JPH0244517B2 - - Google Patents

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JPH0244517B2
JPH0244517B2 JP62048995A JP4899587A JPH0244517B2 JP H0244517 B2 JPH0244517 B2 JP H0244517B2 JP 62048995 A JP62048995 A JP 62048995A JP 4899587 A JP4899587 A JP 4899587A JP H0244517 B2 JPH0244517 B2 JP H0244517B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規色原体であるヒドロキシベンゾ
（イソ）チアゾール及びヒドロキシベンゾピラゾ
ールのアミノ酸エステル及びペプチドエステルを
用いたエステル分解／又は蛋白分解酵素の検出試
薬に関する。本発明の検出試薬は、特に尿中の白
血球の検出に好適に使用される。 体液、特に尿中の白血球の検出は、腎臓及び尿
生触路の病気の診断に極めて重要である。この検
出は、元来、非遠心分離尿又は尿沈積物中の白血
球を計数することによつて実施された。両方の方
法において、完全な白血球だけを記録することが
できる。しかしながら、白血球分解速度が尿媒体
に応じて広範に変動することは公知である。例え
ば、強アルカリ性尿中では、白血球の半減期はわ
ずか60分である。このことは、測定される白血球
数が低すぎることを意味する。この溶解誤差を別
にして、遠心分離していない均質化尿中の白血球
の定量的顕微鏡測定は、計数室中で極めて正確な
数値を与える。それにもかかわらず、この方法は
煩雑で、時間がかかり、熟練者を要するので、実
際にはほとんど使用されていない。 従つて、医療実務において、尿中の白血球の好
ましい測定方法は、尿沈積物のいわゆる視野法で
あつた。この方法には、まず、試料（沈積物）を
遠心分離によつて得なければならない。しかし、
尿の他の成分もそれによつて濃縮され、他の成
分、例えば塩及び上皮細胞が白血球の顕微鏡計数
を著しく困難にする。沈積物含有量の変動、不均
一な沈積物及び光学的設計の異なる顕微鏡によ
り、白血球数に比較的大きい誤差（数百％まで）
が生じた。 これらの困難を回避するには、白血球は広い酵
素スペクトルを有するので、種々の体液中の白血
球の検出原理として、酵素反応を使用する試みが
既になされていた。 例えば、体液中の白血球の検出試薬は西ドイツ
特許出願公開第28 26 965号及び同第28 36 644号
公報から公知であり、これらの公報では、白血球
中に存在するエステル分解及び／又は蛋白分解活
性が分析に利用されている。スルホンフタレイン
エステル又はアゾ色素エステル、白血球エステラ
ーゼ及び／又はプロテアーゼ用基質として使用さ
れている。酵素反応において放出される色素を次
に、公知方法で測定する。しかしながら、これら
の公報に記載されている試薬は、白血球濃度が低
い場合に、反応時間が長すぎるので、なお実用す
るには鋭敏でない。 プロテアーゼ及びエステラーゼを検出する種々
の方法は、組織化学的及び細胞化学的酵素学から
も知られている［例えば、ピアース（A.G.E.
Pearse）著、ヒストケミストリイ、セオレテイ
カル・アンド・アプライド（Histochemishry、
Tkeoretical and Applied）、第３版、チヤーチ
ル・リビングストーン（Churchill Livingstone）
発行、エデインバラーロンドン−ニユーヨーク、
1968年参照］。一般に、無色又はわずかに着色し
たエステルを検出に使用するが、これらは酵素に
よつて無色の酸と同様に無色のアルコール（フエ
ノール）成分に分解される。次に、フエノール成
分をその後の反応で、例えばジアゾニウム塩とカ
ツプリングさせるか、又は酸化によつて無色の生
成物に変える。例えば、エフ・シユマルツ（F.
Schmalzl）及びエイチ・ブラウンシユタイナー
（H.Braunsteiner）は、クリン・ヴシユル（Klin.
