JPH0550276B2 - - Google Patents
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- JPH0550276B2 JPH0550276B2 JP60069244A JP6924485A JPH0550276B2 JP H0550276 B2 JPH0550276 B2 JP H0550276B2 JP 60069244 A JP60069244 A JP 60069244A JP 6924485 A JP6924485 A JP 6924485A JP H0550276 B2 JPH0550276 B2 JP H0550276B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、例えば体液中のエステル分解およ
び／またはタンパク質分解酵素の分析検出用試剤
に関し、エステルは適当な方法で試験試剤、特に
試験片に組み込まれている。本発明の試剤は、酵
素の発色性基質（適当なフエノール類のアミノ酸
エステルまたはペプチドエステル）および適切な
場合はフエノール類とカツプリングして色を生ず
るジアゾニウム塩以外に、アミノ酸エステルまた
はペプチドエステルの酵素的分解の促進剤として
ウンデカノールをも含んでいる。この試剤は白血
球、特に尿中の白血球の検出に好適に用いられ
る。 体液、特に尿中の白血球の検出は、腎臓および
尿・生殖管の病気の診断に大変重要である。この
検出は元来、遠心分離していない尿または遠心分
離後の尿沈渣中の白血球を数えて行うが、この二
つの方法では損われない白血球だけが記録され
る。所が白血球の溶解速度は尿の媒質によつて大
幅な変動を受け易く、従つて例えば、強アルカリ
性の尿中では、白血球の半減期は僅か60分である
ことが知られている。このことは測定した白血球
数が少な過ぎることを意味する。この溶解誤差は
さておいて、遠心分離していない均質化された尿
中の白血球の顕微鏡による定量的測定に従えば、
血球計算板に正確な値が得られる。しかしながら
この方法は面倒で時間がかかり、訓練された係員
が必要なので、実際上まれに用いられるだけであ
る。 従つて、医学的に実施される尿中の白血球の好
ましい測定法は、いわゆる尿沈渣についての視野
法であつた。そのためには遠心分離によつて先ず
試料（沈渣）を得なければならなかつた。しかし
尿の他の成分もそれによつて濃縮され、例えば塩
分や上皮細胞のような成分のために、白血球の顕
微鏡による計数がかなり困難になる。また沈渣含
有量の変動、沈渣の不均質性および顕微鏡の光学
的設計の相違によつて、白血球の計数の際に比較
的大きな誤差（数百％まで及ぶことがある）が生
じた。 このような難点を避けるために、種々の体液中
の白血球を検出する原理として、酵素反応を利用
するいくつかの試みが既になされている。それと
いうのも白血球は幅広い酵素スペクトルを有して
いるからである。 このように、例えばドイツ公開明細書第
2826965号および第2836644号からは、体液中の白
血球検出用試剤が知られており、そこでは白血球
中に存在するエステル分解および／またはタンパ
ク質分解活性が分析目的に利用されている。白血
球のエステラーゼおよび／またはプロテアーゼの
基質としてはスルホンフタレインエステルまたは
アゾ染料エステルが用いられる。酵素反応で遊離
する染料は次に既知の方法で測定される。しかし
これらの刊行物に記載されている試剤は、低濃度
の白血球について用いる時は反応時間が長過ぎる
ため、実際上の目的には未だ感度が低過ぎる。 プロテアーゼおよびエステラーゼの種々の検出
法は組織化学的および細胞化学的酵素学からも知
られている（例えばエー・ジー・イー・ピアース
（A.G.E.Pearse）著：組織化学の理論と応用第３
版、チヤーチル・リビングストーン、エジンバー
ア−ロンドン−ニユーヨーク（Churchill Liv−
ingstone，Edinburgh−London−New York）
1968年参照）。一般に検出には無色かまたは僅か
に着色したエステルが用いられ、このエステルは
酵素によつて無色の酸および同様に無色のアルコ
ール（フエノール）類成分に分解される。それか
らこのフエノール類成分は次の反応、例えばジア
ゾニウム塩とのカツプリングまたは酸化によつて
着色生成物に変換される。例えばエフ・シユマル
ツル（F.Schmalzl）およびエイチ・ブラウンシ
ユタイナー（H.Braunsteiner）は例えば、クリ
ン・ブシユル（Klin Wschr）46，642（1968）に、
基質としてのナフトール−AS−Ｄ−クロロアセ
テートと遊離したナフトールと反応して着色した
アゾ化合物を生ずるジアゾニウム塩とを用いた白
血球エステラーゼの特殊な細胞化学的検出法につ
いて述べている。 しかしこのような型の二成分系は、例えば尿の
ような体液中の白血球の迅速且つ簡単な検出には
不適当であることがわかつた。それというのもこ
れらの感度が低過ぎるからで、1μについて、
5000個の白血球を含む試料でも反応を示さない。 英国特許第Ａ−1128371号および欧州特許第Ａ
−12957号は、体液中の加水分解酵素の検出用の
発色性基質として、インドキシルエステルおよぎ
チオインドキシルエステルを用いることを開示し
ている。基質が酵素によつて分解すると、遊離の
インドキシルが生じ、次にこれが酸化されて容易
に検出できる青色染料のインジゴになる。欧州特
許第Ａ−12957号に基いた商業的に利用できる試
験は、Ｎ−トシル−Ｌ−アラニンインドキシルエ
ステルを含浸させた紙片から成つていて、この
試験片を白血球を含んだ尿試料に浸すと、色が青
くなる。しかし着色の終結点に達し、試験を評価
できるまでの待ち時間が長いことが、この製品の
大きな欠点である。 欧州特許第Ａ−14929号は、酵素的分解反応に
用いる種々の促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾ
ール誘導体、アルコール類、金属錯体）について
述べているが、インドキシルの酸化が完了するま
での時間が比較的長いこと、および試験の感度が
低いこと（検出限界：μについて数千個の白血
球）が欠点となつている。欧州特許第Ａ−34323
号に従つて、白血球酵素の基質として、ロイコ−
インドアニリンのエステルを使用することについ
ても、同じことがあてはまる。 欧州特許第Ａ−39880号は、上述したジアゾニ
ウム塩とのカツプリングによる検出原理と、欧州
特許第Ａ−12957号および同第Ａ−14929号による
基質との組合せを提示している。この方法では白
血球の検出限界をかなり小さくすることができる
が、実用上望ましい15〜20白血球／μという検
出感度はまだ達成されない。 それ故、本発明の目的は、白血球の酵素による
基質の酵素的分解が促進される結果、尿中の白血
球が感度よく且つより迅速に検出されるようなエ
ステル分解酵素用の新しい促進剤を見出すことで
あつた。そして驚くべきことには、ｎ−ウンデカ
ノールが白血球の酵素を著しく活性化させること
が今回わかつた。欧州特許第Ａ−14929号には白
血球酵素の有力な活性剤としてアルコール類が開
示されており、該アルコール類は、欧州特許第Ａ
−7404号、同第Ａ−8428号および同第Ａ−12957
号に記載のアリールエステルの分解をかなり促進
すると記されている。以前に既に記載されている
〔ジー・ゴモリ（G.Gomori）、ジエー・ヒストケ
ム・サイトケム（J.Histochem.Cyto−chem.）
６，469（1953）；エイチ・レフラー（H.Lｏ¨
ffler）、クリン・ヴオツヘンシユル（Klin.
Wochenschr.）39，1120（1961）並びにエル・フ
イツサー（L.Visser）およびイー・ブロウト（E.
Blout）、フエド・プロク（Fed.Proc.）28，407
（1969）、並びにバイオキム・バイオフイズ・アク
タ（Biochim.Biophys.Acta）268，257（1972）、
並びにエフ・スウイートマン（F.Sweetman）お
よびエル・オルンシユタイン（L.Ornstein）、ジ
エー・ヒストケム・サイトケム（J.Histochem.
