JPH0242992A - 生体触媒を用いる反応方法およびその反応装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、酵素や微生物菌体のような生体触媒を基質と
反応させて種々の有用物質を製造する方法において、該
触媒反応を効率良く行う方法および該方法に用いるため
の装置に関するものである。

さらに詳しくは、本発明は、限外濾過膜を併置した反応
部と、生成物の分離機能を備えた晶析部とで構成される
反応装置を用い、反応混合物を該装置に循環させて生成
物を析出させ、分離することにより、高い基質濃度の反
応混合物から生成物を蓄積させ、効率よく生体触媒反応
を行う方法およびそのための装置に関するものである。

［従来技術５と解決すべき課題］ 酵素や微生物を触媒とする反応は、その高い基質特異性
により、常温、常圧の緩和な条件下で効率良（進むこと
から、これらの生体触媒を用いて種々の有用物質を製造
する試みがなされている。

これらの生体触媒を用いる反応は通常、水溶液または水
性懸濁液中で行なわれるが、これら生体触媒は、高温等
の過酷な条件下では極めて容易に失活してしまうので、
反応後、生成物を懸濁状の反応混合物から分離し、さら
に生体触媒をその活性を維持したままで回収して再刊用
することは極めて困難である。従って、たとえ充分な活
性か残っていても反応液と一緒に捨てなければならず、
極めて不経済であった。

近年、上記問題の解決策として、固定化生体触媒の利用
が高まっている。固定化生体触媒とは、生体触媒を、適
当な固体担体に眼前させるか、もしくは固体担体に包括
せしめてなる不溶性の触媒である。この固定化生体触媒
を用いた物質生産プロセスの利点として、生体触媒が安
定化されており、反応の連続操作が可能であること、生
成物と生体触媒との分離が容易であり、澄明な反応液が
得られること、生体触媒の反ＩＶ刊用か可能であること
等を挙げ得るか、他方、欠点として、固定化時に生体触
媒の一部変性および失活を免れ得す活性か低下している
こと、また、このような生体触媒反応の反応性は基質濃
度に依存しているが、基質濃度を高くすると生成物が飽
和溶解度以上に生成し、触媒内部や表面に析出して反応
を円滑に行えなくなるという点か指摘される。即ち、多
くの固定化生体触媒反応では、蓄積できる生成物の濃度
は、それ自身の反応温度における飽和溶解度によって決
まるために、一般には飽和溶解度以上の生成物を得るこ
とができなかったのである。

このような状況下、固定化生体触媒反応での生産効率を
向上する手段として、基質や生成物等の低分子重物質は
透過させるか、生体触媒等の高分子量物質を透過させな
いような膜を用いて生体触媒を隔離することにより、全
体として固定化生体触媒作用を発揮させ、生体触媒の固
定化操作に伴う活性の低下を防ぐ方法か提案されている
。しかしながら、この方法では、活性は充分に発現され
得るか、安定性は従来の吸着法や包括法で調製された固
定化生体触媒の安定性に比べて低く、失活し易いために
、回収再利用には不適当である。他方、本願出願人は、
固定化生体触媒を用いる反応において、反応の進行と同
時に生成物の分離、精製を行うことにより、反応液中の
生成物濃度を高める方法を開示した（特開昭６１−５７
８９号）。

この方法によって、生成物の高濃度化は達成されたが、
固定化に伴う活性の低下という問題点は未解決のままで
あった。従って、本発明者らは、より効率のよい生体触
媒による反応方法を開発することを目的として鋭意、研
究を謙「ねできた。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、上記の様々な課題を解決するものであって、
生体触媒の活性を高く維持しつつ、固定化生体触媒の機
能を充分に発揮させ、高濃度の生成物を蓄積させて効率
よく反応させる方法および該方法に用いるための装置を
提供するものである。

本発明方法は、生体触媒を透過させない限外濾過膜（以
下、ＵＦ膜と弥する）を併置する反応部と、生成物の析
出、分離機能を備えた晶析部とからなる反応装置を用い
ることによって達成された。