Wschr.）第46巻、642頁（1968年）に基質として
ナフトール−AS−Ｄ−クロロアセテート及び遊
離されるナフトールと共に着色アゾ化合物を形成
するジアゾニウム塩を用いる特殊な細胞化学的白
血球エステラーゼ検出法を記載している。 しかし、この種の２成分系は、極めて感度が低
い（白血球5000／μを含む試料でも、まだ、反
応しない）ので、体液、例えば尿中での白血球の
迅速かつ簡単な検出には不適当であることが判つ
た。 英国特許第Ａ−1128371号及びヨーロツパ特許
第Ａ−12957号は、体液中の加水分解酵素を検出
するため色原体基質としてインドキシル及びチオ
インドキシルエステルを使用することを記載して
いる。基質が酵素分解されると遊離インドオキシ
ルが形成され、これをその後、酸化して、容易に
検出しうる青色色素インジゴにする。ヨーロツパ
特許第Ａ−12957号に基づく市販の試験手段は、
Ｎ−トシル−Ｌ−アラニンＬ−インドキシルエス
テルを含浸した紙ストリップから成る。試験ス
トリツプを白血球を含む尿試験中に浸漬すると、
ストリツプは青色に変わる。しかしながら、最終
的呈色を達成し、試験を評価できるようになるま
での長い待ち時間が、この製品の顕著な欠点であ
る。 ヨーロツパ特許第Ａ−14929号は、酵素分解反
応のため種々の促進剤（ピリジン誘導体、イミダ
ゾール誘導体、アルコール類、金属錯体）につい
て記載している。しかしながら、インドキシルが
完全に酸化されるまでに比較的長い時間を要し、
試験感度が低いこと（検出限界：数千白血球／μ
）が、なお欠点である。同じことは、ヨーロツ
パ特許第Ａ−34323号により白血球酵素の基質と
してロイコーインドアニリンのエステルを使用す
る場合にも当てはまる。 ヨーロツパ特許第Ａ−39880号明細書はヨーロ
ツパ特許第Ａ−12957号及び同第14929号による基
質と、前記のジアゾニウム塩とカツプリングさせ
る検出原理との組み合わせを提供している。この
方法で白血球の検出限界を著しく低減することが
できるが、実際に使用するのに望まれる15〜20白
血球／μの検出感度はまだ達成されない。 従つて、本発明の目的は、高い検出感度と白血
球酵素による迅速な分解及びジアゾニウム塩との
迅速かつ強い呈色反応と合わせもつ、エステル分
解酵素の新規色原体基質を見いだすことであつ
た。この目的は、本発明によるエステルによつて
達成される。 本発明は、一般式（）： ［式中X1は窒素又は硫黄を表し；X2は窒素を表
し；R1、R2及びR3は水素を表し；Ａはグリシン、
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フ
エニルアラニン、チロシン及びリジンから選ばれ
るアミノ酸基又は該アミノ酸２〜８個からなるペ
プチド基を表し；Ｇは水素又はアルキル−、アリ
ール−及びアルアルキル−オキシカルボニル基、
アルキル−及びアルアルキル−オキシチオカルボ
ニル基、アルキル−、アリール−及びアルアルキ
ル−スルホニルもしくは−スルフエニル基、ビニ
ルオキシカルボニル基、シクロヘキセニルオキシ
カルボニル基、ホスホリル基並びにカルバミル基
から選ばれる窒素保護基を表す］の化合物を色原
体酵素基質として用いるエステル分解及び／又は
蛋白分解酵素の検出試薬に関する。 前記化合物（）は、一般式（）： ［式中X1、X2、R1、R2及びR3は前記のものを表
す］のフエノールを一般式（）： Ｇ−Ａ−OH （） ［式中Ｇ及びＡは前記のものを表す］のアミノ酸
若しくはペプチド又はその適当な反応性誘導体と
ペプチド化学に常用の方法で反応させることによ
り製造することができる。 適当な反応性誘導体は、酸ハライド及びペプチ
ド合成に常用の混成無水物、例えばクロロギ酸エ
チルとの無水物、又は活性エステル、例えばペン
タクロロフエニルエステル又はＮ−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールエステルである。 本発明は、(a)色原体酵素基質、(b)ジアゾニウム
