JPH0242991A - 再組換えｄｎａシーケンス、微生物、植物細胞、双子葉植物、および双子葉植物若しくは植物細胞中の構造遺伝子の制御された発現のためのプロセス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａ８発明の分野 本発明はＤＮＡ組替え技術の分野に関し、植物中に存在
するＧＲＰ　（グリシンに富むタンパク）遺伝子の同定
にもとづいている。さらに特に、本発明はこのようなサ
リチレート誘発性プロモーターを使用することに関する
ものである。

Ｂ、技術水準 植物はそれらの環境から連続的に影響を受け、この影響
には脅威が含まれる。これらの影響は温度、光、湿度、
塩および損傷のような因子が関連することができ、また
ウィルス、カビ、細菌、昆虫などの病原体による攻撃が
関連する。生き残るために、植物は、植物がいわゆる「
ストレス」状態にさらされた場合に活性化される、広範
囲の防御機構を利用することができる。この活性化は一
般に、特定の植物遺伝子の発現の誘導によって達成され
る。この誘導は問題の遺伝子の上流のプロモーター領域
に多くの場合に存在する制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ　　
ｅｌｅｍｅｎｔｓ）によって制御される。成る与えられ
たストレス因子は高度に特異的な一組の植物遺伝子を活
性化することができるか、あるいはかなりの防衛遺伝子
の広い応答をもたらす。すなわち、短時間の間に温度が
上昇すると、いわゆる「ヒートショックＪ　　（Ｈ３）
タンパク遺伝子の発現が導かれる。植物は引続いて、未
処理植物が耐性でない温度に対して耐性になる。ＨＳタ
ンパク遺伝子のプロモーター領域に数回、存在する約１
４個の塩基対の保存配列がこれらの遺伝子の誘導に関与
することが見い出されている［たとえば、Ｐｅｌｈａｍ
およびＢｉｅｎｚ　（１９８２年）；Ｂｉｅｎｚ　（１
９８５年）］。

一方では、種々の光透発性遺伝子がクローン形成されて
いる。これらの遺伝子の上流に位置する数百側の塩基対
の配列が「レポーター」遺伝子、たとえばクロラムフェ
ニコール−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡ
Ｔ遺伝子）と融合されると、この遺伝子は形質発現性（
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）植物中で光透発性になる［たと
えば、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ等（１９８７年）；Ｇｒｅ
ｅｎ等（１９８７年）；５ｔｏｃｋｈｏｕｓ等（１９８
７年）参照］。多くの光透発性遺伝子（Ｌｉｇｈｔ−ｉ
ｎｄｕｃｉｂｌｅ　　ｇｅｎｅｓ）のプロモーター領域
において、光誘発に関連することができる９個の塩基対
の共通配列を区別することができる［Ｇ　ｒ　ｏ　ｂお
よび５ｔＴｈｂｅｒ（１９８７年）］。

植物が機械的に、あるいは昆虫により食べられることに
よって損傷を受けると、植物遺伝子、中でもプロティア
ーゼ　インヒビターをコードする遺伝子が活性化される
。トマトおよびジャガイモで最も特徴的であるこれらの
タンパクは植物のタンパク溶解酵素に対してはほとんど
作用しないが、動物の消化酵素、特に昆虫の消化酵素を
特異的に阻害する。ジャガイモのプロティアーゼ　イン
ヒビター遺伝子が損傷によって誘発されると、中でも、
この遺伝子の下流に位置する塩基配列が関連する［Ｔｈ
ｏｒｎｂｕｒｇ等の文献（１９８７年）］。ププロティ
アーゼインヒビター遺伝子が構成プロモーター（ＣａＭ
Ｖ−３５８−プロモーター）の制御下におかれ、形質発
現性植物中で発現されると、植物は昆虫の被害に対して
高度に抵抗性になることが見い出されている［Ｈｉｌｄ
ｅｒ等（１９８７年）］。

病原体による感染に対してそれ自体で防御することがで
きるように、植物は「過敏性応答」の用語で知られてい
るメカニズムを有する。感染の結果として、このメカニ
ズムが活性化されると、感染した植物細胞は死に、感染
の中心の周囲に病原体が通過することのできないリグニ
ン壁が形成される。これは、感染が感染の中心部に壊死
斑をもたらすが、植物の他の部分は病原体をほとんど含
まずに保留されることを意味する。過敏性応答を活性化
させない病原体は全植物の全体に広がることができ、高
濃度にまで蓄積するようになる。壊死感染の場合に、植
物の病原体を含まない部分はウィルス、カビおよび細菌
のような広範囲の病原体による二次感染に対する抵抗性
を発現しく「後天的抵抗性」）、この場合に、最初の感
染を生じさせた病原体がどのような病原体であるかは問
題ではないことが見い出だされている。すなわち壊死性
ウィルス感染がカビに対する抵抗性を導き、またこの逆
に、カビ感染がウィルスに対する抵抗性を導く。壊死性
感染によって、多数の遺伝子が植物の病原体を含まない
部分で誘導される［概要は次の文献を参照できる；Ｖａ
ｎ　　Ｌｏｏｎ　（１９８２年）　、Ｖａｎ　　Ｌｏｏ
ｎ　（１９８５年）、ＣｏＣｏ１１ｉｎおよび５ｌｕｓ
ａｒｅｎｋ。