即ち、本発明は、基質と生体触媒とを反応させて有用物
質を製造する方法において、反応混合物をＵＦ膜に通し
て生成物に富む濾液を分離し、該濾液から生成物を析出
、蓄積させることを特徴とする方法、並びに該方法に用
いるための装置を提供するものである。

本発明方法は、たとえば、撹拌下、反応部の反応槽内で
基質と生体触媒とを反応させながら、これら出発物質と
生成物とを含有する反応混合物を循環させてＵＦ膜に接
触させ、生成物に富む濾液を分離し、該濾液を、生成物
の溶解度が反応部での飽和溶解度よりも低くなるように
温度設定された晶析槽に送って析出させ、得られた生成
物を分離し、蓄積させた後、母液を再ひ反応部に戻して
再使用することで実施される。

本発明装置の反応槽に併置されるＯＦ膜としては、生体
触媒である微生物細胞や酵素タンパク質の透過を妨げ、
低分子量の基質や生成物のみを透過させる適当な孔径の
細孔膜である限り、その種類に制限なく、平膜、中空糸
（ホローファイバー）膜等から任意に選択することかで
きる。しかしながら、分画分子型か約５．０００〜５０
，０００であって、単位体積当たりの透過面積か約２な
いし３０ｍ２と大きいホローファイバー型式の膜が好ま
しい。

反応槽としては、基質と生体触媒間の外部拡散抵抗を除
去するための機能を備えたものであればいずれの型式の
ものであってもよく、適当な撹拌機の付いた撹拌槽や、
液流動用ポンプの付いた基型式のものを用いることかで
きる。

また、晶析槽としては、熱交換機能、固−液分離機能、
撹拌機能を有するものであれば、いかなる型式のものを
選択してもよい。

上記の如く、本発明方法では、反応槽〜ＵＦ膜、および
ＵＦ膜〜晶析槽〜反応槽間に、反応液を循環させる。従
って、本発明装置は、これらの各部位を送液ラインで連
結すると共に、液を循環させ°るための循環ポンプを適
宜配設して構成されでい本発明方法は、通常の生体触媒
による反応に広く適用可能である。そのような反応には
、たとえば、トランスアミナーゼのような酵素を粗酵素
のまま、または精製酵素として用いることができ、ある
いは、トランスアミナーセ活性を有するパラコツカス０
デニトリフイカンス（Ｐ　ａｒａｃｏｃｃｕｓｄｅｎｉ
ｔｒｉｆｉｃａｎｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ１２４４２やエッ／
エリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｌ　
ｉ）　Ｐ　Ａ　５　Ｑ　１株（特願昭６２−３１３５０
５号）の如き微生物細胞の培養液をそのまま、あるいは
濃縮精製した濃縮菌体として用いることもできる。この
ような生体触媒は市販されているか、または調製可能で
あるか、微生物細胞を用いるときには、反応液中に培養
液由来の夾雑物か混入することを避けると共に、取り扱
いを容易にするために、培養液を１１５〜１７５０程度
に濃縮精製したものを用いることが好ましい。

また、基質は、目的物質に対応するものが選択されるが
、それが水溶性の場合には、適当に高濃度の水溶液とし
て用い、難溶性であれば、懸濁液として用いる。反応槽
への添加は、最初に一括して加えるか、あるいは反応中
に数回に分けて加えるいずれの方法でもよい。生体触媒
反応が基質で阻害される場合には後者の方法が好ましい
。

本発明方法では、上記の如く、反応槽内の反応混合物を
重環させてＵＦ膜に接触させ、生成物に富む濾液と生体
触媒を含有する反応液とを分離する。後者はそのまま反
応槽に戻されるが、前者の濾液を晶析槽に導き、該槽内
で生成物を析出させて分離した後、反応母液を反応槽に
戻す。この−連の反応機構を通して循環される反応液の
流速は、反応槽〜ＵＦ膜間では生体触媒がＵＦ膜内に貯
溜されない程度であればよ（、ＵＦ膜〜晶析槽〜反応槽
間では、反応効率の観点から、ＵＦ膜の濾液中に基質が
若干残存している状態が得られる程度の流速とするのか
好ましい。

