JPH0555110B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵母NADPH−チトクロムP450還
元酵素をコードする遺伝子に関する。

〔従来技術および問題点〕

NADPH−チトクロムP450還元酵素
（NADPH；フエリチトクロムオキシドレダクタ
ーゼ、EC1.6.2.4）は、哺乳動物や酵母などの真
核細胞のミクロソーム膜に存在し、電子伝達系を
構成する主要酵素である。本酵素は、分子内にフ
ラビンアデニンモノヌクレオチドとフラビンモノ
ヌクレチドを１分子ずつ含有するフラビン酵素で
ある、本酵素は、NADPHからの電子を、ミク
ロソーム電子伝達系の末端酵素であるチトクロム
P450へ伝達する。チトクロムP450は多くの分子
種からなる酵素群で、各々の分子種はは幅広い基
質特異性を示し、しかもその基質特異性は重複し
ているので、広範囲の脂溶性化合物に対して酸化
反応を示すことができる。チトクロムP450は分
子多様性を示すにもかかわらず、いずれの分子種
に対しても、同じ還元酵素がNADPHからの電
子を供給することができる。この還元酵素による
NADPHからチトクロムP450への電子伝達は、
生物種をこえておこり、例えば、ラツト肝還元酵
素がウサギ肝チトクロムP450へ、酵母還元酵素
がウサギあるいははラツト肝チトクロム
P450NADPHからの電子を伝達することができ
る。

本発明者らは、すでに、ラツト肝チトクロム
P450遺伝子およびラツト肝NADPH−チトクロ
ムP450還元酵素遺伝子を単離し（特開昭61−
56072、特開昭62−19085）、酵母内でこれらの遺
伝子を発現させ、酸化活性を有する酵素蛋白質を
生産させることに成功した。酵母内で発現したラ
ツト肝チトクロムP450と還元酵素は、酵母ミク
ロソーム膜に局在し、ラツト肝チトクロムP450
に依存した酸化活性を発揮した。さらに、発明者
らは、チトクロムP450と還元酵素の両方を生産
する酵母菌株を製造し、これがチトクロムP450
依存した酸化活性を示し、各種化合物の酸化反応
プロセスヘバイオリアクターとして利用できるこ
とを示した（特開昭62−104582）。また、発明者
らは、チトクロムP450と還元酵素の両遺伝子を
連結し、１分子でチトクロムP450と還元酵素の
両酵素の機能を発揮できる新規モノオキジゲナー
ゼの作出に成功した（特開昭61−187713）。

一方、ラツト肝還元酵素のほかに、ウサギ肝還
元酵素遺伝子の取得にも成功した（特願昭61−
43443）。

このように、還元酵素は、チトクロムP450と
ともに用いることにより、酸化反反応用のバイオ
リアクターとして利用できる。しかしながら、ラ
ツト肝P450とラツト肝還元酵素の酵母における
生産量を比較した場合、P450の生産量の方が高
かつた。これは、１つには、ラツト肝還元酵素の
酵母内での安定性が劣るためと考えられる。そこ
で、ラツト還元酵素のかわりに、宿主である酵母
の還元酵素を用いれば、酵母還元酵素は、酵母自
身の蛋白質であり、大量生産が可能になると考え
られる。しかも酵母還元酵素の作用による
NADPHからの電子のラツトP450への供給はき
わめて効率的である。したがつて、酵母還元酵素
を生産することにより酸化反応用バイオリアクタ
ーの性能向上が期待できる。

〔問題解決の手段〕 本発明者らは、今回、酵母からNADPH−チ
トクロムP450還元酵素の遺伝子をクローニング
することに成功した。これにより、酵母還元酵素
を生産することが可能になつた。

すなわち、本発明の第１の目的は、酵母還元酵
素をコードする遺伝子を提供することにある。た
とえば、第２図に記載した塩基配列を含む遺伝子
であり、さらには、第２図に記載したアミノ酸配
列に対応する塩基配列を含む遺伝子である。

よく知られているように酵母は本発明の実施例
で用いたサツカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）の他にも多種存在
し、本発明はそれらに由来する酵母還元酵素をコ
ードする遺伝子めも含むものである。