Cytochem.）23，327（1974）〕基質の酵素的分解
もアルコール類によつて著しく活性化される。 欧州特許第Ａ−14929号には、一般式がＲ−
OH（但し、Ｒはアルキル基）のアルコール類が
活性剤として記されている。 その出願に例示されているのは、ヘキサノー
ル、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、
デカノール、ドデカノール、トリデカノールなど
であるが、驚くべきことには今回、欧州特許第Ａ
−14929号に記載されていないｎ−ウンデカノー
ルが、白血球酵素の活性化の点で、上述のすべて
のアルコール類よりもすぐれていることがわかつ
た。 このウンデカノールは、好ましくは液状試験に
おいて10-4〜１重量％、好ましくは10-3〜0.1重
量％の濃度（いずれの場合も試験溶液に対して）
で用いる。下記の試験具の製造では、0.01〜10重
量％、好ましくは0.5〜５重量％の濃度でウンデ
カノールを含浸液に加える。 本発明は、エステル分解および／またはタンパ
ク質分解酵素を検出する試剤に関するもので、こ
の試剤は、(a)酵素の発色性基質としてフエノール
類のアミノ酸エステルまたはペプチドエステル、
(b)成分(a)のアミノ酸エステル結合またはペプチド
エステル結合の酵素的分解を促進する物質として
アルコール、更に適切な場合に(c)ジアゾニウム
塩、適切な場合に(d)緩衝液、また適切な場合に(e)
担体および／または普通の添加物を含んでいて、
促進物質としてｎ−ウンデカノールを用いること
を特徴とするものである。 最後に、本発明はまた液体試料、特に体液中の
エステルおよび／またはタンパク質分解酵素を検
出する方法に関し、その特徴とする所は、本発明
の試剤に試料を接触させ、生じる呈色反応を測定
することである。 本発明に使用されるべきｎ−ウンデカノール
は、以前に既に記述されている〔ジー・ゴモリ
（G.Gomori）、ジエー・ヒストケム・サイトケム
（J.Histochem.Cytochem.）６，469（1953）、エイ
チ・レフラー（H.Lｏ¨ffler）、クリン・ヴオツヘ
ンシユル（Klin.Wochenschr.）39，1120（1961）、
エル・フイツサー（L.Visser）およびイー・ブロ
ウト（E.Blout）、フエド・プロク（Fed.Proc.）
28，407（1969）並びにバイオキム・バイオフイ
ズ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）268，257
（1972）並びにエフ・スウイートマン（F.
Sweetman）およびエル・オルンシユタイン（L.
Ornstein）、ジエー・ヒストケム・サイトケム
（J.Histochem.Cytochem.）23，327（1974〕基質
の分解のみならず、欧州特許第Ａ−7404、8428、
12957、14929、34323および39880号に記載されて
いる白血球酵素による基質の酵素的分解を促進す
る。 本発明の試剤中の好適な発色性基質としては、
平行する出願に記載されている次のような一般式
を有する化合物も含まれる。 式中、 X1およびX2は同じかまたは異なつていて窒素
またはイオウを表わす。但しX1およびX2は同時
にイオウを表わさない。 R1は水素、または場合によつて分枝状化した、
炭素原子数１〜６個のアルキル基を表わし、これ
らは場合によつてはハロゲンまたは水酸基で置換
されていてもよい。 R2およびR3は同じかまたは異なつていて、水
素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ
基、C1〜C6のアシル基、ハロゲン、トリフルオ
ロメチル、ニトロ、SO3H、シアノ、C1〜C8のア
シル−アミノ基、アルキル基のそれぞれがC1〜
C6のジアルキルアミノ基またはC6〜C10のアリー
ル基で、これらはまたC1〜C6のアルキル基、C1
〜C6のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ、ニト
ロ、トリフルオロメチル、SO3H、C1〜C6のアシ
ル基またはC1〜C6のジアルキルアミノ基で置換
されていてもよく、または R2およびR3は一緒になつて縮合芳香環、好ま
しくはベンゼン環を形成し、これも同様に一つま
たは二つの基R2で定義したような基で置換され
てもよく、 Ａはアミノ酸基またはペプチド基を表わし、 Ｇは水素または好ましくは、ペプチド化学にお
ける普通の窒素保護基またはそのような基から誘
導される窒素保護基を表わす。 一般式（）を有する好適な化合物は、X1が
イオウを表わし、X2が窒素を表わすものである。
R1が水素を表わす式（）の化合物、及びR2お
よびR3（同じかまたは異なつている）が水素、C1
〜C2のアルキル、C1〜C2のアルコキシ、ハロゲ
ン、アルキル基のそれぞれがC1〜C4のジアルキ
ルアミノ基またはベンゼン基を表わす式（）の
化合物が一層好適である。 式（）の化合物中のエステル基は、５−位に
あるのが特に好ましい。 本発明により好適とされるその他の発色性基質
は、平行する出願に同様に記されている化合物
で、次のような一般式を有するものである。 式中、 X3およびX4はＮまたはCHを表わす。但し、い
ずれの場合でもX3またはX4の一方はＮを表わす。
R4，R5およびR6は同じかまたは異なつていて、
水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキ
シ基、C1〜C6のアシル基、ハロゲン、トリフル
オロメチル、ニトロ、SO3H、シアノ、C1〜C8の
アシルアミノ基、アルキル基のそれぞれがC1〜
C6のジアルキルアミノ基、またはC6〜C10のアリ
ール基を表わし、これらはC1〜C6のアルキル基、
C1〜C6のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ、ニ
トロ、トリフルオロメチル、SO3H、C1〜C6のア
シル基またはアルキル基のそれぞれがC1〜C6の
ジアルキルアミノ基で置換されてもよく、または R5およびR6は一緒になつて縮合芳香環、好ま
しくはベンゼン環を形成し、これらは１または２
個の基R4で定義したような基で置換されてもよ
く、ＡおよびＧは式（）の場合で上述したよう
な意味を有する。 一般式（）を有する化合物においては、X3
は好ましくはCHを表わし、X4は好ましくは窒素
を表わす。R4，R5およびR6は同じかまたは異な
つていて、好ましくは水素、C1〜C4のアルキル、
C1〜C4のアルコキシ、アシルアミノ（ここで酸
基はC1〜C6の脂肪族または芳香族でもよい。）、
C1〜C4のジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、
ハロゲンまたはアリールを表わし、これらは場合
によつてはC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコ
キシまたはハロゲンで置換されていてもよい。特
に好適なのは、R4，R5およびR6が水素、C1〜C4
のアルキル、フエニル或いはハロゲンであるか、
またはR5およびR6が一緒になつて縮合ベンゼン
環を形成するものである。 本発明の試剤の適当な発色性基質としては、そ
の他、次のような一般式を有する化合物がある。 式中、 R4，R5，R6，ＡおよびＧは式（）の場合に
述べたような意味を有する。 一般式（），（）および（）においては、
Ｇ−Ａ−は好ましくは次のような一般式を有する
基を表わす。 式中、 R7は水素、または１〜15個、好ましくは１〜
９個の炭素原子を有し、また場合によつては水酸
基、メルカプトまたはカルボキシル基で置換され
ている、場合によつて分枝状化したアルキル、シ
クロアルキルまたはアリール基を表わし、 R8は水素、または好ましくは−CO−アルキ
ル、−CO−アルアルキル、−CO−アリール、−
SO2−アルキル或いは−SO2−アリール（アルキ
ル基は１〜９個好ましくは１〜６個の炭素原子を
有する直鎖状または分枝状で、アリール基は好ま
しくは、場合によつては、C1〜C4のアルキル基、
C1〜C4のアルコキシ基またはハロゲンで置換さ
れたベンゼン環を表わす。）を表わす。 Ｇ−Ａ−は、特に好ましくは慣用の窒素保護基
を有する、天然産のアミノ酸またはこのようなア
ミノ酸の２〜８個のペプチドの基を表わす。 このアミノ酸基は、ここではＬ−体でもＤ−体
でもまたはラセミ体であつてもよい。特に好まし
い基はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、フエニルアラニン、およびチロシ
ンの基で、Ｌ−体はいずれの場合でも特に好適で
ある。存在するどんな遊離の水酸基もアシル化、
好ましくくはアセチル化してもよい。 Ａの定義におけるペプチド基は、例えばジ−、
トリ−、テトラ−、およびペンタペプチド、好ま
しくはジ−およびトリペプチドを意味し、好適な
アミノ酸成分は前記のようなアミノ酸である。 一般式（），（）および（）を有する基質
は対応するフエノール類と、一般式Ｇ−Ａ−OH
（式中、ＧおよびＡは前述のような意味を有す
る。）を有するアミノ酸或いはペプチド、または
これらの適当な反応性誘導体とを、ペプチド化学
において普通に用いられる方法で反応させること
によつて得られる。 適当な反応性誘導体の例としては、例えば、ク
ロロギ酸エチル、または例えばペンタクロロフエ
ニルエステルもしくはＮ−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールエステルのような活性エステルとの酸塩
