JPH02462A - ｍＲＮＡの翻訳を向上させる方法および血小板第４因子を製造するための該方法の利用 - Google Patents
ｍＲＮＡの翻訳を向上させる方法および血小板第４因子を製造するための該方法の利用Info
- Publication number
- JPH02462A JPH02462A JP1007546A JP754689A JPH02462A JP H02462 A JPH02462 A JP H02462A JP 1007546 A JP1007546 A JP 1007546A JP 754689 A JP754689 A JP 754689A JP H02462 A JPH02462 A JP H02462A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- gene
- dna
- dna sequence
- platelet factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は遺伝子工学の分野に属し発現効）ｒの悪い組換
えタンパクの発現および回収を向上させる方法、ならび
にヒｌ−血小板第４因子をクローニングし２発現させ、
さらに微生物による生産を行なうためのプラスミドベク
ターに関する。
えタンパクの発現および回収を向上させる方法、ならび
にヒｌ−血小板第４因子をクローニングし２発現させ、
さらに微生物による生産を行なうためのプラスミドベク
ターに関する。
（従来の技術）
血小板は正常な血液凝固メカニズムにおい゛Ｃ血管の社
１傷に呼応して機能する循環血液細胞である。
１傷に呼応して機能する循環血液細胞である。
血小板アルファ顆粒は、血小板第４囚４（ＰＦ−４また
はＰＦ４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） 、結合
＆ｆｌ織活性化ペプチド（Ｃ丁＾卜１）およびβ−ト［
ｆｆンボグロプリン（β−ＴＧ）を含む多くの重要タン
パクを分泌する。これらのタンパクのい（一つかは実質
的にアミノ酸配列に相同性を有する。これらの因子の生
物学的役割は充分に明らかになっていないが、その最も
重要な四つの性質は２次のとおりである： （ａ）ｏｓ
ａ合成と細胞分裂とを刺激して。
はＰＦ４）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） 、結合
＆ｆｌ織活性化ペプチド（Ｃ丁＾卜１）およびβ−ト［
ｆｆンボグロプリン（β−ＴＧ）を含む多くの重要タン
パクを分泌する。これらのタンパクのい（一つかは実質
的にアミノ酸配列に相同性を有する。これらの因子の生
物学的役割は充分に明らかになっていないが、その最も
重要な四つの性質は２次のとおりである： （ａ）ｏｓ
ａ合成と細胞分裂とを刺激して。
強力な分裂促進剤として作用する能力、（ｂ）グルニ】
−スの移送、解糖、プロスタグランジンＥ２およびサイ
クリックＡＭＰの生成、ヒアルロン酸およびグリコサミ
ノグリカンの合成およびプラスミノーゲンアクチベータ
の生成を含む、結合紐ｍ細胞における種々の代謝活性を
刺激する能力、（Ｃ）免疫系細胞を炎症部位に引寄せて
、その機能を刺激する能力、および（ｄ）細胞表面の重
要な成分である硫酸グリコ１サミノグリカンに対する高
い親和性により。
−スの移送、解糖、プロスタグランジンＥ２およびサイ
クリックＡＭＰの生成、ヒアルロン酸およびグリコサミ
ノグリカンの合成およびプラスミノーゲンアクチベータ
の生成を含む、結合紐ｍ細胞における種々の代謝活性を
刺激する能力、（Ｃ）免疫系細胞を炎症部位に引寄せて
、その機能を刺激する能力、および（ｄ）細胞表面の重
要な成分である硫酸グリコ１サミノグリカンに対する高
い親和性により。
結合１１織と肥満細胞とに結合する能力。
血小板第４因子はプロコアギュレーシタン作用。
抗ヘパリン作用、免疫制御作用、走化性などのいくつか
の生物学的機能を有する血小板分泌クンバクである。Ｐ
Ｆ−４については２次のようなことが証明されている：
単核細胞お、Ｌび好中球に対する強力な走化剤であるこ
と（Ｄｅｕｅｌら（１９８１）ｒ’ｒｏｃ ＮａｔｌＱ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８ ： ４５８４） ：
セロトニンに結合すること（ＩＩｅｅｍｓＬｒａ、 Ｖ
、Ｌ、（１９８３）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５２９
：３２３） ；二Ｉラゲナーゼを冴Ｉ古すること〔
１１１０−１１ａｒｐｅｒ、Ｊ、ら（１９７８）３ｃｉ
ｅ−リ−１３１旦！’ｊ：９９１） ；動物において
免疫抑制を回復させること（Ｋａｔｚ、 １．Ｒ，ら（
１９８６）１’ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ｔｌ！Ｑ−−β３：３４９１） ；およびある種の肺瘍
の成育を阻害すること（Ｔａｙｌｏｒ、 Ｓ、およびＦ
ｏｌｋｍａｎ 、 Ｊ、 （１９８２） Ｎ−ａ＋、ｕ
ｒｅ ２９７ ： ３０７ ） 、 ＰＩ’４１よ、ラ
ミ・血液およびヒト血液から単離され、はぼ純粋に精製
され（Ｗｕ、 Ｖ、Ｙ、ら（１９７７） 、 Ｐｒｅ、
ｐＢｊｏｃｈｅｍ−レ４７９；および１ｅｖｉｎｅ、
Ｓ、Ｐ、と−〇旧、■。
の生物学的機能を有する血小板分泌クンバクである。Ｐ
Ｆ−４については２次のようなことが証明されている：
単核細胞お、Ｌび好中球に対する強力な走化剤であるこ
と（Ｄｅｕｅｌら（１９８１）ｒ’ｒｏｃ ＮａｔｌＱ
ｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７８ ： ４５８４） ：
セロトニンに結合すること（ＩＩｅｅｍｓＬｒａ、 Ｖ
、Ｌ、（１９８３）Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅ５２９
：３２３） ；二Ｉラゲナーゼを冴Ｉ古すること〔
１１１０−１１ａｒｐｅｒ、Ｊ、ら（１９７８）３ｃｉ
ｅ−リ−１３１旦！’ｊ：９９１） ；動物において
免疫抑制を回復させること（Ｋａｔｚ、 １．Ｒ，ら（
１９８６）１’ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ｔｌ！Ｑ−−β３：３４９１） ；およびある種の肺瘍
の成育を阻害すること（Ｔａｙｌｏｒ、 Ｓ、およびＦ
ｏｌｋｍａｎ 、 Ｊ、 （１９８２） Ｎ−ａ＋、ｕ
ｒｅ ２９７ ： ３０７ ） 、 ＰＩ’４１よ、ラ
ミ・血液およびヒト血液から単離され、はぼ純粋に精製
され（Ｗｕ、 Ｖ、Ｙ、ら（１９７７） 、 Ｐｒｅ、
ｐＢｊｏｃｈｅｍ−レ４７９；および１ｅｖｉｎｅ、
Ｓ、Ｐ、と−〇旧、■。
（１９７Ｇ）、 Ｊ、 Ｒｉｏｌ Ｃｈｅ１２５１ ：
３２４ ） 、そしてそのアミノ酸配列および物理化
学的性質が決定された〔例えば、讐ａｌｚ、 Ｄ、Ａ、
ら（１９７７）、 Ｔｈｒｏｗ Ｒｅｓ １１ ：８９
３を参照されたい〕。最近、ヒト赤白血病細胞系由来の
ｃＤＮＡのＤＮＡ配列が、 ｒ’ｏｎｃｚ 、 Ｍ、ら
により（（１９８７） 、β１ｏｏｄ ６９ ： ２１
９ ） 、発表された。この配列は、開始メチオニン残
基が先行する３０のアミノ酸をコードするリーダー配列
を有し、それに続＜７０アミノ酸のタンパクをコードす
るコード領域を有する。
３２４ ） 、そしてそのアミノ酸配列および物理化
学的性質が決定された〔例えば、讐ａｌｚ、 Ｄ、Ａ、
ら（１９７７）、 Ｔｈｒｏｗ Ｒｅｓ １１ ：８９
３を参照されたい〕。最近、ヒト赤白血病細胞系由来の
ｃＤＮＡのＤＮＡ配列が、 ｒ’ｏｎｃｚ 、 Ｍ、ら
により（（１９８７） 、β１ｏｏｄ ６９ ： ２１