塩、必要に応じて(c)緩衝剤及び必要に応じて(d)担
当及び／又は常用の添加剤を含むエステル分解剤
及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬において、色
原体酵素基質が前記化合物（）であることを特
徴とするエステル分解及び／又は蛋白分解酵素の
検出試薬に関する。 試料を本発明による試薬と接触させ、起こつた
呈色反応を測定することにより液体試料、殊に体
液中のエステル分解及び／又は蛋白分解酵素を検
出することができる。 本発明において、一般式（）の好ましい化合
物は、X1が硫黄を表す化合物である。 基Ｇ−Ａ−Ｏ−が一般式（）の化合物におい
て５位に存在するのが好ましい。 最後に、Ｇ−Ａ−は、一般式（）： ［式中R4は水素、又は場合により分岐したアル
キル基、シクロアルキル基、アルアルキル基を表
し、これらの基は１〜15個、好ましくは１〜９個
の炭素原子を有し、場合により１個又は２個、特
に１個のヒドロキシル基、メルカプト基、カルボ
キシル基、アミノ基又はグアニド基で置換されて
おり、R5は水素又は好ましくは−COO−アルキ
ル基、−COO−アルアルキル基、−COO−アリー
ル基、−SO2−アルキル基又は−SO2−アリール
基を表し、アルキル基は１〜９個の炭素原子、好
ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分
枝鎖の基であり、アリール基は好ましくは６〜12
個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子を含
み、場合により炭素原子数１〜４のアルコキシ基
はハロゲンで置換されている］の基を表すものが
好ましい。 Ｇ−Ａ−は、特に好ましくは、天然に存在する
アミノ酸又はこのような酸２〜８個のペプチド
の、前記窒素保護基を有する基を表す。 アミノ酸基は、そのＬ−又はＤ−形又はそのラ
セミ形で存在しうる。特に好ましい基は、グリシ
ン、アラニン、バリン、リジン、ロイシン、イソ
ロイシン、フエニルアラニン及びチロシンの基で
あり、それぞれの場合にＬ−形が特に好ましい。
存在する遊離ヒドロキシル基をアシル化、好まし
くはアセチル化することができる。 Ａの定義におけるペプチド基は、例えばジ−、
トリ−、テトラ−及びペンタ−ペプチド、好まし
くはジ−及びトリペプチドを表す。 一般式（）のフエノール類は、自体公知であ
るか、又は公知方法で製造される。 一般式（）のフエノール類の製造方法は、例
えば下記の参照文献に記載されている。フランケ
（Franke）ら著、アルツナイミツテル−フオルシ
ユング（Arzneimittel−Forschung）第30巻（11
頁）1831〜1838年；ドイツ特許第Ａ−2704793号
公報、デイビーズ（Davies）、ソク（Soc.）
1955、2412；クラーク（Clarke）ら著、縮合し
たイソチアゾール類（Condensed Isothiazoles）
第７部、ジエイ・ケム・レス・シノプ（J.Chem.
Res.、Synop.）（第６巻）197頁（1980年）及び
ヒドロキシインダゾール・イン・ザ・ケミストリ
イ・オブ・ヘテロサイクリツク・コンパウンズ
（Hydroxyindazole in The Chemistry of
Heterocyclic Compounds）第22巻336〜340頁、
アール・エイチ・ウイリイ（R.H.Wiley）編。 本発明による化合物は、一般式（）のフエノ
ール類及び一般式（）のアミノ酸若しくはペプ
チド又はそれらの反応性誘導体（特に酸ハライド
又は活性エステル）から、ペプチド化学から自体
公知の合成方法によつて製造することができる。
この種の方法は、例えば、下記の刊行物（及び本
明細書に引用する文献）、即ち、ジヤノツフ
（Janoff）ら著、プロク・ソク・イクスペル・ビ
オル・メド（Proc.Soc.Exper.Biol.Med.）第136
巻、1045〜1049頁（1971年）；スイートマン
（Sweetman）ら著、ジエイ・ヒスト・ソク（J.
