JPH02451A - 酵母ｎａｄｐｈ−チトクロムｐ４５０還元酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵母ＮＡＤＰ）Ｉ−チトクロムＰ４５０還元
酵素をコードする遺伝子に関する。

〔従来技術および問題点〕

ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素（ＮＡＤＰＩ
Ｉ　；　フェリチトクロムオキシドレダクターゼ、ＥＣ
１，６，２，４）は、哺乳動物や酵母などの真核細胞の
ミクロソーム１１りに存在し、電子伝達系を構成する主
要酵素である。本酵素は、分子内にフラビンアデニンモ
ノヌクレオチドとフラビンモノヌクレオチドを１分子ず
つ含有するフラビン酵素である。本酵素は、ＮＡＤＰＩ
Ｉからの電子を、ミクロソーム電子伝達系の末端酵素で
あるチトクロムＰ４５０へ伝達する。チトクロムｌ”４
５０は多くの分子種からなる酵素群で、各々の分子種は
幅広い基質特異性を示し、しかもその基質特異性は重複
しているので、広範囲の脂溶性化合物に対して酸化反応
を示すことができる。

チトクロムＰ４５０は分子多様性を示すにもかかわらず
、いずれの分子種に対しても、同じ還元酵素がＮＡＤＰ
Ｈからの電子を供給することができる。この還元酵素に
よるＮＡ［ＪｐＨからチトクロムＰ４５０への電子伝達
は、生物種をこえておこり、例えば、ラット肝還元酵素
がウサギ肝チトクロムＰ４５０へ、酵母還元酵素がウサ
ギあるいはラット肝チトクロムＰ４５０へ＋ＩＡＤＰＩ
からの電子を伝達することができる。

本発明者らは、すでに、ラント肝チトクロムＰ４５０遺
伝子およびラント肝ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還
元酵素遺伝子を単離しく特開昭６１−５６０７２、特開
昭６２−１９０８５　）　、酵母内でこれらの遺伝子を
発現させ、酸化活性を有する酵素蛋白質を生産させるこ
とに成功した。酵母内で発現したラット肝チトクロムＰ
４５０と還元酵素は、酵母ミクロソーム膜に局在し、ラ
ット肝チトクロムＰ４５０に依存した酸化活性を発揮し
た。さらに、発明者らは、チトクロムＰ４５０と還元酵
素の両方を生産する酵母菌株を製造し、これがチトクロ
ムＰ４５０に依存した酸化活性を示し、各種化合物の酸
化反応プロセスへバイオリアクターとして利用できるこ
とを示した（特開昭６２−１０４５８２　）。また、発
明者らは、チトクロムＰ４５０と還元酵素の両遺伝子を
連結し、１分子でチトクロムＰ４５０と還元酵素の両酵
素の機能を発揮できる新規モノオキシゲナーゼの作出に
成功した（特開昭６ｌ−１８７７１３）　。

一方、ラット肝還元酵素のほかに、ウサギ肝還元酵素遺
伝子の取得にも成功した（特願昭６１−１３４４３　）
。

このように、還元酵素は、チトクロムＰ４５０とともに
用いることにより、酸化反応用のバイオリアクターとし
て利用できる。しかしながら、ラット肝Ｐ４５０とラッ
ト肝還元酵素の酵母における生産量を比較した場合、Ｐ
２Ｓ５の生産量の方が高かった。

これは、１つには、ラット肝還元酵素の酵母内での安定
性が劣るためと考えられる。そこで、ラット還元酵素の
かわりに、宿主である酵母の還元酵素を用いれば、酵母
還元酵素は、酵母自身の蛋白質であり、大量生産が可能
になると考えられる。

しかも酵母還元酵素の作用によるＮＡＤＰＨからの電子
のラットＰ４５０への供給はきわめて効率的である。

したがって、酵母還元酵素を生産することにより酸化反
応用バイオリアクターの性能向上が期待できる。

〔問題解決の手段〕

本発明者らは、今回、酵母からＮＡＩ）Ｐ）Ｉ−チトク
ロムＰ４５０還元酵素の遺伝子をクローニングすること
に成功した。これにより、酵母還元酵素を生産すること
が可能になった。