９ ） 、発表された。この配列は、開始メチオニン残
基が先行する３０のアミノ酸をコードするリーダー配列
を有し、それに続＜７０アミノ酸のタンパクをコードす
るコード領域を有する。
現在まで１組換えＤＮＡ技術によるＰＦ−４の製造に成
功したことは報告されていない。さらに、ヒト結合組織
活性化ペプチド−１ｉｔ（ＰＦ−４と６０％を越える相
同性を有するタンパクである）について達成された成功
例と異なり、同一の発現系においてＰＦ−４を使用する
本発明者の同様の試みは、 ＰＦ−４の直接発現につい
ては、完全に不成功であった。初期の研究で報告されて
いるＰＦ−４は血小板から入手されているが、その単離
法は大量のタンパクを生産するには実用的でない。この
点に関連して８本発明の目的は１組換えＤＮＡ技術によ
りＰＦ４を製造する手段を提供することにある。この手
段は、ＰＦ−４をコードする合成遺伝子（細菌中でのＰ
Ｆ−４の発現を目的として設計されたものである）；お
よび修飾コリシンＥｌ構造遺伝子領域に融合したＰＦ−
４遺伝子を含む発現ベクターの使用を包含する。
功したことは報告されていない。さらに、ヒト結合組織
活性化ペプチド−１ｉｔ（ＰＦ−４と６０％を越える相
同性を有するタンパクである）について達成された成功
例と異なり、同一の発現系においてＰＦ−４を使用する
本発明者の同様の試みは、 ＰＦ−４の直接発現につい
ては、完全に不成功であった。初期の研究で報告されて
いるＰＦ−４は血小板から入手されているが、その単離
法は大量のタンパクを生産するには実用的でない。この
点に関連して８本発明の目的は１組換えＤＮＡ技術によ
りＰＦ４を製造する手段を提供することにある。この手
段は、ＰＦ−４をコードする合成遺伝子（細菌中でのＰ
Ｆ−４の発現を目的として設計されたものである）；お
よび修飾コリシンＥｌ構造遺伝子領域に融合したＰＦ−
４遺伝子を含む発現ベクターの使用を包含する。
組換えｐＢＲ３２２由来のプラスミドは、 ｐＢＩ１３
２２とｐＢＲ３２２のＰｓｔｌの部位でｐＢＲ３２２に
挿入されたコリシンＥ１発現制御配列およびコリシンの
構造遺伝子を含むＤＮＡ断↓断金１有し、 Ｗａｌｅｈ
、 Ｎ、Ｓ、およびＪｏｈｎｓｏｎ、 Ｐ、Ｈ。
２２とｐＢＲ３２２のＰｓｔｌの部位でｐＢＲ３２２に
挿入されたコリシンＥ１発現制御配列およびコリシンの
構造遺伝子を含むＤＮＡ断↓断金１有し、 Ｗａｌｅｈ
、 Ｎ、Ｓ、およびＪｏｈｎｓｏｎ、 Ｐ、Ｈ。
（１９８５）、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ
Ｓｃｉ ＩＪＳＡ ８２ ： ８３８９−
８３９３に記載され、そして国際公開ＷＯ８５１０１０
６７に開示されている。このプラスミドは、ヒト結合組
織活性化ペプチド−■をコードする合成遺伝子を発現す
るために使用された。
Ｓｃｉ ＩＪＳＡ ８２ ： ８３８９−
８３９３に記載され、そして国際公開ＷＯ８５１０１０
６７に開示されている。このプラスミドは、ヒト結合組
織活性化ペプチド−■をコードする合成遺伝子を発現す
るために使用された。
米国特許第４．３６６．２４６号には、特定の開裂位置
を規定するアミノ酸を介して外来のアミノ酸配列に連結
した外来のポリペプチドの融合タンパクを微生物によっ
て産生ずるための組換え体および方法が一般的に記載さ
れている。
を規定するアミノ酸を介して外来のアミノ酸配列に連結
した外来のポリペプチドの融合タンパクを微生物によっ
て産生ずるための組換え体および方法が一般的に記載さ
れている。
多数の文献がＢｒｏｓｉｕｓ Ｊ、によって引用されて
おり、それによって、所望の遺伝子を他の遺伝子の一部
（例えば、 １ａｃＺ 、 ＭＳ２ポリメラーゼ、幻上
り。
おり、それによって、所望の遺伝子を他の遺伝子の一部
（例えば、 １ａｃＺ 、 ＭＳ２ポリメラーゼ、幻上
り。
ｍＥまたはラムダｃｌレプレッサ）に融合させることに
より一層安定なハイブリッドタンパクが生成されるとい
う状況が支持される。上記文献には。
より一層安定なハイブリッドタンパクが生成されるとい
う状況が支持される。上記文献には。
”ＩＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｅｍｐｌ
ｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−、υ更。
ｏｙｉｎｇ Ｌａｍｂｄａ−、υ更。
Ｉａｃ−、ａｎｄ ｂ伊−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｏｍｏ
ｔｅｒｓ、” Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ。
ｔｅｒｓ、” Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ。
Ｒ，Ｌ、およびＤｅｎｈａｒｄｔ、 Ｄ、Ｔ、１ｉ ；
およびＶｅｃｔｏｒｓ ：八ＳｕｒｖｅｏｆＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎＶｅｃｔｏｒｓａｎｄＴｈｅｉ
ｒＵｓｅｓ、 Ｂｏｓｔｏｎ ： Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒ
ｔｈｓ ； １９８８ ； ２０７がある。
およびＶｅｃｔｏｒｓ ：八ＳｕｒｖｅｏｆＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎＶｅｃｔｏｒｓａｎｄＴｈｅｉ
ｒＵｓｅｓ、 Ｂｏｓｔｏｎ ： Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒ
ｔｈｓ ； １９８８ ； ２０７がある。
この引用文献はメンセンジャーＲＮＡの翻訳の効率の悪
さから生じる生産物の低収率を取扱うものではない。
さから生じる生産物の低収率を取扱うものではない。
（発明の構成）
本発明のひとつの局面は５＆１１換えタンパクの発現を
向上させる方法である。この方法は、そのアミノ末端を
コードし開裂部位配列により隔てられた第１のＤＮＡ配
列および組換えタンパクをコードする第２のＤＮＡ配列
からなるハイブリッド遺伝子（このハイブリッド遺伝子
は融合タンパクをコートする）を構築する工程と、該ハ
イプリント遺伝子を有するベクターで形質転換された宿
主細胞を培養する工程と、該形質転換細胞から融合タン
パクを回収する工程とを包含する方法であって、該ハイ
ブリッド遺伝子の第１のＤＮＡ配列として、改組換えタ
ンパクをコードするｍＲＮＡ１Ｕ域と，リボソーム結合
部位を含むｍＲＮＡ領域とが，リボソームが該リボソー
ム結合部位へ接近できなくなるような好ましくない２次
構造を形成するのを阻害するのに充分な長さのＤＮＡ配
列を選択すること、を包含する。
向上させる方法である。この方法は、そのアミノ末端を
コードし開裂部位配列により隔てられた第１のＤＮＡ配
列および組換えタンパクをコードする第２のＤＮＡ配列
からなるハイブリッド遺伝子（このハイブリッド遺伝子
は融合タンパクをコートする）を構築する工程と、該ハ
イプリント遺伝子を有するベクターで形質転換された宿
主細胞を培養する工程と、該形質転換細胞から融合タン
パクを回収する工程とを包含する方法であって、該ハイ
ブリッド遺伝子の第１のＤＮＡ配列として、改組換えタ
ンパクをコードするｍＲＮＡ１Ｕ域と，リボソーム結合
部位を含むｍＲＮＡ領域とが，リボソームが該リボソー
ム結合部位へ接近できなくなるような好ましくない２次
構造を形成するのを阻害するのに充分な長さのＤＮＡ配
列を選択すること、を包含する。
本発明の他の局面は、プラスミド発現ベクターである。