また、遺伝子組換え技術によれば基本となる
DNAの特定の部位に、該DNAがコードするもの
の基本的な特性を変化させることなく、あるいは
その特性を改善するように、人為的に変異を起こ
すことができる。本発明により提供される遺伝子
に関しても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を
行うことにより天然の遺伝子と同等あるいは改善
された特性とすることが可能であり、本発明はそ
のような変異遺伝子を含むものである。

更に、多くのアミノ酸についてはそれをコード
するDNA塩基配列は複数存在する。従つて、そ
の塩基配列は一義的に決まらず多数の可能性が在
りうる。本発明者らにより明らかにされた酵母還
元酵素をコードする遺伝子の場合も、そのDNA
の塩基配列は、天然の遺伝子の塩基配列以外にも
多数の可能性があるが、本発明の遺伝子は、天然
のDNA塩基配列のみに限定されるものではなく、
本発明により明らかにされたアミノ酸配列をコー
ドする他のDNA塩基配列を含むものである。

本発明の第２の日的は、酵母還元酵素をコード
する塩基配列を含む組換え体DNAを提供するこ
とにある。好ましいDNAは、宿主微生物細胞内
で自己増殖可能な（すなわち、自己増殖するに必
要な塩基配列を含む）DNAであり、特に好まし
のは、本発明書中でpgGYRと命名されたもので
ある。

本発明の第３の目的は、酵母還元酵素をコード
する塩基配列を含み、宿主微生物細胞内で自己増
殖可能なDNAを保持する形質転換微生物を提供
することにある。特に好ましい微生物は、本明細
書中でエシエリキアユリY1090（pgGYR）と命名
されたものである。

酵母還元酵素をコードする遺伝子は、酵母遺伝
子の場合にはアクチンなどの一部の遺伝子を除き
介在配列を持たなので、そのままで宿主微生物細
胞内で発現可能であることから、例えば、酵母細
胞の染色体DNAを直接クローニングすることに
よつて、あるいは酵母細胞から公知の方法
（CARLSON、ＭアンドBDTSTEIN，D.セル
（cell）28巻、145−154頁、1982年）により
mRNAを調製し、適当なベクターを用いて、
cDNAをクローニングすることにより単離でき
る。

本発明において、目的の還元酵素をコードする
遺伝子のソースとなる細胞は酵母細胞であるが、
好ましくはサツカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）に属する細胞をさ
し、さらに好ましくはサツカロミセス・セレビシ
エ（Saccharomyces cerevisiae）AH22株
（ATCC 38626）等を用いることができる。

DNAのクローニングの方法としては、例えば
染色体DNAの場合、ラムダgt11（クローンテク
社）あるいはコスミツド・ベクター（ベーリンガ
ー・マンハイム社）等の適当なベベクターを用い
て染色体DNAライブラリーを作製し、スクリー
ニングする方法が挙げられる。cDNAの場合、例
えば、酵母細胞から調製したmRNAを用いて逆
転写酵素とDNAポリメラーゼにより、２本鎖
cDNAを作製し、これをホモポリマー法等の方法
でpBR322などのベクターへ挿入する、あるいは
岡山−バーグのクローニングベクター（フアルマ
シア社より入手可能）等の適当なベクターに挿入
し、これを用いてcDNAライブラリーを作製し、
このライブラリーから目的とするcDNAクローン
を選抜する方法などを用いることができる。

DNAの選抜に関しては、酵母還元酵素に対す
る抗体を用いた免疫化学的手法、ポジデイブハイ
ブリダイゼーシヨントランスレーシヨンアツセイ
を用いたスクリーニング法、蛋白質の部分アミノ
酸配列に対応した合成DNA、第２図記載の塩基
配列より合成したDNAの一部をプローブとした
ハイブリダイゼーシヨンによるスクリーニング法
など、種々の方法を用いることができる。

プローブとしては、上記の他、染色体DNAの
場合は上述の方法により得たcDNAを、cDNAの
場合は上述の方法により得た染色体DNAを用い
ることができる。また、上述の方法で酵母還元酵
素DNAの１部のみしか得られなかつた場合は、
これをプローブとして完全なDNAを得ることが
できる。

