JPH0244320B2 - - Google Patents
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- JPH0244320B2 JPH0244320B2 JP57021905A JP2190582A JPH0244320B2 JP H0244320 B2 JPH0244320 B2 JP H0244320B2 JP 57021905 A JP57021905 A JP 57021905A JP 2190582 A JP2190582 A JP 2190582A JP H0244320 B2 JPH0244320 B2 JP H0244320B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- interferon
- solution
- human
- precipitate
- crude
- Prior art date
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- Expired - Lifetime
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト起原性のα−インターフエロンを
工業的規模において収率よくかつ簡易な操作で精
製・回収するα−インターフエロンの製法に関す
る。 インターフエロンはウイルスその他の物質の刺
激によりヒトを含む動物細胞から産出されるある
種の糖蛋白質である。このものはウイルスや細菌
又は原虫の細胞内増殖を阻止する機能をもつてい
るが、この機能は動物種に特異的であることか
ら、医薬としてヒトに用いる場合はヒトの細胞か
ら産生されたインターフエロンを得る必要があ
る。ヒトのインターフエロンを大量に得るために
は、ヒトリンパ球、ヒト繊維芽細胞又はヒト株化
リンパ芽球等を大量に集め、これらの細胞に適当
な刺激を与えてインターフエロンを産生させ、産
生されたインターフエロンを収率よく回収しなけ
ればならない。しかし従来の回収法は複雑な操作
と長い時間を要しており、工業的規模で行うには
不適なだけでなく、収率も低いという欠点があつ
た。 インターフエロンを精製、回収する先行技術と
しては、ヨードイオンあるいはチオシアン酸イオ
ンを遊離させる水溶性の塩を用いる分画法（特公
昭43−16061号）、弱酸性および弱塩基性イオン交
換体を用いるカラムクロマトグラフイーとゲル
過を組み合わせた精製法（特公昭51−34442号）、
強酸性陽イオン交換体による分画法（特開昭54−
89011号）、および多孔性ガラスビーズによる精製
法（特開昭52−145516号）等が知られている。 本発明はチオシアン酸塩を用いる分画法を改良
したもので、特に、公知の方法における回収率の
低さ（50％以下）に着目し、この問題点を解決す
ることによつて本発明を完成した。すなわち従来
のチオシアン酸塩分画法は夾雑物を沈澱させ、こ
の沈澱を除去することによつてインターフエロン
を精製しているが、インターフエロンの分別効果
が十分でなく、インターフエロンが沈澱中へ混入
するので、回収率が低かつた。又チオシアン酸塩
をインターフエロンの沈澱剤として高濃度に用い
た場合にも、生成した沈澱からのインターフエロ
ンの抽出回収が困難であるため十分な結果が得ら
れなかつた。 本発明はヒト起原性α−インターフエロン（以
下、「α−インターフエロン」を単に「インター
フエロン」とも言う）を含有する粗インターフエ
ロン液をチオシアン酸塩によつて分画するに際
し、チオシアン酸塩を添加して長時間にわたり低
温下に保持し、生成した沈澱を分取し、これに60
〜100％のエタノール溶液を混合してインターフ
エロンを抽出するのである。 本発明においてヒト起原性インターフエロンを
含有する粗インターフエロン液とは、たとえばヒ
ト由来細胞からインターフエロンを誘発・産生さ
せて得られるもののほか、硫安分画法、イオン交
換吸着法、ベントナイト吸着法等を用いて粗イン
ターフエロン液を部分精製したものをいう。 ヒト由来細胞からインターフエロンを誘発・産
生させて粗インターフエロン液を得るには、公知
のインターフエロン産生法〔シンポジア シリー
ズ イン イムノ バイオロジカル スタンダー
