JPH0243479B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0243479B2 JPH0243479B2 JP58103317A JP10331783A JPH0243479B2 JP H0243479 B2 JPH0243479 B2 JP H0243479B2 JP 58103317 A JP58103317 A JP 58103317A JP 10331783 A JP10331783 A JP 10331783A JP H0243479 B2 JPH0243479 B2 JP H0243479B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chromogen
- bilirubin oxidase
- enzyme
- activity
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はビリルビンオキシダーゼの存在下縮合
反応せしめることを特徴とする縮合反応方法に関
する。詳しくは、色原体と発色剤とをビリルビン
オキシダーゼの存在下で縮合せしめることを特徴
とする縮合反応方法に関し、さらに詳しくは、色
原体と結合した酵素基質を用い、これに酵素を作
用せしめ遊離した色原体と発色剤とをビリルビン
オキシダーゼの存在下で縮合せしめることを特徴
とする縮合反応方法に関する。上記反応で生成し
た色素を定量することにつて特定の酵素活性の測
定が可能である。
反応せしめることを特徴とする縮合反応方法に関
する。詳しくは、色原体と発色剤とをビリルビン
オキシダーゼの存在下で縮合せしめることを特徴
とする縮合反応方法に関し、さらに詳しくは、色
原体と結合した酵素基質を用い、これに酵素を作
用せしめ遊離した色原体と発色剤とをビリルビン
オキシダーゼの存在下で縮合せしめることを特徴
とする縮合反応方法に関する。上記反応で生成し
た色素を定量することにつて特定の酵素活性の測
定が可能である。
生体液中の各種酵素の活性は種々の疾患によつ
て変動することが明らかになり、診断治療上の指
針として重要視されている。これら酵素活性の測
定のうちあるものは色原体と結合した酵素基質を
用い、これに酵素試料を作用せしめ遊離した色原
体と発色剤とを特定の存在下反応させて色素に導
き、これを比色定量する方法が採用されている。
例えば、ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定
は、酵素基質としてＬ−ロイシル−ｐ−ジエチル
アミノアニリドを用い、反応により遊離した色原
体ｐ−ジエチルアミノアニリンをアルカリ性下、
メタ過沃素酸ナトリウムを縮合剤として発色剤１
−ナフトール−２−スルホン酸カリウムと縮合さ
せ、生成した青色色素を比色定量することにより
測定される。しかし、従来の上記のような方法は
縮合反応が強アルカリ性または強酸性下で行われ
ること、縮合剤によつて酵素が失活することなど
により、酵素反応を行つた後に縮合反応を行わな
ければならないといつた不便があつた。
て変動することが明らかになり、診断治療上の指
針として重要視されている。これら酵素活性の測
定のうちあるものは色原体と結合した酵素基質を
用い、これに酵素試料を作用せしめ遊離した色原
体と発色剤とを特定の存在下反応させて色素に導
き、これを比色定量する方法が採用されている。
例えば、ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定
は、酵素基質としてＬ−ロイシル−ｐ−ジエチル
アミノアニリドを用い、反応により遊離した色原
体ｐ−ジエチルアミノアニリンをアルカリ性下、
メタ過沃素酸ナトリウムを縮合剤として発色剤１
−ナフトール−２−スルホン酸カリウムと縮合さ
せ、生成した青色色素を比色定量することにより
測定される。しかし、従来の上記のような方法は
縮合反応が強アルカリ性または強酸性下で行われ
ること、縮合剤によつて酵素が失活することなど
により、酵素反応を行つた後に縮合反応を行わな
ければならないといつた不便があつた。
本発明者らは各種酵素活性の測定法について鋭
意検討したところ、従来の縮合剤の代わりにビリ
ルビンオキシダーゼが有効であることを見いだ
し、本発明を完成した。本発明法によれば目的と
する酵素活性の測定反応と縮合反応を同時に行う
ことができ、初速度法（rate assay法）または終
点法（end point法）のいずれの方法でも測定が
可能となつた。
意検討したところ、従来の縮合剤の代わりにビリ
ルビンオキシダーゼが有効であることを見いだ
し、本発明を完成した。本発明法によれば目的と
する酵素活性の測定反応と縮合反応を同時に行う
ことができ、初速度法（rate assay法）または終
点法（end point法）のいずれの方法でも測定が
可能となつた。
本発明法において縮合剤として用いるビリルビ
ンオキシダーゼは、例えば特開昭57−159487号公
報および特願昭57−25613号に開示されているミ
ロセシウム（Myrothecium）属菌、またはコプ
リナス（Coprinus）属菌産生のビリルビンオキ
シダーゼが使用できる。ビリルビンオキシダーゼ
は血中の黄色色素であるビリルビンを酸化してビ