このようにして取得した酵母NADPH−チト
クロムP450還元酵素遺伝子は、これを適当なベ
クターに組込み、大腸菌、酵母などの微生物細胞
あるいは動細胞等に導入することにより、酵母
NADPH−チトクロムP450還元酵素を生産する
細胞を製造することができる。特に酵母細胞を用
いると前述のとおり効率良く酵母NADPH−チ
トクロムP450還元酵素を生産できる。発現ベク
ターとしては、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報
を含み、自立的に増殖できるものであつて、宿主
からの単離精製が容易であり、検出可能なマーカ
ーを持つものが好適である。種々のベクターが市
販されており、ベクターの切断に用いる制限酵素
等も市販されている。これらの使用方法は公知で
ある。例えば、大腸菌での発現には、lac，tac，
trpなどのプロモーターを含む発現ベクター（こ
れらは、発現ベクターとして、あるいはプロモー
ターカートリツジとしてフアルマシアPL社より
市販されている）を用いることができる。酵母で
の発現には、アルコール脱水素酵素プロモータ
ー、ホスフオグリセロキナーゼプロモーター、グ
ルセロアルデヒド３−リン酸脱水素酵素プロモー
ターなどを含む発現ベクターを用いることができ
る。製造した酵母還元酵素を生産する細胞は、チ
トクロムP450を生産する細胞と組合わせること
により、バイオリアクターとして有用な化合物の
生産に利用することが可能である。

以下に実施例をあげ、本発明をより詳細に説明
する。本発明は、以下の実施例のみに限定される
ものではなく、本発明の技術分野における通常の
変更をすることができる。

実施例 １ 酵母還元酵素cDNAクローンの単離 (1) 酵母mRNAの調製 サツカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）AH22株（ATCC
38626）を、100mlのVPD培地（１％酵母エキス、
２％ポリペプトン、２％グルコース）中で、30℃
で18時間振とう培養したのち、菌体を集菌した。
水で２回洗浄したのち、菌体の湿重量を測定し、
1g菌体あた２mlの破砕バツフアー（0.2Mトリス
ー塩酸、PH7.5，10mMEDTA，0.5M NaCl）お
よび2gのグラスビーズ、0.1％ジエチルオキシド
酸エステルを加え、１分間ずつ３回ボルテツクス
ミキサーにかけた。つぎに等容のフエノール・ク
ロホルム（１：１V/V）で２回、等容のクロロ
ホルムで１回抽出を行つたのち、水層に2.5倍容
のエタノールを添加し、核酸を沈澱させた。

得られた核酸をオリゴ（dT）セルロースカラ
ムに通して、ポリ(A)を有するmRNAを分画し
た。。エタノール沈澱により回収した核酸を平衡
化緩衝液（10mMトリス−塩酸、PH7.5、1mM
EDTA、0.5M NaCl 0.1％ SDS）で約30
A₂₆₀／mlになるように溶解した。これを65℃で５
分間加熱したのち、あらかじめ平衡化緩衝液で平
衡化したオリゴ（dT）セルロースカラムにかけ、
平衡化緩衝液で十分洗浄した。洗浄後、滅菌水で
溶出を行い、溶出されるポリ(A)RNA画分を、終
濃度２％の酢酸カリウム水溶液、２倍容の冷エタ
ノールを加え、エタノール沈澱を施し、RNAを
回収した。RNAは90％エタノールで洗浄したの
ち、滅菌水に溶解した。

(2) cDNAライブラリーの作製 調製したポリ(A)RNAからのcDNA合成は、ア
マーシヤム社から市販されているcDNA合成シス
テム（製品コードNO，RPN、1256）を用い、製
品に添付されているプロトコール従つて実施し
た。即ち、逆転写酵素によりmRNAに相補的な
cDNAを合成したのち、リボヌクレアーゼＨで、
RNA鎖にニツクとギヤツプを入れ、これを大腸
菌DNAポリメラーゼを用いて修復合成するこ
とにより、RNA鎖をDNA鎖に置換した。最後に
T₄DNAポリメラーゼにより、DNA鎖の両末端
を平衡化した。続いて、プロメガバイオテツク社
から市販されているプロトクローンラムダgt11シ
ステムを用いて、cDNAライブラリーを作製し
た。方法は、すべて製品に添付されているプロト
コールに従つた。まず、２本鎖cDNA内に存在す
るEcoRI部位を、EcoRIメチラーゼにより、メチ
ル化し、後のEcoRI消化から保護したのち、両端
にEcoRIリンカーを付加した。EcoRIで初期した
たのち、cDNAをラムダgt11のEcoRIアームを連
結し、インビトロパツケージングを行い、大腸菌
Y1090株（製品に添付 ）を感染させること
により、cDNAライブラリーとした。