デイゼーシヨン（Symposia Series in Immuno
Bielogical Standardization）第14巻、17〜23
頁、1970年〕を使用する。ヒト由来細胞も白血
球、リンパ球、腹腔、肺、脾の細胞のような網内
系細胞、培養ヒトリンパ芽球様細胞等あらゆる公
知のインターフエロン産生細胞を利用できるが、
好ましいものは産生能等の点からヒト白血球およ
び培養ヒトリンパ芽球様細胞であり、培養ヒトリ
ンパ芽球様細胞としては特にナマルバ株が好まし
い（J.Clim.Microbiol.1、116〜117、1974年）。
なお粗インターフエロン液として遺伝子工学の手
法によりヒト由来のインターフエロン遺伝子を大
腸菌に投入し、培養後その大腸菌が生産するイン
ターフエロンを精製する際に得られる粗インター
フエロン液を用いてもよい。また細胞融合の技術
によりヒト由来のインターフエロン産生細胞と温
血動物由来細胞を融合し、培養後その融合細胞が
生産するインターフエロンを精製する際に得られ
る粗インターフエロン液を用いてもよい。 本発明は粗インターフエロン液を過した後、
その液にチオシアン酸塩を最終濃度が約0.1〜
5.0Mになるように添加する。添加後、溶液のPH
を酸性側（PH２〜６）に調整し、２〜10℃の低温
で20〜30時間保持する。次に生成してくるインタ
ーフエロンを含む沈澱を遠心分離により回収し、
この沈澱にエタノール溶液を混合して抽出操作を
行なう。 エタノール溶液は水や有機溶媒を混合して60〜
100％濃度に調整したものを用いる。有機溶媒は
たとえばアセトンを用い、エタノールとアセトン
の混合比を１：0.1〜0.6にする。エタノール溶液
の添加量はチオシアン酸塩による分画前の粗イン
ターフエロン液の１／７〜１／２容量である。抽
出操作時の温度は０〜−30℃である。抽出を終つ
たエタノール溶液は３〜10℃で10〜60分間遠心分
離（2000〜10000rpm）を行ない、生じた沈澱を
除去して上清を回収する。 得られたインターフエロン含有の上清は要すれ
ば公知のイオン交換吸着法、ゲル過法あるいは
チオシアン酸塩による沈澱分画法等を行なつて高
度精製する。又PHを変えて分画してもよい。この
ようにして得た精製インターフエロンは安定剤を
添加したのち、医薬品製造の常法に従つて脱塩透
折、除菌過、分注したのち、凍結乾燥を行なつ
て乾燥製剤とする。 本発明はチオシアン酸塩を用いる分画法である
から、硫安分画法に比較して透折等の工程が簡略
となり、工業的規模の製法として好適である。本
発明によるとき得られたインターフエロンの比活
性は粗インターフエロン液に対して５〜100倍に
上昇しており、粗インターフエロン液からの回収
率はほぼ100％あり、これは従来の50％以下の値
からみて驚くべき回収率である。 本発明を実施例によつて詳細に説明するが、本
発明はこの実施例に限定されるものではない。ま
た実施例においてインターフエロンの活性値とし
て示した国際単位（IU）は、プラツク半減法あ
るいはCPE抑制法により国際ヒトインターフエ
ロン標準品MRC69／19を対照として求めたもの
である（最新医学、第29巻、第４号、660頁、
1974年）。 実施例 １ 粗インターフエロン液５を塩酸にてPH２に調
整し、２日間４℃に放置してインデユーサとして
用いたセンダイウイルスを不活化し、この粗イン
ターフエロン液を遠心分離して上清を集める。集
めた上清を5Nの水酸化ナトリウムによりPH３に
調整し、これにチオシアン酸カリウムを終濃度
0.4Mになるように添加して撹拌し、４℃にて一
夜保存して沈澱を生成させる。次に溶液を４℃で
40分間遠心分離（4000rpm）して沈澱を分取し、
この沈澱にエタノールとアセトンを９：１に混合
したエタノール溶液１を加えて溶解させ、再び
４℃で40分間遠心分離（4000rpm）して沈澱を除
去し、上清を回収する。 この上清を予め0.1Mの酢酸緩衝液（PH３）で
平衡化したSP−セフアデツクス−25（フアルマシ
ア社製）により、イオン交換カラムクロマトグラ
フイーを行ない、吸着したインターフエロンを
0.1Mのリン酸２ナトリウム液（PH８）で溶出す
る。溶出液をガラスフイルターに通して液を集
め、塩酸で液のPHを7.4に調整したのち、室温
で30分間遠心分離（10000rpm）を行なう。続い