リベルジンに変える反応を触媒する酵素として知
られているが、縮合反応に有効であることは知ら
れていない。
ンオキシダーゼは、例えば特開昭57−159487号公
報および特願昭57−25613号に開示されているミ
ロセシウム（Myrothecium）属菌、またはコプ
リナス（Coprinus）属菌産生のビリルビンオキ
シダーゼが使用できる。ビリルビンオキシダーゼ
は血中の黄色色素であるビリルビンを酸化してビ
リベルジンに変える反応を触媒する酵素として知
られているが、縮合反応に有効であることは知ら
れていない。
本発明法によつて縮合を受ける物質の一方、即
ち色原体としてはｐ−ジエチルアミノアニリン、
ｐ−ニトロアニリン、ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルアミノアニリン、ｐ−ニトロフエノ
ール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、３−カルボキシ
−４−ニトロアニリン、３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリン、β−ナフチルアミン、フエノ
−ル、ｐ−クロルフエノール、５−アミノイソフ
タル酸などが例示され、他方発色剤としては４−
アミノアンチピリン、１−ナフトール−２−スル
ホン酸、ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒ
ド、キシレノール（ジメチルフエノぶル）などが
例示される。
ち色原体としてはｐ−ジエチルアミノアニリン、
ｐ−ニトロアニリン、ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルアミノアニリン、ｐ−ニトロフエノ
ール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、３−カルボキシ
−４−ニトロアニリン、３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリン、β−ナフチルアミン、フエノ
−ル、ｐ−クロルフエノール、５−アミノイソフ
タル酸などが例示され、他方発色剤としては４−
アミノアンチピリン、１−ナフトール−２−スル
ホン酸、ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒ
ド、キシレノール（ジメチルフエノぶル）などが
例示される。
本発明法を利用して測定される酵素活性は、例
えばアルカリ性ホスフアターゼ、酸性ホスフアタ
ーゼ、コリンエステラーゼ、ロイシンアミノペプ
チダーゼ、シスチンアミノペプチダーゼ、γ−グ
ルタルミルトランスペプチダーゼ、α−アミラー
ゼなどである。
えばアルカリ性ホスフアターゼ、酸性ホスフアタ
ーゼ、コリンエステラーゼ、ロイシンアミノペプ
チダーゼ、シスチンアミノペプチダーゼ、γ−グ
ルタルミルトランスペプチダーゼ、α−アミラー
ゼなどである。
具体的には、例えばロイシンアミノペプチダー
ゼ活性の測定にはＬ−ロイシル−β−ナフチルア
ミドを基質として遊離したβ−ナフチルアミンと
ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドを縮合さ
せる方法、またはＬ−ロイシル−ｐ−ジエチルア
ミノアニリドを基質として遊離したｐ−ジエチル
アミノアニリンと１−ナフトール−２−スルホン
酸カリウムを縮合させる方法が使用できる。
ゼ活性の測定にはＬ−ロイシル−β−ナフチルア
ミドを基質として遊離したβ−ナフチルアミンと
ｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドを縮合さ
せる方法、またはＬ−ロイシル−ｐ−ジエチルア
ミノアニリドを基質として遊離したｐ−ジエチル
アミノアニリンと１−ナフトール−２−スルホン
酸カリウムを縮合させる方法が使用できる。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性の測
定にはＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４
−ニトロアニリドを基質として遊離した３−カル
ボキシ−４−ニトロアニリンとキシレノールを縮
合させる方法、またはＬ−γ−グルタミル−ｐ−
ニトロアニリドを基質として遊離したｐ−ニトロ
アニリンとｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒ
ドを縮合させる方法が使用できる。
定にはＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４
−ニトロアニリドを基質として遊離した３−カル
ボキシ−４−ニトロアニリンとキシレノールを縮
合させる方法、またはＬ−γ−グルタミル−ｐ−
ニトロアニリドを基質として遊離したｐ−ニトロ
アニリンとｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒ
ドを縮合させる方法が使用できる。
アルカリ性ホスフアターゼまたは酸性ホスフア
ターゼ活性の測定にはフエニルリン酸を基質とし
て遊離したフエノールと４−アミノアンチピリン