反応槽の温度は生体触媒の活性と安定性を維持するため
に、通常、０〜６０°Ｃの範囲とするが、２０〜４５°
Ｃに設定することが好ましい。

晶析槽の温度は、反応温度における生成物の飽和溶解度
よりも低い飽和溶解度を与えるｔ温度に設定することか
必要である。即ち、溶解度が温度上昇に伴って上昇する
物質の場合には、晶析槽の温度を反応槽の温度よりも低
くし、その逆の場合には高くすればよい。

次に、上記本発明方法の１実施態様を、図面に従って説
明する。

第１図は本発明の反応装置の該略ブロック図である。反
応槽（１）にはホローファイバー型のＯＦ膜（２）か、
晶析槽（３）には濾過器（４）がそれぞれ併設されてお
り、これらの間にはポンプ（５）、（６）および（７）
が配設され、反応槽（１）からＵＦ膜（２）には反応Ｋ
１合物力、ＵＦ膜（２）カラ晶析槽（３）ニハＵＦＩＩ
！ａ濾液が、そして濾過器（４）から反応槽（１）間に
は生成物分離後の母液が夫々送液ライン（１０）、（ｔ
ｏ’）、（１０”）を通って循環するように構成されて
いる。

反応槽（１）および晶析槽（３）にはそれぞれ、撹拌機
（８）および（９）か設けられている。晶析槽（３）に
併置される濾過器（４）の形状および設置方法は特に限
定されるものでなく、第１図に示すように、晶析槽（４
）にオーバーフロー管を付け、その管の出口に設置して
もよいが、晶析槽（３）の断面全域に吸引式の平板式濾
過板を設置したり、あるいは、円筒式濾過板を晶析槽（
３）内に浸漬して設ける方法（第２図参照）てもよい。

本発明装置を用いて生体触媒反応を行うには、まず、反
応槽（１）に基質溶液または基質懸濁液と生体触媒を入
れ、反応混合物を撹拌機（８）で撹拌する。

同時に、反応混合物を、ポンプ（５）により送液ライン
（ｌＯ）を経てＯＦ膜（２）に導く。ＵＦ膜（２）がホ
ローファイバー膜であれば、循環液を膜の内、外いずれ
に導いてもよい。次いで、ＵＦ膜（２）を透過した濾液
をポンプ（６）によって抜き出し、送液ライン（１０’
）を経て晶析槽（３）に送り込むと、反応生成物の溶解
度が反応槽（１）内におけるよりも低くなるように温度
設定された晶析槽（３）内で生成物は過飽和となり、析
出する。生成物が析出し、反応槽（１）内よりも低濃度
で飽和されたＵＦ膜（２）濾液はオーバーフローして濾
過機（４）に入り、生成物が分離される。析出した生成
物を晶析部に残し、母液をポンプ（７）により送液ライ
ン（１０′”）を経て反応１４！（１）に戻すと、該液
は未飽和の基質を溶解し、再度反応に供せられる。

基質が消耗されるまでこの操作を繰り返して行うと、晶
析部には懸濁状の生成物のみが蓄積されることになる。

第２図は他の実施例を示す図であって、第１図の反応装
置において、反応槽（１）か除かれている。

この場合には、基質を晶析槽（３）内に入れ、生体触媒
をＯＦ膜（２）の空間に置いて、反応混合物を晶析槽（
３）からＵＦ膜（２）に循環させて反応させる。

この装置では、晶析部［晶析槽（３）と濾過器（４）］
の実効容積に対する反応部［ＵＦ膜（２）］の実効容積
の比か小さいので、反応液への生成物量の損失を少なく
することかできる。

［実施例］ 以下に実施例および実験例を挙げ、本発明をさらに詳し
く説明する。

実施例１　トランスアミナーセ活性を有するＤＮＡ組換
えエッシエリヒア・コリＰΔ５０１株によるフェニルピ
ルビン酸とＬ−アスパラキン酸カらのし一フェニルアラ
ニンの生産 （１）装置 ホローファイバー型ＵＦ膜（旭化成、５ＩＰＩ０１３、
透過面積０２ｍ２、万両分子ｆｆ１６０００）を併置し
た反応槽（実効容積０．５５のと実効容積０．４５１２
の外浴付き晶析槽および円筒型平板濾過器（直径８ｃｍ
φガラスフィルター）を第１図の様式で連結したちのを
用いる。