すなわち、本発明の第１の目的は、酵母還元酵素をコー
ドする遺伝子を提供することにある。たとえば、第２図
に記載した塩基配列を含む遺伝子であり、さらには、第
２図に記載したアミノ酸配列に対応する塩基配列を含む
遺伝子である。

よく知られているように酵母は本発明の実施例で用いた
サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒ。

Ｂｅｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の他にも多種存在し
、本発明はそれらに由来する酵母還元酵素をコードする
遺伝子も含むものである。

また、遺伝子組換え技術によれば基本となるＤＮＡの特
定の部位に、Ｉｉ　ＤＮＡがコードするものの基本的な
特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善す
るように、人為的に変異を起こすことができる。　本発
明により提供される遺伝子に関しても、同様に人為的に
挿ノい欠失、置換を行うことにより天然の遺伝子と同等
あるいは改善された特性とすることが可能であり、本発
明はそのような変異遺伝子を含むものである。

更に、多くのアミノ酸についてはそれをコードするＤＮ
Ａ塩基配列は複数存在する。従って、その塩基配列は一
義的に決まらず多数の可能性が在りうる。本発明者らに
より明らかにされた酵母還元酵素をコードする遺伝子の
場合も、そのＤＮＡの塩基配列は、天然の遺伝子の塩基
配列以外にも多数の可能性があるが、本発明の遺伝子は
、天然のＤＮＡ塩基配列のみに限定されるものではなく
、本発明により明らかにされたアミノ酸配列をコードす
る他のＤＮＡ塩基配列を含むものである。

本発明の第２の目的は、酵母還元酵素をコードする塩基
配列を含む組換え体ＤＮＡを提供することにある。好ま
しいＤＮＡは、宿主微生物細胞内で自己増殖可能な（す
なわち、自己増殖するに必要な塩基配列を含む）ＤＮＡ
であり、特に好ましいのは、本発明書中でｐｇＧＹＲと
命名されたものである。

本発明の第３の目的は、酵母還元酵素をコードする塩基
配列を含み、宿主微生物細胞内で自己増殖可能なＤＮＡ
を保持する形質転換微生物を提供することにある。特に
好ましい微生物は、本明細書中でエンエリキアユリＹ１
０９０　（ｐｇＧＹＲ）と命名されたものである。

酵母還元酵素をコードする遺伝子は、酵母遺伝子の場合
にはアクチンなどの一部の遺伝子を除き介在配列を持た
ないので、そのままで宿主微生物細胞内で発現可能であ
ることから、例えば、酵母細胞の染色体ＤＮＡを直接ク
ローニングすることによって、あるいは酵母細胞から公
知の方法（ＣＡＲＬＳＯＮ、　ＭアンドＢＤＴＳＴＥＩ
Ｎ、　Ｄ、セル（ｃｅｌｌ）　２８巻、１４５−１５４
頁、１９８２年）によりｍＲＮＡを調製し、適当なベク
ターを用いて、ｃ　ＤＮＡをクローニングすることによ
り単離できる。

本発明において、目的の還元酵素をコードする遺伝子の
ソースとなる細胞は酵母細胞であるが、好ましくはサツ
カロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する細胞をさし、さらに
好ましくはサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＡｌＩ２２
株（＾ＴＣＣ３８６２６）等を用いることができる。

ＤＮＡのクローニングの方法としては、例えば染色体Ｄ
ＮＡの場合、ラムダｇｉｌｌ　（クローンチク社）ある
いはコスミンド・ベクター（ベーリンガー・マンハイム
社）等の適当なベクターを用いて染色体ＤＮＡライブラ
リーを作製し、スクリーニングする方法が挙げられる。