このプラスミド発現ベクターは、 Ｅ、ｃｏｌｉに挿入
されると、全細胞タンパクの少なくとも１０％を与える
だけの量の上記融合遺伝子の産生物を発現する。
されると、全細胞タンパクの少なくとも１０％を与える
だけの量の上記融合遺伝子の産生物を発現する。
上記組換えプラスミド発現ベクターの好適な実施態様は
、 Ｃｏｌ（１５０）−ＰＦ４である。これはｐ８Ｒ３
２２由来のベクターであり、 ｐＢＩ１３２２ ；およ
びコリシンＥｌ発現制御配列、および血小板第４因子を
コードする配列に融合したコリシン上１構造遺伝子（カ
ルボキシル末端が切断されている）を含むＤＮＡ断片；
を含む。
、 Ｃｏｌ（１５０）−ＰＦ４である。これはｐ８Ｒ３
２２由来のベクターであり、 ｐＢＩ１３２２ ；およ
びコリシンＥｌ発現制御配列、および血小板第４因子を
コードする配列に融合したコリシン上１構造遺伝子（カ
ルボキシル末端が切断されている）を含むＤＮＡ断片；
を含む。
本発明の他の局面は、血小板第４因子を微生物生産する
方法であって、該方法は。
方法であって、該方法は。
ａ）上記発現ベクターで形質転換されたＥ、ｃｏｌｉを
培養する工程と ｂ）該培養した形質転換体を破砕する工程と。
培養する工程と ｂ）該培養した形質転換体を破砕する工程と。
Ｃ）融合タンパクを他の細胞タンパクから精製する工程
と。
と。
ｄ）該融合タンパクを特異的な開裂部位で切断する工程
と ｅ）該工程（ｄ）の切断された産物から血小板第４因子
を回収する工程と を包含する。
と ｅ）該工程（ｄ）の切断された産物から血小板第４因子
を回収する工程と を包含する。
本発明のさらに他の局面は、上記方法の生産物。
特に融合Ｃｏｔ ： ＰＦ４メツセンジャーＲＮ＾転
写体および遺伝子生産物、およびそれから回収される血
小板第４因子自体である。
写体および遺伝子生産物、およびそれから回収される血
小板第４因子自体である。
本発明方法は、融合タンパクの形態でＰＦ−４産生ずる
ことを包含する。この融合タンノ卸の内因性部分は、所
望のタンパクが容易に切断されるように融合部分内に選
択的切断部位を含む生物学的Ｇこ不活性コリシンＥ１断
片である。このようなタンパクは、適当な翻訳クーミネ
ータを有するＰＦ−４遺伝子を、ベクター（カルボキシ
末端付近に都合の良い制限酵素部位を持つコリシン構造
遺伝子の一部及びコリシン発現制御配列を有する）に挿
入した１発現ベクターを使用して調製され得る。グリコ
サミノグリカン類、特にヘパリン類に対するＰＦ４の高
い親和性によって、融合タンパクおよび遊離ＰＦ−４の
アフィニテイクロマトグラフイーによる単離のためにヘ
パリンとコンドロイチン硫酸が使用されうる。
ことを包含する。この融合タンノ卸の内因性部分は、所
望のタンパクが容易に切断されるように融合部分内に選
択的切断部位を含む生物学的Ｇこ不活性コリシンＥ１断
片である。このようなタンパクは、適当な翻訳クーミネ
ータを有するＰＦ−４遺伝子を、ベクター（カルボキシ
末端付近に都合の良い制限酵素部位を持つコリシン構造
遺伝子の一部及びコリシン発現制御配列を有する）に挿
入した１発現ベクターを使用して調製され得る。グリコ
サミノグリカン類、特にヘパリン類に対するＰＦ４の高
い親和性によって、融合タンパクおよび遊離ＰＦ−４の
アフィニテイクロマトグラフイーによる単離のためにヘ
パリンとコンドロイチン硫酸が使用されうる。
ここに使用されるＵ血小板第４因子」という用語は、
Ｐｏｎｃｚら（１９８７、前出）に記載された成熟タン
パクに実質的に対応する７０のアミノ酸からなるタンパ
クをさしていい、前述の免疫刺激性１走化性およびヘパ
リン中和作用のようなＰＦ−４に関連した生物活性のい
ずれかを有するものを意味する。
Ｐｏｎｃｚら（１９８７、前出）に記載された成熟タン
パクに実質的に対応する７０のアミノ酸からなるタンパ
クをさしていい、前述の免疫刺激性１走化性およびヘパ
リン中和作用のようなＰＦ−４に関連した生物活性のい
ずれかを有するものを意味する。
翻訳中に、配列中に挿入されたアミノ酸め除去。
添加または変更により、初めの構造そのものを変更する
ことがまた。タンパクの活性を損なうことなく行なわれ
得る。このような置換またはその他の変更により、
ｒＰＦ〜４と実質的に同等なアミノ酸配列を有する」と
いうタンパクの定義に包含されるアミノ酸配列を有する
タンパクが生成する。例えば、ポンス（Ｐｏｎｃｚ ）
ら（前出）の文献によれば、残基４７は正しくはアスパ
ラギンであると認められた。しかし、この位置は以前か
らアスパラギン酸またはアスパラギンとして当該分野で
特定されていたことであり、その事実は、 ＰＦ−４に
関する文献では分かっていなかった。本発明では、４７
位にそれぞれの残基を有するＰＦ−４配列を合成し１そ
れぞれのタンパクが生物活性を有し１４７位にアスパラ
ギン酸を有するタンパクの方がより望ましい溶解性を有
しているらしいことがわかった。
ことがまた。タンパクの活性を損なうことなく行なわれ
得る。このような置換またはその他の変更により、
ｒＰＦ〜４と実質的に同等なアミノ酸配列を有する」と
いうタンパクの定義に包含されるアミノ酸配列を有する
タンパクが生成する。例えば、ポンス（Ｐｏｎｃｚ ）
ら（前出）の文献によれば、残基４７は正しくはアスパ
ラギンであると認められた。しかし、この位置は以前か
らアスパラギン酸またはアスパラギンとして当該分野で
特定されていたことであり、その事実は、 ＰＦ−４に
関する文献では分かっていなかった。本発明では、４７
位にそれぞれの残基を有するＰＦ−４配列を合成し１そ
れぞれのタンパクが生物活性を有し１４７位にアスパラ
ギン酸を有するタンパクの方がより望ましい溶解性を有
しているらしいことがわかった。
すべてのタンパクがそうであるように２本発明のＰＦ−
４タンパクの正確な化学構造は多数の因子に依存する。
４タンパクの正確な化学構造は多数の因子に依存する。
分子中にイオン化し得るアミノ基およびカルボキシル基
を有するため、タンパクは酸性塩または塩基性塩として
、または中性の形で得られ得る。適当な環境条件下にお
くとその活性を保持するすべてのそのような調製物は、
１）Ｆ〜４の定義に含まれる。さらに、当初のアミノ酸
配列は、糖部分により誘導体とすること（グリコジル化
）；脂質、リン酸基、アセチル基などのような他の補足
的な分子により誘導体とすること等によってさらに一般
的にはサツカライドと結合させることによってその大き
さが大きくなり得る。当初のアミノ酸構造はまた。集合
して複合体を形成し得る。
を有するため、タンパクは酸性塩または塩基性塩として
、または中性の形で得られ得る。適当な環境条件下にお
くとその活性を保持するすべてのそのような調製物は、
１）Ｆ〜４の定義に含まれる。さらに、当初のアミノ酸
配列は、糖部分により誘導体とすること（グリコジル化
）；脂質、リン酸基、アセチル基などのような他の補足
的な分子により誘導体とすること等によってさらに一般
的にはサツカライドと結合させることによってその大き
さが大きくなり得る。当初のアミノ酸構造はまた。集合
して複合体を形成し得る。
そのように大きさが大きくなるという局面は、産生宿主
の翻訳後のプロセッシングにより達成される。そのよう
な他の修飾はインビトロで導入され得る。さらに、鎖中
の個々のアミノ酸残基は酸化。
の翻訳後のプロセッシングにより達成される。そのよう
な他の修飾はインビトロで導入され得る。さらに、鎖中
の個々のアミノ酸残基は酸化。
還元または他の誘導体化によって修飾されうる。
活性を失なわせることのないそのような修飾は。
タンパク配列をその定義から除くものではない。
細菌宿主中でのＰＦ−４の直接発現（すなわち、他のペ
プチド配列に融合しない）を含む組換えＤＮＡ技術によ
りＰＦ−４を発現させる種々の試みが実施された。ヒト