（２）生体触媒 微生物細胞を次の如く調製した。

まず、グルコース０．２％、ラクトース１％、コーンス
チーブリカ−２％、ミーストＮ２％、クルタミン酸ナト
リウム０．５％、（ＮＨ，）、３０．０１％、Ｋ、ＨＰ
Ｏ，０，７％、ＫＨ，ＰＯ，０，３％、Ｍｇ　Ｓ　Ｏ４
・７ＨｔＯ０，０２５％、カラリン０．０３％を含む培
地Ｉ　Ｑ１２（ｐＨ７，０）にＤＮＡ組換えエノシェリ
ヒア・コリＰＡ５０１株（宿主：エッンエリヒア・コリ
ＨＢ１０１株；ベクター・ｐＵＣ１８；挿入ＤＮＡ・バ
ラコツカス・デニトリフィカンスのゲノムＤＮＡの一部
）の前項ｅｒ（１０，１ρを植菌し、３７°Ｃて２２ｈ
通気撹拌培養した。

培養液を遠心分離してｌ／３７に濃縮し、濃縮微生物細
胞を調製した。

（３）操作 濃Ｗ６　？ａ　生物細胞５９、フェニルピルビン酸ナト
Ｊウム（１水塩）０．２ｍｏＬ　Ｌ−アスパラギン酸ア
ンモニウムＩ−６２５ｍｏＱを反応槽に充填し全量を０
、９７Ｑ（ｐｒ（８，０）とした。

反応槽の温度を３０’Ｃに設定し、撹拌を行うと同時に
？’？内の基質と微生物細胞をＵＦ膜の外側（シェル側
）を循環させた。

同時に、ＵＦ膜から濾液を０．！Ｍ／ｈの流速で抜き出
し、５°Ｃに設定した晶析槽に送り、晶析槽からのオー
バフロー液は濾過器を通して反応槽に戻した。

反応開始０．５時間後に反応槽に０．０２ｍｏ（のフェ
ニルピルビン酸ナトリウムを加え、以後０５時間間隔で
同量のフェニルピルビン酸ナトリウムを加えて行き、７
５時間で総ｆｆ１０．５ｍｏｆ！を仕込んだ。

２４時間で反応を停止したところ、反応液中のフェニル
ピルビン酸は完全に消失し、０．４８６ｍｏｆ２のし一
フェニルアラニンが生成していた。

生成したし一フェニルアラニンのうち５７％は固を目に
、残りの４３％か液相に存在していた。

この固相のＬ−フェニルアラニンを瘍刑し、その時得ら
れた母液と洗滌液（０，９８５１２）に新たに濃縮微生
物細胞５ｇとフェニルピルビン酸ナトリウムを加え（初
回０．０５ｍｏ（、以後は０．５時間毎に０．０２ｍｏ
ｆ！、総仕込ｆｆ１０．２５ｍｏの、ｐＨを８０として
２４時間反応させ、１回目の反応と同様に、蓄積したし
一フェニルアラニンの結晶を濾別した。この操作を合計
３回行った（フェニルピルビン酸の総仕込ｆｆｔ１．２
５ｍｏのところ、生成したＩ、−フェニルアラニンは１
．１８５ｍｏＱ（転換率９１１．５％）となり、このう
ち７６．５％が結晶として回収できた。

実施例２　トランスアミナーゼ活性を有するパラコツカ
ス・デニトリフィカンスＩＦ○１２４，４２によるフェ
ニルピルビン酸とＬ−アスパラキン酸からのし一フェニ
ルアラニンの生産 （１）装置 ホローファイバー型ＵＦ膜（アミコン社、Ｈｌｐｔｏ−
ｓ、透過面積０．０８３ｍ’、分画分子↑１０、　ＯＯ
Ｏ）と実効容積０．１７１２の外温付晶析槽とを第２図
の様式に従って連結して用いる。