化物およびペプチド合成において通常使用される
混合酸無水物がある。 本発明の試剤は、好ましくは、フエノール類
（酵素的分解中に遊離する）と反応する発色剤と
して、次のような一般式を有するジアゾニウム塩
を含んでいる。 R′は低級アルキル、低級アルコキシ、低級ア
ルキルメルカプト、ヒドロキシ、ニトロ、シア
ノ、トリフルオロメチル、C1〜C8のアルキルス
ルホンアミド、アリールスルホンアミド、C1〜
C8のアルキルスルホン、アリールスルホン、ス
ルホン酸またはカルボン酸、Ｎ−モルホリノ、Ｎ
−チオモルホリノ、Ｎ−ピロリジノ、また場合に
よつてN′−アルキル化されたＮ−ピペラジノま
たはＮ−ピペリジノ基、ハロゲンまたは水素を表
わし、 R′3は低級アルキル、低級アルコキシ、アリー
ルオキシ、低級アルキルメルカプト、アルキルア
ミノもしくはジアルキルアミノ、ヒドロキシル、
ニトロ、シアノ、C1〜C8のアルキルスルホンア
ミド、アリールスルホンアミド、C1〜C8のアル
キルスルホン、アリールスルホン、スルホン酸も
しくはカルボン酸、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−チオモ
ルホリノ、またはＮ−ピロリジノ、また場合によ
つて、N′−アルキル化されたＮ−ピペラジノま
たはＮ−ピペリジノ、またはフエニルアミノ基、
場合によつては低級アルキルもしくは低級アルコ
キシ基で置換されたフエニル基、ハロゲンまたは
水素を表わし、 R′2，R′4およびR′5は同じかまたは異なつたも
ので、各々低級アルキル、低級アルコキシ、ニト
ロ、C1〜C8のアルキルスルホンアミド、アリー
ルスルホンアミド、C1〜C8のアルキルスルホン、
アリールスルホン、スルホン酸もしくはカルボン
酸または低級アルキルメルカプト基、ハロゲンま
たは水素を表わし、Ｘは安定化陰イオンを表わ
す。 尚、どんな場合でも、R′1〜R′5の二つの隣接し
た基が環化して、場合によつてはハロゲン、C1
〜C6のアルキル、C1〜C6のアルコキシ、もしく
はニトロ、スルホン酸またはカルボン酸基で置換
された、ベンゼン環を形成し、その結果ナフタリ
ン系のジアゾニウム塩を形成することもできる。 一般式（）において、好ましくは、 R′1はC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコキ
シ、ヒドロキシル、ニトロ、ハロゲンまたは水素
を表わし、 R′3はC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコキ
シ、アリールオキシ、C1〜C4のアルキルアミノ、
アルキル基のそれぞれがC1〜C4のジアルキルア
ミノ、ニトロ、C1〜C4のアルキルスルホンアミ
ド、アリールスルホンアミド、C1〜C4のアルキ
ルスルホン、アリールスルホン、Ｎ−モルホリ
ノ、Ｎ−ピロリジノ、フエニルアミノ、もしくは
スルホン酸基または水素を表わし、 R′2，R′4およびR′5は同じかまたは異なつてい
てもよく、C1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコ
キシ、C1〜C4のアルキルアミノ、アルキル基の
それぞれがC1〜C4のジアルキルアミノ、ニトロ、
C1〜C4のアルキルスルホンアミド、アリールス
ルホンアミドもしくはスルホン酸基、ハロゲン、
または水素を表わす。 いずれの場合でもR′1〜R′5の二つの隣接した基
は、場合によつては環化して、場合によりハロゲ
ン、またはC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコ
キシ、ニトロ、またはスルホン酸基で置換された
ベンゼン環を形成してもよい。 （）式に関しては、各々の場合のアリールは
６〜12個、好ましくは６個の炭素原子を有する芳
香族基を表わし、場合によつてはハロゲン、C1
〜C4のアルキルまたはC1〜C4のアルコキシで置
換されていてもよい。 一般式（）を有するジアゾニウム塩はそれ自
体既知であり、本来既知の方法（ホウベン−ウエ
イル（Houben−Weyl）：有機化学の手法、第
Ｘ／３巻）によつて合成することができる。 本発明のタンパク質分解酵素および特に白血球
酵素検出用の試剤は、適当な緩衝系を含んでいる
ことが好ましい。この目的のために可能な系とし
ては、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩／重炭
酸塩、炭酸塩、バルビツール酸塩、トリス−（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン（＝トリス）、２
−アミノ−２−メチル−プロパン−１，３−ジオ
ール（＝アメジオール）またはアミノ酸緩衝液が
あり、PH値と容量は原則として、測定溶液中また
は試験片上において６〜10、好ましくは７〜９の
PH値が確立するように選ぶ。 場合によつては、本発明の試剤に、さらに洗剤
を一緒に用いるのが有利であるかも知れない。と
いうのもこうすることによつて、一層均質な色の
分布と一層濃い着色が得られるからである。使用
できる洗剤としては、陽イオン性および陰イオン
性洗剤、並びに両性および非イオン性洗剤があ
る。ここに記述してもよい例としては、ベンジル
−ジメチル−テトラデシルアンモニウムクロリ
ド、ドデシル硫酸ナトリウム、ゼフイロール、ポ
リビニルピロリドン、ヘパリノイド
（heparinoid）、および塩基性アミノ酸を含むホモ
ポリアミノ酸またはコポリアミノ酸〔イー・カチ
ヤルスキー（E.Ka−tchalski）およびエム・セ
ラ（M.Sela）：アドバンシス・オブ・プロテイ
ン・ケミストリー（Advances of Protein
Chemistry）13，243〜492（1958）；並びにシー・
ビー・アンフインゼン（C.B.Anfinsen）、エム・
エル・アンソン（M.L.Anson）、ジエー・テイ
ー・エドサール（J.T.Edsall）およびケー・バイ
レイ（K.Bailey）（編集者）；アカデミツク・プ
レス・インク・パブリツシヤース（Academic
Press.Inc.Publishers）、ニユーヨーク、ニユーヨ
ーク（New York，N.Y.）〕および逐次ポリアミ
ノ酸がある。使用できる塩基性アミノ酸は、側鎖
にアミノ基またはグアニジノ基を有するアミノ酸
である。その中には特にアルギニンの他にリジン
およびオルニチン、さらに例えばジアミノ酸、ジ
アミノプロピオン酸またはジアミノピメリン酸な
どのような天然タンパク質中に生じない塩基性ア
ミノ酸も含まれる。ポリアミノ酸の成分となるア
ミノ酸は、ラセミ体でも、または光学活性のＤ−
体もしくはＬ−体でもよい。ポリアミノ酸の分子
量は、1000〜2000000で、好ましくは、5000〜
500000である。塩基性アミノ酸の含有量はポリア
ミノ酸に対して５〜100モル％、好ましくは20〜
100モル％である。 適切な場合は、前述の洗剤の二つ以上の混合物
も用いることもできる。 洗剤は、好ましくは液状試験において10-4〜
10-1重量％、特に好ましくは10-4〜10-2重量％の
濃度で用いる。また含浸溶液中の含有量は、0.01
〜10重量％が好ましく、特に好ましいのは0.1〜
５重量％である。 白血球測定の際は、周囲に固定した試薬混合物
の助けによつて上記の洗剤を用いるのが特に有利
である。というのは、こうすることによつて、一
層均質な色の分布と、一層濃い着色が得られるか
らである。 本発明の試剤では、上記の色々な試剤は本来既
知の型の不活性担体に組み込ませるのが好まし
く、特に好ましい担体マトリツクスは、例えば特
に紙、またプラスチツク製の膜、ガラス繊維の
マツト（米国特許明細書第3846247号）、多孔性の
セラミツク片、合成不織布、スポンジ状材料（米
国特許明細書第3552928号）、フエルト、織物、木
材、セルロースまたはシリカゲルのような多孔性
材料である。 この目的のために、例えば水、メタノール、エ
タノール、アセトン、ジメチルホルムアミドまた
はジメチルスルホキシドのような容易に除去でき
る適当な溶媒に、上記の試薬を溶かした溶液を上
記の担体に含浸させる。この操作は別個の２工程
で行うことが好ましい。即ち、緩衝液やその他の
水溶性添加物を含んだ水溶液を先ず材料に含浸さ
せる。次に、これに、一般式（）を有する酵素
の発色性基質および活性剤の溶液を含浸させる。
しかしこの含浸操作は違つた順序でも、また二つ
の含浸溶液の組成の異なつたものを用いても行う
ことができる。含浸液または被験液体はいずれの
場合でも10-4〜10-1モル／、特に10-3〜10-2モ
ル／の濃度の発色性基質およびジアゾニウム
塩、並びに0.01〜10重量％、特に0.5〜５重量％
の濃度のウンデカノールを含有することが好まし
い。 マトリツクスとして紙を用いる場合は、出来
上つた試験紙はそのまま使えるが、また本来既知
の方法で把持部材に張りつけたり、または好まし
くは例えばドイツ公開明細書第2118455号に従つ
て、プラスチツクと細かい網の目の網織物との間
に封止してもよい。 フイルムで被覆した試験片を作るには、例えば
ポリビニルエステルまたはポリアミドのようなフ
イルム形成物質の溶液または分散液にすべての試
薬をいれて、均質に混合することが好ましい。そ
してこの混合物の薄層をプラスチツク製の担体の
上に塗り、乾燥する。乾燥後、得られたフイルム
被覆試験片を切断して、そのまま使用してもよ
く、または本来既知の方法で把持部材に張りつけ