Hist.Soc.）第22巻327〜339頁；ヤクプケ
（Jakubke）ら著、ケム・ベル（Chem.Ber.）
100、2267〜2372頁（1967年）及び特に、フーベ
ン−ワイル（Houben−Weyl）著、メトーデン・
デル・オルガニツシエル・ヘミー（Methoden
der organischen Chemie）、第XV／１巻及び
／２巻に記載されている。 本発明による、エステル分解及び／又は蛋白分
解酵素の検出用試薬は、前記化合物（）の他
に、一般式（）： ［式中R′1は低級アルキル基、低級アルコキシ基、
低級アルキルメルカプト基、ヒドロキシ基、ニト
ロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、炭素原
子数１〜８のアルキルスルホンアミド基、アリー
ルスルホンアミド基、炭素原子数１〜８のアルキ
ルスルホン基、アリールスルホン基、スルホン酸
又はカルボン酸、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオモ
ルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、場合により
N′−アルキル化Ｎ−ピペラジノ基又はＮ−ピペ
リジノ基、ハロゲン又は水素を表し、R′3は低級
アルキル基、低級アルコキシ基、アリールオキシ
基、低級アルキルメルカプト基、アルキルアミノ
基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシル基、ニト
ロ基、シアノ基、炭素原子数１〜８のアルキルス
ルホンアミド基、アリールホンアミド基、炭素原
子数１〜８のアルキルスルホン基、アリールスル
ホン基、スルホン酸又はカルボン酸、Ｎ−モルホ
リノ酸、Ｎ−チオモルホリノ基又はＮ−ピロリジ
ノ基、場合によりN′−アルキル化N′−ピペラジ
ノ基又はＮ−ピペリジノ基又はフエニルアミノ
基、場合により低級アルキル基若しくは低級アル
コキシ基で置換されたフエニル基、ハロゲン又は
水素を表し、R′2、R′4及びR′5は、同一又は異な
り、それぞれ低級アルキル基、低級アルコキシ
基、ニトロ基、炭素原子数１〜８のアルキルスル
ホンアミド基、アリールスルホンアミド基、炭素
原子数１〜８のアルキルスルホン基、アリールス
ルホン基、スルホン酸基又はカルボン酸基又は低
級アルキルメルカプト基、ハロゲン又は水素を表
し、Ｘは安定化陰イオンを表し、それぞれの場合
に２個の隣接する基R1〜R5が閉環して、場合に
よりハロゲン、炭素原子数１〜６のアルキル基、
炭素原子数１〜６のアルコキシ基又はニトロ基、
スルホン酸基又はカルボン酸基で置換されたベン
ゼン環を形成することができ、ナフタリン系のジ
アゾニウム塩を形成する］のジアゾニウム塩を含
む。 一般式（）において、好ましくは、R′1は炭
素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜４
のアルコキシ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、ハ
ロゲン又は水素を表し、R′3は炭素原子数１〜４
のアルキル基、炭素原子数１〜４のアルコキシ
基、アリールオキシ基、炭素原子数１〜４のアル
キルアミノ基、炭素原子数１〜４のジアルキルア
ミノ基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のアルキル
スルホンアミド基、アリールスルホンアミド基、
炭素原子数１〜４のアルキルスルホン基、アリー
ルスルホン基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−ピロリジ
ノ基、フエニルアミノ基又はスルホン酸基又は水
素を表し、R′2、R′4及びR′5は同一又は異なり、
炭素原子数１〜４のアルキル基、炭素原子数１〜
４のアルコキシ基、炭素原子数１〜４のアルキル
アミノ基、炭素原子数１〜４のジアルキルアミノ
基、ニトロ基、炭素原子数１〜４のアルキルスル
ホンアミド基、アリールスルホンアミド基又はス
ルホン酸基、ハロゲン又は水素を表す。 それぞれの場合に、２個の隣接する基R′1〜R′5
は閉環して、ベンゼン環を形成することができ、
これは場合によりハロゲン又は炭素原子数１〜４
のアルキル基又は炭素原子数１〜４のアルコキシ
基又はニトロ基又はスルホン酸基で置換されてい
てもよい。 一般式（）において、アリール基はそれぞれ
６〜12個の炭素原子、好ましくは６個の炭素原子
を含む芳香族基を表し、場合によりハロゲン又は
炭素原子数１〜４個のアルキル基又は炭素原子数
１〜４のアルコキシ基で置換されている。 一般式（）のジアゾニウム塩は、自体公知で
あるか又は自体公知の方法によつて製造すること
ができる［フーベン−ワイル（Houben−Weyl）
著、メソツド・オブ・オーガニツク・ケミストリ
ー（Methods of Organic Chemisry）、第Ｘ／
３巻参照］。 本発明による試薬は、検出すべき酵素による色
原体基質（）の分解を促進する物質を含むのが
好ましい。可能な、このような促進剤は、例えば
ヨーロツパ特許第Ａ−14929号に記載されている
化合物であり、炭素原子数８〜25、好ましくは炭
素原子数10〜20の脂肪族アルコール（場合により
不飽和であつてもよい）が好ましい。このような
好ましい促進剤は、例えばｎ−デカノール、ｎ−
デカノール及び特にｎ−ウンデカノールである。
特に好ましい促進剤は、塩基性アミノ酸を含むホ
モポリアミノ酸又はコポリアミノ酸［イー・カチ
アルスキイ（E.Katchalski）著、アドバンシイ
ズ・オブ・プロテイン・ケミストリイ
（Advances of Protein Chemistry）第13巻、
243〜493頁（1958年）；及びシー・ビー・アンフ
インゼン（C.B.Anfinsen）、エム・エル・アンソ
ン（M.L.Anson）、ジエイ・テイ・エドサル（J.