ＣＴＡＰ−ＩＩＩに使用されたものと同一の発現系を使
用しても、有意のレベルのＰＦ−４は得られなかった。
プチド配列に融合しない）を含む組換えＤＮＡ技術によ
りＰＦ−４を発現させる種々の試みが実施された。ヒト
ＣＴＡＰ−ＩＩＩに使用されたものと同一の発現系を使
用しても、有意のレベルのＰＦ−４は得られなかった。
ＣＴＡＰ−ｆｌ［はＰＦ−４に極めて高い相同性を有す
る（ヌクレオチド配列ではほぼ７５％が同一であり、ア
ミノ酸配列ではほぼ６５％が同一である）事実を考慮す
れば、これは驚（べきであった。国際公開ＷＯ８５１０
１０６７に開示されたコリシンＥ１発現系は、全細胞タ
ンパクのほぼ３０％のＣＴＡＰ−Ｉ［［を産出すること
が認められた。鋭敏な放射線標識技術およびインビトロ
転写−翻訳アッセイを用いて。
る（ヌクレオチド配列ではほぼ７５％が同一であり、ア
ミノ酸配列ではほぼ６５％が同一である）事実を考慮す
れば、これは驚（べきであった。国際公開ＷＯ８５１０
１０６７に開示されたコリシンＥ１発現系は、全細胞タ
ンパクのほぼ３０％のＣＴＡＰ−Ｉ［［を産出すること
が認められた。鋭敏な放射線標識技術およびインビトロ
転写−翻訳アッセイを用いて。
ＰＦ−４タンパクの収率が低いのはＰＦ−４メツセンジ
ヤーＲＮＡ （ａ＋ＲＮＡ）の乏しいかまたは効率の
悪い翻訳の結果であって、転写効率が悪いことまたはタ
ンパクが不安定であることには起因しないことが明らか
になった。
ヤーＲＮＡ （ａ＋ＲＮＡ）の乏しいかまたは効率の
悪い翻訳の結果であって、転写効率が悪いことまたはタ
ンパクが不安定であることには起因しないことが明らか
になった。
研究により、 ｍＲＮＡの二次構造が翻訳開始決定部位
を露出している場合には遺伝子の発現はしばしば増強さ
れるが、これらの領域が遮へいされている止２発現の減
少が認められた。 Ｚｕｃｋｅｒ、 Ｍ、およびＳＬｉ
ｅｇｌｅｒ、Ｐ、 （１９８１） Ｎｕｃ Ａｃ１ｄ
Ｒｅｓ ９ ： １３３の方法によって、−本鎖核酸
類の二次構造を予測するコンピューター法を使用してＰ
Ｆ−４およびＣＴＡＰ１１１６Ｄｎ＋ＲＮＡの構造を予
測した。その結果を第１図（ＣＴＡＰ−ｍ）および第２
図（ＰＦ−４＞に示す。ＣＴＡＰ−ｍ ｍＲＮＡのリボ
ソーム結合部位は一本鎖ルーブ状に露出していることが
予測されるが、 ＰＦ−４ｍＲＮＡのリボソーム結合部
位は遠い配列（ヌクレオチド２３２〜２３７．第２図）
との塩基対を形成することによりリボソーム結合に接近
できないことが予測される。
を露出している場合には遺伝子の発現はしばしば増強さ
れるが、これらの領域が遮へいされている止２発現の減
少が認められた。 Ｚｕｃｋｅｒ、 Ｍ、およびＳＬｉ
ｅｇｌｅｒ、Ｐ、 （１９８１） Ｎｕｃ Ａｃ１ｄ
Ｒｅｓ ９ ： １３３の方法によって、−本鎖核酸
類の二次構造を予測するコンピューター法を使用してＰ
Ｆ−４およびＣＴＡＰ１１１６Ｄｎ＋ＲＮＡの構造を予
測した。その結果を第１図（ＣＴＡＰ−ｍ）および第２
図（ＰＦ−４＞に示す。ＣＴＡＰ−ｍ ｍＲＮＡのリボ
ソーム結合部位は一本鎖ルーブ状に露出していることが
予測されるが、 ＰＦ−４ｍＲＮＡのリボソーム結合部
位は遠い配列（ヌクレオチド２３２〜２３７．第２図）
との塩基対を形成することによりリボソーム結合に接近
できないことが予測される。
−ｉ的に，リボソーム結合部位およびＡＵＧ開始コドン
に近いｍＲＮＡの配列および／またはその二次構造の改
変は１発現レベルに影響をおよぼすことが予想される。
に近いｍＲＮＡの配列および／またはその二次構造の改
変は１発現レベルに影響をおよぼすことが予想される。
従って１発現レベルが低い場合には、一般に当業者は翻
訳効率を高めるために，リボソーム結合部位のいずれか
の側の約１５ヌクレオチドからなる局部領域におけるｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列を改変しようと試みる。現在
までは、［金的な」相互作用、つまり上記のリボソーム
結合部位と局部構造領域の外のｍＲＮＡ領域との長距離
の相互作用が翻訳効率に影響を与えることは認められて
いなかった。本発明は： ｍＲＮＡの乏しい翻訳につい
ての問題を次のことにより克服する。つまり。
訳効率を高めるために，リボソーム結合部位のいずれか
の側の約１５ヌクレオチドからなる局部領域におけるｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列を改変しようと試みる。現在
までは、［金的な」相互作用、つまり上記のリボソーム
結合部位と局部構造領域の外のｍＲＮＡ領域との長距離
の相互作用が翻訳効率に影響を与えることは認められて
いなかった。本発明は： ｍＲＮＡの乏しい翻訳につい
ての問題を次のことにより克服する。つまり。
ＲＮＡを折りたたむ好ましくない相互作用は，リボソー
ム結合部位を含むＤＮＡと発現効率の悪い遺伝子をコー
ドするＤＮＡとの間に十分な長さのＤＮＡ配列を挿入し
て、融合タンパクをコードするハイブリッド遺伝子をつ
くり出すことによって中断させるのである。ここで使用
される「充分な長さ」については、挿入ＤＮＡ配列は翻
訳開始コドンおよび組換えタンパクをコードする配列の
始まりを分離するため１５塩基対よりも大きくなければ
ならないことが明らかになった。好ましくは、この距離
は約１５０塩基対から約４５０塩基対の配合物内にある
。
ム結合部位を含むＤＮＡと発現効率の悪い遺伝子をコー
ドするＤＮＡとの間に十分な長さのＤＮＡ配列を挿入し
て、融合タンパクをコードするハイブリッド遺伝子をつ
くり出すことによって中断させるのである。ここで使用
される「充分な長さ」については、挿入ＤＮＡ配列は翻
訳開始コドンおよび組換えタンパクをコードする配列の
始まりを分離するため１５塩基対よりも大きくなければ
ならないことが明らかになった。好ましくは、この距離
は約１５０塩基対から約４５０塩基対の配合物内にある
。
融合遺伝子が、５°末端で転写開始制御配列と隣接する
ようにし、そして３”末端で転写および翻訳終止配列に
隣接するように、融合遺伝子の構築には適当な発現ベク
ターが用いられる。（５゛−および３゛−は転写の方向
を意図する）。
ようにし、そして３”末端で転写および翻訳終止配列に
隣接するように、融合遺伝子の構築には適当な発現ベク
ターが用いられる。（５゛−および３゛−は転写の方向
を意図する）。
（以下余白）
適当な宿主に導入するためのブラスミ）”ＤＮＡを調製
したのち、宿主を形質転換し、クローン化し。
したのち、宿主を形質転換し、クローン化し。
クローンを培養し、所望の産生物１例えば、 ｌ’Ｆ−
４の産生を検出することによって、有効な発現を示す個
々のクローンを選択する。本発明につき例示すると、有
効な産生とは、 ＰＦ−４融合タンパクの発現レベルは
、全細胞タンパクの少なくとも１０％であることを意味
する。スクリーニングは、ニトロセルロースまたは他の
適当な材料のフィルターに移した宿主細胞コロニーのウ
ェスタンブロッティング（生産物の抗体検出）を使用し
て有効に実施できる。あるいは、ゲル電気泳動を用いて
試料を分析し、タンパク染色強度の視覚化、オートラジ
オグラフ、・−士たは生産物バンドのウェスタンブロン
ティングにより、どのクローンが最も効率よく発現する
かを迅速かつ直接的に比較することができる。このスク
リーニング操作で通常充分であるが、適当であれば、よ
り定量的な免疫検定法または酵素検定法が使用できる。
４の産生を検出することによって、有効な発現を示す個
々のクローンを選択する。本発明につき例示すると、有
効な産生とは、 ＰＦ−４融合タンパクの発現レベルは
、全細胞タンパクの少なくとも１０％であることを意味