てもよく、または例えばドイツ公開明細書第
2118455号に従つて、プラスチツクと細かい網の
目の網織物との間に封止してもよい。 本発明のエステル分解および／またはタンパク
質分解酵素、特に白血球酵素検出のための診断用
試剤は、普通の薬学的添加物を上記の試験試剤の
成分に加え、混合物を粒状にすることによつて、
粉末状混合物または試薬錠剤の形に作ることがで
きる。このようなタイプの添加剤の例としては、
例えば単糖類、少糖類、多糖類のような炭水化
物、マンニトール、ソルビトール、キシリトール
のような糖アルコール、またはポリエチレングリ
コール、ポリビニルピロリドンのようなその他の
可溶性不活性化合物がある。粉末状混合物または
試薬錠剤の最終重量は、通常、約50〜200mg、好
ましくは50〜80mgである。 それぞれ約５〜20mg、好ましくは約10mgの全重
量を有する凍結乾燥物を作るには、試験に必要な
すべての試薬の他に、例えばポリビニルピロリド
ンのような普通の賦形剤、また適切な場合は、例
えばマンニトール、ソルビトール、キシリトール
のような他の添加剤を含んだ溶液を凍結乾燥す
る。 本発明の診断用試剤で溶液状のものは、試験に
必要なすべての試薬を含んでいることが好まし
い。使用できる溶剤としては、水および、例えば
メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホ
ルムアミドのような水溶性有機溶剤と水との混合
物がある。貯蔵上の理由から、試験に要する試薬
を二つ以上の溶液に分けて、実際試験する間だけ
一緒にするのが得策であろう。 このようにして作つた診断用試剤は、被験体液
に浸したり、対象となる体液に加えた後、色の形
成によつてエステル分解および／またはタンパク
質分解酵素、特に白血球酵素の存在を迅速且つ簡
単に検出でき、その色の形成は視覚によつて、ま
たは例えば反射率光度測定法またはセル中で光度
測定的に測定される。セル毎の白血球酵素の活性
は、本質的に一定のパラメータと見なすことがで
きるので、被験体液の白血球の濃度は、形成した
色の濃さから測定できる。白血球酵素の活性は、
白血球の溶解後も十分保持されるので、この際損
なわれない白血球も溶解した白血球も共に記録さ
れる。従つて溶解誤差は全く起らない。 次の実施例は本発明の説明に役立つものであ
る。尚、別に指定しない限り、記載してある量は
重量部または重量％である。 実施説明書 基質に応じ、溶解剤として50〜250μのＮ−
メチルピロリドンを、問題となつている緩衝液
2.25mlに加え、緩衝液を用いてその溶液の容量を
2.5mlとした。次に、５〜100mgのｎ−ウンデカノ
ールを１mlのＮ−メチルピロリドンに溶かした溶
液5μおよび２mgのドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）またはその他の洗剤４mgを１mlの水また
はＮ−メチルピロリドンに溶かした溶液5μを
反応混合物に加えた。十分に撹拌後、10-1モルの
基質をＮ−メチルピロリドン、ジメチルホルムア
ミドまたはジメチルスルホキシドに溶かした溶液
5μを反応溶液に加え、白血球の懸濁液を加え
た後、指定した波長における吸光度の増加を連続
的に監視した。また基質の自然加水分解は、白血
球を加えない対照群で、吸光度の増加によつて測
定する。 反応速度を測定するために、酵素反応で得られ
た吸光度の増加から自然加水分解について測定し
た値を差引く。基質の分解についての絶対値（モ
ル数／分）は、モル吸光係数によつて吸光度の差
から算出できる。 実施例 １ 紙（例えばイートン・アンド・ダイクマン
（Eaton and Dikeman）205）に下記の溶液を順
次含浸させた後、60℃で乾燥した。 溶液１：３％のポリビニルピロリドンを含む
0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン／塩酸緩衝液（PH＝8.8） 溶液２：無水アセトン１中に7.5・10-3モルの
Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン ５−ヒドロキシ−
１，２−ベンズイソチアゾリルエステル、10-2
モルの２，４−ジメトキシベンゼンジアゾニウ
ムテトラフルオボレートおよび3.5ｇのｎ−ウ
ンデカノールを含むもの。 白血球を含む尿中に浸すと、赤褐色に変化する
淡黄色の試験紙が得られる。 実施例 ２ SDSまたは平均分子量14000のポリリジンを加
えたPH8.8の0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−
アミノメタン／塩酸緩衝液中の白血球によるＮ−
トシル−Ｌ−アラニンインドキシルエステルの酵
素的分解に対するアルカノール類の促進作用
（360nmで測定）。 【表】 実施例 ３ 0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン／塩酸緩衝液（PH8.8）中で、50μのＮ−メ
チルピロリドン／試験群および10μｇ／試験の
SDSの存在の下に、白血球によるＮ−トシル−Ｌ
−アラニンインドキシルエステルの分解に対する
ｎ−ウンデカノールの促進作用の濃度依存性
（360nmで測定）。 【表】 実施例 ４ 0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン／塩酸緩衝液（PH8.4）中で、100μのＮ−
メチルピロリドンの存在下における白血球による
Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン ５−ヒドロキシ−
１，２−ベンズイソチアゾリルエステルの分解の
活性剤および洗剤の添加による促進作用（325nm
で測定）。 【表】 ポリアミノ酸の数平均分子量は括弧内に示してあ
る。
実施例 ５ 0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン塩酸緩衝液（PH8.8）中で、250μのＮ−メ
チルピロリドンの存在下における白血球によるＮ
−トシル−Ｌ−アラニン ３−ヒドロキシ−５−
フエニルピロールエステルの分解の活性剤および
洗剤の添加による促進作用（330nmで測定）。 【表】 実施例 ６ 種々の0.1M緩衝液（PH8.4）中における白血球
によるＮ−トシル−Ｌ−アラニン ３−ヒドロキ
シ−５−フエニルピロールエステルの分解の、
250μのＮ−メチルピロリドン、並びに活性剤
および洗剤の添加による促進作用（330nmで測
定）。 【表】 【表】 トリス＝トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン塩酸緩衝液、BDTA＝ベンジル−ジメチ
ル−テトラデシルアミン塩酸塩、ポリアミノ酸の
平均分子量は括弧内に示してある。 Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルエステル製造の一般
操作説明書 いずれの場合でもこのエステルは、粉末状炭酸
カリウムの存在下に、無水メチルエチルケトンま
たは無水トルエン中で、Ｎ−トシル−Ｌ−アラニ
ルクロリドをフエノール類と反応させて製造し
た。約55℃で６〜12時間撹拌後、40〜70％のフエ
ノールが反応していた。フエノール：K2CO3：
酸塩化物のモル比は通常１：1.5：1.5であつた。
またPH値は全反応時間中、約７であつた。仕上げ
のために50℃で炭酸カリウムを別後、真空中で
溶剤を留去した。生成物はシリカゲル−溶離剤
（石油エーテル：アセトン＝約９：１）を用いる
カラムクロマトグラフイー、次いで再結晶によつ
て精製した。 Ｌ−ｐ−トシルアラニン 文献：イー・フイツシヤー（E.Fischer）および
ダブリユ・リプシツツ（W.Lipschitz），B.48，
362（1915） 83.7ｇ（0.93モル）のＬ−アラニンを約2Nの水
酸化ナトリウム溶液465mlに溶解した。ｐ−トル
エンスルホニルクロリド186ｇ（0.976モル）を、
約70〜72℃で少しずつ20分かけてこの溶液に加え
た。このスルホニルクロリド添加中は、自動滴定
装置を用い、約2Nの水酸化ナトリウム溶液で反
応混合物のPHを10に保つた。ここで2N水酸化ナ
トリウム溶液560mlが消費された。反応混合物の
PHが最早変化しなくなつたら、混合物を15〜５℃
に冷却し、37％濃度の塩酸でPHを３にした。分離
した生成物を吸引過し、湿つた塊を2350mlの
水から再沈澱させた。収量：融点132〜135℃のＬ
−ｐ−トシルアラニン185.5ｇ（理論量の82％） ｐ−トシル−Ｌ−アラニルクロリド 透明な溶液が生ずるまで、158.1ｇ（0.65モル）
のＬ−ｐ−トシルアラニンを40℃で350mlの塩化
チオニル中で撹拌した。次に、過剰の塩化チオニ
ルを水流ポンプの真空下で留去した。フラスコ中
の残渣を300mlの蒸留トルエンにとつた。透明な
僅かに黄味がかつた溶液が得られ、これを900ml
の撹拌したナフサに注いだ。酸無水物が沈殿し
た。翌日これを吸引過し、軽ガソリンで洗浄
し、真空デシケーター内で塩化カルシウム／水酸
化カリウム上で乾燥した。 収量：融点81〜83℃の殆んど無色の結晶155ｇ
（理論量の91％）。
び／またはタンパク質分解酵素の分析検出用試剤
に関し、エステルは適当な方法で試験試剤、特に
試験片に組み込まれている。本発明の試剤は、酵
素の発色性基質（適当なフエノール類のアミノ酸
エステルまたはペプチドエステル）および適切な
場合はフエノール類とカツプリングして色を生ず