　　ｃＤＮＡの場合、例えば、酵母細胞から調製したｍ
ＲＮＡを用いて逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼ■によ
り、２末鎖ｃ　ＤＮＡを作製し、これをホモポリマー法
等の方法でｐＢＲ３２２などのベクターへ挿入する、あ
るいは岡山−バーブのクローニングベクター（ファルマ
シア社より人手可能）等の他の適当なベクターに挿入し
、これを用いてｃ　ＤＮＡライブラリーを作製し、この
ライブラリーから目的とするｃＤＮＡクローンを選抜す
る方法などを用いることができる。

ＤＮＡの選抜に関しては、酵母還元酵素に対する抗体を
用いた免疫化学的手法、ポジティブハイブリダイゼーシ
ョントランスレーションアンセイを用いたスクリーニン
グ法、蛋白質の部分アミノ酸配列に対応した合成ＤＮＡ
、第２図記載の塩基配列より合成したＤＮＡの一部をプ
ローブとしたハイブリダイゼーションによるスクリーニ
ング法など、種々の方法を用いることができる。

プローブとしては、上記の他、染色体ＤＮＡの場合は上
述の方法により得たｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの場合は上述
の方法により得た染色体ＤＮＡを用いることができる。

また、上述の方法で酵母還元酵素ＤＮＡの一部のみしか
得られなかった場合は、これをプローブとして完全なＤ
ＮＡを得ることができる。

このようにして取得した酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ
４５０還元酵素遺伝子は、これを適当なベクターに組込
み、大腸菌、酵母などの微生物細胞あるいは動物細胞等
に導入することにより、酵母ＮＡＤＰＩ＋−チトクロム
Ｐ４５０還元酵素を生産する細胞を製造することができ
る。特に酵母細胞を用いると前述のとおり効率良く酵母
ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素を生産できる
。発現ベクターとしては、宿主細胞中で複製可能な遺伝
情報を含み、自立的に増殖できるものであって、宿主か
らの単離精製が容易であり、検出可能なマーカーを持つ
ものが好適である０種々のベクターが市販されており、
ベクターの切断に用いる制限酵素等も市販されている。

これらの使用方法は公知である。例えば、大腸菌での発
現には、ｌａｃ、　ｔａｃ、けρなどのブロモ−クーを
含む発現ベクター（これらは、発現ベクターとして、あ
るいはプロモーターカートリンジとしてファＪＬ／７シ
アＰＬ社より市販されている）を用いることができる。

酵母での発現には、アルコール脱水素酵素プロモーター
、ホスフォグリセロキナーゼプロモーター、グルセロア
ルデヒド３−リン酸脱水素酵素プロモーターなどを含む
発現ベクターを用いることができる。製造した酵母還元
酵素を生産する細胞は、チトクロムＰ４５０を生産する
細胞と組合わせることにより、バイオリアクターとして
有用な化合物の生産に利用することが可能である。

以下に実施例をあげ、本発明をより詳細に説明する０本
発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、
本発明の技術分野における通常の変更をすることができ
る。

施例１　酵母　−酵素ｃＤＮＡクローンの単離（１）酵
母ｍＲＮＡの調製 サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ａｔ１２２株（ＡＴＣＣ
３８６２６）を、１００＋ｄのＹＰＤ培地（１％酵母エ
キス、２％ポリペプトン、２％グルコース）中で、３０
℃で１８時間振とう培養したのち、菌体を集菌した。水
で２回洗浄したのち、菌体の湿重量を測定し、１ｇ菌体
あたり２Ｉｒ１の破砕バッファー（０，２Ｍ　トリス−
塩酸、ｐＨ７，５，１０＋ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．５Ｍ
　ＮａＣ１）および２ｇのグラスビーズ、０．１％ジエ
チルオキンギ酸エステルを加え、１分間ずつ３回ポルテ
ックスミキサーにかけた。つぎに等容のフェノール・ク
ロロホルム（１：ｌν／Ｖ）で２回、等容のクロロホル
ムで１回抽出を行ったのち、水層に２．５倍容のエタノ
ールを添加し、核酸を沈澱させた。