する。スクリーニングは、ニトロセルロースまたは他の
適当な材料のフィルターに移した宿主細胞コロニーのウ
ェスタンブロッティング（生産物の抗体検出）を使用し
て有効に実施できる。あるいは、ゲル電気泳動を用いて
試料を分析し、タンパク染色強度の視覚化、オートラジ
オグラフ、・−士たは生産物バンドのウェスタンブロン
ティングにより、どのクローンが最も効率よく発現する
かを迅速かつ直接的に比較することができる。このスク
リーニング操作で通常充分であるが、適当であれば、よ
り定量的な免疫検定法または酵素検定法が使用できる。
本発明の好適な実施Ｂ様においては、挿入１１Ｎ＾は、
ＰＦ−，１に融合し、カルボキシル末端が切断された
］リシンＥ１タンパクをコードする。これらの態様にお
いては、コリタンＥｌ遺伝子は、疎水性（他の細胞成分
から融合タンパクの精製を容易にする物理化学的性質で
ある）部分（約３０アミノ酸）を有するタンパクをコー
ドする。この疎水性部分は高塩濃度（例えば、 １Ｍの
塩酸グアニジン）を用いて融合タンパクからの選択的な
混入タンパクの抽出を許容し、そして、純度が８０％を
越えるコリシンＥＩ ＰＦ−４！！ｌ！合タンパクが
提供される。
ＰＦ−，１に融合し、カルボキシル末端が切断された
］リシンＥ１タンパクをコードする。これらの態様にお
いては、コリタンＥｌ遺伝子は、疎水性（他の細胞成分
から融合タンパクの精製を容易にする物理化学的性質で
ある）部分（約３０アミノ酸）を有するタンパクをコー
ドする。この疎水性部分は高塩濃度（例えば、 １Ｍの
塩酸グアニジン）を用いて融合タンパクからの選択的な
混入タンパクの抽出を許容し、そして、純度が８０％を
越えるコリシンＥＩ ＰＦ−４！！ｌ！合タンパクが
提供される。
融合タンパクを部分的に精製したのち、融合タンパクを
、融合部位でタンパクを切断する化学反応または酵素反
応に供することにより、 ＰＦ−４が分離される。例え
ば１ タンパクの画部分がメチオニン残基により融合し
ている場合には、タンパクはシアノーゲンプロミドで処
理され得る。
、融合部位でタンパクを切断する化学反応または酵素反
応に供することにより、 ＰＦ−４が分離される。例え
ば１ タンパクの画部分がメチオニン残基により融合し
ている場合には、タンパクはシアノーゲンプロミドで処
理され得る。
以下に、 ＰＦ−４，コリタンＥｌ断片およびＰＦ−４
を含む融合タンパク、および微生物によって産生じたＰ
Ｆ−４の精製を包含する本発明の実施態様についての詳
細な説明を行なう。
を含む融合タンパク、および微生物によって産生じたＰ
Ｆ−４の精製を包含する本発明の実施態様についての詳
細な説明を行なう。
遺但子ψ−構−築
ＰＰ−４用の合成遺伝子は、それぞれ８個および４個の
オリゴヌクレオチドからなる２つの主要なサブ断片（Ｉ
および■と呼ぶ）から構築した２４３塩基対のＤＮＡか
らなる。１２個のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダ
・イト法を用いて、アプライド・ハイオシステムズのＤ
ＩＩＡ シンセサイザーで合成された。
オリゴヌクレオチドからなる２つの主要なサブ断片（Ｉ
および■と呼ぶ）から構築した２４３塩基対のＤＮＡか
らなる。１２個のオリゴヌクレオチドは、ホスホアミダ
・イト法を用いて、アプライド・ハイオシステムズのＤ
ＩＩＡ シンセサイザーで合成された。
１２個の合成オリゴヌクレオチドは、以下に記載し、か
つ第３図に例示するように、精製し、連結して断片ｌお
よび■を調製した。
つ第３図に例示するように、精製し、連結して断片ｌお
よび■を調製した。
オリゴヌクレオチＦの および
１、精製
７ｐ＋ｒｌ素、 ２ｍＭ ＥＤＴＡを含む９０ｍＭ ！
−リスーホウ酸緩衝液を用いて、ポリアクリルアミドゲ
ル（１２％）を調製した。１〜５ ＾２ｏ中位の未精製
オリボスクレオ千ド試料および同量の７Ｍ尿素を、１０
ｍＭトリス−＋１ＣＩｉｌ衝１（ｐｕ ７．５）中で混
合シタ。ＤＮＡ Ｘ１４をゲルに加え１色素混合物（０
，］７７％ブロムフェノールフルー ０．２７％キシレ
ンシアツール、ｌＯｍＭｔ・リスー利ＩＣＩ、 ｐｉ（
７，５）をウェルの１つに加えて、オリゴヌクレオチド
の移動速度をモニターした。ブロムフェノールブルーが
ゲルの先端から約３０ ｃｍに移動するまで、４００〜
６００ｖで電気泳動を行った。
−リスーホウ酸緩衝液を用いて、ポリアクリルアミドゲ
ル（１２％）を調製した。１〜５ ＾２ｏ中位の未精製
オリボスクレオ千ド試料および同量の７Ｍ尿素を、１０
ｍＭトリス−＋１ＣＩｉｌ衝１（ｐｕ ７．５）中で混
合シタ。ＤＮＡ Ｘ１４をゲルに加え１色素混合物（０
，］７７％ブロムフェノールフルー ０．２７％キシレ
ンシアツール、ｌＯｍＭｔ・リスー利ＩＣＩ、 ｐｉ（
７，５）をウェルの１つに加えて、オリゴヌクレオチド
の移動速度をモニターした。ブロムフェノールブルーが
ゲルの先端から約３０ ｃｍに移動するまで、４００〜
６００ｖで電気泳動を行った。
ゲルをプレートから取り出し、プラスチックのラップに
包み、螢光バンクグラウンド上にｅｌし。
包み、螢光バンクグラウンド上にｅｌし。
短波長紫外光を用いてＤＮＡを可視化した。所望のハン
ドをカミソリの刃で注意深く切り出した。このゲル片を
エンベンドルフチューブにいれ、ガラス捧で砕いた。次
いで、 ０．５ ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ ）シス１１
ＣＩ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）をこのチ１−
ブに加え。
ドをカミソリの刃で注意深く切り出した。このゲル片を
エンベンドルフチューブにいれ、ガラス捧で砕いた。次
いで、 ０．５ ｍｌのＴＥ（１０ｍＭ ）シス１１
ＣＩ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）をこのチ１−
ブに加え。
ＤＮＡを抽出するために、このチューブを一晩回転させ
た。このチューブを１０分間１５．０００ｒｐｍで遠心
分離し、そして上清を回収した。このＤＮＡ試料をｉｐ
で１０倍に希釈した後、 Ｃ−１８５ｅｐ−Ｐａｋカラ
ムを用いて脱塩した。ＤＮＡの回収率は、一般に５０％
と８０％との間であった。溶出液を凍結乾燥し１次いで
水０．５ｍｌに再懸濁した。
た。このチューブを１０分間１５．０００ｒｐｍで遠心
分離し、そして上清を回収した。このＤＮＡ試料をｉｐ
で１０倍に希釈した後、 Ｃ−１８５ｅｐ−Ｐａｋカラ
ムを用いて脱塩した。ＤＮＡの回収率は、一般に５０％
と８０％との間であった。溶出液を凍結乾燥し１次いで
水０．５ｍｌに再懸濁した。
回収したＤＮＡの純度はＴ４キナーゼによる５゛末端の
３２ｐ−リン酸標識物をゲル電気泳動後のオートラジオ
グラフィーで確認した。
３２ｐ−リン酸標識物をゲル電気泳動後のオートラジオ
グラフィーで確認した。
２．オリゴヌクレオチド゛′ ・ｔ
オリゴヌクレオチドを連結するための反応混合物は、５
０ｄトリス−）ＩＣＩ、 （ｐ）ｌ ７．５）、 １０
ｍＭ ＭｇＣｂ。
０ｄトリス−）ＩＣＩ、 （ｐ）ｌ ７．５）、 １０
ｍＭ ＭｇＣｂ。
２０ ｍＭジチオスレイトール、 Ｉｎ＋Ｍ ＡＴＰ、
１００ピコモルのＤＮＡ（５°末端の濃度）、および
１００単位のＴ４リガーゼからなり、その全容量は１０
０μ！であった。これらの反応混合物１６〜２１°Ｃに
て一晩インキユベートした。
１００ピコモルのＤＮＡ（５°末端の濃度）、および
１００単位のＴ４リガーゼからなり、その全容量は１０
０μ！であった。これらの反応混合物１６〜２１°Ｃに
て一晩インキユベートした。
連結反応は、３倍過剰のＥＤＴＡを加えて＋ ’ｇ”を