(3) 酵母還元酵素cDNAクローンの選抜 作製したcDNAライブラリーから、酵母還元酵
素cDNAクローンを選抜するために、酵母還元酵
素に対する抗体を用いて免疫化学的スクリーニン
グを実施した。抗還元酵素ウサギ抗体は、精製し
た酵母還元酵素（Aoyama.Yら、Arch，
Biochem，Biophys、185巻２号362〜369ベージ、
1978年に記載の方法により精製できる）をウサギ
に投与することにより、容易に調製できる。作製
したcDNAライブラリーを大腸菌Y1090株（バイ
オテツク社）に感染させ、プレートあたり、10⁴
個のプラークが生成するように広げた。プレート
に、あらかじめ10mMIPTG（イソプロピルβ−
Ｄ−チオガラクトピラノシド）に浸したち、風乾
しておいたニトロセルロースフイルターをを重
ね、37℃で３時間、４℃で１時間インキユベート
した。プレートからはがしたフイルターを、スキ
ムミルク液〔0.5％スキムミルク（デイフコ社よ
り購入）を含む50mMトリスー塩酸、PH８、
150mM NaCl〕30mlに浸し、室温で１時間イン
キユベートした。ついで、中和抗体50μ（大腸
菌Y1090株の菌体を100μの水にけんだくし、95
℃で15分間熱処理したものに、抗還元酵素ウサギ
抗体100μを添加し、４℃で終液インキユベー
トすることにより調製した）を含むスキムミルク
液20ml中に浸し、室温で終液インキユベートし
た。

フイルターは、Ｔ−スキムミルク液（浄上記ス
キムミミルク液に0.05％Tween20を含む）25mlを
用いて、10分間ずつ３回洗浄したのち、アルカリ
性ホスフアターゼを結合した抗ウサギIgGヤギ抗
体（プロメガバイオテツク社より購入）10μを
含むスキムミルク液20ml中に浸し、37℃で１時間
インキユベートした。ついで、50mMトリスー塩
酸（PH８）、150mM NaClで３回洗浄したのち、
ニトロブルーテトラゾリウム（70％ジエチルホル
ムアミドに50mg/mlになるように溶解）132μ、
５−ブロモ−４−クロロ−３−イソドリルリン酸
（ジエチルホルムアミドに50mg/mlになるように溶
解）66μを含むALP緩衝液（100mMトリスー
塩酸（PH9.5）、100mM NaCl、5mM MgCl₂）20
ml中に浸し、室温で１時間インキユベートするこ
とより、呈色反応を実施した。最後に、フイルタ
ーを水で２、３回洗浄したのち、風乾した。

合計約15000個のプラークについて、上記免疫
化学的スクリーニングを実施し、最終的に２個の
ポジデイブフアージクローンを得た。

後述するように、２個のポジテイブフアージク
ローンは互いにオーバーラツプするcDNAインサ
ートを含んでおり、cDNA鎖長のみが異なつてい
た。２個のうちより長いcDNAインサートを含む
クローンをpgCYRと命名した。

実施例 ２ 酵母還元酵素ゲノムDNAクローンの単離 後述するように、実施例１−(3)で取得した
cDNAクローンは、酵母還元酵素蛋白質の全長を
コードするには十分な長さを持つていなかつた。
そこで、このcDNAをプローブとしたプラークハ
イブリダイゼーシヨン法により、酵母ゲノムライ
ブラリーをスクリーニングした。