（１９８７年）、ＢｏｌおよびＶａｎ　　Ｋａｎ（１９
８８年）　、Ｂｏ　１　（１９８８年）、ｖａｎＬｏｏ
ｎ　（１９８８年）］。これらの遺伝子によりコードさ
れた産生物は後天的抵抗性において成る役割を演じるも
のと予想される。誘導された遺伝子の一部分はアミノ酸
フェニルアラニンがら始まり、種々の芳香族化合物を合
成する酵素をコードする。これらには、カビの生育を抑
制する化合物、いわゆるフィトアレキシンが含まれる。

これらはまた、細胞壁を強化し、感染中心の周囲に障壁
を形成するのに使用されるリグニンの先駆体を包含する
。誘導された遺伝子の別の一部分は細胞壁中に存在し、
リグニンのような芳香族化合物の結合マトリックスとし
て機能するヒドロキシプロリンに富むグリコタンパク（
ＨＲＧＰ、エクステンシン）をコードする。第三の群の
誘発された遺伝子はまた、植物細胞の液胞中に蓄積され
るか、または葉の細胞内空隙に排泄されるタンパクをコ
ードする。これらのいわゆるＰＲタンパク（病因関連タ
ンパク質）はタバコに最も特徴的であるが、植物界に高
度に保存された形で存在する。−面において、これらは
組合されて人工培地上のカビの育成を効果的に抑制する
、キチナーゼおよびグルカナーゼのような加水分解性（
ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ）酵素になる。他のＰＲタンパク
は昆虫の消化酵素を阻害するものと考えられる。その他
のＰＲタンパクの機能は不明である。

Ｗｈｉｔｅはタバコをサリチル酸（中和された形）のよ
うな成る種の芳香族化合物で処理すると、ＰＲタンパク
のサブグループ（すなわち、ＰＲ−１タンパク質）の発
生およびウィルス感染に対する抵抗性が導かれることを
発見した（１９７９年）。これは、このサブグループの
ＰＲタンパクがウィルス感染に対する誘発抵抗性に関与
することを示唆しているものと見做された。Ｆｒａｓｅ
ｒはこれに反論して（１９８３年）、ＰＲ−１タンパク
を誘発させるが抗ウイルス応答を発生させない状態が存
在することを主張した。Ｈｏｏｆｔ　　ｖａｎ　　Ｈｕ
ｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ等はＳ　ａ　ｍ　ｓ　ｕｎ　　Ｎ
Ｎ　　ｔｏｂａｃｃｏでタバコ　モザイク病ウィルス（
ＴＭＶ）感染により誘発される６種のメセンジャ−−Ｒ
ＮＡ　（ｍＲＮＡ）のＤＮＡ：ｌピーをクローン化した
（１９８６年）。これらの種類のｍＲＮＡのうちの２種
はまた、サリチレートによっても誘導される。これらの
うちの１種はＰＲ−１タンパクに相当するものと見做さ
れる。他の１種は既知のＰＲタンパクには相当せず、初
めは［クラスターＣｌ　　（ｃｌｕｓｔｅｒ　　Ｃ）と
称された。その後、この名称はこれがグリシンに富むタ
ンパク質をコードするという発見からＧＲＰ−ｍＲＮＡ
に変えられた。このことは、このタンパク質が細胞壁成
分であごとができ、ＨＧＲＰに対して機能的に匹敵する
ものであることを示唆している［ＶａｒｎｅｒおよびＧ
ａ５５ａｂ　（１９８６）］　、ＰＲ−１ｍＲＮＡのコ
ビイＤＮＡ　（ｃＤＮＡｓ）はＰＲ−１遺伝子のクロー
ンをタバコの遺伝子ライブラリィを用いて単離するため
のプローベとして使用されており、これらの塩基配列は
明らかにされている［Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ等（１９
８７年）コ。

Ｃ１本発明の説明 ニコチアナ　タバクム　Ｃｖ、サムサン　ＮＮ（Ｎｉｃ
ｏｔｉａｎａ　　ｔａｂａｃｕｍ　　ｃｖＳａｍｓｕｎ
　　ＮＮ）のＤＮＡのサザン法（Ｓ。

ｕｔｈｅｒｎ　　ｂｌｏｔ）によりＧＲＰ−ｃＤＮＡを
ハイブリッド形成することによって、タバコのゲノムが
約８個のＧＲＰ遺伝子を含有することが見い出だされた
。Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　　ｔａｂａｃｕｍ　　ｃｖ、Ｓ
ａｍｓｕｎ　　ＮＮのゲノムライブラリィから、４種の
ＧＲＰ遺伝子がクローン化された。これらのクローン形
成ＧＲＰ遺伝子のうちの２種の塩基配列は明らかにされ
た。これらは１０９のアミノ酸のタンパクをコードする
２種のエキソンの両方よりなることが見い出された。

推定シグナル　ペプチドを切り離した後に、この熟成タ
ンパク質は約２５％のグリシンおよび約３０％の帯電（
ｃｈａｒｇｅｄ）アミノ酸よりなる。

分析された２種の遺伝子のうちの１種が発現されること
が、Ｓｌ−ヌクレアーゼ地図によって見い出だされた。

この遺伝子（クローンｇＧＲＰ−８）の配列および側鎖
（ｆ　１ａｎｋ　ｉｎｇ）ＤＮＡ配列を第１図に示す。

もう一種の遺伝子はウィルス感染に応答しては多分、発
現されない。このことから、そしてまたクローン化され
たＧＲＰ−ｃＤＮＡｓの塩基配列の分析から、８個のＧ
ＲＰ遺伝子のうちの少なくとも３種はウィルス感染後に
発現されるものと結論することができる。得られたデー
タは種々のＧＲＰ遺伝子のコード配列間およびまた上流
ＤＮＡ領域間に８０％より大きい相同性があることを示
している。