T.Edsall）及びケイ・バイリイ（K.Bailey）（編
集者）；アカデミツク・プレス・インコーポレイ
デツド（Academic Press. Inc.）：ニユーヨーク
州ニユーヨーク市発行］及び逐次ポリアミノ酸で
ある。可能な塩基性アミノ酸は、側鎖にアミノ基
又はグアニド基を有するアミノ酸である。これら
は特に、リジン及びオルニチン、並びにアルギニ
ン、及び更に天然に存在しない塩基性アミノ酸、
例えばジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸又は
ジアミノピメリン酸である。構成アミノ酸は、ポ
リアミ酸中にラセミ形又は光学活性Ｄ−又はＬ−
形で存在することができる。ポリアミ酸の分子量
（数平均）は1000〜2000000であり、好ましくは
5000〜500000である。塩基性アミノ酸の含有率
は、５〜100モル％、好ましくは20〜100モル％で
ある。 促進剤は、下記の試験具を製造する際の含浸液
の0.5〜10重量％、好ましくは１〜５重量％の量
で使用するのが好ましい。 蛋白分解酵素及び特に白血球酵素の検出用の本
発明の試薬は、適当な緩衝剤系を含むのが好まし
い。この目的で可能な系は、例えば燐酸塩、硼酸
塩、炭酸塩／重炭酸塩、炭酸塩、バルビツール酸
塩、トリース（ヒドロキシメチル）−アミノメタ
ン（＝トリス）、２−アミノ−２−メチル−プロ
パン−１，３−ジオール（＝アメジオール）又は
アミノ酸緩衝剤であり、PH値及び容量は原則とし
て測定溶液又は試薬ストリツプにおいてPH値が６
〜10、好ましくは７〜９になるように選択する。 本発明の試薬は、自体公知の洗浄剤を含んでい
てよい。なぜならば、これにより一層均質な色素
分布及び一層強い呈色が達成されるからである。
可能な洗浄剤は陽イオン性及び陰イオン性洗浄
剤、並びに両性及び非イオン性洗浄剤である。こ
れらの洗浄剤としては、例えば、ベンジル−ジメ
チル−テトラデシルアンモニウムクロリド、ドデ
シル硫酸ナトリウム、ゼフイロール、ポリビニル
ピロリドン、活性剤として前記のポリアミノ酸、
ヘパリノイド及びこれらの化合物の混合物が挙げ
られる。 本発明の試薬において、前記の試薬を自体公知
の不活性担体に組み込むのが好ましく、特に好ま
しい担体マトリツクスは多孔性物質、例えば特に
紙、及びプラスチツク製膜、ガラス繊維マツト
（米国特許第3846247号明細書）、多孔性セラミツ
クストリツプ、合成不織布、スポンジ状物質（米
国特許第3552928号明細書）、フエルト、繊維、木
材、セルロース又はシリカゲルである。 この目的で、前記の担体を、容易に除去しうる
適当な溶剤、例えば、水、メタノール、エタノー
ル、アセトン、ジメチルホルムアミド又はジメチ
ルスルホキシド中の前記試薬の溶薬で含浸する。
これは２つの別工程で行うのが好ましい。即ち、
まず、材料を緩衝剤及び他の水溶性添加剤を含む
水溶液で含浸する。次いで、これを一般式（）
の色原体酵素基質及び活性剤の溶液で含浸する。
しかしながら、含浸を別の順序で又は組成の異な
る２種の含浸溶液を用いて実施することもでき
る。含浸溶液又は試験すべき液体が前記化合物
（）及びジアゾニウム塩を10-4〜10-1モル／、
特に10-3〜10-2の濃度で含むのが好ましい。 紙をマトリツクスとして使用する場合には、
完成試験紙をそのまま使用するか、又は自体公知
の方法で把手に接着させるか、又は好ましくは、
例えば西ドイツ特許出願公開第2118455号公報に
よりプラスチツクと微細なメツシユ網との間に封
入することができる。 フイルムを被覆した試験ストリツプを製造する
ため、好ましくはすべての試薬をフイルム形成物
質、例えばポリビニルエステル又はポリアミドの
溶液又は分散液中に入れ、均質に混合する。この