酵母ゲノムライブラリーは、クローンテク社か
ら市販されている酵母ゲゲノムライブラリー
（DNAソースは、酵母サツカロミセス・セレビシ
エX2180株（ATCC26109）、ベクターはλgt11、
製品コード番号CYL 101）を用いた。このライ
ブラリーは、酵母ゲノンDNAを制限酵素EcoRI
で部分消化し、1.5〜6.0kbに相当するDNA断片
をベクターλgt11のEcoRI部位に挿入したもので
ある。製品に添付されたタイターを目安として、
プレートあたり約10⁴プラークとなるように、ラ
イブラリーを希釈し、プレートに広げた。プレー
トにニトロセルロースフイルターを重ね、１分間
放置することにより、DNAをフイルター移した。
フイルターは、1.5M NaCl、0.5M NaOH、
1.5M aCl、0.5Mトリスー塩酸（PH８）、３
×SSCでそれぞれ５分間ずつ処理したのち、80℃
で真空乾燥することにより、DNAをフイルター
に固定した。ついで、フイルターを３×SSC、
68℃、1.5時間、３×SSC、10×デンハート
（0.2％フイコール、0.2％ポリビニルピロリドン、
0.2％ウシ血清アルブミン）、68℃、1.5時間、
ハイブリダイゼーシヨン緩衝液（50mMトリスー
塩酸、PH7.5、10mM EDTA、1M NcCl、10×
デハート、μg/mlサケ精巣DNA）、68℃、１時間
の順に処理した。その後、製品に添付されててる
説明書に従い、ニツクトランスレーシヨンキツト
（アマーシヤム社より購入）を用いてニツクトラ
ンスレーシヨン法により酵母還元酵素cDNAの
EcoRI−BamHI断片（第二図の塩基配列におい
て塩基番号第474−1015番目の断片）を³²Pで標識
し、これを含むハイブリダイゼーシヨン緩衝液と
上記の処理したフイルターをプラスチツクバツグ
に詰め、60℃で終液インキユベートした。ハイブ
リダイゼーシヨンを行つたフイルターは、２×
SSC、室温10分、１×SSC、0.1％SDS、60℃
25分、0.3×SSC、0.1％SDS、60℃、25分、
0.1％SSC、0.1％SDS、60℃45分の順に処理した
のち、風乾し、Ｘ線フイルム（コダツクXAR−
５）をあてて、オートラジオグラムをとつた。こ
うして、ポジテイブシグナルを与えるゲノム
DNAクローンを一個得、これをpgGYRと命名し
た。

実施例 ３ cDNAクローン、ゲノムDNAクローンの制
限酵素地図の作製 実施例１−(3)、２で取得した酵母還元酵素
cDNA、ゲノムDNAクローンについて、それぞ
れインサートDNAの制限酵素地図を作製した。
フアージDNAを調製し、これを、EcoRIで切断
することにより、インサートDNAを切り出し、
pUC19のEcoRI部位にサブクローニングした。た
だし、ゲノムDNAクローンの場合は、片側の
EcoRI部位を欠失していたので、EcoRIとSacIで
同時消化することにより、DNA断片を切り出し、
pUC19のEcoRI、Sac1部位の間にサブクローニ
ングした。これらプラスミドを導入した大腸菌
JM109株（宝酒造(株)）を培養し、バーンボイムー
ドリ（Birnboim−Doly）の方法による、プラス
ミドDNAを調製した。プラスミドDNAは、種々
の制限酵素で切断し、切断したDNA断片を0.8％
アガロースゲル電気泳動で分析した。種々の制限
酵素により切断したDNA断片の鎖長を比較する
ことにより、第１図に示す制限酵素地図を得た。
２つのcDNAクローン制限酵素地図は一致し、ま
た、これらは、ゲノムDNAクローンの制限酵素
地図と完全にオーバーラツプした。