クローンｇＧＲＰ−８中のＧＲＰ遺伝子のプロモーター
領域の断片をＣＡＴ−レポーター遺伝子と融合させた。

アグロバクテリウム　ツメファシよって、これらの構築
物をタバコのゲノム中に組み込み、この形質発現性植物
をサリチレートによるＣＡＴ遺伝子の誘導能力に関して
試験した。再現性の方法で、転写開始部位の上流の初め
の１１４のネタレオチドがサリチレートによりこのプロ
モーターを誘導性にする１種または２種以上の配列を含
有することが見い出だされた。このプロモーターはまた
、アクリル酸、エチレンおよびエテホンを包含する数種
の他の物質によっても誘導されることが見い出だされた
。第１図のヌクレオチド−４００〜−６４５には、プロ
モーターのサリチレート誘導性活性を極めて増大させる
１種または２種以上の配列が存在する。従って、ヌクレ
オチド−６４５〜＋８の配列を有するＤＮＡ断片をいず
れか与えられた遺伝子に結合させた場合に、植物をこの
構築物により形質転換させた後に、サリチレートおよび
数種の他の特定の芳香族化合物により、制御された様相
で、問題の遺伝子を誘導することができる。この点で、
このような簡単な方法で化学的エフェクターを調整させ
ることのできることを特徴とする他の植物プロモーター
は存在していない。

Ｄ１本発明の引続く考案 本発明は広義には、ベクターＤＮＡおよび植物のＧＲＰ
遺伝子のサリチレート誘発性プロモーターに相当するか
、または関連するＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡを提供
する。

本発明による組換えＤＮＡのベクターＤＮＡ部分にはそ
れ自体制限はなく、組換えＤＮＡの意図する用途、特に
形質転換させようとする宿主によって決定される。当業
者にとって、与えられた宿主に対して、如何なるベクタ
ーが適当であるかは周知のことである。植物および植物
細胞の形質転換に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓチクノロシイにおいて使用するこ
とのできる既知のベクターは、たとえばｐＡＧｓ１２７
　［ｖａｎ　　ｄｅｒ　　Ｅｌｚｅｎ等（１９８５年）
および　ｐＲＯＫｌ　［Ｂａｕ　ｌｃｏｍｅ等（１９８
６年）］である。エスケリッチャ　コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈａ　　ｃｏｌｔ）のような細菌におけるクローニ
ングに使用することができる既知のベクターには、たと
えば種々のｐＵＣプラスミドがある。

当業者に良く知られているように、ベクターＤＮＡは通
常、宿主に適する複製の原型（Ｏｒｉｇｉｎ）に加えて
、１種または２種以上のマーカー遺伝子、たとえば抗生
物質耐性遺伝子を、形質転換された宿主が容易に選択で
きるように、含有する。

本発明による組換えＤＮＡの新規で、発明的特徴は植物
のＧＲＰ遺伝子のサリチレート誘発性プロモーターに相
当するか、または関連するＤＮＡ配列よりなる。第１図
はこのようなＧＲＰ遺伝子の具体例の一つを例示するも
のであり、構造ＧＲＰ遺伝子および側面の調節配列（ｒ
ｅｇｕｌａｔｉｏｎ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ）よりなる。

しかしながら、自然界において、サリチレート誘発性プ
ロモーターを含むかぎり、種々の変株が本発明に包含さ
れる。このことは天然には存在することが証明されてい
ない、人工的に構築されたプロモーターにも当てはまり
、これもまた、サリチレート誘発性プロモーターを含有
するかぎり、本発明に包含される。側鎖ＤＮＡ配列の中
で、成る種のタンパク質だけがプロモーター機能、プロ
モーターのサリチレートによる誘導能、およびプロモー
ターまたはサリチレートによるその誘導能の強度に関与
することができる。特に側鎖領域の他の部分において、
著しい変更が許容される。プロモーター配列の制御の下
のおかれる、使用できる構造遺伝子のヌクレオチド配列
に関して、アミノ酸の最終的゛配列に影響しない変更は
また、多くの場合に、許容される。アミノ酸の配列にお
ける僅かな変更を導く変化はかなりの場合に、タンパク
の発現および機能に対して重要ではない。イントロンの
場所、長さおよびヌクレオチド配列は一般に、これらが
宿主によって処理されうるかぎり、同様に変化させるこ
とができる。

本明細書で使用されているｒＧＲＰ遺伝子」の用語はＧ
ＲＰをコードするＤＮＡばかりでなく、また広義にはＧ
ＲＰをコードするＤＮＡ　（本明細書においては、構造
ＧＲＰ遺伝子と称する）を包含するＧＲＰの発現に関連
するＤＮＡおよびＧＲＰプロモーターを含む調節機能を
有する側鎖ＤＮＡ領域を意味するものとする。