て0.15Mのリン酸加生理食塩水（PH7.4）で平衡
化したセフアデツクスＧ−100（フアルマシア社
製）のカラム（直径1.5cm×高さ60cm）を用い、
溶出液の遠心上清を3.8ml／時の流速で流下させ
てゲル過を行ない、精製インターフエロン画分
を得る。 その比活性は2.55×107IU／mg蛋白、回収率は
89％、精製度は950倍であつた。 実施例 ２ 粗インターフエロン液50に終濃度0.5Mにな
るようにチオシアン酸カリウムを添加し、PH3.8
に調整した後、４℃で一夜保存して沈澱を生成さ
せる。次に４℃で30分間遠心分離（3000rpm）し
て沈澱を分取し、この沈澱に94％エタノール溶液
を加え溶解させ、再び４℃で30分間遠心分離
（3000rpm）して沈澱を除去し、上清10を回収
する。 この上清に含まれる精製インターフエロン画分
の比活性は7.5×104IU／mg蛋白、回収率は100％、
精製度は10倍であつた。 実験例 比活性2.5×104IU／mg蛋白の粗インターフエロ
ン液を用い、チオシアン酸カリウム沈澱からイン
ターフエロンを抽出する溶媒の適性を比較した。 抽出処理は実施例２に準じて行ない、94％エタ
ノール溶液のほか種々の抽出溶媒を用いてインタ
ーフエロンを抽出し、その精製度と回収率を調べ
た。その結果を第１表に示す。この実験結果から
エタノール溶液はインターフエロンの抽出に特異
的に有効であることが判る。 【表】
工業的規模において収率よくかつ簡易な操作で精
製・回収するα−インターフエロンの製法に関す
る。 インターフエロンはウイルスその他の物質の刺
激によりヒトを含む動物細胞から産出されるある
種の糖蛋白質である。このものはウイルスや細菌
又は原虫の細胞内増殖を阻止する機能をもつてい
るが、この機能は動物種に特異的であることか
ら、医薬としてヒトに用いる場合はヒトの細胞か
ら産生されたインターフエロンを得る必要があ
る。ヒトのインターフエロンを大量に得るために
は、ヒトリンパ球、ヒト繊維芽細胞又はヒト株化
リンパ芽球等を大量に集め、これらの細胞に適当
な刺激を与えてインターフエロンを産生させ、産
生されたインターフエロンを収率よく回収しなけ
ればならない。しかし従来の回収法は複雑な操作
と長い時間を要しており、工業的規模で行うには
不適なだけでなく、収率も低いという欠点があつ
た。 インターフエロンを精製、回収する先行技術と
しては、ヨードイオンあるいはチオシアン酸イオ
ンを遊離させる水溶性の塩を用いる分画法（特公
昭43−16061号）、弱酸性および弱塩基性イオン交
換体を用いるカラムクロマトグラフイーとゲル
過を組み合わせた精製法（特公昭51−34442号）、
強酸性陽イオン交換体による分画法（特開昭54−
89011号）、および多孔性ガラスビーズによる精製
法（特開昭52−145516号）等が知られている。 本発明はチオシアン酸塩を用いる分画法を改良
したもので、特に、公知の方法における回収率の
低さ（50％以下）に着目し、この問題点を解決す
ることによつて本発明を完成した。すなわち従来
のチオシアン酸塩分画法は夾雑物を沈澱させ、こ
の沈澱を除去することによつてインターフエロン
を精製しているが、インターフエロンの分別効果
が十分でなく、インターフエロンが沈澱中へ混入
するので、回収率が低かつた。又チオシアン酸塩
をインターフエロンの沈澱剤として高濃度に用い
た場合にも、生成した沈澱からのインターフエロ
ンの抽出回収が困難であるため十分な結果が得ら
れなかつた。 本発明はヒト起原性α−インターフエロン（以
下、「α−インターフエロン」を単に「インター
フエロン」とも言う）を含有する粗インターフエ
ロン液をチオシアン酸塩によつて分画するに際
し、チオシアン酸塩を添加して長時間にわたり低
温下に保持し、生成した沈澱を分取し、これに60
〜100％のエタノール溶液を混合してインターフ
エロンを抽出するのである。 本発明においてヒト起原性インターフエロンを
含有する粗インターフエロン液とは、たとえばヒ
ト由来細胞からインターフエロンを誘発・産生さ
せて得られるもののほか、硫安分画法、イオン交
換吸着法、ベントナイト吸着法等を用いて粗イン
ターフエロン液を部分精製したものをいう。 ヒト由来細胞からインターフエロンを誘発・産
生させて粗インターフエロン液を得るには、公知
のインターフエロン産生法〔シンポジア シリー
