｉｎ／酵素単位が得られる。 第３８頁の分離は、バンド７でクロストリジオペブチダーゼＡとの完全な反応後 のＨＡ４１３３／１の試料からの最大分解生成物の電気泳動分離を示す。 ３．３　５Ａ５０６／１の分解 該−木調タンパク質は、４８６個のアミノＭ（分子量５０５９６）の長さを有し 、；ラゲナーゼによって切断可能の配列ニ ー　Ｇｌｙ　−（Ｐｒｏ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｓ　−Ｐｒ。 ］前記配列中Ｙは１回は旧ｓ、　４回はＡｌａを表わす（表１参照）〕を含む。 すべてのＹ　−ｃｒｙ結合を切断すると、Ｈ５４１３３／１から生じるタンパク 質（，３，２゜参照）と同じタンパク質及び基質１Ｍ０１当り４ＭＯ】のＧｌｙ −Ｐｒｏ−Ａｌａが形成される。クロストリジオペブチダーゼＡに対する５Ａ５ ０６／１の反応性の測定は、Ｈ５４１３３／ｌの場合と同様に行なった。 反応溶液はＩＱＱ、ｕｆｆ中５３μｙの５Ａ５０６／１を含有しており、Ｈ５４ １３３／１の反応溶液と同じ酵素濃度及び緩衝液濃度を有してぃｔ；。３７℃で ８０分間インキニペートした。１０〜１５分の間隔で１０μＱの試料を取出し、 ３．２．で記載したように停止し、ゲル電気泳動後にゲルスキャナーで分析した 。結果は第３８頁に区示しである。生成物形成速度は６０ｐＭｏｌ／ｍ１１１／ ＃素単位であった。 第３８頁の分離は、クロストリジオペブチダーゼＡとの定量的反応後の５Ａ５０ ６／１からの最大反応生成物をバンド５で示す。 ３．４．　５Ａ３０２／ｌの分解 該−木調タンパク質は４７７個のアミノ酸の長さを有し、コラゲナーゼによって 切断できる配列ニー　Ｇａｙ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−Ｐｒｏ　−（ 表１参照）を含む。３０１アミノ酸（分子量３１２６９）及び１７６アミノ酸（ 分子量１８６６８）の長さを有する２種の分解生成物が形成される。５Ａ３０２ ／１の反応性は小さいためｔ：、生成物形成速度のおおよその値しか得られなか った。 反応緩衝液１５μＱ　（３，２の場合と同様）中に５Ａ３０２／１μり及びクロ ストリジオペブチダーゼＡ１．０単位を含有する反応混合物を３７℃で１５時間 インキュベートとし、次に３．２で記載したように試料緩衝液を加えかつ加熱し て停止し、ゲル電気泳動及びゲルスキャナーでの評価によって分析した。大きい 反応生成物約０　、０２　ｐＭｏｌ／　ｍｉｎ／酵素単位が形成された。第３８ 頁にはバンド９で相、応のゲル電気泳動分離を示しである。 表　２：　修飾プレホスファターゼ（表１）及びプレホスファターゼ／ＡＴＣＨ 融合タンパク質（西独国特許出願第Ｐ・３７３１８７５．６号）とクロストリジ オペブチダーゼＡとの反応の性成物形成速度 ｕｓ４ｔ３３／’ｌ　２　２１．０ ｓＡ５０６Ａ　５　５９．８ ＳＡ１８６／１　１　＜　Ｄ−０１ ＳＡ３４３／１　２　４０ ＳＡ３４１／１　５　３５０ ＳＡ３６０ダ　８５４０ 応生成物のグル電気泳動分離 ５Ａ３４Ｔ／１　５Ａ５０６／Ｉ　Ｈ５４Ｔ３３／Ｉ　５Ａ３０２／１第３．　 ５．　７及び９列：クロスト１，１ジオペプチダーゼＡで分解した後の生成物第 ２及び３列で使用した融合タンパク質は勾配クロマトグラフィーによって精製さ れなかった。 