本明細書に記載の本発明の好適態様は下記の目的のため
のＧＲＰプロモーターを使用することよりなる。

１、植物における商業的に重要なタンパク質の制御され
た産生 翻訳後修飾、たとえばグリコジル化を受けなければなら
ないタンパク質を組換えＤＮＡ技術により産生ずる場合
には、真核有機体を使用することが奨められる。この産
生において、イーストおよび動物細胞に加えて、植物は
将来、使用することができるものと予想される。ＧＲＰ
プロモーターを使用することによって、所望のタンパク
質の産生を、植物にサリチル酸ナトリウム含有溶液を噴
霧もしくは散布することにより、制御された時点で切り
換えることができる。これは生産しようとするタンパク
質が植物にとって毒性であるか、あるいは一方的アミノ
酸組成によって、植物の代謝の障害になる場合に、特に
重要である。サリチレートはまた、局部的効果が望まし
くないと考えられる場合に、地中水を通して供給するこ
ともできる。さらにまた、乾燥すると、葉上に壊死を生
じさせることのあるサリチレートをすすぎ去る別の処理
は、この場合には不必要であることができる。

ＧＲＰプロモーターまたはその誘導体が適当なシグナル
ペプチドのためのコードを融合された場合には、植物に
よって葉の細胞内空隙に所望のタンパク質を分泌させる
ことができ、これから簡単な方法で、比較的純粋な形で
単離することができる。

もう一つの可能性は、たとえば農業用途で興味のある植
物における成るプロセスを制御する目的で、外部からの
遺伝子発現を制御することにある。

すなわち、病気抵抗に関連する遺伝子を制御された様相
で発現させることができる。また、このプロモーターは
病気抵抗に関連する適当な遺伝子と組合せて、広い群の
病原体による感染に応答して迅速に、かつまた極めて効
果的に反応し、さらに効果的な抵抗反応をもたらす。こ
のような場合には、たとえばＴＭＶによるタバコの感染
後にオリジナルのＧＲＰ遺伝子が最も迅速で、かつまた
最も効果的な反応性遺伝子である場合がある。ＧＲＰプ
ロモーターによって制御される問題の遺伝子は植物それ
自体から生じさせることができ、あるいは外部から導入
し、別の植物からまたは別の有機体から発生させること
ができる（適当に発現させ、植物における遺伝子産生物
を機能するようにした後に）。

現在の研究は、種々のバイオチクノロシイを用いる農場
および機関において、タンパク質の産生または二次代謝
に遺伝子工学的に処理された植物細胞の大規模培養を使
用することを可能にすることにある。原則的には、ＧＲ
Ｐプロモーターまたはその誘導体の制御の下で、経済的
に重要な遺伝子を発現させることは可能である。標準技
法によれば、細胞培養物または起源培養物はＡｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓテコノロ
シイにより、問題のプロモーター／遺伝子融合構築物を
用いて形質転換された植物材料から得ることができる。

このような細胞培養物において、関連遺伝子はこの借地
にミリモル量のサリチル酸ナトリウムを添加することに
より、所望の時点で、生じさせることができる。

８１例 １、ＧＲＰ−ｃＤＮＡのクローニング ポリアルデニル化されたＲＮＡをタバコモザイク秒ウィ
ルス感染タバコから単離し、６５０のヌクレオチドの分
子について、勾配遠心分離により濃縮させた［Ｈｏｏｆ
ｄ　　ｖａｎ　　Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ　　等（１
９８６年）］。この分野における研究でよく知られてい
る標準技術を使用して、ＲＮＡは（−）鎖ＤＮＡにおい
て、オリゴ（ｄＴ）プライマー、逆転写酵素およびデス
オキシリボヌクレオチド　トリホスフニートにより複写
されることができる。引続いて、ＲＮアーゼＨおよびＤ
ＮＡポリメラーゼを使用して、相補的ＤＮＡ鎖をこのＤ
ＮＡに対しＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの方法（
１９８３年）により合成した。この二重鎖ＤＮＡはこれ
をＰｓｔＩで開裂させた後に、プラスミドｐｕｃ９に形
成されるＣ末端（これはＣ末端とハイブリッド形成させ
る）を有した。この構築物をＥ、ｃｏｉｌ　　ＭＨ−１
の形質転換に使用した。この形質転換株をニトロセルロ
ース　フィルター上に二通りの縞状に付与した。フィル
ターの一つはインビトロで転写された、ＴＭＶ感染タバ
コからのポリ（Ａ）　−ＲＮＡのＣＤＮＡとバイブリド
形成させ、もう一つのフィルターは健康なタバコからの
ポリ　（Ａ）−ＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリッド
形成させた［Ｍａｎｉａｔｉｓ等（１９８２年）］　。

ｍＲＮＡのＣＤＮＡを含有する第二のプローベに比較し
て、第一のブローベと良好にハイブリッド形成する形質
転換株がＴＭＶ感染によって生じた。これらの形質転換
株から、プラスミドを単離し、この挿入分子をＭ１３ベ
クター中でサブクローン化させ、挿入分子の配列をＳａ
ｎｇｅ　ｒ等の方法（１９７７年）により決定した。第
１図に示されているヌクレオチドの配列に相同する配列
を有するクローンがＧＲＰ−ｃＤＮＡを含有する。ディ
ファレンシャル　ハイビリラド形成法に対する別法とし
て、第１図に示されているＧＲＰエクソンの配列にもと
づいて合成されたデスオキシオリゴヌクレオチドよりな
るプローベを使用して、ｃＤＮＡライブラリィを調査す
ることができる。