混合物をプラスチツク製担体上に薄い層を形成す
るようにブラシで塗布し、乾燥する。乾燥後、こ
うして製造したフイルムを被覆した試験ストリツ
プを切断し、そのまま使用するか、又は自体公知
の方法で把手に接着させるか、又は例えば西ドイ
ツ特許出願公開第２ 118 455号公報によりプラ
スチツクと微細なメツシユ網との間に封入するこ
とができる。 エステル分解及び／又は蛋白分解酵素、特に白
血球腰素を検出するための本発明の診断剤は、試
験試薬の前記成分に常用の薬品添加剤を添加し、
混合物を造粒することによつて粉末混合物又は試
薬錠剤の形で製造することができる。この種の添
加剤は、例えば炭水化物（例えば単糖類、オリゴ
糖若しくは多糖類）、又は糖アルコール（例えば
マンニツト、ソルビツト若しくはキシリツト）、
又は他の可溶性不活性化合物、例えばポリエチレ
ングリコール若しくはポリビニルピロリドンであ
る。粉末混合物又は試薬錠剤は、例えば、約50〜
200mg、好ましくは50〜80mgの最終重量を有する。 それぞれの場合に、約５〜20mg、好ましくは約
10mgの合計重量を有する凍結乾燥物を製造するに
は、試験に必要なすべての試薬の他に、常用の構
造形成剤、例えばポリビニルピロリドン及び必要
に応じて他の充填剤、例えばマンニツト、ソルビ
ツト若しくはキシリツトを含む溶液を凍結乾燥す
る。 溶液の形の本発明の診断剤は、試験に必要なす
べての試薬を含むのが好ましい。可能な溶剤は、
水及び水と水溶性有機溶剤、例えばメタノール、
エタノール、アセトン若しくはジメチルホルムア
ミドとの混合物である。貯蔵上の理由では、試験
に必要な試薬を２以上の溶液に分割し、これを実
際の試験の間に一緒にするのが有利である。 こうして製造した診断剤は、試験すべき体液中
に浸漬するか又は試験すべき体液に添加した後、
エステル分解及び／又は蛋白分解酵素、特に白血
球酵素の存在を、発色により迅速かつ簡単に検出
することができ、その発色は肉眼又は分光光度計
で、例えば反射測光法で、すなわち、キユベツト
中で測定することができる。一細胞当たりの白血
球酵素の活性はほぼ一定のパラメータと見なされ
るので、試験する体液の白血球濃度を発色の強度
から測定することができる。これにより、本発明
の診断剤を用いて完全な白血球及び溶解した白血
球を記録する。なぜならば白血球酵素の活性は、
白血球の溶解後でも完全に保持されるからであ
る。従つて、溶解現象による誤差は生じない。 下記の実施例は本発明を説明するためのもので
ある。特に断らない限り、量は重量部又は重量％
を表すものとする。 合成例 １ Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルエステルの製造 このエステルは、それぞれの場合に、例えばＮ
−トシル−Ｌ−アラニルクロリドを無水メチルエ
チルケトン又は無水トルエン中で粉末炭酸カリウ
ムの存在下でフエノール類と反応させることによ
つて製造した。約55℃で６〜12時間撹拌した後、
40〜70％のフエノールが反応していた。フエノー
ル：K2CO3：酸クロリドのモル比は、通常１：
1.5：1.5であつた。PH値は、全反応期間を通じて
約７であつた。後処理のため炭酸カリウムを50℃
で去し、次に溶剤を真空中で蒸発させた。生成
物をシリカゲル−溶離剤（例えば石油エーテル：
アセトン＝約９：１）を用いてカラムクロマトグ
ラフイーし、その後、再結晶させることによつて
精製した。 ｐ−トシル−Ｌ−アラニン 文献：イー・フイツシヤー（E.Fischer）及び
ダブリユー・リツプシツツ（W.Lipschitz）著、
ビイ（B.）第48巻、362頁（1915年） Ｌ−アラニン83.7ｇ（0.93モル）を約2Nの水酸