得られた核酸をオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに通し
て、ポリ（Ａ）を存するｍＲＮＡを分画した。エタノー
ル沈澱により回収した核酸を平衡化緩衝液（ｌｏｍＭ　
トリス−塩酸、ｐＨ７，５，ｌｄ　ＥＤＴＡ。

０．５Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％ＳＯ５）で約３０　　Ａ
ｚｂｏ　／Ｉａｌ　になるように溶解した。これを６５
°Ｃで５分間加熱したのち、あらかじめ平衡化緩衝液で
平衡化したオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムにかけ、平
衡化緩衝液で十分洗浄した。洗浄後、滅菌水で溶出を行
い、溶出されるポリ（Ａ）ＲＮＡ画分を、終１度２％の
酢酸カリウム水溶液、２倍容の冷エタノールを加え、エ
タノール沈澱を施し、ＲＮＡを回収した。

ＲＮＡは９０％エクノ′−ルで洗浄したのち、滅菌水に
１容解した。

（２）ＣＤＮＡライブラリーの作製 調製したポリ（Ａ）ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成は、アマ
ージャム社から市販されているｃＤＮＡ合成システム（
製品コードＮＯ，ｌｌｐＨ，１２５６）を用い、製品に
添付されているプロトコールに従って実施した。即ち、
逆転写酵素によりｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合成し
たのち、リボヌクレアーゼＨで、ＲＮＡｊＸに二ンクと
ギヤノブを入れ、これを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを
用いて修復合成することにより、ＲＮＡ鎖をＤＮＡ鎖に
置換した。

最後にＴ、ＤＮＡポリメラーゼにより、ＤＮＡ鎖の両末
端を平衡化した。ｖｔいて、プロメガバイオチック社か
ら市販されているプロトクローンラムダｇｔｌｌシステ
ムを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。方法は
、すべて製品に添付されているプロトコールに従った。

まず、２本積ｃＤＮＡ内に存在するＥｃｏ旧部位を、Ｅ
ｃｏＲＩメチラーゼにより、メチル化し、後のεｃｏＲ
Ｉ消化から保護したのち、両端にＥｃｏＲＩリンカ−を
付加した。　　ＥｃｏＲｌで切断したのち、ｃＤＮＡを
ラムダｇｉｌｌのＥｃｏＲＩアームを連結し、インビト
ロパッケージングを行い、大腸菌Ｙ１０９０株（製品に
添付　　　　）を感染させることにより、ｃ　ＤＮＡラ
イブラリーとした。

（３）酵母還元酵素ｃＤＮＡクローンの選抜作製したｃ
ＤＮＡライブラリーから、酵母還元酵素ｃＤＮＡクロー
ンを選抜するために、酵母還元酵素に対する抗体を用い
た免疫化学的スクリーニングを実施した。抗還元酵素ウ
サギ抗体は、精製した酵母還元酵素（Ａｏｙａｍａ　、
　Ｙら、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅａ、　Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、　　１８５巻２号３６２〜３６９ページ、」９７８
年に記載の方法により精製できる）をウサギに投与する
ことにより、容易に調製できる０作製したｃ　ＤＮＡラ
イブラリーを大腸菌Ｙ１０９０株（バイオチック社）に
感染させ、プレートあたり１０’個のプラークが生成す
るように広げた。プレートに、あらかじめ］ＯｍＭＩＰ
ＴＧ　（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド
）に浸したのち、風乾しておいたニトロセルロースフィ
ルターを重ね、３７°Ｃで３時間、４″Ｃで１時間イン
キュベートした。プレートからはがしたフィルターを、
スキムミルク液【０．５％スキムミルク（デイフコ社よ
り購入）を含む５０１１Ｍ　）リス−塩酸、ｐｌ＋８．
１５０５Ｍ　ＮａＣｌ　）　３０ｍに浸し、室温で１時
間インキュベートした。ついで、中和抗体５０μ２（大
腸菌Ｙ１０９０株の菌体を１００μ２の水にけんだくし
、９５“Ｃで１５分間熱処理したものに、抗還元酵素ウ
サギ抗体１００μ２を添加し、４°Ｃで終夜インキュベ
ートすることにより調製した）を含むスキムミルク液２
０ｄ中に浸し、室温で終夜インキュベートした。

