【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔産業上の利用分野〕
本発明は、粉末カタラーゼの製法に関し、更に
詳しくはカタラーゼ含有溶液を凍結乾燥させて安
定な粉末カタラーゼを製造する方法に関する。
〔従来の技術〕
カタラーゼは過酸化水素を水と酸素とに分解す
る酵素で、一部の嫌気性菌を除き殆んど全ての生
物体に広く存在し、生体機能の維持にかかせない
重要な酵素の一つである。
カタラーゼは溶液状や粉末状の酵素製剤とし
て、臨床分析用、食品加工用或いはその他の過酸
化水素を分解する必要のある産業分野において利
用されている。
通常、カタラーゼは牛、豚、馬などの動物の臓
器例えば肝臓や赤血球などから抽出されるが、抽
出されたカタラーゼは非常に不安定で容易に失活
してしまう。そこで、従来はカタラーゼの抽出液
に安定剤としてアルコールや塩類等を添加してカ
タラーゼ含有溶液として提供されていた。しかし
ながら、用途上粉末状のカタラーゼ製剤が必要な
場合もある。
多くの酵素において粉末製剤として凍結乾燥製
剤が製造されているが、カタラーゼは凍結乾燥中
および凍結乾燥後の保管中に失活が著しく、その
ためカタラーゼの製剤化について凍結乾燥操作は
不適とされていた。この失活を防止するために、
糖類、グリセリン、無機塩類など種々の化合物を
安定剤として添加がなされてきたが十分な成果を
挙げるには至つていなかつた。
そこで特開昭58−101690号においては、凍結乾
燥ではなく、カタラーゼ活性を保有している乾燥
微生物細胞をカタラーゼ含有水溶液に浸漬させて
カタラーゼを捕集させた後これをアセトン乾燥さ
せて粉末化させる方法がとられている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
前記アセトン乾燥粉末も広く利用されるが、使
用されている乾燥微生物細胞が増殖力を残してお
り、この方法によつて得られたカタラーゼ粉末を
使用した場合には適当な処置をして細胞増殖を抑
えなければならなかつた。
これに対して、安定で保存性のよい凍結乾燥粉
末カタラーゼが得られたならば、上記の欠点がな
くなるばかりでなく、他の凍結乾燥可能な酵素や
その他の物質との配合物を凍結乾燥することがで
きるので利用価置が一層高まるものである。そこ
でカタラーゼの凍結乾燥粉末の製造が要望されて
いた。
しかしながら、溶液状態におけるカタラーゼの
安定化と、凍結乾燥時または凍結乾燥品としての
カタラーゼの安定化とは根本的に異なるところが
あつた。即ち、凍結乾燥時および製品では、真空
中での水の昇華に伴なう高次構造の変化、空気と
の接触による活性部位の酸化など溶液中ではおこ
り得ない原因がある。このため、カタラーゼを含
む凍結乾燥粉末の製造は困難であつた。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者等は、凍結乾燥時および凍結乾燥製品
の保管中のカタラーゼの失活を同時に防ぐ方法を
得るため、凍結乾燥処理前にカタラーゼの安定化
のための保護物質を加え、混合した後凍結乾燥処
理を行なうことを考え、保護物質について広く
様々な物について検討した結果、酵母菌体を存在
させるとカタラーゼが凍結乾燥に対して極めて安
定化させることを見出して本発明を完成した。
即ち、本発明は、カタラーゼ含有水溶液に酵母
の生菌体または死菌体を添加混合した後凍結乾燥
することを特徴とする粉末カタラーゼの製造法で
ある。
本発明の対象とするカタラーゼの起源は、動物
体、植物体、微生物体のいずれのものでもよく、
また使用される酵母はとくに限定はなく、通常は
入手し易いパン酵母、ール酵母、サケ酵母などが
使用される。使用菌体は生菌体でも死菌体でもよ
いが、生菌体では湿菌体であつても乾燥菌体であ
つても凍結乾燥後も増殖をする可能性が残るの
で、死菌体の方が好ましい。
本発明に使用されるカタラーゼ含有水溶液は、
動植物体または微生物体よりカタラーゼを抽出し
た粗抽出液であつてもよいし、また更に精製され
た分画であつてもよい。
本発明は、例えばカタラーゼ含有水溶液に酵母
菌体を添加し、撹拌等の方法で均一に分散した後
常法により凍結乾燥処理に付すという極めて容易
な操作で実施することができる。
〔実施例〕
次に参考例および実施例をあげて本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれによつて限定され
るものではない。
参考例 １
カタラーゼの抽出方法
豚の肝臓10Kgをサイレントカツターで細切り
し、水10を加えた後ホモジナイザーにかけた。
得られた懸濁液にアセトン９を加え、遠心分離
して上清28を採取した。次にこれに更にアセト
ン12を加え、遠心分離して沈澱を捕集した。こ
の沈澱を水7.5に分散させ、フイルタープレス
により過し、液７を得た。この液に更に
水を加えて全量を10とした後メンブレンフイル
ターを通過させて除菌し、これをカタラーゼ含有
水溶液とした。
この溶液中のカタラーゼの力価は、１分間に
1μモルの過酸化水素を分解する酵素力を１単位
とした場合85800U／mlであつた。
参考例 ２
生パン酵母および水添化ドライイースト（サツ
カロミセス・セレビシエ）のオートクレーブ処
理
１） 生パン酵母（三共フーヅ社製）１Kgに水
0.5を加えてよく混合した後121℃で40分間オ
ートクレーブ処理を行つた。処理後の酵母は全
て死滅し、カタラーゼ活性もなかつた。
２） ドライイースト（S.I.ルザツフル社製）
270ｇに水0.73を加えてよく混合して生イー
ストと同様の水分含量にした後更に水0.5を
加え、上記１）と同様にオートクレーブ処理し
た。処理後のイーストは全て死滅し、カタラー
ゼ活性もなかつた。
実施例 １
参考例１で得られたカタラーゼ含有水溶液１
に、下記Ａ、ＢおよびＣの物質を夫々添加したも
のと試験区Ａ、ＢおよびＣとし、別に無添加のも
のを対照区として凍結乾燥処理を行なつた。
Ａ：生パン酵母400ｇ
Ｂ：参考例２−１）で得られた死滅酵母600ｇ
（生パン酵母400ｇに相当）
Ｃ：参考例２−２）で得られた死滅ドライイー
スト600ｇ（同上）
凍結乾燥処理は次のようにして行なわれた。上
記各区の混合物を大きめのポリエチレン製の袋に
入れ、これを60×40（cm）のトレーの上で袋ごと
入れて平坦にならし、−35℃で予備凍結した。凍
結終了後袋の上部を切開して通気可能にし真空乾
燥機に入れ、棚温40℃、真空度１×10-1トルで真
空乾燥した。最終品温は40℃である。
凍結乾燥直後の夫々のカタラーゼ活性を基準に
して100％とし、その後の37℃における保存中の
活性の経時変化を測定した。その結果を表１に示
した。
[Industrial Application Field] The present invention relates to a method for producing powdered catalase, and more particularly to a method for producing stable powdered catalase by freeze-drying a catalase-containing solution. [Prior art] Catalase is an enzyme that decomposes hydrogen peroxide into water and oxygen, and is widely present in almost all living organisms, except for some anaerobic bacteria, and is essential for maintaining biological functions. It is one of the most important enzymes. Catalase is used as an enzyme preparation in solution or powder form for clinical analysis, food processing, and other industrial fields where it is necessary to decompose hydrogen peroxide. Usually, catalase is extracted from the organs of animals such as cows, pigs, and horses, such as the liver and red blood cells, but the extracted catalase is extremely unstable and easily deactivated. Therefore, in the past, alcohol, salts, etc. were added to the catalase extract as a stabilizer to provide a catalase-containing solution. However, there are cases where a powdered catalase preparation is necessary for the purpose of use. Freeze-dried formulations of many enzymes are manufactured as powder formulations, but catalase is significantly inactivated during freeze-drying and during storage after freeze-drying, so freeze-drying was considered inappropriate for preparing catalase formulations. . To prevent this deactivation,