化ナトリウム溶液465mlに溶かす。この溶液にｐ
−トルエンスルホニルクロリド186ｇ（0.976モ
ル）を70〜72℃で20分かけて少量ずつ添加する。
スルホニルクロリドの添加の間、自動滴定装置を
用いて約2Nの水酸化ナトリウム溶液で反応混合
物をPH10に保持する。ここにおいて、2N水酸化
ナトリウム溶液560mlが消費される。反応混合物
のPHがもはや変化しなくなつたら、混合物を15〜
５℃に冷却し、37℃強度の塩酸でPH３にする。分
離した生成物を吸引過し、湿つたフイルターケ
ーキを水2350mlから再結晶させる。 収量：融点132〜135℃のＬ−ｐ−トシルアラニ
ン185.5ｇ（理論量の82％）。 ｐ−トシル−Ｌ−アラニルクロリド ｐ−トシル−Ｌ−アラニン158.1ｇ（0.65モル）
を40℃の塩化チオニル350mlで、澄明な溶液が形
成するまで、撹拌する。過剰の塩化チオニルを水
流ポンプの真空下に溜去する。フラスコ内の残渣
したトルエン300mlに取る。得られる澄明で、わ
ずかに黄色の溶液を撹拌したリグロイン900ml中
に注ぐ。酸クロリドが沈澱する。翌日、吸引過
し、軽質ガソリンで洗浄し、真空デシケータ中で
塩化カルシウム／水酸化カリウム上で乾燥した。 収量：融点81〜83℃のほとんど無色の結晶155
ｇ（理論量の91％）。 ５−［Ｎ−トルエン−4″−スルホニル）−Ｌ−ア
ラニルオキシ］−１，２−ベンゾイソチアゾー
ル ５−ヒドロキシ−１，２−ベンゾイソチアゾー
ル3.02ｇを無水メチルエチルケトン150ml中で無
水K2CO33ｇと共に撹拌しながら55℃に加温す
る。合計６ｇのＮ−トシル−アラニルクロリドを
55℃で６時間かけて、充分撹拌しながら少量ずつ
添加する。混合物をその後、更に２時間55℃で撹
拌する。冷却後、K2CO3を去し、次いで溶剤
を回転蒸発器で蒸発させる。粗製生成物をシリカ
ゲルカラムで高速液体クロマトグラフイーによつ
て精製した。溶離剤：ヘキサン：塩化メチレン：
ｎ−ブタノール＝40：８：１。所望の生成物の検
出：254nｍでのUV。３×100mgの適用量に対し
て、合計100mgの５−［Ｎ−（トルエン−4″−スル
ホニル）−Ｌ−アラニルオキシ］−１，２−ベンゾ
イソチアゾールが単離された。 ５−［Ｎ−（トルエン−4″−スルホニル）−Ｌ−
アラニルオキシ］−イソダゾール ５−ヒドロキシ−インダゾール0.6ｇを40℃で
無水ピリジン1.2ｇと一緒に無水塩化メチレン50
mlに取る。無水塩化メチレン25ml中に溶解したＮ
−トシル−Ｌ−アラニルクロリド1.5ｇを40℃で
３時間かけて滴加する。その後、混合物を40℃で
更に２時間撹拌する。冷却後、塩化メチレン溶液
を、２％クエン酸を毎回100ml用いて３回洗浄す
る。塩化メチレン相を硫酸ナトリウムで乾燥し、
乾燥剤を去した後、室温で真空中で蒸発させ
る。こうして得た残渣をシリカゲル上でカラムク
ロマトグラフイーによつて精製する。溶離剤：石
油エーテル：アセトン６：４。溶剤を所望のフラ
クシヨンから蒸発させた後、0.4ｇの［Ｎ−（トル
エン−4″−スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ］−
イソダゾールが得られる。 同様の方法で、一般式（）の対応するヒドロ
キシベンゾイソチアゾール及びヒドロキシインダ
ゾールを特定のＮ−保護アミノ酸又は反応性アミ
ノ酸誘導体と反応させることによつて下記の基質
が得られる：４−［Ｎ−（トルエン−4″−スルホニ
ル）−Ｌ−アラニルオキシ］−１，２−ベンゾイソ
チアゾール、４−［Ｎ−（トルエン−4″−スルホニ
ル）−Ｌ−バリルオキシ］−１，２−ベンゾイソチ
アゾール、５−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）