（２）生体触媒 微生物細胞を次の如（調製した。

まず、グルコース１％、（ＮＨ４）２８　Ｐ　０４０．
２％、ミーストＮ（ビール酵母エキス）１％、コーンス
チーブリ力−１％、ペプトン０．５％、Ｋ　Ｈ２ＰＯ，
０，］％、Ｍｇ５Ｏ，・７８２０００５％、カラリン０
１０３％を含む培地５ρ（ｐＨ７，０）にパラコツカス
・デニトリフィカンス＋ｒＯ１２４４２の前培養液０．
０　！Ｍを植菌し、３０’Ｃて２４時間通気撹拌培養し
た。培養液に１％のセチルトリメチルアンモニウムブロ
マイドをＯ，Ｏ！Ｍ添加し、３０°Ｃで０．５時間放置
して微生物細胞の活性化を行った後、遠心分離によって
１／１５に濃縮し、濃縮微生物細胞を調製した。

（３）操作 この濃縮微生物細胞１６９に水を加えて全量を０．０３
１ｄとし、３０°Ｃに保温したＯＦ膜の外側空間部に充
填した。他方、晶析槽には、０．０６４　ｍｏ（２のフ
ェニルピルビン酸すトリウム（ｌ水塩）、０．２０４ｍ
ｏ（！のＬ−アスパラキン酸アンモニウム、２　×１０
−５ｍｏ（のピリドキサル５゛−リン酸（補酵素）を充
填し、水で全量を０．１６！Ｍとした。

晶析槽の温度を５°Ｃに設定し、０．０９ｆ２／ｈの循
環流速で濾液循環を行い反応を開始した。反応開始２，
３．および１２時時間−フェニルピルビン酸ナトリウム
をそれぞれ０．０３１ｍｏ（ずつ追加し、反応を続けた
ところ、２５．５時間後フェニルピルビン酸は完全にな
くなり、晶析槽にＬ−フェニルアラニンの結晶が蓄積し
た。

フェニルピルビン酸のし一フェニルアラニンへの転換率
は９２．４％で、そのうち６５．５％が固相に、そして
残りの３４，５％が液相に存在していた。

上記の実施例２で使用した生体触媒の固定化ＩＨ品を用
い、従来の晶析槽を備えた装置、およびカラムを用いる
連続系で以下の実験例に従って反応を行い、その結果を
比較した。

実験例１ （ａ）晶析槽を備えた装置を用いる方法実施例２−　（
２）で調製した濃縮微生物細胞をに一カラギーナンゲル
で包括した固定化パラコツカスデニトリフィカンスを用
いてＬ−フェニルアラニンのけん副反応を行った。

（１）装置 実施例２の装置におけるＵＦ膜に代えて、目皿式撹拌捨
型反応器（実効容積０．１３のと実効容積０、３２　Ｅ
Ｍの晶析槽を閉回路で連結（連結様式は第２図参照）し
たものを用いた。

（２）固定化生体触媒 固定化微生物細胞は次の如（調製した。

まず上記濃縮固定化微生物細胞８０ｇに生理食塩水を加
えて全量を０．１６ρとして４０°Ｃに保温した。

これと別にに一カラギーナン１２．５ｙを含んだ４５°
Ｃの溶液０１２０７ｔ２を用意し、両者を混合してＩＯ
’Ｃに冷却してゲル化した。

得られたゲルの塊を２％塩化カリウム溶液に浸せきし、
１０°Ｃ以下で一夜放置してから、平均粒径３ｍ／ｍφ
に成形し、成形品を２％塩化カリウム溶液で洗浄して標
品とした。

（３）操作 上記（２）で調製した標品５５９を反応槽に充填シ、同
時に晶析槽には０．１ｍｏ（！のフェニルピルビン酸ナ
トリウム、０．４５ｍｏＣのし一アスパラギン酸アンモ
ニウム、４．５　Ｘ　１０−５ｍｏＱビリドキサル５°
−リン酸を充填し、全量を０．３１５Ｑ（ｐＨ８，０）
とした。

反応槽の温度を３０’Ｃ１晶折槽の温度を５°Ｃに調節
して濾液を１．１６ｃ／ｈの流速で循環し反応を開始し
た。

反応開始５，５．３０．５．４７．５、および５５．５
時Ｆ’ｌ目にフェニルピルビン酸ナトリウムを０．０５
ｍｏＣずつ加えて反応を続けたところ、９５時間［］に
フェニルピルビン酸は完全になくなり、晶析槽にはＬ−
フェニルアラニンの結晶が蓄積した。