るジアゾニウム塩以外に、アミノ酸エステルまた
はペプチドエステルの酵素的分解の促進剤として
ウンデカノールをも含んでいる。この試剤は白血
球、特に尿中の白血球の検出に好適に用いられ
る。 体液、特に尿中の白血球の検出は、腎臓および
尿・生殖管の病気の診断に大変重要である。この
検出は元来、遠心分離していない尿または遠心分
離後の尿沈渣中の白血球を数えて行うが、この二
つの方法では損われない白血球だけが記録され
る。所が白血球の溶解速度は尿の媒質によつて大
幅な変動を受け易く、従つて例えば、強アルカリ
性の尿中では、白血球の半減期は僅か60分である
ことが知られている。このことは測定した白血球
数が少な過ぎることを意味する。この溶解誤差は
さておいて、遠心分離していない均質化された尿
中の白血球の顕微鏡による定量的測定に従えば、
血球計算板に正確な値が得られる。しかしながら
この方法は面倒で時間がかかり、訓練された係員
が必要なので、実際上まれに用いられるだけであ
る。 従つて、医学的に実施される尿中の白血球の好
ましい測定法は、いわゆる尿沈渣についての視野
法であつた。そのためには遠心分離によつて先ず
試料（沈渣）を得なければならなかつた。しかし
尿の他の成分もそれによつて濃縮され、例えば塩
分や上皮細胞のような成分のために、白血球の顕
微鏡による計数がかなり困難になる。また沈渣含
有量の変動、沈渣の不均質性および顕微鏡の光学
的設計の相違によつて、白血球の計数の際に比較
的大きな誤差（数百％まで及ぶことがある）が生
じた。 このような難点を避けるために、種々の体液中
の白血球を検出する原理として、酵素反応を利用
するいくつかの試みが既になされている。それと
いうのも白血球は幅広い酵素スペクトルを有して
いるからである。 このように、例えばドイツ公開明細書第
2826965号および第2836644号からは、体液中の白
血球検出用試剤が知られており、そこでは白血球
中に存在するエステル分解および／またはタンパ
ク質分解活性が分析目的に利用されている。白血
球のエステラーゼおよび／またはプロテアーゼの
基質としてはスルホンフタレインエステルまたは
アゾ染料エステルが用いられる。酵素反応で遊離
する染料は次に既知の方法で測定される。しかし
これらの刊行物に記載されている試剤は、低濃度
の白血球について用いる時は反応時間が長過ぎる
ため、実際上の目的には未だ感度が低過ぎる。 プロテアーゼおよびエステラーゼの種々の検出
法は組織化学的および細胞化学的酵素学からも知
られている（例えばエー・ジー・イー・ピアース
（A.G.E.Pearse）著：組織化学の理論と応用第３
版、チヤーチル・リビングストーン、エジンバー
ア−ロンドン−ニユーヨーク（Churchill Liv−
ingstone，Edinburgh−London−New York）
1968年参照）。一般に検出には無色かまたは僅か
に着色したエステルが用いられ、このエステルは
酵素によつて無色の酸および同様に無色のアルコ
ール（フエノール）類成分に分解される。それか
らこのフエノール類成分は次の反応、例えばジア
ゾニウム塩とのカツプリングまたは酸化によつて
着色生成物に変換される。例えばエフ・シユマル
ツル（F.Schmalzl）およびエイチ・ブラウンシ
ユタイナー（H.Braunsteiner）は例えば、クリ
ン・ブシユル（Klin Wschr）46，642（1968）に、
基質としてのナフトール−AS−Ｄ−クロロアセ
テートと遊離したナフトールと反応して着色した
アゾ化合物を生ずるジアゾニウム塩とを用いた白
血球エステラーゼの特殊な細胞化学的検出法につ
いて述べている。 しかしこのような型の二成分系は、例えば尿の
ような体液中の白血球の迅速且つ簡単な検出には
不適当であることがわかつた。それというのもこ
れらの感度が低過ぎるからで、1μについて、
5000個の白血球を含む試料でも反応を示さない。 英国特許第Ａ−1128371号および欧州特許第Ａ
−12957号は、体液中の加水分解酵素の検出用の
発色性基質として、インドキシルエステルおよぎ
チオインドキシルエステルを用いることを開示し
ている。基質が酵素によつて分解すると、遊離の
インドキシルが生じ、次にこれが酸化されて容易
に検出できる青色染料のインジゴになる。欧州特
許第Ａ−12957号に基いた商業的に利用できる試
験は、Ｎ−トシル−Ｌ−アラニンインドキシルエ
ステルを含浸させた紙片から成つていて、この
試験片を白血球を含んだ尿試料に浸すと、色が青
くなる。しかし着色の終結点に達し、試験を評価
できるまでの待ち時間が長いことが、この製品の
大きな欠点である。 欧州特許第Ａ−14929号は、酵素的分解反応に
用いる種々の促進剤（ピリジン誘導体、イミダゾ
ール誘導体、アルコール類、金属錯体）について
述べているが、インドキシルの酸化が完了するま
での時間が比較的長いこと、および試験の感度が
低いこと（検出限界：μについて数千個の白血
球）が欠点となつている。欧州特許第Ａ−34323
号に従つて、白血球酵素の基質として、ロイコ−
インドアニリンのエステルを使用することについ
ても、同じことがあてはまる。 欧州特許第Ａ−39880号は、上述したジアゾニ
ウム塩とのカツプリングによる検出原理と、欧州
特許第Ａ−12957号および同第Ａ−14929号による
基質との組合せを提示している。この方法では白
血球の検出限界をかなり小さくすることができる
が、実用上望ましい15〜20白血球／μという検
出感度はまだ達成されない。 それ故、本発明の目的は、白血球の酵素による
基質の酵素的分解が促進される結果、尿中の白血
球が感度よく且つより迅速に検出されるようなエ
ステル分解酵素用の新しい促進剤を見出すことで
あつた。そして驚くべきことには、ｎ−ウンデカ
ノールが白血球の酵素を著しく活性化させること
が今回わかつた。欧州特許第Ａ−14929号には白
血球酵素の有力な活性剤としてアルコール類が開
示されており、該アルコール類は、欧州特許第Ａ
−7404号、同第Ａ−8428号および同第Ａ−12957
号に記載のアリールエステルの分解をかなり促進
すると記されている。以前に既に記載されている
〔ジー・ゴモリ（G.Gomori）、ジエー・ヒストケ
ム・サイトケム（J.Histochem.Cyto−chem.）
６，469（1953）；エイチ・レフラー（H.Lｏ¨
ffler）、クリン・ヴオツヘンシユル（Klin.
Wochenschr.）39，1120（1961）並びにエル・フ
イツサー（L.Visser）およびイー・ブロウト（E.
Blout）、フエド・プロク（Fed.Proc.）28，407
（1969）、並びにバイオキム・バイオフイズ・アク
タ（Biochim.Biophys.Acta）268，257（1972）、
並びにエフ・スウイートマン（F.Sweetman）お
よびエル・オルンシユタイン（L.Ornstein）、ジ
エー・ヒストケム・サイトケム（J.Histochem.
Cytochem.）23，327（1974）〕基質の酵素的分解
もアルコール類によつて著しく活性化される。 欧州特許第Ａ−14929号には、一般式がＲ−
OH（但し、Ｒはアルキル基）のアルコール類が
活性剤として記されている。 その出願に例示されているのは、ヘキサノー
ル、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、
デカノール、ドデカノール、トリデカノールなど
であるが、驚くべきことには今回、欧州特許第Ａ
−14929号に記載されていないｎ−ウンデカノー
ルが、白血球酵素の活性化の点で、上述のすべて
のアルコール類よりもすぐれていることがわかつ
た。 このウンデカノールは、好ましくは液状試験に
おいて10-4〜１重量％、好ましくは10-3〜0.1重
量％の濃度（いずれの場合も試験溶液に対して）
で用いる。下記の試験具の製造では、0.01〜10重
量％、好ましくは0.5〜５重量％の濃度でウンデ
カノールを含浸液に加える。 本発明は、エステル分解および／またはタンパ
ク質分解酵素を検出する試剤に関するもので、こ
の試剤は、(a)酵素の発色性基質としてフエノール
類のアミノ酸エステルまたはペプチドエステル、
(b)成分(a)のアミノ酸エステル結合またはペプチド
エステル結合の酵素的分解を促進する物質として
アルコール、更に適切な場合に(c)ジアゾニウム
塩、適切な場合に(d)緩衝液、また適切な場合に(e)
担体および／または普通の添加物を含んでいて、
促進物質としてｎ−ウンデカノールを用いること
を特徴とするものである。 最後に、本発明はまた液体試料、特に体液中の
エステルおよび／またはタンパク質分解酵素を検
出する方法に関し、その特徴とする所は、本発明
の試剤に試料を接触させ、生じる呈色反応を測定
することである。 本発明に使用されるべきｎ−ウンデカノール
は、以前に既に記述されている〔ジー・ゴモリ
（G.Gomori）、ジエー・ヒストケム・サイトケム
（J.Histochem.Cytochem.）６，469（1953）、エイ
チ・レフラー（H.Lｏ¨ffler）、クリン・ヴオツヘ
ンシユル（Klin.Wochenschr.）39，1120（1961）、
エル・フイツサー（L.Visser）およびイー・ブロ
ウト（E.Blout）、フエド・プロク（Fed.Proc.）
28，407（1969）並びにバイオキム・バイオフイ
ズ・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）268，257
（1972）並びにエフ・スウイートマン（F.