フィルターは、Ｔ−スキムミルク液（上記スキムミルク
液に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む）２５ｍｌを用い
て、１０分間ずつ３回洗浄したのち、アルカリ性ホスフ
ァターゼを結合した抗つサギＩｇＧヤギ抗体（プロメガ
バイオチック社より購入）１０μｌを含むスキムミルク
？ｆ７．２０ｄ中に浸し、３７”Ｃで１時間インキュベ
ートした。ついで、５０ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ８）
　、１５０ｍＭ　ＮａＣｌで３回洗浄したのち、ニトロ
ブルーテトラゾリウム（７０％ジエチルホルムアミドに
５０ｍｇ／−になるようにン容解）１３２μｌ、５ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ジエチルホル
ムアミドに５０１１ｇ／ｍｆｆ１になるように溶解）６
１１ｉｌ／Ｉ！を含むＡＬＰ緩街液（１００Ｉｌガトリ
スー塩酸（ｐＨ９，５）　、１１００ＩＩ　ＮａＣ１，
５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　）　２０ｍ中に浸し、室温で１時
間インキュベートすることにより、呈色反応を実施した
。最後に、フィルターを水で２．３回洗浄したのち、風
乾した。

合計的１５，０００個のプラークについて、上記免疫化
学的スクリーニングを実施し、最終的に２個のポジティ
ブファージクローンを得た。

後述するように、２個のポジティブファージクローンは
互いにオーバーラツプするｃＤＮＡインサートを含んで
おり、ｃＤＮＡの鎖長のみが異なっていた。

２個のうちより長いｃＤＮＡインサートを含むクローン
をｐｇＣＹＲと命名した。

施例２　酵　還−酵素ゲノムＤＮＡクローン生爪胆 後述するように、実施例１−（３）で取得したｃ　ＤＮ
Ａクローンは、酵母還元酵素蛋白質の全長をコードする
には十分な長さを持っていなかった。

そこで、このｃ　ＤＮＡをプローブとしたプラークハイ
ブリダイゼーション法により、酵母ゲノムライブラリー
をスクリーニングした。

酵母ゲノムライブラリーは、クローンチク社から市販さ
れている酵母ゲノムライブラリー（ＤＮＡソースは、酵
母サツカロミセス・セレビシェＸ２１８０株（Ａ　Ｔ　
ＣＣ２６１０９）、ベクターはλｇｔｌｌ、製品コード
番号ｃｙｔ、　１０１　）を用いた。このライブラリー
は、酵母ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで部分消化
し、１．５〜６．０ｋｂに相当するＤＮＡ断片をベクタ
ーλｇｔｌｌのＥｃｏＲｒ部位に挿入したものである。

製品に添付されたクイターを目安として、プレートあた
り約１０４プラークとなるように、ライブラリーを希釈
し、プレートに広げた。プレー・トにニトロセルロース
フィルターを重ね、１分間放置することにより、ＤＮＡ
をフィルターに移した。フィルターは、０１．５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ　、０．５！１　＃ａＯＨ１■１．５Ｍ　ＮａＣ
１，０，５Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ８）　、■３ｘｓｓ
ｃでそれぞれ５分間ずつ処理したのち、８０°Ｃで真空
乾燥することにより、ＤＮＡをフィルターに固定した。