ｎ、ＧＲＰ遺伝子のクローニング Ｓａｍａｕｎ　　ＮＮタバコの核から単離されたＤＮＡ
を５ａｕ３ＡＩにより部分的に消化させ、ベクター　Ｃ
ｈａｒｏｎ　　３５　［Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ等によ
る文献（１９８７年）参照］においてクローン化させた
。このゲノムライブラリーはＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖ
ｉｓのプラーク　ハイブリッド形成技法（１９７７年）
により、プローベとして例Ｉで単離され多ｃＤＮＡを使
用して調査した。ポジティブのハイブリッド形成性ファ
ージ（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ　　ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎ
ｇ　　ｐｈａｇｅｓ）中の挿入分子はＧＲＰ遺伝子を含
有しており、標準技法により、部分的にｐｕｃ９プラス
ミド中でサブクローンを形成することができた。

ｍ、ＧＲＰプロモーター活性の測定 第２図には、ＧＲＰプロモーター／ＣＡＴ遺伝子融合構
築物が図解式に示されている。ヌクレオチド配列−６４
５〜＋１５５を有するｇＧＲＰ−８のＨｉｎｄｎ［断片
をサブクローン化した。位置＋１５５からＢａ１３１に
より欠失を行ない、その後、その末端に標準技法により
Ｃ１ａｌリンカ−を付与した。Ｈｉｎｄｍ−Ｃ１ａＩ断
片をベクターｐｕｃｃにおいてサブクローン化し、配列
分折により特徴を確認した。一つの欠失変異株（ｐＤＥ
Ｌ＋８）は−６４５から＋８までの配列を有するように
なり、従ってＧＲＰ遺伝子のＡＴＧ開始コドンが欠落す
る。

ツバリン−シンターゼ遺伝子をプラスミドｐＤＨ５２か
ら２ｋｂ　　ＢａｍＨＩ断片として単離し［Ｖａｎ　　
Ｄｕｎ等（１９８４年）］、ｐＩｃ１９Ｈでクローン化
した［Ｍａｒｓｈ等（１９８４年）］。これにより、ｐ
ｌｃ１９Ｈ−Ｔｎｏｓが得られた。このプラスミドから
、Ｔ０ｎ５を２６０ｂｐ　　ＥｃｏＲ１断片として切断
することができる、ｐＵＣａ中でサブクローン化した。

これはｐＵＣ８−Ｔｎｏｓをもたらす。この２６０ｂｐ
Ｔｏｎｓ断片をまた、ＧＲＰプロモーターの上流のｐＤ
ＨＬ＋８でサブクローン化させた。最後に、このトラン
スポゾン　Ｔｎ９のＣＡＴ遺伝子［Ａｌｔｏｎ　　およ
び　Ｖａｐｎｅｋ　（１９７９年）］はｐＣａＭＶ−Ｃ
ＡＴプラスミドから７７３　　ｂｐ　　ＴａｑＩ断片と
して単離し［Ｆｒｏｍｍ等（１９８５年）］、構築物ｐ
ＰＲ６４５のｐｌａｌ側でクローン化し、プラスミドｐ
ＰＲＣ６４５を得た。

ｐＤＥＬ＋８の断片はｐＵＣ８−ＴｎｏｓでブラントＣ
１ａｌ断片としてサブクローン化した。

引続いて、７３３ｂｐ　　Ｔａｑｌ断片をＣＡＴ遺伝子
により、これらの構築物に組込んだ。この経路により　
ＣＴＡ遺伝子と融合されたｐＤＥＬ＋８のプロモーター
断片をＣ１ａｌによりその３′側でおよびそれぞれ酵素
ＥｃｏＲＶ　（−４００の位置で）　、Ｈａｅｌ［［（
−１３５の位置で）、またはＡｖａｎ　（−１４４の位
置で）により位置＋８および５′側で切断した。相当す
るプラスミドをｐＰＲｃ４００、ｐ　ＰＲＣ１３５およ
びｐＰＲＣ１１４と称する。これら３種のプラスミドお
よびｐＰＲＣ６４５プラスミドをＨｉｎｄｍで直線状に
し、次いでこの二重鎖（ｂｉｎａｒｙ）形質転換ベクタ
ーｐＡＧｓ１２７のＨｉｎｄｌｌＩ部位においてクロー
ン化した。ＣａＭＶＣＡＴプラスミドはｐＡＧｓ１２７
でＸｂａＩ断片としてクローンｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａ
ｃｉｅｎｓ、株ＬＢＡ　　４４０４に移入し［Ｏｏｍｓ
　　等（１９８２年）］、このトランスコンジュゲー）
　（ｔ　ｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を使用して、
標準方法によって、リーフディスク法でＳａｍｓｕｎ　
　ＮＮを形質転換した。小さい芽から再生した形質発現
性植物を、その葉からディスクを切り取り、これらを水
の上に、または１ｍＭサリチル酸溶液上に２４時間、浮
べて試験した。これらのディスクのタンパク質抽出物を
Ｇｏｒｍａｎ等の方法（１９８２年）によりＣＡＴ活性
に関して試験した。第３図にその結果を示す。第１列お
よび第２列では４００μｌのタンパク質を使用し、他の
列では１００μｌのタンパク質を使用した。Ｗ列および
８列はそれぞれ、水およびサリチル酸溶液に浮べられた
ディスクからのタンパク質を使用したことを示す。第３
列は、葉からディスクを切り取った直後に単離されたタ
ンパク質を使用した結果を示す。第６列〜第１１列は４
００ｂｐ、１３５ｂｐおよび１１４ｂｐのＧＲＰプロモ
ーター配列が同一程度のサリチル酸誘発性ＣＡＴ活性を
与えることを示している。この活性は比較的低いけれど
も、第１列および第２列のシグナルの大きさから見るこ
とができるように、有意である。６４５ｐｂプロモータ
ー領域を有する構築物ははるかに高い活性を示す。