キレート化させることにより終結させた。尿素と色素混
合物とを加えた後１試料を熱変性させ、そしてゲル電気
泳動で分析した。
キレート化させることにより終結させた。尿素と色素混
合物とを加えた後１試料を熱変性させ、そしてゲル電気
泳動で分析した。
第３図は９合成遺伝子を構築するために用いた１２個の
オリゴヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチド１〜８
は断片Ｉを構成し、オリゴヌクレオチド９〜１２は断片
■を構成した。これらの２種の断片は、インビトロで構
築したあと５以下で述べるように１Ｍ１３ベクターにク
ローン化してＤＮＡ配列を確認した。
オリゴヌクレオチドを示す。オリゴヌクレオチド１〜８
は断片Ｉを構成し、オリゴヌクレオチド９〜１２は断片
■を構成した。これらの２種の断片は、インビトロで構
築したあと５以下で述べるように１Ｍ１３ベクターにク
ローン化してＤＮＡ配列を確認した。
旧３のクローニングベタ −の
ＭＬ３の２本鎖複製形（ＲＦ） ＤＮＡを、以下のよう
にｍ製した。Ｍ１３を導入したＥ、 ｃｏｌｉ Ｊ
ＭＩＯＩ細胞を２ｘＹＴブロスに接種し、３７°Ｃで一
晩培養した。
にｍ製した。Ｍ１３を導入したＥ、 ｃｏｌｉ Ｊ
ＭＩＯＩ細胞を２ｘＹＴブロスに接種し、３７°Ｃで一
晩培養した。
細胞を遠心分離により採集し、洗浄し、緩衝液に再懸濁
し、リゾチームおよびトリトンＸ−１００で溶解し、そ
してリボヌクレアーゼで処理した。細胞破片を除去し、
ＲＦ ＤＮＡを＋ ＣｓＣｌ−エチジウムプロミド平
衡遠心分離を用いて精製した。ｎ−ブタノールで抽出す
ることにより、エチジウムプロミドを除去した。Ｉ？Ｆ
ＤＮＡ を透析し、エタノール沈澱により濃縮した
。
し、リゾチームおよびトリトンＸ−１００で溶解し、そ
してリボヌクレアーゼで処理した。細胞破片を除去し、
ＲＦ ＤＮＡを＋ ＣｓＣｌ−エチジウムプロミド平
衡遠心分離を用いて精製した。ｎ−ブタノールで抽出す
ることにより、エチジウムプロミドを除去した。Ｉ？Ｆ
ＤＮＡ を透析し、エタノール沈澱により濃縮した
。
Ｅ、 ｃｏｌｉを０Ｄ６６゜が０．６と０．７との間
になるまで、２ｘＹＴプロス中で培養した。細胞を遠心
分離により採集し、 ５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ （培地の
半分の容量）に再懸濁し、そして２０分間氷上に保持し
た。細胞を採集し、 １／１０容量のＣａＣｌ□に再懸
濁した。
になるまで、２ｘＹＴプロス中で培養した。細胞を遠心
分離により採集し、 ５０ｍＭ ＣａＣ１ｚ （培地の
半分の容量）に再懸濁し、そして２０分間氷上に保持し
た。細胞を採集し、 １／１０容量のＣａＣｌ□に再懸
濁した。
皿π転迫
予めエンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲｒおよびＸ ｈａ
１で消化させたＭ１３ ＲＦ ＤＮＡを、 ＰＦ−４
断片Ｉまたは■に連結させ、そしてコンピテントＪＭＩ
ＯＩ細胞と混合し、２０〜４０分間氷上に保持した。こ
の混合物に４６゛Ｃにて２分間熱シａｙりを与え＋ Ｉ
ＰＴＧ、 Ｂｌｕｏ−ｇａｌ。
１で消化させたＭ１３ ＲＦ ＤＮＡを、 ＰＦ−４
断片Ｉまたは■に連結させ、そしてコンピテントＪＭＩ
ＯＩ細胞と混合し、２０〜４０分間氷上に保持した。こ
の混合物に４６゛Ｃにて２分間熱シａｙりを与え＋ Ｉ
ＰＴＧ、 Ｂｌｕｏ−ｇａｌ。
軟寒天（４６℃）、および新たに生育させたＪＭＩＯＩ
細胞と混合した。この混合物をＹＴ寒天プレート上にプ
レートし、３７”Ｃにて一晩培養した。
細胞と混合した。この混合物をＹＴ寒天プレート上にプ
レートし、３７”Ｃにて一晩培養した。
ＰＦ４断片を含まないＭ１３で形質転換されたＪＭＩＯ
Ｉ細胞は、β−ガラクトシダーゼを合成し、青色のプラ
ークを与えた。ＰＦ−４断片を含む旧３で形質転換され
た細胞は、β−ガラクトシダーゼを生産せず、無色のプ
ラークを与えた。
Ｉ細胞は、β−ガラクトシダーゼを合成し、青色のプラ
ークを与えた。ＰＦ−４断片を含む旧３で形質転換され
た細胞は、β−ガラクトシダーゼを生産せず、無色のプ
ラークを与えた。
ニトロセルロースフィルター・ハイブリダイゼーション
（以下余白）
組換えファージを以下のようにＰＦ−４遺伝子配列の存
在についてスクリーニングした。ファージ培養物は、
ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の９６穴ＨＹＢＲＩ−ＤＯＴマニ
ホールドを用いて、ニトロセルロースフィルタペーパー
上にドツトプロットした。プロットしたファージを溶解
させ、 ＤＮＡは、これらのフィルタを３次の溶液中で
、それぞれ１５分間撹拌下に１度づつ洗浄することによ
り変性させて固定化した： ０．５ Ｍ ＮａＯＨ；
０．５ Ｍ トリス、 ｐＨ７，４； ２ Ｘ５ＳＣ
（０，３Ｍ ＮａＣｌ 、 ３０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）、ｐＨ７゜これらのフィルタを９５％エタノール
中で簡単に洗浄し、風乾し、３時間プレハイブリダイゼ
ーションし、そして室温にて一晩３２ｐ−標識化オリゴ
ヌクレオチドでハイブリダイゼーションした。これらの
ハイブリダイゼーションしたフィルタを、０．１％ＳＯ
５を含むＩ Ｘ５ＳＰＥ中で、２５°Ｃにて１５分間２
回洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行なった
。次いで、これらのフィルタを再度洗浄し、そしてオリ
ゴヌクレオチド５’ −ＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＣＴＡ
ＧＡＣＣＴＧ −３’をプローブとして用いて調べた。
在についてスクリーニングした。ファージ培養物は、
ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の９６穴ＨＹＢＲＩ−ＤＯＴマニ
ホールドを用いて、ニトロセルロースフィルタペーパー
上にドツトプロットした。プロットしたファージを溶解
させ、 ＤＮＡは、これらのフィルタを３次の溶液中で
、それぞれ１５分間撹拌下に１度づつ洗浄することによ
り変性させて固定化した： ０．５ Ｍ ＮａＯＨ；
０．５ Ｍ トリス、 ｐＨ７，４； ２ Ｘ５ＳＣ
（０，３Ｍ ＮａＣｌ 、 ３０ｍＭクエン酸ナトリ
ウム）、ｐＨ７゜これらのフィルタを９５％エタノール
中で簡単に洗浄し、風乾し、３時間プレハイブリダイゼ
ーションし、そして室温にて一晩３２ｐ−標識化オリゴ
ヌクレオチドでハイブリダイゼーションした。これらの
ハイブリダイゼーションしたフィルタを、０．１％ＳＯ
５を含むＩ Ｘ５ＳＰＥ中で、２５°Ｃにて１５分間２
回洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーを行なった
。次いで、これらのフィルタを再度洗浄し、そしてオリ
ゴヌクレオチド５’ −ＧＴＡＡＡＡＴＣＴＧＴＣＴＡ
ＧＡＣＣＴＧ −３’をプローブとして用いて調べた。
このオリゴヌクレオチドは。
ＰＦ〜４（■）およびＰＦ〜４（Ｕ）サブ断片間の接合
部分に対応する。
部分に対応する。
！１：０１ Ｅｌブ乞と支しΔ爪慕
ＪＣ４１１株（Ｃｏｌ ＥＬ−０３０）を、６０１のＭ
９培地（ｌｅあたり：ＮＬＣＩ １ ｇｔ ＮａＪＰ
ＩＬ ’ＬＯ６ｇ。
９培地（ｌｅあたり：ＮＬＣＩ １ ｇｔ ＮａＪＰ
ＩＬ ’ＬＯ６ｇ。
ＫＨｚＰＯ４３ｇ、 ＮａＣｌ ５ ｇ、 カザミノ
酸 ３ｇ、１０％Ｍｇ５Ｏｎ ｌ ｄ 、さらに加圧滅
菌後２０％グルコースｉｏ−およびｌ Ｍ ＣａＣＩｚ
Ｏ，５ｄを補充添加）で５３７°Ｃの培養器中にて、