ついで、フィルターを■３ＸＳＳＣ１６８°Ｃ１１，５
時間、■３ｘＳＳＣ１１０×デンハート（０，２％フィ
コール、０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％ウソ
血清アルブミン）、６８“Ｃ５１，５時間、■ハイブリ
ダイゼーション緩衝液（５ｋＭ）リス−塩酸、ｐＨ７，
５、ｌｏＩＩＩＭ　ＥＤＴＡ　、、ＩＭ　ＮａＣ１、１
０ｘデンハート、ｔｔｇ／ｒｒｄｌサケ精巣ＤＮＡ）、
６８°Ｃ１１時間の順に処理した。その後、製品に添付
されている説明書に従い、ニックトランスレーションキ
ット（アマージャム社より購入〕を用いてニックトラン
スレーション法により酵母還元酵素ｃＤＮＡのＩＥｃｏ
ＲＩ−Ｂａｍ旧断片（第二図の塩基配列において塩基番
号第４７４−１０１５番目の断片）を３２ｐで標識し、
これを含むハイブリダイゼーション緩衝液と上記の処理
したフィルターをプラスチックバッグに詰め、６゜°Ｃ
で終夜インキュベートした。ハイブリダイゼーシヨンを
行ったフィルターは、■２ＸＳＳＣ１室温ＩＯ分、■ｌ
Ｘ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ、６０°Ｃ２５分、■０゜３
ｘ　ｓｓｃ、０．１％ＳＯ５，６０°Ｃ１２５分、■０
．１％５ＳＣ１０，１％ＳＯ５，６０°Ｃ４５分の順に
処理したのち、風乾し、Ｘ線フィルム（コダンクＸＡＲ
−５）をあてて、オートラジオグラムをとった。こうし
て、ポジティブシグナルを与えるゲノムＤＮＡクローン
を一個得、これをｐｇＧＹＲと命名した。

実施例１−（３）、２で取得した酵母還元酵素ｃ　ＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡクローンについて、それぞれインサー
トＤＮＡの制限酵素地図を作製した。

ファージＤＮＡを調製し、これをＥｃｏＲＩで切断する
ことにより、インサートＤＮＡを切り出し、ｐＵＣ１９
のＥｃｏＲ１部位にサブクローニングした。ただし、ゲ
ノムＤＮＡクローンの場合は、片側のＥｃ。

Ｒ１部位を欠失していたので、ＥｃｏＲＩと５ａｃｌで
同時消化することにより、ＤＮＡ断片を切り出し、ｐＵ
Ｃ１９のＥｃｏＲＩ、Ｓａｃ　１部位の間にサブクロー
ニングした。これらプラスミドを導入した大腸ｉ１ＪＭ
１０９株（宝酒造（株））を培養し、バーンボイムード
リ　（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙ　）の方法により、
プラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡは、種
々の制限酵素で切断し、切断したＤＮＡ断片を０６８％
アガロースゲル電気泳動で分析した０種々の制限酵素に
より切断したＤＮＡ断片の鎖長を比較することにより、
第１図に示す制限酵素地図を得た。

２つのｃＤＮＡクローンの制限酵素地図は−敗し、また
、これらは、ゲノムＤＮＡクローンの制限酵素地図と完
全にオーバーラツプした。

ｃＤＮＡインサートの全塩基配列を、ｐＵｃプラスミド
の正逆両方向のプライマーＤＮＡ　（７アルマシア社よ
り購入）および７−　ＤＥＡＺＡシークエンスキット（
宝酒造−より購入）を用いて決定した。