Ｌ−アラニルオキシ］−１，２−ベンゾイソチア
ゾール、６−［Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−
Ｌ−アラニルオキシ］−インダゾール、５−［Ｎ−
メチルスルホニル−Ｌ−リジルオキシ］−インダ
ゾール、４−［Ｎ−（4″−メトキシベンゼンスルホ
ニル）−Ｌ−アラニルオキシ］−インダゾール、５
−［Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｏ−アセチ
ル−Ｌ−チロシルオキシ］−２，１−ベンゾイソ
チアゾール、５−［Ｎ−ベンゼンスルホニル−Ｌ
−フエニルアラニルオキシ］−１，２−ベンゾイ
ソチアゾール及び６−［Ｎ−ベンジルオキシカル
ボニル−Ｌ−バリルオキシ］−インダゾール。 実施例 １ 紙［例えばイートン・アンド・ダイクマン
（Eaton and Dikeman）205］を下記の溶液で順
次含浸し、次いで60℃で乾燥する。 溶液１ 0.1モルのトリスー（ヒドロキシメチル）−アミ
ノメタン緩衝液（PH8.4）、３％のポリビニルピロ
リドン及び2.5％のポリ−Ｌ−アルギニン． 溶剤：水 溶液２ 7.5×10-3モル／の５−［Ｎ−（トルエン−
4″−スルホニル）Ｌ−アラニルオキシ］−１，２
−ベンゾイソチアゾール及び１×10-2モル／の
２，４−ジメトキシ−ベンゼンジアゾニウムテト
ラヒドロフルオボレート． 溶剤：無水アセトン 淡黄色試験紙が得られ、この紙は白血球を含
む尿中に浸漬したときに赤褐色に変色する。 実施例 ２ ５−［Ｎ−（トルエン−4″−スルホニル）−Ｌ−
アラニルオキシ］−１，２−ベンゾイソチアゾー
ル５mg、２，４−ジメトキシ−ベンゼンジアゾニ
ウムテトラヒドロフルオボレート５mg、燐酸二水
素カリウム４mg、燐酸水素二ナトリウム２水和物
80mg、ポリーＬ−リジン６mg及びマンニツト110
mgを含む錠剤を、白血球を含む尿５mlと混合す
る。尿試料は、赤褐色に変色する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ (a)色原体酵素基質、(b)ジアゾニウム塩、必要
    に応じて(c)緩衝剤及び必要に応じて(d)担体及び／
    又は常用の添加剤を含むエステル分解及び／又は
    蛋白分解酵素の検出試薬において、色原体酵素基
    質が 一般式： ［式中X1は窒素又は硫黄を表し；X2は窒素を表
    し；R1、R2及びR3は水素を表し；Ａはグリシン、
    アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フ
    エニルアラニン、チロシン及びリジンから選ばれ
    るアミノ酸基又は該アミノ酸２〜８個からなるペ
    プチド基を表し；Ｇは水素又はアルキル−、アリ
    ール−及びアルアルキル−オキシカルボニル基、
    アルキル−及びアルアルキル−オキシチオカルボ
    ニル基、アルキル−、アリール−及びアルアルキ
    ル−スルホニルもしくは−スルフエニル基、ビニ
    ルオキシカルボニル基、シクロヘキセニルオキシ
    カルボニル基、ホスホリル基並びにカルバミル基
    から選ばれる窒素保護基を表す］の化合物の少な
    くとも一つであることを特徴とするエステル分解
    及び／又は蛋白分解酵素の検出試薬。 ２ 一般式におけるX1が硫黄を表す特許請求の
    範囲第１項記載の検出試薬。 ３ 一般式におけるエステル基が５位に存在する
    特許請求の範囲第１項又は第２項記載の検出試
    薬。
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