を縮合させる方法が使用できる。
ターゼ活性の測定にはフエニルリン酸を基質とし
て遊離したフエノールと４−アミノアンチピリン
を縮合させる方法が使用できる。
コリンエステラーゼ活性の測定にはｐ−ヒドロ
キシベンゾイルコリンを基質として遊離したｐ−
ヒドロキシ安息香酸と４−アミノアンチピリンを
縮合させる方法が使用できる。
キシベンゾイルコリンを基質として遊離したｐ−
ヒドロキシ安息香酸と４−アミノアンチピリンを
縮合させる方法が使用できる。
本発明法により特定の酵素活性を測定するに
は、その酵素が触媒することができる色原体と結
合した前述のような酵素基質を用い、酵素基質、
色原体と縮合可能な発色剤、ビリルビンオキシダ
ーゼ、被測定酵素試料および必要に応じ緩衝液を
混合し一定温度で反応させる。反応により生じた
色素を比色またはその他の方法により定量するこ
とにより酵素活性が測定される。なお、発色剤を
結合せしめた酵素基質を使用し、しかるのち発色
剤と色原体を縮合させた酵素活性を測定すること
もできる。
は、その酵素が触媒することができる色原体と結
合した前述のような酵素基質を用い、酵素基質、
色原体と縮合可能な発色剤、ビリルビンオキシダ
ーゼ、被測定酵素試料および必要に応じ緩衝液を
混合し一定温度で反応させる。反応により生じた
色素を比色またはその他の方法により定量するこ
とにより酵素活性が測定される。なお、発色剤を
結合せしめた酵素基質を使用し、しかるのち発色
剤と色原体を縮合させた酵素活性を測定すること
もできる。
ビリルビンオキシダーゼの使用量は、反応液中
で約0.5〜50u／mlである。また、反応のPHは約
4.5〜10.5、温度は約20〜40℃の範囲であるが、
上記ビリルビンオキシダーゼまたはラツカーゼの
使用量並びに反応条件は、測定しようとする酵素
の反応条件に応じ適宜変化させることができる。
なおビリルビンオキシダーゼの活性は、フエノー
ルと４−アミノアンチピリンを基質としてPH7.0、
37℃で反応させたとき、１分間に505nmにおける
吸光度を0.01変化させる酵素量を１単位（ｕ）と
した。
で約0.5〜50u／mlである。また、反応のPHは約
4.5〜10.5、温度は約20〜40℃の範囲であるが、
上記ビリルビンオキシダーゼまたはラツカーゼの
使用量並びに反応条件は、測定しようとする酵素
の反応条件に応じ適宜変化させることができる。
なおビリルビンオキシダーゼの活性は、フエノー
ルと４−アミノアンチピリンを基質としてPH7.0、
37℃で反応させたとき、１分間に505nmにおける
吸光度を0.01変化させる酵素量を１単位（ｕ）と
した。
以下実施例により本発明を具体的に説明する。
実施例 １
1.0mML−ロイシル−ｐ−ジエチルアミノアニ
リド、0.5mM1−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムおよび10.0u／mlビリルビンオキシダーゼ
を含む、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）1.0mlと
155u／mlのロイシンアミノペプチダーゼ活性を
含む標準血清（コンセーラ：日水製薬社商標）０
〜80μの各容量を混合して、37℃で反応し
670nmにおける吸光度の増加を測定した（吸光度
は反応液1.02ml当りに補正した）。１分間当りの
吸光度の増加とロイシンアミノペプチダーゼ活性
の関係（検量線）は直線的であつた（図示に示
ず）。
リド、0.5mM1−ナフトール−２−スルホン酸カ
リウムおよび10.0u／mlビリルビンオキシダーゼ
を含む、0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）1.0mlと
155u／mlのロイシンアミノペプチダーゼ活性を
含む標準血清（コンセーラ：日水製薬社商標）０
〜80μの各容量を混合して、37℃で反応し
670nmにおける吸光度の増加を測定した（吸光度
は反応液1.02ml当りに補正した）。１分間当りの
吸光度の増加とロイシンアミノペプチダーゼ活性
の関係（検量線）は直線的であつた（図示に示
ず）。
上記標準血清の代わりに血清試料20μを用い
同様に操作し、得られた吸光度を上記検量線と対
比したところ、ロイシンアミノペプチダーゼ活性
は320u／mlであつた。
同様に操作し、得られた吸光度を上記検量線と対
比したところ、ロイシンアミノペプチダーゼ活性
は320u／mlであつた。
実施例 ２
2.0mML−γ−グルタミル−３−カルボキシ−
４−ヒドロキシアニリド、10.0mMグルシルグリ
シン、7.0mMキシレノールおよび10.0u／mlビリ
ルビンオキシダーゼを含む0.1Mトリス塩酸緩衝
液（PH8.45）3.0mlと血清試料50μを混合して、
37℃、５分間反応し、635nmにおける吸光度の増
加を測定した。得られた吸光度とあらかじめ標準
血清を用いて作成した検量線とを対比してγ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ活性を求めたとこ
ろ、195IU／であつた。
４−ヒドロキシアニリド、10.0mMグルシルグリ
シン、7.0mMキシレノールおよび10.0u／mlビリ
ルビンオキシダーゼを含む0.1Mトリス塩酸緩衝