第３列の最低分子量を有するバンドはａｌｙ−ｐｒｏ−ｈｃＴＨｃ　１−３９） である。 第５及び７列には高分子分解生成物のみが認められ、低分子生成物はデルを完全 に通過する。 タンパク質５Ａ３０２／１、ｎ５４１３３／１及び５Ａ５０６／１　とクロスト リジオペブチダーゼＡとの反応の時間従属関係単試料半シ の生成物 反応条件は例３．２〜３．４に記載されている。 ５Ａ５０６／１及びＨ９４１３３／１の値はそれぞれクロスト１．１ジオペプチ ダーゼＡ　Ｏ，０１単位を用いて得られ、５Ａ３０２／１の値はクロストリジオ ペプチダ−Ａｏ、１単位で得られた。 Ａｂｂ、ｉ：　プ７　スミ）　ｐｓＢ９４　（６４５４塩基対）ノ制限ｐ素ａ断 地図１５す Ａｂｂ・　２　：　ｒ５ヌミドｐｓＡ３，０２の制限酵素切断地図Ａｂｂ、３　 ：　プラスミドｐＳＡ　５０．６の制限酵素切断地図１５！３ Ａｂｂ、４　：　プラスミドｐｐｓ４１３３の制限酵素切断地図国際調査報告 −１−−１−ｍ−１龜　ＰＣＴ／ＤＥ　８ε１００５３５国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．一段式Ｉ ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中 ｎ≧２であり、 Ｘ及びＹは遺伝暗号によつて決定される２０種のアミノ酸のいずれか１つを表わ し、 Ｚ１は細菌のアミノ酸配列を表わし、 Ｚ２は遺伝暗号の任意のアミノ酸からの目標ペプチドを表わす〕で示される融合 タンパク質。
2. ２．ｎが２〜１０であり、ｘがＧ１ｙを表わす請求項１記載の融合タンパク質。
3. ３．Ｚ１がＥ・ｃｏ１１Ｋ１２からのプレホスファターゼのアミノ酸前列１〜４ ４４の範囲の４４４個のアミノ酸の配列を表わす請求項１又は２記載の融合タン パク質。
4. ４．Ｚ２がヒトＡＣＴＨのアミノ酸配列を表わす請求項１から請求項３までのい ずれか１項記載の融合タンパク質。
5. ５．請求項１記載の式１で示される融合タンパク質をコードする遺伝子構造を細 菌宿主細胞で発現させ、分離方法を介して該タンパク質を得ることを特徴とする 式１で示される融合タンパク質の製造方法。
6. ６．細菌宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉを使用する請求項５記載の方法。
7. ７．請求項１記載の式１で示される融合タンパク質をコードする遺伝子構造。
8. ８．コラゲナーゼの反復切断位置のコドンを有し、従って請求項１記載の融合タ ンパク質の製造のために適しているプラスミド又は比較可能のベクター。
9. ９．プラスミドｐＳＡ５０６。
10. １０．プラスミドｐＨＳ４１３３。
11. １１．請求項１記載の式１で示される融合タンパク質から、アミノ酸配列−Ｘ− （Ｐｒｏ−Ｙ−ＧＩｙ）ｎ−Ｐｒｏ−〔前記配列中Ｘ及びＹは遺伝的にコードさ れうるアミノ酸のいずれか１つを表わす〕に続くＣ末端タンパク質配列を酵素的 に切断することを特徴とする真核タンパク質の製造方法。
12. １２．アミノ酸配列−Ｘ−（Ｐｒｏ−Ｙ−ＧＩｙ）ｎ−Ｐｒｏ−中のＹ−ＧＩｙ 結合コラゲナーゼで選択的に切断し、次にＮ末端Ｇｌｙ−Ｐｒｏ残基をポストプ ロリンジペプテジルアミノペプチダーゼによつて切断する、請求項１１記載の真 核タンパク質の製造方法。