ズ イン イムノ バイオロジカル スタンダー
デイゼーシヨン（Symposia Series in Immuno
Bielogical Standardization）第14巻、17〜23
頁、1970年〕を使用する。ヒト由来細胞も白血
球、リンパ球、腹腔、肺、脾の細胞のような網内
系細胞、培養ヒトリンパ芽球様細胞等あらゆる公
知のインターフエロン産生細胞を利用できるが、
好ましいものは産生能等の点からヒト白血球およ
び培養ヒトリンパ芽球様細胞であり、培養ヒトリ
ンパ芽球様細胞としては特にナマルバ株が好まし
い（J.Clim.Microbiol.1、116〜117、1974年）。
なお粗インターフエロン液として遺伝子工学の手
法によりヒト由来のインターフエロン遺伝子を大
腸菌に投入し、培養後その大腸菌が生産するイン
ターフエロンを精製する際に得られる粗インター
フエロン液を用いてもよい。また細胞融合の技術
によりヒト由来のインターフエロン産生細胞と温
血動物由来細胞を融合し、培養後その融合細胞が
生産するインターフエロンを精製する際に得られ
る粗インターフエロン液を用いてもよい。 本発明は粗インターフエロン液を過した後、
その液にチオシアン酸塩を最終濃度が約0.1〜
5.0Mになるように添加する。添加後、溶液のPH
を酸性側（PH２〜６）に調整し、２〜10℃の低温
で20〜30時間保持する。次に生成してくるインタ
ーフエロンを含む沈澱を遠心分離により回収し、
この沈澱にエタノール溶液を混合して抽出操作を
行なう。 エタノール溶液は水や有機溶媒を混合して60〜
100％濃度に調整したものを用いる。有機溶媒は
たとえばアセトンを用い、エタノールとアセトン
の混合比を１：0.1〜0.6にする。エタノール溶液
の添加量はチオシアン酸塩による分画前の粗イン
ターフエロン液の１／７〜１／２容量である。抽
出操作時の温度は０〜−30℃である。抽出を終つ
たエタノール溶液は３〜10℃で10〜60分間遠心分
離（2000〜10000rpm）を行ない、生じた沈澱を
除去して上清を回収する。 得られたインターフエロン含有の上清は要すれ
ば公知のイオン交換吸着法、ゲル過法あるいは
チオシアン酸塩による沈澱分画法等を行なつて高
度精製する。又PHを変えて分画してもよい。この
ようにして得た精製インターフエロンは安定剤を
添加したのち、医薬品製造の常法に従つて脱塩透
折、除菌過、分注したのち、凍結乾燥を行なつ
て乾燥製剤とする。 本発明はチオシアン酸塩を用いる分画法である
から、硫安分画法に比較して透折等の工程が簡略
となり、工業的規模の製法として好適である。本
発明によるとき得られたインターフエロンの比活
性は粗インターフエロン液に対して５〜100倍に
上昇しており、粗インターフエロン液からの回収
率はほぼ100％あり、これは従来の50％以下の値
からみて驚くべき回収率である。 本発明を実施例によつて詳細に説明するが、本
発明はこの実施例に限定されるものではない。ま
た実施例においてインターフエロンの活性値とし
て示した国際単位（IU）は、プラツク半減法あ
るいはCPE抑制法により国際ヒトインターフエ
ロン標準品MRC69／19を対照として求めたもの
である（最新医学、第29巻、第４号、660頁、
1974年）。 実施例 １ 粗インターフエロン液５を塩酸にてPH２に調
整し、２日間４℃に放置してインデユーサとして
用いたセンダイウイルスを不活化し、この粗イン
ターフエロン液を遠心分離して上清を集める。集
めた上清を5Nの水酸化ナトリウムによりPH３に
調整し、これにチオシアン酸カリウムを終濃度
0.4Mになるように添加して撹拌し、４℃にて一
夜保存して沈澱を生成させる。次に溶液を４℃で
40分間遠心分離（4000rpm）して沈澱を分取し、
この沈澱にエタノールとアセトンを９：１に混合
したエタノール溶液１を加えて溶解させ、再び
４℃で40分間遠心分離（4000rpm）して沈澱を除
去し、上清を回収する。 この上清を予め0.1Mの酢酸緩衝液（PH３）で
平衡化したSP−セフアデツクス−25（フアルマシ
ア社製）により、イオン交換カラムクロマトグラ
フイーを行ない、吸着したインターフエロンを
0.1Mのリン酸２ナトリウム液（PH８）で溶出す
る。溶出液をガラスフイルターに通して液を集
め、塩酸で液のPHを7.4に調整したのち、室温