液（PH8.45）3.0mlと血清試料50μを混合して、
37℃、５分間反応し、635nmにおける吸光度の増
加を測定した。得られた吸光度とあらかじめ標準
血清を用いて作成した検量線とを対比してγ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼ活性を求めたとこ
ろ、195IU／であつた。
実施例 ３
1.0mMフエニルリン酸−２−ナトリウム、
0.4mM4−アミノアンチピリンおよび10.0u／mlビ
リルビンオキシダーゼを含む0.1M炭酸塩緩衝液
（PH10.3）3.0mlと血清試料100μを混合して、37
℃で５分間反応し505nmにおける吸光度の増加を
測定した。得られた吸光度とあらかじめ標準血清
を用いて作成した検量線とを対比してアルカリ性
ホスフアターゼ活性を求めたところ、100.2ミリ
ｕ／mlであつた。
0.4mM4−アミノアンチピリンおよび10.0u／mlビ
リルビンオキシダーゼを含む0.1M炭酸塩緩衝液
（PH10.3）3.0mlと血清試料100μを混合して、37
℃で５分間反応し505nmにおける吸光度の増加を
測定した。得られた吸光度とあらかじめ標準血清
を用いて作成した検量線とを対比してアルカリ性
ホスフアターゼ活性を求めたところ、100.2ミリ
ｕ／mlであつた。
実施例 ４
2.0mMフエニルテトラマルトシド、0.4mM4−
アミノアンチピリン、α−グルコシダーゼ
10.0u／mlおよび0.0u／mlビリルビンオキシダー
ゼを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）3.0mlと血清
試料20μを混合して、37℃で５分間反応し
505nmにおける吸光度の増加を測定した。得られ
た吸光度とあらかじめ標準血清を用いて作成した
検量線とを対比してα−アミラーゼ活性を求めた
ところ、250u／dlであつた。
アミノアンチピリン、α−グルコシダーゼ
10.0u／mlおよび0.0u／mlビリルビンオキシダー
ゼを含む0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）3.0mlと血清
試料20μを混合して、37℃で５分間反応し
505nmにおける吸光度の増加を測定した。得られ
た吸光度とあらかじめ標準血清を用いて作成した
検量線とを対比してα−アミラーゼ活性を求めた
ところ、250u／dlであつた。
図面は本発明法によるロイシンアミノペプチダ
ーゼ活性測定の検量線を表す図である。
ーゼ活性測定の検量線を表す図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ビリルビンオキシダーゼの存在下、一般式
（）で表わされる色原体とビリルビンオキシダ
ーゼによつて該色原体と酸化縮合して色素を形成
する発色剤とを反応せしめることを特徴とする縮
合反応方法。 （ただし式中、R1は水酸基又はアミノ基を示し、
R2、R3、R4、R5又はR6は水素原子、ハロゲン原
子、ニトロ基、置換アミノ基、水酸基又はカルボ
キシル基を示し、R4とR5は環を形成する基でも
よい。） ２ 一般式（）で表わされる色原体が酵素反応
により基質より遊離されたものである特許請求の
範囲第１項記載の縮合反応方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10331783A JPS59227300A (ja) | 1983-06-09 | 1983-06-09 | 縮合反応方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10331783A JPS59227300A (ja) | 1983-06-09 | 1983-06-09 | 縮合反応方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59227300A JPS59227300A (ja) | 1984-12-20 |
| JPH0243479B2 true JPH0243479B2 (ja) | 1990-09-28 |
Family
ID=14350819
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10331783A Granted JPS59227300A (ja) | 1983-06-09 | 1983-06-09 | 縮合反応方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59227300A (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5963198A (ja) * | 1982-10-01 | 1984-04-10 | Toyo Jozo Co Ltd | 酵素を用いる定量法 |
-
1983
- 1983-06-09 JP JP10331783A patent/JPS59227300A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59227300A (ja) | 1984-12-20 |
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