Sweetman）およびエル・オルンシユタイン（L.
Ornstein）、ジエー・ヒストケム・サイトケム
（J.Histochem.Cytochem.）23，327（1974〕基質
の分解のみならず、欧州特許第Ａ−7404、8428、
12957、14929、34323および39880号に記載されて
いる白血球酵素による基質の酵素的分解を促進す
る。 本発明の試剤中の好適な発色性基質としては、
平行する出願に記載されている次のような一般式
を有する化合物も含まれる。 式中、 X1およびX2は同じかまたは異なつていて窒素
またはイオウを表わす。但しX1およびX2は同時
にイオウを表わさない。 R1は水素、または場合によつて分枝状化した、
炭素原子数１〜６個のアルキル基を表わし、これ
らは場合によつてはハロゲンまたは水酸基で置換
されていてもよい。 R2およびR3は同じかまたは異なつていて、水
素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキシ
基、C1〜C6のアシル基、ハロゲン、トリフルオ
ロメチル、ニトロ、SO3H、シアノ、C1〜C8のア
シル−アミノ基、アルキル基のそれぞれがC1〜
C6のジアルキルアミノ基またはC6〜C10のアリー
ル基で、これらはまたC1〜C6のアルキル基、C1
〜C6のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ、ニト
ロ、トリフルオロメチル、SO3H、C1〜C6のアシ
ル基またはC1〜C6のジアルキルアミノ基で置換
されていてもよく、または R2およびR3は一緒になつて縮合芳香環、好ま
しくはベンゼン環を形成し、これも同様に一つま
たは二つの基R2で定義したような基で置換され
てもよく、 Ａはアミノ酸基またはペプチド基を表わし、 Ｇは水素または好ましくは、ペプチド化学にお
ける普通の窒素保護基またはそのような基から誘
導される窒素保護基を表わす。 一般式（）を有する好適な化合物は、X1が
イオウを表わし、X2が窒素を表わすものである。
R1が水素を表わす式（）の化合物、及びR2お
よびR3（同じかまたは異なつている）が水素、C1
〜C2のアルキル、C1〜C2のアルコキシ、ハロゲ
ン、アルキル基のそれぞれがC1〜C4のジアルキ
ルアミノ基またはベンゼン基を表わす式（）の
化合物が一層好適である。 式（）の化合物中のエステル基は、５−位に
あるのが特に好ましい。 本発明により好適とされるその他の発色性基質
は、平行する出願に同様に記されている化合物
で、次のような一般式を有するものである。 式中、 X3およびX4はＮまたはCHを表わす。但し、い
ずれの場合でもX3またはX4の一方はＮを表わす。
R4，R5およびR6は同じかまたは異なつていて、
水素、C1〜C6のアルキル基、C1〜C6のアルコキ
シ基、C1〜C6のアシル基、ハロゲン、トリフル
オロメチル、ニトロ、SO3H、シアノ、C1〜C8の
アシルアミノ基、アルキル基のそれぞれがC1〜
C6のジアルキルアミノ基、またはC6〜C10のアリ
ール基を表わし、これらはC1〜C6のアルキル基、
C1〜C6のアルコキシ基、ハロゲン、シアノ、ニ
トロ、トリフルオロメチル、SO3H、C1〜C6のア
シル基またはアルキル基のそれぞれがC1〜C6の
ジアルキルアミノ基で置換されてもよく、または R5およびR6は一緒になつて縮合芳香環、好ま
しくはベンゼン環を形成し、これらは１または２
個の基R4で定義したような基で置換されてもよ
く、ＡおよびＧは式（）の場合で上述したよう
な意味を有する。 一般式（）を有する化合物においては、X3
は好ましくはCHを表わし、X4は好ましくは窒素
を表わす。R4，R5およびR6は同じかまたは異な
つていて、好ましくは水素、C1〜C4のアルキル、
C1〜C4のアルコキシ、アシルアミノ（ここで酸
基はC1〜C6の脂肪族または芳香族でもよい。）、
C1〜C4のジアルキルアミノ、ニトロ、シアノ、
ハロゲンまたはアリールを表わし、これらは場合
によつてはC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコ
キシまたはハロゲンで置換されていてもよい。特
に好適なのは、R4，R5およびR6が水素、C1〜C4
のアルキル、フエニル或いはハロゲンであるか、
またはR5およびR6が一緒になつて縮合ベンゼン
環を形成するものである。 本発明の試剤の適当な発色性基質としては、そ
の他、次のような一般式を有する化合物がある。 式中、 R4，R5，R6，ＡおよびＧは式（）の場合に
述べたような意味を有する。 一般式（），（）および（）においては、
Ｇ−Ａ−は好ましくは次のような一般式を有する
基を表わす。 式中、 R7は水素、または１〜15個、好ましくは１〜
９個の炭素原子を有し、また場合によつては水酸
基、メルカプトまたはカルボキシル基で置換され
ている、場合によつて分枝状化したアルキル、シ
クロアルキルまたはアリール基を表わし、 R8は水素、または好ましくは−CO−アルキ
ル、−CO−アルアルキル、−CO−アリール、−
SO2−アルキル或いは−SO2−アリール（アルキ
ル基は１〜９個好ましくは１〜６個の炭素原子を
有する直鎖状または分枝状で、アリール基は好ま
しくは、場合によつては、C1〜C4のアルキル基、
C1〜C4のアルコキシ基またはハロゲンで置換さ
れたベンゼン環を表わす。）を表わす。 Ｇ−Ａ−は、特に好ましくは慣用の窒素保護基
を有する、天然産のアミノ酸またはこのようなア
ミノ酸の２〜８個のペプチドの基を表わす。 このアミノ酸基は、ここではＬ−体でもＤ−体
でもまたはラセミ体であつてもよい。特に好まし
い基はグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、フエニルアラニン、およびチロシ
ンの基で、Ｌ−体はいずれの場合でも特に好適で
ある。存在するどんな遊離の水酸基もアシル化、
好ましくくはアセチル化してもよい。 Ａの定義におけるペプチド基は、例えばジ−、
トリ−、テトラ−、およびペンタペプチド、好ま
しくはジ−およびトリペプチドを意味し、好適な
アミノ酸成分は前記のようなアミノ酸である。 一般式（），（）および（）を有する基質
は対応するフエノール類と、一般式Ｇ−Ａ−OH
（式中、ＧおよびＡは前述のような意味を有す
る。）を有するアミノ酸或いはペプチド、または
これらの適当な反応性誘導体とを、ペプチド化学
において普通に用いられる方法で反応させること
によつて得られる。 適当な反応性誘導体の例としては、例えば、ク
ロロギ酸エチル、または例えばペンタクロロフエ
ニルエステルもしくはＮ−ヒドロキシベンゾトリ
アゾールエステルのような活性エステルとの酸塩
化物およびペプチド合成において通常使用される
混合酸無水物がある。 本発明の試剤は、好ましくは、フエノール類
（酵素的分解中に遊離する）と反応する発色剤と
して、次のような一般式を有するジアゾニウム塩
を含んでいる。 R′は低級アルキル、低級アルコキシ、低級ア
ルキルメルカプト、ヒドロキシ、ニトロ、シア
ノ、トリフルオロメチル、C1〜C8のアルキルス
ルホンアミド、アリールスルホンアミド、C1〜
C8のアルキルスルホン、アリールスルホン、ス
ルホン酸またはカルボン酸、Ｎ−モルホリノ、Ｎ
−チオモルホリノ、Ｎ−ピロリジノ、また場合に
よつてN′−アルキル化されたＮ−ピペラジノま
たはＮ−ピペリジノ基、ハロゲンまたは水素を表
わし、 R′3は低級アルキル、低級アルコキシ、アリー
ルオキシ、低級アルキルメルカプト、アルキルア
ミノもしくはジアルキルアミノ、ヒドロキシル、
ニトロ、シアノ、C1〜C8のアルキルスルホンア
ミド、アリールスルホンアミド、C1〜C8のアル
キルスルホン、アリールスルホン、スルホン酸も
しくはカルボン酸、Ｎ−モルホリノ、Ｎ−チオモ
ルホリノ、またはＮ−ピロリジノ、また場合によ
つて、N′−アルキル化されたＮ−ピペラジノま
たはＮ−ピペリジノ、またはフエニルアミノ基、
場合によつては低級アルキルもしくは低級アルコ
キシ基で置換されたフエニル基、ハロゲンまたは
水素を表わし、 R′2，R′4およびR′5は同じかまたは異なつたも
ので、各々低級アルキル、低級アルコキシ、ニト
ロ、C1〜C8のアルキルスルホンアミド、アリー
ルスルホンアミド、C1〜C8のアルキルスルホン、
アリールスルホン、スルホン酸もしくはカルボン
酸または低級アルキルメルカプト基、ハロゲンま
たは水素を表わし、Ｘは安定化陰イオンを表わ
す。 尚、どんな場合でも、R′1〜R′5の二つの隣接し
た基が環化して、場合によつてはハロゲン、C1
〜C6のアルキル、C1〜C6のアルコキシ、もしく
はニトロ、スルホン酸またはカルボン酸基で置換
された、ベンゼン環を形成し、その結果ナフタリ
ン系のジアゾニウム塩を形成することもできる。 一般式（）において、好ましくは、 R′1はC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコキ
シ、ヒドロキシル、ニトロ、ハロゲンまたは水素
を表わし、 R′3はC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコキ
シ、アリールオキシ、C1〜C4のアルキルアミノ、
アルキル基のそれぞれがC1〜C4のジアルキルア
ミノ、ニトロ、C1〜C4のアルキルスルホンアミ
ド、アリールスルホンアミド、C1〜C4のアルキ
ルスルホン、アリールスルホン、Ｎ−モルホリ
ノ、Ｎ−ピロリジノ、フエニルアミノ、もしくは
スルホン酸基または水素を表わし、 R′2，R′4およびR′5は同じかまたは異なつてい
てもよく、C1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコ
キシ、C1〜C4のアルキルアミノ、アルキル基の
それぞれがC1〜C4のジアルキルアミノ、ニトロ、
C1〜C4のアルキルスルホンアミド、アリールス
ルホンアミドもしくはスルホン酸基、ハロゲン、
または水素を表わす。 いずれの場合でもR′1〜R′5の二つの隣接した基
は、場合によつては環化して、場合によりハロゲ
ン、またはC1〜C4のアルキル、C1〜C4のアルコ
キシ、ニトロ、またはスルホン酸基で置換された
ベンゼン環を形成してもよい。 （）式に関しては、各々の場合のアリールは
６〜12個、好ましくは６個の炭素原子を有する芳
香族基を表わし、場合によつてはハロゲン、C1
〜C4のアルキルまたはC1〜C4のアルコキシで置
換されていてもよい。 一般式（）を有するジアゾニウム塩はそれ自
体既知であり、本来既知の方法（ホウベン−ウエ
イル（Houben−Weyl）：有機化学の手法、第
Ｘ／３巻）によつて合成することができる。 本発明のタンパク質分解酵素および特に白血球
酵素検出用の試剤は、適当な緩衝系を含んでいる
ことが好ましい。この目的のために可能な系とし
ては、例えばリン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩／重炭
酸塩、炭酸塩、バルビツール酸塩、トリス−（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン（＝トリス）、２
−アミノ−２−メチル−プロパン−１，３−ジオ
ール（＝アメジオール）またはアミノ酸緩衝液が
あり、PH値と容量は原則として、測定溶液中また
は試験片上において６〜10、好ましくは７〜９の
PH値が確立するように選ぶ。 場合によつては、本発明の試剤に、さらに洗剤
を一緒に用いるのが有利であるかも知れない。と
いうのもこうすることによつて、一層均質な色の
分布と一層濃い着色が得られるからである。使用
できる洗剤としては、陽イオン性および陰イオン
性洗剤、並びに両性および非イオン性洗剤があ
る。ここに記述してもよい例としては、ベンジル
−ジメチル−テトラデシルアンモニウムクロリ
ド、ドデシル硫酸ナトリウム、ゼフイロール、ポ
リビニルピロリドン、ヘパリノイド
（heparinoid）、および塩基性アミノ酸を含むホモ
ポリアミノ酸またはコポリアミノ酸〔イー・カチ
ヤルスキー（E.Ka−tchalski）およびエム・セ
ラ（M.Sela）：アドバンシス・オブ・プロテイ
ン・ケミストリー（Advances of Protein
Chemistry）13，243〜492（1958）；並びにシー・
ビー・アンフインゼン（C.B.Anfinsen）、エム・
エル・アンソン（M.L.Anson）、ジエー・テイ
ー・エドサール（J.T.Edsall）およびケー・バイ
レイ（K.Bailey）（編集者）；アカデミツク・プ
レス・インク・パブリツシヤース（Academic
Press.Inc.Publishers）、ニユーヨーク、ニユーヨ
ーク（New York，N.Y.）〕および逐次ポリアミ
ノ酸がある。使用できる塩基性アミノ酸は、側鎖
にアミノ基またはグアニジノ基を有するアミノ酸
である。その中には特にアルギニンの他にリジン
およびオルニチン、さらに例えばジアミノ酸、ジ
アミノプロピオン酸またはジアミノピメリン酸な
どのような天然タンパク質中に生じない塩基性ア
ミノ酸も含まれる。ポリアミノ酸の成分となるア
ミノ酸は、ラセミ体でも、または光学活性のＤ−
体もしくはＬ−体でもよい。ポリアミノ酸の分子
量は、1000〜2000000で、好ましくは、5000〜
500000である。塩基性アミノ酸の含有量はポリア
ミノ酸に対して５〜100モル％、好ましくは20〜
100モル％である。 適切な場合は、前述の洗剤の二つ以上の混合物
も用いることもできる。 洗剤は、好ましくは液状試験において10-4〜
10-1重量％、特に好ましくは10-4〜10-2重量％の
濃度で用いる。また含浸溶液中の含有量は、0.01
〜10重量％が好ましく、特に好ましいのは0.1〜
５重量％である。 白血球測定の際は、周囲に固定した試薬混合物
の助けによつて上記の洗剤を用いるのが特に有利
である。というのは、こうすることによつて、一
層均質な色の分布と、一層濃い着色が得られるか
らである。 本発明の試剤では、上記の色々な試剤は本来既
知の型の不活性担体に組み込ませるのが好まし
く、特に好ましい担体マトリツクスは、例えば特
に紙、またプラスチツク製の膜、ガラス繊維の
マツト（米国特許明細書第3846247号）、多孔性の
セラミツク片、合成不織布、スポンジ状材料（米
国特許明細書第3552928号）、フエルト、織物、木
材、セルロースまたはシリカゲルのような多孔性
材料である。 この目的のために、例えば水、メタノール、エ
タノール、アセトン、ジメチルホルムアミドまた
はジメチルスルホキシドのような容易に除去でき
る適当な溶媒に、上記の試薬を溶かした溶液を上
記の担体に含浸させる。この操作は別個の２工程
で行うことが好ましい。即ち、緩衝液やその他の
水溶性添加物を含んだ水溶液を先ず材料に含浸さ
せる。次に、これに、一般式（）を有する酵素
の発色性基質および活性剤の溶液を含浸させる。
しかしこの含浸操作は違つた順序でも、また二つ
の含浸溶液の組成の異なつたものを用いても行う
ことができる。含浸液または被験液体はいずれの
場合でも10-4〜10-1モル／、特に10-3〜10-2モ
ル／の濃度の発色性基質およびジアゾニウム
塩、並びに0.01〜10重量％、特に0.5〜５重量％
の濃度のウンデカノールを含有することが好まし
い。 マトリツクスとして紙を用いる場合は、出来
上つた試験紙はそのまま使えるが、また本来既知
の方法で把持部材に張りつけたり、または好まし
くは例えばドイツ公開明細書第2118455号に従つ
て、プラスチツクと細かい網の目の網織物との間
に封止してもよい。 フイルムで被覆した試験片を作るには、例えば
ポリビニルエステルまたはポリアミドのようなフ
イルム形成物質の溶液または分散液にすべての試
薬をいれて、均質に混合することが好ましい。そ
してこの混合物の薄層をプラスチツク製の担体の
上に塗り、乾燥する。乾燥後、得られたフイルム
被覆試験片を切断して、そのまま使用してもよ
く、または本来既知の方法で把持部材に張りつけ
てもよく、または例えばドイツ公開明細書第
2118455号に従つて、プラスチツクと細かい網の
目の網織物との間に封止してもよい。 本発明のエステル分解および／またはタンパク
質分解酵素、特に白血球酵素検出のための診断用
試剤は、普通の薬学的添加物を上記の試験試剤の
成分に加え、混合物を粒状にすることによつて、
粉末状混合物または試薬錠剤の形に作ることがで
きる。このようなタイプの添加剤の例としては、
例えば単糖類、少糖類、多糖類のような炭水化
物、マンニトール、ソルビトール、キシリトール
のような糖アルコール、またはポリエチレングリ
コール、ポリビニルピロリドンのようなその他の
可溶性不活性化合物がある。粉末状混合物または
試薬錠剤の最終重量は、通常、約50〜200mg、好
ましくは50〜80mgである。 それぞれ約５〜20mg、好ましくは約10mgの全重
量を有する凍結乾燥物を作るには、試験に必要な
すべての試薬の他に、例えばポリビニルピロリド
ンのような普通の賦形剤、また適切な場合は、例
えばマンニトール、ソルビトール、キシリトール
のような他の添加剤を含んだ溶液を凍結乾燥す
る。 本発明の診断用試剤で溶液状のものは、試験に
必要なすべての試薬を含んでいることが好まし
い。使用できる溶剤としては、水および、例えば
メタノール、エタノール、アセトン、ジメチルホ
ルムアミドのような水溶性有機溶剤と水との混合
物がある。貯蔵上の理由から、試験に要する試薬
を二つ以上の溶液に分けて、実際試験する間だけ
一緒にするのが得策であろう。 このようにして作つた診断用試剤は、被験体液
に浸したり、対象となる体液に加えた後、色の形
成によつてエステル分解および／またはタンパク
質分解酵素、特に白血球酵素の存在を迅速且つ簡
単に検出でき、その色の形成は視覚によつて、ま
たは例えば反射率光度測定法またはセル中で光度
測定的に測定される。セル毎の白血球酵素の活性
は、本質的に一定のパラメータと見なすことがで
きるので、被験体液の白血球の濃度は、形成した
色の濃さから測定できる。白血球酵素の活性は、
白血球の溶解後も十分保持されるので、この際損
なわれない白血球も溶解した白血球も共に記録さ