Various compounds such as sugars, glycerin, and inorganic salts have been added as stabilizers, but no satisfactory results have been achieved. Therefore, in JP-A-58-101690, instead of freeze-drying, dried microbial cells that possess catalase activity are immersed in an aqueous catalase-containing solution to collect catalase, and then dried with acetone to form a powder. A method is being taken. [Problems to be Solved by the Invention] The acetone dry powder is also widely used, but the dried microbial cells used still have proliferative ability, and when the catalase powder obtained by this method is used. Therefore, it was necessary to take appropriate measures to suppress cell proliferation. On the other hand, if a stable and shelf-stable lyophilized powdered catalase were obtained, it would not only eliminate the above-mentioned disadvantages but also make it possible to lyophilize formulations with other lyophilizable enzymes and other substances. This makes it even more valuable. Therefore, there was a desire to produce a freeze-dried powder of catalase. However, there is a fundamental difference between the stabilization of catalase in a solution state and the stabilization of catalase during lyophilization or as a lyophilized product. That is, during freeze-drying and in products, there are causes that cannot occur in a solution, such as changes in higher-order structure due to sublimation of water in vacuum and oxidation of active sites due to contact with air. For this reason, it has been difficult to produce lyophilized powder containing catalase. [Means for Solving the Problems] In order to obtain a method for simultaneously preventing the deactivation of catalase during freeze-drying and during storage of the freeze-dried product, the present inventors have developed a method for stabilizing catalase before the freeze-drying process. After considering adding a protective substance and performing freeze-drying after mixing, we investigated a wide variety of protective substances and found that the presence of yeast cells makes catalase extremely stable against freeze-drying. They discovered this and completed the present invention. That is, the present invention is a method for producing powdered catalase, which comprises adding and mixing live or dead yeast cells to a catalase-containing aqueous solution, and then freeze-drying the mixture. Catalase, which is the object of the present invention, may originate from animals, plants, or microorganisms,
The yeast to be used is not particularly limited, and usually easily available baker's yeast, beer yeast, salmon yeast, etc. are used. The microorganisms used may be live or dead, but live microorganisms, whether wet or dry, have the potential to proliferate even after freeze-drying. is preferable. The catalase-containing aqueous solution used in the present invention is
It may be a crude extract obtained by extracting catalase from animals, plants or microorganisms, or it may be a further purified fraction. The present invention can be carried out by an extremely easy operation, for example, by adding yeast cells to a catalase-containing aqueous solution, uniformly dispersing the mixture by stirring, etc., and then subjecting it to freeze-drying by a conventional method. [Example] Next, the present invention will be specifically explained with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto. Reference Example 1 Catalase Extraction Method 10 kg of pig liver was cut into thin pieces using a silent cutter, 10 kg of water was added, and the mixture was placed in a homogenizer.