で30分間遠心分離（10000rpm）を行なう。続い
て0.15Mのリン酸加生理食塩水（PH7.4）で平衡
化したセフアデツクスＧ−100（フアルマシア社
製）のカラム（直径1.5cm×高さ60cm）を用い、
溶出液の遠心上清を3.8ml／時の流速で流下させ
てゲル過を行ない、精製インターフエロン画分
を得る。 その比活性は2.55×107IU／mg蛋白、回収率は
89％、精製度は950倍であつた。 実施例 ２ 粗インターフエロン液50に終濃度0.5Mにな
るようにチオシアン酸カリウムを添加し、PH3.8
に調整した後、４℃で一夜保存して沈澱を生成さ
せる。次に４℃で30分間遠心分離（3000rpm）し
て沈澱を分取し、この沈澱に94％エタノール溶液
を加え溶解させ、再び４℃で30分間遠心分離
（3000rpm）して沈澱を除去し、上清10を回収
する。 この上清に含まれる精製インターフエロン画分
の比活性は7.5×104IU／mg蛋白、回収率は100％、
精製度は10倍であつた。 実験例 比活性2.5×104IU／mg蛋白の粗インターフエロ
ン液を用い、チオシアン酸カリウム沈澱からイン
ターフエロンを抽出する溶媒の適性を比較した。 抽出処理は実施例２に準じて行ない、94％エタ
ノール溶液のほか種々の抽出溶媒を用いてインタ
ーフエロンを抽出し、その精製度と回収率を調べ
た。その結果を第１表に示す。この実験結果から
エタノール溶液はインターフエロンの抽出に特異
的に有効であることが判る。 【表】
Claims (1)
- １ ヒト起原性α−インターフエロンを含有する
粗α−インターフエロン液にチオシアン酸塩を添
加し、長時間にわたり低温下に保持し、生成した
沈澱を分取し、これに60〜100％エタノール溶液
を混合してα−インターフエロンを抽出すること
を特徴とするα−インターフエロンの製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57021905A JPS58140093A (ja) | 1982-02-13 | 1982-02-13 | α―インターフエロンの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57021905A JPS58140093A (ja) | 1982-02-13 | 1982-02-13 | α―インターフエロンの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58140093A JPS58140093A (ja) | 1983-08-19 |
| JPH0244320B2 true JPH0244320B2 (ja) | 1990-10-03 |
Family
ID=12068112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57021905A Granted JPS58140093A (ja) | 1982-02-13 | 1982-02-13 | α―インターフエロンの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58140093A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07211450A (ja) * | 1993-09-18 | 1995-08-11 | Daewoo Electron Co Ltd | 電子レンジ用マグネトロンのノイズ遮蔽装置 |
-
1982
- 1982-02-13 JP JP57021905A patent/JPS58140093A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07211450A (ja) * | 1993-09-18 | 1995-08-11 | Daewoo Electron Co Ltd | 電子レンジ用マグネトロンのノイズ遮蔽装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58140093A (ja) | 1983-08-19 |
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