実施例 ４ 酵母還元酵素のDNA塩基配列およびアミノ酸
配列の決定 cDNAインサートの全塩基配列を、pUCプラ
スミドの正逆両方向のプライマーDNA（フアルマ
シア社より購入）および７−DEAZAシークエン
スキツト（宝酒造(株)より購入）を用いて決定し
た。インサートの内部ににあるEcoRI部位周辺の
塩基配列は、他の制限酵素による切断断片を
pUC19にサブクローニングしたのち、同様にし
て決定した。cDNAクローンpgCYRは、第２図
の塩基番号67番目から最後のポリ(A)テイルまでを
コードしていた。この塩基配列は、チロシン残基
からはじまる669アミノ酸残基をコードでき、塩
基番号号2074〜2076番目の終止コドンTAAでお
わるオープンリーデイングフレームが存在した。
蛋白質の読み枠としては、塩基を１つずつずらし
た他の２つの読み枠も考えられるが、これらで
は、塩基配列の途中に、終止コトンが何回もあら
われ、還元酵素の読み枠とは考えられない。この
最長の読み枠に相当する塩基配列をアミノ酸に変
換した結果を第２図に示す。このアミノ酸配列
を、すでにアミノ酸配列が既知であるラツトおよ
びウサギのNADPH−チトクロムP450還元酵素
の配列（DNA、５巻１号１〜10頁、1986年J.
Biochem100巻945〜954頁1986年に記載）と比較
した結果、非常によく類似した配列が見出され
た。例えば、還元酵素の補酵素であるFMNを結
合する領域と考えられている配列（ラツト、ウサ
ギ酵素では、NIIVFYGSQTGTAEE）とよく似
た配列が、塩基番号178番目から222番目にみられ
た。また、フラビン酵素に特徴的なグリシン残基
を含む配列（ラツトでは、
VIMVGPGTGIAPFMGFIQR）に相当する配列
が、塩基番号1606番目から1665番目にみられた。
これらの結果から判断して、第２図に示すアミノ
酸配列は、酵母還元酵素のものであることが明ら
かになつた。

次に、同様の方法により、ゲノムDNAインサ
ートの塩基配列を決定した。決定した塩基配列お
よび、それをアミノ酸配列に変換した結果を、第
２図に示す。ゲノムDNAインサートの（塩基番
号67−2076番目）の塩基配列は、cDNAインサー
トの塩基配列と完全に一致した。この結果、酵母
NADPH−チトクロムP450還元酵素アミノ酸配
列は、cDNAから決定した配列よりさらに22アミ
ノ酸残基長いことが判明した。したがつて、酵母
還元酵素は、691アミノ酸残基から成る分子量76、
756の蛋白質であることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、酵母NADPH−チトクロムP450還
元酵素をコードするcDNAクローンpgCYRおよ
びゲノムDNAクローンpgGYRの制限酵素地図を
示す。図中、黒く塗つた部分は、本酵素をコード
するDNA領域を示す。第２図はcDNAクローン、
ゲノムDNAクローンのインサートDNAの塩基配
列と、それから推定される酵母還元酵素のアミノ
酸配列を示す。酵母還元酵素のコーデイング領域
は、塩基番号１から2073番目に相当する。 ただし、Ａ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，
Ｋ，Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｐ，Ｑ，Ｒ，Ｓ，Ｔ，Ｖ，Ｗ，
Ｙはそれぞれアラニン、システイン、アスパラギ
ン酸、グルタミ酸、フエニルアラニン、グリシ
ン、ヒスチジン、イソロイシ、リジン、ロイシ
ン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グル
タミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリ
ン、トリプトフアン、チロシン残基を表す。ゲノ
ムDNAクローンのスクリーニングに用いたプロ
ーブは塩基番号474から1015番目に相当する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 第２図に記載のアミノ酸配列で特定される酵
   母NADPH−チトクロムP450還元酵素をコード
   する遺伝子。 ２ 第２図に記載の塩基配列で特定される請求項
   １記載の遺伝子。 ３ 第２図に記載の塩基配列で特定される酵母
   NADPH−チトクロムP450還元酵素遺伝子を含
   む組み換え体DNA。 ４ 微生物細胞内で自己増殖可能な請求項３記載
   のDNA。 ５ 第２図に記載の塩基配列で特定される酵母
   NADPH−チトクロムP450還元酵素遺伝子を含
   み、微生物細胞内で自己増殖可能なDNAを保持
   する微生物。 ６ 微生物がエシエリキア・コリである請求項５
   記載の微生物。