インサートの内部にあるＥｃｏＲ１部位周辺の塩基配列
は、他の制限酵素による切断断片をｐｕｃ　１９にサブ
クローニングしたのち、同様にして決定した。

ｃＤＮＡクローンｐｇＣＹＲは、第２図の塩基番号６７
番目から最後のポリ　（Ａ）ティルまでをコードしてい
た。この塩基配列は、チロシン残基がらはじまる６６９
アミノ酸残基をコードでき、塩基番号２０７４〜２０７
６番目の終止コドンＴＡＡでおわるオーブンリーディン
グフレームが存在した。蛋白質の読み枠としては、塩基
を１つずつずらした他の２つの読み枠も考えられるが、
これらでは、塩基配列の途中に、終止コドンが何回もあ
られれ、還元酵素の読み枠とは考えられない、この最長
の読み枠に相当する塩基配列をアミノ酸に変換した結果
を第２図に示す、このアミノ酸配列を、すでにアミノ酸
配列が既知であるラットおよびウサギのＮＡＤＰＩ＋−
チトクロムＰ４５０還元酵素の配列（ＤＮＡ、５巻１号
１−１ｏ頁、１９８６年Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　　１００
５９４５〜９５４頁　１９８６年　に記載）と比較した
結果、非常によ＜部位した配列が見出された０例えば、
還元酵素の補酵素であるＦＭＮを結合する領域と考えら
れている配列（ラット、ウサギ酵素では、ＮＩＩＶＦＹ
ＧＳＱＴＧＴＡＥＥ　）とよく偵た配列が、塩基番号１
７８番目から２２２番目にみられた。また、フラビン酵
素に特徴的なグリシン残基を含む配列（ラットでは、Ｖ
ＩＦＩＶＧＰＧＴＧＩＡＰＦＭＧＦＩＱＥＲ）　ニ相当
する配列が、塩基番号１６０６６０６番目６６５６６５
番目れた。これらの結果から判断して、第２図に示すア
ミノ酸配列は、酵母還元酵素のものであることが明らか
になった。

次に、同様の方法により、ゲノムＤＮＡインサートの塩
基配列を決定した。決定した塩基配列および、それをア
ミノ酸配列に変換した結果を、第２図に示す、ゲノムＤ
ＮＡインサートの（塩基番号６７−２０７６０７６番目
基配列は、ｃ　ＤＮＡインサートの塩基配列と完全に一
致した。この結果、酵ＩＮＡＤＰＩ＋−チトクロムＰ４
５０還元酵素のアミノ酸配列は、ｃ　ＤＮＡから決定し
た配列よりさらに２２アミノ酸残基長いことが判明した
。したがって、酵母還元酵素は、６９１アミノ酸残基が
ら成る分子量７６７５６の蛋白質であることが判明した
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵母Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｉ＋−チトクロムＰ４
５０還元酵素をコードするｃ　ＤＮＡクローンｐｇＣＹ
ＲおよびゲノムＤＮＡクローンｐｇＧＹＲの制限酵素地
図を示す０図中、黒く塗った部分は、本酵素をコードす
るＤＮＡ領域を示す。 第２図は、ｃＤＮＡクローン、ゲノムＤＮＡりローンの
インサートＤＮＡの塩基配列と、それから推定される酵
母還元酵素のアミノ酸配列を示す。 酵母還元酵素のコーディング領域は、塩基番号１から２
０７３番目に相当する。 ただし、Ａ、Ｃ，Ｄ、　Ｅ、Ｆ、Ｇ、）１．　Ｉ、に、
　Ｌ、　Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ，Ｓ、ＴＶ、ｗ、ｙはそれ
ぞれアラニン、システィン、アスパラギン酸、グルタミ
ン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソ
ロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギ
ン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレ
オニン、バリン、トリプトファン、千ロジン残基を表す
。 ゲノムＤＮＡクローンのスクリーニングに用いたプロー
ブは塩基番号４７４から１０１５番目に相当する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素を
   コードする遺伝子 （２）第２図に記載のアミノ酸配列で特定される特許請
   求の範囲第１項記載の遺伝子 （３）第２図に記載の塩基配列で特定される特許請求の
   範囲第１項記載の遺伝子 （４）酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素を
   コードする塩基配列を含む組換え体ＤＮＡ（５）微生物
   細胞内で自己増殖可能な特許請求の範囲第４項記載のＤ
   ＮＡ （６）酵母ＮＡＤＰＨ−チトクロムＰ４５０還元酵素を
   コードする塩基配列を含み、微生物細胞内で自己増殖可
   能なＤＮＡを保持する微生物 （７）微生物がエシエリキア・コリである特許請求の範
   囲第６項記載の微生物