この場合、フェニルピルビン酸のし一フェニルアラニン
への転換率は７１．２％で、生成したＩ２−フェニルア
ラニンのうち、６５．３％か固相に、残りの３４．７％
力冒夜相に存在した。

（ｂ）連続系による方法 上記（ａ）−（２）で調製した固定化微生物細胞を用い
、連続系でＬ−フェニルアラニンの生産を行った。

（１）装置および操作 使用した反応器は直径３ｃｍφ、高さ２５ｃｍの外浴付
円筒カラムで、この中に固定化微生物細胞０゜０６８５
＆充填（充填率０．５８５）Ｌ、た。

カラムを３０’Ｃに制御し、その中ヘフェニルピルヒン
酸ナトリウム０．２５Ｍ、Ｌ−アスパラキン酸アンモニ
ウム０．３２５Ｍ、ピリドキサル５リン酸１０−’Ｍの
基質溶液（ｐｉ（８，０）をポンプによって連続的に供
給した。

流速か０．００７６り／ｈ（平均滞留時間９ｈ）の時、
カラム出口のフェニルピルビン酸の濃度はＯであり、Ｌ
−フェニルアラニンの濃度は０．１９７Ｍであった。こ
の値から、フェニルピルビン酸のしフェニルアラニンへ
の転換率は７８８％ト計算される。

以上の実施例２および実験例（ａ）および（ｂ）の反応
で実際に蓄積したし一フェニルアラニンの濃度と、微生
物細胞力たりのし一フェニルアラニンの生産性をまとめ
ると第１表の如くとなった。

実施例２　　０．７２１　　　　　３．５５Ｘ　１０−
’実験例（ａ）　　０．４７０　　　　　１．９７ｘ　
ｔｏ−’実験例（ｂ）　　０．１９７　　　　　１７２
Ｘ１０−’−ヒ記表より明らかな如く、本発明方法によ
れば従来の晶析槽を併置した固定化生体触媒反応器や、
カラム型反応器による生産法よりも、高濃度のしフェニ
ルアラニンを蓄積でき、生産性が向上される。

［発明の効果］ 上記の如く、本発明方法によれば、簡単な装置と操作に
より、生体触媒が高活性を保った状態で、高濃度の基質
の存在下、生成物を高濃度に製造し、蓄積させることか
できる。従って、基質および生体触媒を無駄なく利用し
、効率よく反応を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

装 第１図は本発明の実施例を示す置の概略ブロック図、第
２図は他の実施例を示す装置の概略ブローク図である。 図中、（１）は反応槽、（２）はＵＦ膜、（３）は晶析
槽、（４）は濾過器、（５）〜（７）はポンプ、（８）
および（９）は撹拌機、（１０）、（１０″）および（
１０”）は送液ライン。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、基質と生体触媒とを反応させて有用物質を製造する
   方法において、反応混合物を限外濾過膜に通して生成物
   に富む濾液を分離し、該濾液から生成物を析出、蓄積さ
   せることを特徴とする方法。 ２、限外濾過膜を併置する反応槽からなる反応部と、温
   度調節機構を備えた晶析槽に濾過器を併置してなる晶析
   部とで構成された装置を用い、反応混合物を反応槽から
   限外濾過膜に循環させて生成物に富む濾液を得、該濾液
   を生成物の析出温度に設定した晶析槽に送って生成物を
   析出させ、濾過器で分離した後、その母液を反応槽に循
   環させることからなる請求項１に記載の方法。 ３、生体触媒がトランスアミナーゼであり、基質がフェ
   ニルピルビン酸およびＬ−アスパラギン酸であり、生成
   物がＬ−フェニルアラニンである請求項１または２に記
   載の方法。 ４、反応槽および生体触媒を透過させない限外濾過膜か
   らなる反応部と、温度調節機構を有する晶析槽および濾
   過器からなる晶析部とを相互に連結してなることを特徴
   とする生体触媒反応用の装置。