Acetone 9 was added to the resulting suspension and centrifuged to collect supernatant 28. Next, 12 ml of acetone was further added to this, and the mixture was centrifuged to collect the precipitate. This precipitate was dispersed in 7.5 liters of water and filtered through a filter press to obtain liquid 7. Water was further added to this solution to bring the total volume to 10, and the solution was passed through a membrane filter to eliminate bacteria, and this was used as a catalase-containing aqueous solution. The titer of catalase in this solution is
The enzyme power to decompose 1 μmol of hydrogen peroxide was 85,800 U/ml, defined as 1 unit. Reference example 2 Autoclave treatment of fresh baker's yeast and hydrogenated dry yeast (Satsucharomyces cerevisiae) 1) Add water to 1 kg of fresh baker's yeast (manufactured by Sankyo Foods Co., Ltd.)
After adding 0.5 and mixing well, autoclaving was performed at 121°C for 40 minutes. All yeasts after treatment died and there was no catalase activity. 2) Dry yeast (manufactured by SI Rzazful)
After adding 0.73 g of water to 270 g and mixing well to make the same moisture content as fresh yeast, 0.5 g of water was added and autoclaved in the same manner as in 1) above. After treatment, all the yeast died and there was no catalase activity. Example 1 Catalase-containing aqueous solution 1 obtained in Reference Example 1
The following substances A, B, and C were added to the test plots A, B, and C, and those without additives were used as a control group, and freeze-drying was performed. A: 400 g of fresh baker's yeast B: 600 g of killed yeast obtained in Reference Example 2-1) (equivalent to 400 g of fresh baker's yeast) C: 600 g of killed dry yeast obtained in Reference Example 2-2) (same as above) Freeze-drying The processing was performed as follows. The mixtures of each of the above groups were placed in a large polyethylene bag, placed on a 60 x 40 (cm) tray, flattened, and pre-frozen at -35°C. After freezing, the top of the bag was cut open to allow ventilation, and the bag was placed in a vacuum dryer and vacuum dried at a shelf temperature of 40°C and a vacuum level of 1 x 10 -1 torr. The final product temperature is 40℃. The activity of each catalase immediately after freeze-drying was set as 100%, and the change in activity over time during subsequent storage at 37°C was measured. The results are shown in Table 1.
【表】
上記の結果から明らかなように、酵母菌体を添
加して凍結乾燥することによつて保存中のカタラ
ーゼ活性の低下は顕著に抑制された。
また凍結乾燥処理中のカタラーゼの活性低下を
みるため、凍結乾燥前と凍結乾燥直後の活性を測
定した。その結果を表２に示した。なお凍結乾燥
前のカタラーゼ活性は、カタラーゼ含有水溶液の
力価で表わし、乾燥物の力価は乾燥品に水を加
え、乾燥前のカタラーゼ含有水溶液と同量になる
ように調整した。[Table] As is clear from the above results, the decrease in catalase activity during storage was significantly suppressed by adding yeast cells and freeze-drying. In addition, in order to examine the decrease in catalase activity during the freeze-drying process, the activity was measured before and immediately after freeze-drying. The results are shown in Table 2. The catalase activity before freeze-drying was expressed as the titer of the catalase-containing aqueous solution, and the titer of the dried product was adjusted by adding water to the dried product to be the same amount as the catalase-containing aqueous solution before drying.
〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕
カタラーゼ含有水溶液を凍結乾燥するに当り、
本発明のように酵母菌体を添加して凍結乾燥処理
を行なうと、凍結乾燥時におけるカタラーゼの失
活が抑制できるばかりでなく、長期の保存に対し
ても安定な凍結乾燥粉末を得ることができる。
When freeze-drying a catalase-containing aqueous solution,
When freeze-drying is performed by adding yeast cells as in the present invention, it is possible not only to suppress the deactivation of catalase during freeze-drying, but also to obtain a freeze-dried powder that is stable for long-term storage. can.