水上に浮べた葉ディスクにおけるＣＡＴ活性（第４列）
は多分、切り取りの処理中に葉を傷付けたことにより生
じたものである。さらにまた、この場合のＣＴＡ活性は
サリチル酸により著しく刺激される。従って、サリチル
酸誘発能力に関与する配列はヌクレオチド−１１４と＋
８との間の領域に存在し、他方、一種または二種以上の
増強配列がヌクレオチド−６４５と−４００との間に存
在するものと結論することができる。

Ｆ９図面の説明 第１図はｇＧＲＰ−８クローンの構造ＧＲＰ遺伝子およ
び側鎖ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を示すものである
。ＧＲＰ読み枠は相当するアミノ酸配列で整列されてい
る。初めの２６番目のアミノ酸の後の太い垂直矢印はシ
グナルペプチドの推定開裂部位を示す。転写および翻訳
プロセスに関連する開始シグナルおよび終了シグナルは
下線で示されている。１７塩基対および１８塩基対の長
さを有する直接反復の場所および９塩基対および６４塩
基対の長さを有する逆行した反復の場所は平行矢印によ
り示されている。推定アクチベーター配列は二二で示さ
れているか、または波線により示されている。

第２図はＧＲＰ−プロモーター／ＣＡＴ遺伝子融合構築
を図解式に示すものである。第２図において、ツバリン
−シンセターゼ遺伝子（Ｔｎｏｓ）のポリアデニル化シ
グナルを含有する既知のｐＤＨ５２プラスミド、既知の
ｐｌｃ１９ＨおよびｐＵＣ８プラスミド、トランスボゾ
ンＴｎ９のＣＡＴ遺伝子を有する既知のｐＣａＭＶ−Ｃ
ＡＴプラスミドおよびプラスミドｐＤＥＬ＋８が使用さ
れており、これらの構築がここに記載されている。

第３図は形質発現性植物の葉ディスクのタンパク質抽出
物におけるＣＡＴ活性を評価する試験の結果が示されて
いる。このＣＡＴ活性はＧｏ　ｒｍａｎ等の方法（１９
８２年）により測定した。さらに詳細な説明は前記され
ている。

Ｇ、参考文献 Ａｌｔｏｎ、　Ｎ、　Ｋ、　　およびＶａｐｎｅｋ、　
Ｄ、　（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ　２Ｂａｕｌｃｏｍ
ｂｅ、　Ｄ、　Ｃ，、５ａａｎｄｅｒｓ、　Ｇ、　Ｒ，
、Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、　Ｗ、　、　Ｌｙｏ、　Ｍ、　Ａ
、　、　　およびＨａ＋ｒｉ＋ｏｎ、　Ｂ、Ｄ、　（１
９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２Ｂｉｅｎｚ、　Ｍ、　（１
９８５）　ＴｌＢ５　ＩＧ、　　１５７−１６１゜Ｂｏ
ｌ、Ｊ、Ｆ、　（１９８８）　Ｉｎ：Ｐｌａｎｔ　Ｇｅ
ｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ：　ｔｅｍｐ。

ｒａｌ　ａｎｄ　５ｐａｔｉａｌ　＋ｅｇｕｌａｌｉｏ
ｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｅｎｅｓ　（Ｄｐ、Ｓ、Ｖｅ
＋ｍａおよびＲｏＧｏｌｄｂｅｒｇ、　ｅｄｓ、）、　
Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ！ｒｌａｇ、　　ａｔ　ｐｅｒｓ
。

ＢＯＩ、　Ｊ、Ｆ、およびＶａｎ　Ｋａｎ、　Ｉ、Ａ、
Ｌ、　（１９８８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　
５ｃｉｅｎｃｅｓ　５．　４７４７−５２Ｃｏｌｌｉｎ
、　Ｄ、Ｂ、　　およびＳｌｕ＋ａｒｅｎｋｏ、　Ａ、
Ｊ、　（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、
　９３８９−４１０Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓａｎ　　Ｂ、Ｊ
　Ｃ，ｆｌｏｒｏｗｉＮ　　Ｊ　　Ｖａｎ　ＫａｎＪ、
Ａ、Ｌ、、　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｒ，Ｂ、　　および
Ｂｏｌ、　　１．Ｆ、（１９８７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｃｓ、　　１５　６７９９−６８１１Ｆ
ｒａｓｅ＋、　ＲｏＳ、　　およびＣ１ａｙ、　Ｃ，Ｍ
、　（１９８３］　Ｎｅｔｈ。