細胞密度が約５ ＸＩＯ＠ＣＦｔｌ／ｄとなるまで培養
した。クロラムフェニコールを。
酸 ３ｇ、１０％Ｍｇ５Ｏｎ ｌ ｄ 、さらに加圧滅
菌後２０％グルコースｉｏ−およびｌ Ｍ ＣａＣＩｚ
Ｏ，５ｄを補充添加）で５３７°Ｃの培養器中にて、
細胞密度が約５ ＸＩＯ＠ＣＦｔｌ／ｄとなるまで培養
した。クロラムフェニコールを。
最終濃度が１００ ｕｇ ／１ａｆｌになるまで添加し
、３７°Ｃにて培養をさらに６時間続行した。５ｈａｒ
ｐｅｌｓ連続遠心分離機を用いて細胞を回収した。１０
ｇ（４潤重量）のペレットを、 ５０ｎ＋Ｍ ＥＤＴＡ
と１５％シヨ塘とを含む１８０ｓｊ！の５Ｏｎ＋Ｍ
）リス−〇ＣＩ 緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁させた。
、３７°Ｃにて培養をさらに６時間続行した。５ｈａｒ
ｐｅｌｓ連続遠心分離機を用いて細胞を回収した。１０
ｇ（４潤重量）のペレットを、 ５０ｎ＋Ｍ ＥＤＴＡ
と１５％シヨ塘とを含む１８０ｓｊ！の５Ｏｎ＋Ｍ
）リス−〇ＣＩ 緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁させた。
次いで、リゾチーム０．１４ｇを加え。
混合物を室温で１０分間静置した。次いで、 １０％５
ＯＳ１６ｄと５Ｍ酢酸カリウム２０−とを加えた。この
混合物を氷上で３０分間インキュベートした後、５Ｓ−
１４０−夕と５ｏｒｖａ ｌ ｌ遠心分離機とを用いて
３０分間１２、 ＯＯＯｒｐｍで遠心分離した。上清に
膵臓リボヌクレアーゼ八を４■加え、混合物を３７°Ｃ
で１時間イン二トユベートした。０．１Ｍ１−リス（ｐ
ｌ＋８．０ ）で飽和した同量のフェノールで、この試
料を２回抽出し、そしてこの試料の１７１０容量の３．
０Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量の冷エタノールとを加
えることにより、 ＤＮＡを沈澱させた後、 −２０
’Ｃで一晩インキユベートした。ＨＢ−４０−夕を用い
た冷却５ｏｒｖａ ｌ ｌ遠心分離機により７．００Ｏ
ｒｐｍで５０分間遠心分離して得られる沈澱物を回収し
た。このペレットを。
ＯＳ１６ｄと５Ｍ酢酸カリウム２０−とを加えた。この
混合物を氷上で３０分間インキュベートした後、５Ｓ−
１４０−夕と５ｏｒｖａ ｌ ｌ遠心分離機とを用いて
３０分間１２、 ＯＯＯｒｐｍで遠心分離した。上清に
膵臓リボヌクレアーゼ八を４■加え、混合物を３７°Ｃ
で１時間イン二トユベートした。０．１Ｍ１−リス（ｐ
ｌ＋８．０ ）で飽和した同量のフェノールで、この試
料を２回抽出し、そしてこの試料の１７１０容量の３．
０Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容量の冷エタノールとを加
えることにより、 ＤＮＡを沈澱させた後、 −２０
’Ｃで一晩インキユベートした。ＨＢ−４０−夕を用い
た冷却５ｏｒｖａ ｌ ｌ遠心分離機により７．００Ｏ
ｒｐｍで５０分間遠心分離して得られる沈澱物を回収し
た。このペレットを。
０．３ Ｍ ＮａＣ１と５ｍＭＥＤＴ＾とを含む１０ｍ
Ｍ ’ｔ−リスｏｃ＋ １１街液（ｐＨ７，５） （
ＮＥＩＩ衝液）５０ｄに溶解させた。次いで、この試料
を、 ＮＥ緩衝液で平衡化した５Ｍ１００ｃｍのＢｉｏ
−Ｇｅｔ Ａ、 ５カラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 ＣΔ）にかけ
た。ＤＮＡはＮＥ緩衝液で溶出した。６０ｄ／ｈｒの流
量で２０ｍ１の両分を採集した。 ＤＮＡの溶出は、
Ｇ１１ｆｏｒｄ ２６００ ＵＶＶｉｓ分光光度計を用
いて、各両分の２６Ｏｎ＋ｍにおける吸光度を測定して
モニターした。宿主ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは共
にボイドボリューム中に回収された。ＤＮＡを含む両分
をプールし、エタノールで沈澱させた。ＨＢ−４０−タ
を用いた冷却５ｏｒｖａ ｌ ｌ遠心分離機により８．
００Ｏｒｐｍで４０分間遠心分離して沈澱を採集し、
０．２Ｍ Ｎａｃｌを含む５−の１０ｍＭトリス−１１
０１緩衝液（ｐＨ７，８）中に再度溶解させた。
Ｍ ’ｔ−リスｏｃ＋ １１街液（ｐＨ７，５） （
ＮＥＩＩ衝液）５０ｄに溶解させた。次いで、この試料
を、 ＮＥ緩衝液で平衡化した５Ｍ１００ｃｍのＢｉｏ
−Ｇｅｔ Ａ、 ５カラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、 Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 ＣΔ）にかけ
た。ＤＮＡはＮＥ緩衝液で溶出した。６０ｄ／ｈｒの流
量で２０ｍ１の両分を採集した。 ＤＮＡの溶出は、
Ｇ１１ｆｏｒｄ ２６００ ＵＶＶｉｓ分光光度計を用
いて、各両分の２６Ｏｎ＋ｍにおける吸光度を測定して
モニターした。宿主ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡは共
にボイドボリューム中に回収された。ＤＮＡを含む両分
をプールし、エタノールで沈澱させた。ＨＢ−４０−タ
を用いた冷却５ｏｒｖａ ｌ ｌ遠心分離機により８．
００Ｏｒｐｍで４０分間遠心分離して沈澱を採集し、
０．２Ｍ Ｎａｃｌを含む５−の１０ｍＭトリス−１１
０１緩衝液（ｐＨ７，８）中に再度溶解させた。
このＤＮＡ試料を、 ０．９Ｍ９０ｃｍのＲＰＣ−５
カラムにかけた後、加圧下３０”Ｃでパックした。ＤＮ
Ａは、 １０ＩＩＩＦＩトリス−１１ｃＩ 緩衝液（Ｐ
Ｈ７，８）中の０．６〜０．７ＭＮａＣ１直線勾配（全
容積１ｆｆｉ）で溶出させた。０．８ｄ／ｍｉｎの流量
で、２．５ｄずつの両分を採集した。
カラムにかけた後、加圧下３０”Ｃでパックした。ＤＮ
Ａは、 １０ＩＩＩＦＩトリス−１１ｃＩ 緩衝液（Ｐ
Ｈ７，８）中の０．６〜０．７ＭＮａＣ１直線勾配（全
容積１ｆｆｉ）で溶出させた。０．８ｄ／ｍｉｎの流量
で、２．５ｄずつの両分を採集した。
ＤＮＡの溶出は、伝導率計（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、
Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）を用いて、採集した各試料の伝
導率を測定することに５より、および垂直アガロースス
ラブゲル（０，２５Ｘ １４ Ｘ １５．５ｃｍ ）を
用いたアガロースゲル電気泳動により、モニターした。
Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）を用いて、採集した各試料の伝
導率を測定することに５より、および垂直アガロースス
ラブゲル（０，２５Ｘ １４ Ｘ １５．５ｃｍ ）を
用いたアガロースゲル電気泳動により、モニターした。
これらの試料を、 ｌ ＩＴＩＭ ＥＤＴＡと５ｍＭ
酢酸ナトリウムとを含む４０ｍＭ トリス塩基緩衝ｆＬ
（ｐＨ８，２） （ＴＡＥ ｌｌｌ液液中で調製した
１％アガロースＶルにかけ、５Ｖ／ｃｍの一定電圧で３
時間電気泳動した。スーパーコイルＯＮ＾および切れ目
の入った環状ＤＮＡを含む両分を別々にプールし、冷エ
タノールで沈澱させた。得られたＣｏｔ ＥＩＤＮＡ分
子の沈′ｒｉ物を、それぞれ１ 、０ ｍｌおよび０
、６ ｔｎｌのＴＥＮ緩衝液に溶解させた。
酢酸ナトリウムとを含む４０ｍＭ トリス塩基緩衝ｆＬ
（ｐＨ８，２） （ＴＡＥ ｌｌｌ液液中で調製した
１％アガロースＶルにかけ、５Ｖ／ｃｍの一定電圧で３
時間電気泳動した。スーパーコイルＯＮ＾および切れ目
の入った環状ＤＮＡを含む両分を別々にプールし、冷エ
タノールで沈澱させた。得られたＣｏｔ ＥＩＤＮＡ分