れる。従つて溶解誤差は全く起らない。 次の実施例は本発明の説明に役立つものであ
る。尚、別に指定しない限り、記載してある量は
重量部または重量％である。 実施説明書 基質に応じ、溶解剤として50〜250μのＮ−
メチルピロリドンを、問題となつている緩衝液
2.25mlに加え、緩衝液を用いてその溶液の容量を
2.5mlとした。次に、５〜100mgのｎ−ウンデカノ
ールを１mlのＮ−メチルピロリドンに溶かした溶
液5μおよび２mgのドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）またはその他の洗剤４mgを１mlの水また
はＮ−メチルピロリドンに溶かした溶液5μを
反応混合物に加えた。十分に撹拌後、10-1モルの
基質をＮ−メチルピロリドン、ジメチルホルムア
ミドまたはジメチルスルホキシドに溶かした溶液
5μを反応溶液に加え、白血球の懸濁液を加え
た後、指定した波長における吸光度の増加を連続
的に監視した。また基質の自然加水分解は、白血
球を加えない対照群で、吸光度の増加によつて測
定する。 反応速度を測定するために、酵素反応で得られ
た吸光度の増加から自然加水分解について測定し
た値を差引く。基質の分解についての絶対値（モ
ル数／分）は、モル吸光係数によつて吸光度の差
から算出できる。 実施例 １ 紙（例えばイートン・アンド・ダイクマン
（Eaton and Dikeman）205）に下記の溶液を順
次含浸させた後、60℃で乾燥した。 溶液１：３％のポリビニルピロリドンを含む
0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン／塩酸緩衝液（PH＝8.8） 溶液２：無水アセトン１中に7.5・10-3モルの
Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン ５−ヒドロキシ−
１，２−ベンズイソチアゾリルエステル、10-2
モルの２，４−ジメトキシベンゼンジアゾニウ
ムテトラフルオボレートおよび3.5ｇのｎ−ウ
ンデカノールを含むもの。 白血球を含む尿中に浸すと、赤褐色に変化する
淡黄色の試験紙が得られる。 実施例 ２ SDSまたは平均分子量14000のポリリジンを加
えたPH8.8の0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−
アミノメタン／塩酸緩衝液中の白血球によるＮ−
トシル−Ｌ−アラニンインドキシルエステルの酵
素的分解に対するアルカノール類の促進作用
（360nmで測定）。 【表】 実施例 ３ 0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン／塩酸緩衝液（PH8.8）中で、50μのＮ−メ
チルピロリドン／試験群および10μｇ／試験の
SDSの存在の下に、白血球によるＮ−トシル−Ｌ
−アラニンインドキシルエステルの分解に対する
ｎ−ウンデカノールの促進作用の濃度依存性
（360nmで測定）。 【表】 実施例 ４ 0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン／塩酸緩衝液（PH8.4）中で、100μのＮ−
メチルピロリドンの存在下における白血球による
Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン ５−ヒドロキシ−
１，２−ベンズイソチアゾリルエステルの分解の
活性剤および洗剤の添加による促進作用（325nm
で測定）。 【表】 ポリアミノ酸の数平均分子量は括弧内に示してあ
る。
実施例 ５ 0.1Mトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメ
タン塩酸緩衝液（PH8.8）中で、250μのＮ−メ
チルピロリドンの存在下における白血球によるＮ
−トシル−Ｌ−アラニン ３−ヒドロキシ−５−
フエニルピロールエステルの分解の活性剤および
洗剤の添加による促進作用（330nmで測定）。 【表】 実施例 ６ 種々の0.1M緩衝液（PH8.4）中における白血球
によるＮ−トシル−Ｌ−アラニン ３−ヒドロキ
シ−５−フエニルピロールエステルの分解の、
250μのＮ−メチルピロリドン、並びに活性剤
および洗剤の添加による促進作用（330nmで測
定）。 【表】 【表】 トリス＝トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン塩酸緩衝液、BDTA＝ベンジル−ジメチ
ル−テトラデシルアミン塩酸塩、ポリアミノ酸の
平均分子量は括弧内に示してある。 Ｎ−トシル−Ｌ−アラニルエステル製造の一般
操作説明書 いずれの場合でもこのエステルは、粉末状炭酸
カリウムの存在下に、無水メチルエチルケトンま
たは無水トルエン中で、Ｎ−トシル−Ｌ−アラニ
ルクロリドをフエノール類と反応させて製造し
た。約55℃で６〜12時間撹拌後、40〜70％のフエ
ノールが反応していた。フエノール：K2CO3：
酸塩化物のモル比は通常１：1.5：1.5であつた。
またPH値は全反応時間中、約７であつた。仕上げ
のために50℃で炭酸カリウムを別後、真空中で
溶剤を留去した。生成物はシリカゲル−溶離剤
（石油エーテル：アセトン＝約９：１）を用いる
カラムクロマトグラフイー、次いで再結晶によつ
て精製した。 Ｌ−ｐ−トシルアラニン 文献：イー・フイツシヤー（E.Fischer）および
ダブリユ・リプシツツ（W.Lipschitz），B.48，
362（1915） 83.7ｇ（0.93モル）のＬ−アラニンを約2Nの水
酸化ナトリウム溶液465mlに溶解した。ｐ−トル
エンスルホニルクロリド186ｇ（0.976モル）を、
約70〜72℃で少しずつ20分かけてこの溶液に加え
た。このスルホニルクロリド添加中は、自動滴定
装置を用い、約2Nの水酸化ナトリウム溶液で反
応混合物のPHを10に保つた。ここで2N水酸化ナ
トリウム溶液560mlが消費された。反応混合物の
PHが最早変化しなくなつたら、混合物を15〜５℃
に冷却し、37％濃度の塩酸でPHを３にした。分離
した生成物を吸引過し、湿つた塊を2350mlの
水から再沈澱させた。収量：融点132〜135℃のＬ
−ｐ−トシルアラニン185.5ｇ（理論量の82％） ｐ−トシル−Ｌ−アラニルクロリド 透明な溶液が生ずるまで、158.1ｇ（0.65モル）
のＬ−ｐ−トシルアラニンを40℃で350mlの塩化
チオニル中で撹拌した。次に、過剰の塩化チオニ
ルを水流ポンプの真空下で留去した。フラスコ中
の残渣を300mlの蒸留トルエンにとつた。透明な
僅かに黄味がかつた溶液が得られ、これを900ml
の撹拌したナフサに注いだ。酸無水物が沈殿し
た。翌日これを吸引過し、軽ガソリンで洗浄
し、真空デシケーター内で塩化カルシウム／水酸
化カリウム上で乾燥した。 収量：融点81〜83℃の殆んど無色の結晶155ｇ
（理論量の91％）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (a) 酵素の発色性基質として、フエノール類
のアミノ酸エステルまたはペプチドエステル、
および (b) 成分(a)のアミノ酸エステル結合またはペプチ
ドエステル結合の酵素的分解を促進する物質と
して、ｎ−ウンデカノールを含むことを特徴と
する、エステル分解酵素および／またはタンパ
ク質分解酵素検出用の試剤。 ２ 試薬が、試験片に包含されていることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のの試剤。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE3413119.1 | 1984-04-06 | ||
| DE19843413119 DE3413119A1 (de) | 1984-04-06 | 1984-04-06 | Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60224500A JPS60224500A (ja) | 1985-11-08 |
| JPH0550276B2 true JPH0550276B2 (ja) | 1993-07-28 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60069244A Granted JPS60224500A (ja) | 1984-04-06 | 1985-04-03 | エステル分解酵素及び／又はタンパク質分解酵素の検出用試薬 |
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1984
- 1984-04-06 DE DE19843413119 patent/DE3413119A1/de not_active Withdrawn
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1985
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