１、ｏｆ　　Ｐｌａｎｔ　　Ｐａｔｈｏｌ、８９．　２
８３−２９２゜Ｆｒａｍｍ、　Ｍ、、　Ｔａ１ｌｏｒ、
　Ｌ、Ｐ、およびＷａｌｂｉ、　ｖ、　（１９８５）　
　Ｐ＋ｏｃ Ｎａｔｌ　　　Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ　　ＵＳＡ　　８２
　５８２４−５８２８Ｇｏ＋ｍａｎ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｍ
ｏ１ｌａｊ、　Ｌ、Ｆ、およびＨｏｔａｒｄ、　Ｂ、Ｈ
（１９８２）　　Ｍｏ１．　　Ｃｅ１ｌ、　　Ｒｉａｌ
、　　２．　１０４４−１０５１Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、１
．、　Ｋａ７．　Ｓ、Ａ、　　およびＣｈｕａ、　Ｎ、
−Ｈ，（１９８７）　　ＥＭＢＯ１，６，２５４３−２
５４９Ｇ＋ｏｂ　　ｔｌ、　　およびＳｌ’ｉｂｅ＋、
　　Ｋ、　（１９８７）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ
　　Ｒｅｓ、　　１５　　９９５７−９９７３Ｇｏｂｌ
ｅ「、　Ｕ、　　およびＨｏｌｆｍａｎ、　Ｂ、１．　
　（１９８３）　Ｇｅｎｅ２５、　２６３−２６９ Ｗｉｌｄｅ＋、　’ｉ、＾、、　Ｇａｊｅｈｏｕｓｅ、
　Ａ、Ｍ、Ｒ，、Ｓｈｅｅｒｍａｎ、　ＳＰ、　　Ｂａ
ｒｋｅｒ、　Ｒ，Ｆ、およびＢｏａｌｌｅｒ、　Ｄ、　
　（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　　３００．　１６０−１
６３゜Ｈｏｏｆｔ　　ｖａｎ　　Ｈｕｉｊｓｄｕｔｉｎ
ｅｎ、　　Ｒ，Ａ、Ｍ、、　　Ｖａｎ　　Ｌｏａｎ、　
　ＬＣ，、ＢＯＩ、　　Ｊ、Ｆ、　　（１９８６）　　
ＥＭＢＯＪ、　　５．　２０５７−２０６１゜Ｋｎｈｌ
ｅｍｅｉｅ＋、　Ｃ０，Ｇｒｅｅｎ、　Ｐ、］、　およ
びＣｈｕａ、　Ｎ−Ｈ（１９８７）　　＾ｎｎｕ、　　
Ｒｅｖ、　　Ｐｌａｎｔ　　Ｐｈ７ｓｉｏ１．　３１１
．　２２１２ｋｌａｎｉａｊｉｓ、　Ｔ、、　　Ｆ＋ｉ
ｌ＋ｃｈ、　Ｅ、Ｆ、　およびＳａｍｂ＋ｏｏｋノ、　
　　（１９８２）　　　Ｍｏｌ　ｅｃＵｌａｒ　　Ｃ１
ｏｎｉＢ、　　　Ｃｏ１ｄ　　　Ｓｐｔｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｕ＋　ＬａｂｏＭａ「ｓｈ、　　１．Ｌ、、　　
Ｅ＋Ｎｅ、　Ｍ　　およびＷｙｋｅｓ、　　Ｅ、１．　
　（１９８４）　　Ｇｅｎｅ　　３２．　４８１−４８
５０ｏｍｓ、　　Ｇ、、　　Ｈｕ＋ｙｋａａｓ、　　Ｐ
、Ｉ；Ｌ　　　Ｖａｎ　　Ｖｅｅｎ　　ＲＩ　　ＭＶａ
ｎ　Ｂｅｅｌｅｎ、　Ｐ、、　Ｒｅｇｅｎｓｂｕ＋ｇ−
Ｔｕｉｎｋ、　Ａ１．Ｇおよび５ｃｈｉｌｐｕｏｏ＋ｔ
、　Ｒ，Ａ、（１９８２）　Ｐｌａｓｍｉｄ　７　１Ｐ
ｅｌｈａｍ、　Ｈ，Ｒ，Ｂ、　　およびＢｉｅｎｚ、　
Ｍ、　　（１９８２）　ＥＭＢＯｌ、　　Ｉ　　　１４
７３−１４７７ Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、　お
よびＣｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ（１９７７）Ｐ＋ｏｃ。

Ｎａ１ｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　７
４．　５４６３−５４６７Ｓｆｏｃｋｂｏｕｓ、　　Ｊ
、、　　Ｅｃｋｅｓ、　　Ｐ、、　　Ｒｏｃｈａ−５ａ
ｓａ　　Ｍ、　　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　　およびＷｉ
ｌｌｍｉｔｘｅｒ、　　Ｌ、　（１９８７）　Ｐ＋ｏｃ
。

Ｎａｊｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ　８
４．　７９４３−７９４７Ｔｂｏ＋ｎｂｕ＋ｇ、　　Ｒ
８Ｗ、、　　Ａｎ、　　Ｇ、、　　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ
　　Ｔ、Ｅ、１０ｈｎｓｏｎ、　Ｒ，およびＲｙａｎ、
　Ｃ，＾、　　（１９８７）　Ｐ＋ｏｃ、　Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８４　７４４−７４
８Ｖａｎ　　ｄｅｎ　　Ｅｌｘｅｎ　　　Ｐ　　Ｊ　　
Ｍ　　　Ｌｅｅ　　Ｋ　　Ｙ　　　ＴｏｖｎｓｅｎｄＪ Ｂｅｄｂ＋ｏｏｋ、　　Ｉ　　（１９８５）　　Ｐｌａ
ｎｔ　　Ｍｏｌ、　　８ｉｏ１．　５．　１４９−１５
４゜ Ｖａｎ　Ｄｏｎ、　Ｃ，Ｍ、Ｐ、、　ＢＯＩ　　］、Ｆ
、　　およびＶａｎ　Ｖｌｏｔｅｎ　Ｄｏｔｉｎｇ、　
　Ｌ、　　（１９８７）　　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　１５
９．　２９９−３０５゜Ｖａｎ　　Ｌｏａｎ、　　Ｌ、
Ｃ，（１９８２）　　Ｉｎ：　　＾ｃｔｏｖｅ　　ｄｅ
ｆｅｎｓｅ　　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　　ｉｎ　　ｐｌ
ａｎｌ＋　　（Ｗｏｏｄ、　　Ｒ，に、Ｓ、　　ｅｄ、
ｌ、　　ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ　　Ｎｅｗ　　Ｙｏｌ
ｋ　　２４７−２７３Ｖａｎ　　Ｌｏａｎ、　　Ｌ、Ｃ
，（１９８５）　　Ｐｌａｎｔ　　１１＋０１．　　Ｂ
ｉｏｌ、　　４　　Ｉｌｌ＋１ｘｎ　　Ｌｏｏｎ、　　
　Ｌ、Ｃ，（１９８Ｂ）　　Ｉｎ：　　Ｐｌａｎｔ−ｍ
ｉｃｒｏｂｅ　　１ｎｌｅ＋ａｃｔｉｏｎｓ；　　ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒａｎｄ　　ｇｅｎｅｔｉｃ　　ｐｅｒｓ
ｐｅｃｔｉｖｅｓ（Ｎｅｓｔｅｒ、　Ｅ、Ｗ、　　およ
びＫｏ＋ｕｇｅ、　Ｔ、、　ｅｄｓ、）　Ｍａｃｍｉｌ
ｌａｎ　　ＰＩＩｂｌ、　　Ｃｏ。　ａｔ　　ｐｅｎ。

Ｖａｉｎｅ「、　　Ｉ、Ｅ、　　およびＣａ５ｓａｂ、
　Ｇ、　１．　　（１９８５）　Ｎａｔｕｓｅ　　３２
３　　１１０ Ｗｈｉｔｅ、　　Ｒ，Ｆ、　　（１９７９）　　Ｖｉ＋
ｏｌａｇｙ　　９９．　４１０−４１２゜

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のｇＧＲＰ−８の構造ＧＲＰ遺伝子およ
び側鎖ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を示すものであり
、第２図はＧＲＰ−プロモーター／ＣＡＴ遺伝子融合の
構築を図解式で示すものであり、そして第３図はＧｏｒ
ｍａｎ等の方法により測定された、’ＣＡＴ活性試験結
果を示すものである。 弔３図 −４３ａｃ−ａｍ −一一１°０°０ｍ ゆ１Ｐ０ ５ｗ５ １１４　　　　　：１５Ｓ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ベクター−ＤＮＡおよび植物のＧＲＰ遺伝子のサ
   リチレート誘発性プロモーターに相当するか、または関
   連するＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ。
2. （２）ベクター−ＤＮＡおよびタバコのＧＲＰ遺伝子の
   サリチレート誘発性プロモーターを含む請求項１に記載
   の組換えＤＮＡ。
3. （３）ベクター−ＤＮＡおよびニコチアナ　タバクムＣ
   Ｖ．サムサンＮＮ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ
   ｍ　ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ　ＮＮ）のＧＲＰ遺伝子のサリ
   チレート誘発性プロモーターを含む請求項１に記載の組
   替えＤＮＡ。
4. （４）ベクター−ＤＮＡおよびクローンｇＧＲＰ−８の
   ＧＲＰ遺伝子のヌクレオチド−６４５番目からヌクレオ
   チド＋８番目までのＤＮＡ配列、あるいはサリチレート
   誘発性プロモーター活性を有するその変種またはタンパ
   クを含む請求項１に記載の組替えＤＮＡ。
5. （５）ＧＲＰプロモーターの制御の下で、ＧＲＰ構造遺
   伝子とは異なる構造遺伝子を含む、請求項１〜４のいず
   れか一項に記載の組替えＤＮＡ。
6. （６）請求項１〜５のいずれかに記載の組替ＤＮＡおよ
   び導入されたプロモーター配列を依然として含有するそ
   の子孫を使用して形質転換された微生物、植物細胞およ
   び植物。
7. （７）所望のポリペプチドまたはタンパクを合成できる
   植物または植物細胞を培養し、そして産生されたポリペ
   プチドまたはタンパクを単離することによって、ポリペ
   プチドまたはタンパクを製造する方法であって、所望の
   ポリペプチドまたはタンパクをコードするＧＲＰ−プロ
   モーター制御構造遺伝子による請求項５に記載の組替え
   ＤＮＡを使用して形質転換された植物を使用し、そして
   この植物または植物細胞を、ＧＲＰプロモーターを誘導
   するサリチレートまたはその他の試薬と接触させること
   によりポリペプチドまたはタンパクの産生を誘発させる
   ことを含む方法。