子の沈′ｒｉ物を、それぞれ１ 、０ ｍｌおよび０
、６ ｔｎｌのＴＥＮ緩衝液に溶解させた。
１ｉ忍」」１鱈近ｌへ１里
上記のＣｏｌ Ｅｌプラスミドを半月１するために用い
た手順により、 Ｅ、ｃｏｌｉ株２９４ （ｐＢＲ３
２２）からプラスミドｐＢＲ３２２を単離した。
た手順により、 Ｅ、ｃｏｌｉ株２９４ （ｐＢＲ３
２２）からプラスミドｐＢＲ３２２を単離した。
Ｃｏｌ ＥＩ ＤＮＡの された の２００ｕｆ！
の切れ目の入った環状Ｃｏｌ Ｅｌ −ＤＮＡ （０
，７ｇｇ／ｕｌ）と、 ２．８ ｄの０．３ Ｍ酢酸ナ
トリウムとを混合した。この口ＭＡ溶液をオムニミキサ
ー（ＤｕｐｏｎＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 Ｎｅｗ
ｔｏｎ、 ＣＮ）のマイクワホモジナイザーセルに入れ
、 ３８．５０Ｏｒｐｍで２０分間ＤＮＡを剪断した。
の切れ目の入った環状Ｃｏｌ Ｅｌ −ＤＮＡ （０
，７ｇｇ／ｕｌ）と、 ２．８ ｄの０．３ Ｍ酢酸ナ
トリウムとを混合した。この口ＭＡ溶液をオムニミキサ
ー（ＤｕｐｏｎＬ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 Ｎｅｗ
ｔｏｎ、 ＣＮ）のマイクワホモジナイザーセルに入れ
、 ３８．５０Ｏｒｐｍで２０分間ＤＮＡを剪断した。
剪断工程中は常に温度を０°Ｃに維持した。剪断された
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、 １００μｉのＴＥＮ
緩衝液に再度溶解させ、そして子ウシ腸ホスファターゼ
（ＣＩＴ ） （ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅ
ｉ＋ｌｌ、 Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、 ＩＮ）で処
理した。ＣＩＴによる処理は、２つの反応混合物５００
μ！中で実施した。各反応混合物は、蒸留水３８０μＡ
、１Ｍトリス−＋１ｃＩ緩衝液（ｐＨ８，０） ５０μ
２．硫酸亜鉛１０ｍＭ ５ｕｌ、 ＣＩＴ （ＩＯ
Ｕ／μｊ２） ５ｕｌを含有した。３７°Ｃで３０分間
インキュベートした後、さらにＣＩＴ ５μｉを加え、
３７°Ｃにて培養ををさらに３００分間行した。これら
の反応混合物を、同量の緩衝液で飽和したフェノールで
２回抽出し、 ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。ＤＮ
Ａ断片の異種集団を。
ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、 １００μｉのＴＥＮ
緩衝液に再度溶解させ、そして子ウシ腸ホスファターゼ
（ＣＩＴ ） （ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅ
ｉ＋ｌｌ、 Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、 ＩＮ）で処
理した。ＣＩＴによる処理は、２つの反応混合物５００
μ！中で実施した。各反応混合物は、蒸留水３８０μＡ
、１Ｍトリス−＋１ｃＩ緩衝液（ｐＨ８，０） ５０μ
２．硫酸亜鉛１０ｍＭ ５ｕｌ、 ＣＩＴ （ＩＯ
Ｕ／μｊ２） ５ｕｌを含有した。３７°Ｃで３０分間
インキュベートした後、さらにＣＩＴ ５μｉを加え、
３７°Ｃにて培養ををさらに３００分間行した。これら
の反応混合物を、同量の緩衝液で飽和したフェノールで
２回抽出し、 ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。ＤＮ
Ａ断片の異種集団を。
ショ糖密度勾配画分離により、さらに精製し。
大きさに従って分離した。不連続なシーＪ糖密度勾配は
、 ５Ｗ４０ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ ）用の遠心管内
に。
、 ５Ｗ４０ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ ）用の遠心管内
に。
１ｍＭＥＤＴ八を含む０．３ Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ１，０）中へ、２０％、 １５％、１０％、およ
び５％のショ糖３．４ ｄを順次積層させることにより
調製された。１００ ｌＥ （０，２５μｇ／μりのＤ
ＮＡ試料を。
（ｐＨ１，０）中へ、２０％、 １５％、１０％、およ
び５％のショ糖３．４ ｄを順次積層させることにより
調製された。１００ ｌＥ （０，２５μｇ／μりのＤ
ＮＡ試料を。
このショ糖密度勾配上に積層し、 Ｌ ８−７０ Ｂ
ｅｃｋｍａｎ超遠心分離機を用いて、１０°Ｃにて２０
時間３５．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。０．５ｍｌず
つの両分を採集し、エタノールで沈澱させた。これらの
沈澱をＴＥＮ緩衝液５０μｌに再度溶解させ、アガロー
スゲル電気泳動により分析した。バクテリオファージＤ
ＮＡをμｎｄ■エンドヌクレアーゼで処理することによ
り得られるＤＮＡ断片を２分子量の標準として使用した
。λ／Ｈｉｎｄｌｌ１反応混合物は、蒸留水２７μ２，
５×石ｄｌｌ！緩衝液ｌＯμｌ、λＤＮＡ （０，７ｇ
ｇ／μｌ）１μ！、およびｌ１ｉｎｄｎｌ溶液（２Ｕ／
μ１２μｊｌ！を含有した。
ｅｃｋｍａｎ超遠心分離機を用いて、１０°Ｃにて２０
時間３５．００Ｏｒｐｍで遠心分離した。０．５ｍｌず
つの両分を採集し、エタノールで沈澱させた。これらの
沈澱をＴＥＮ緩衝液５０μｌに再度溶解させ、アガロー
スゲル電気泳動により分析した。バクテリオファージＤ
ＮＡをμｎｄ■エンドヌクレアーゼで処理することによ
り得られるＤＮＡ断片を２分子量の標準として使用した
。λ／Ｈｉｎｄｌｌ１反応混合物は、蒸留水２７μ２，
５×石ｄｌｌ！緩衝液ｌＯμｌ、λＤＮＡ （０，７ｇ
ｇ／μｌ）１μ！、およびｌ１ｉｎｄｎｌ溶液（２Ｕ／
μ１２μｊｌ！を含有した。
平均して２．０００ ｂｐの剪断ＣｏｌＥＩ ＤＮＡ断
片を含む。
片を含む。
ショ糖密度勾配画分をプールし、エタノールで沈澱させ
、 ＴＥＮ緩衝液に再度溶解させた。
、 ＴＥＮ緩衝液に再度溶解させた。
ＢＲ３２２への ＣｏｌＥ１ のクローニング
プラスミドρＢＲ３２２をＰｓｔＩで切断して線状分子
とした。反応混合物は、蒸留水５２０μｊ！、 ５Ｘ
Ｐｓｔ）緩衝液２００μｌ、 ｐＢＲ３２２ＤＮ八へ液
（０，２５μｇ／μ１）２００ｐｆ、およびＰｓｔ Ｉ
（１２Ｕ／ ａ Ｅ ） ８０μｌを含有し、３７
°Ｃで４時間インキュベートした。 ＥＤＴＡを２０ｍ
Ｍまで加えて反応を停止させ、同量のフェノールで抽出
した。エタノールでＤＮＡを沈澱させ。
プラスミドρＢＲ３２２をＰｓｔＩで切断して線状分子
とした。反応混合物は、蒸留水５２０μｊ！、 ５Ｘ
Ｐｓｔ）緩衝液２００μｌ、 ｐＢＲ３２２ＤＮ八へ液
（０，２５μｇ／μ１）２００ｐｆ、およびＰｓｔ Ｉ
（１２Ｕ／ ａ Ｅ ） ８０μｌを含有し、３７
°Ｃで４時間インキュベートした。 ＥＤＴＡを２０ｍ
Ｍまで加えて反応を停止させ、同量のフェノールで抽出
した。エタノールでＤＮＡを沈澱させ。
ＴＥＮ緩衝液に再度溶解させた。
蒸留水５μＥ、 ５００ ｍＭカコジル酸カリウム２０
μ２１ＯＩＩＩＭ塩化コバルト１０μｌ、 ｉｎ＋Ｍ
ＤＴＴ １０μ４１！、１０ｍＭｄＧＴＰ２ μ
ｆ、 ゴＩｔ−ｄＧＴＰ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ。
μ２１ＯＩＩＩＭ塩化コバルト１０μｌ、 ｉｎ＋Ｍ
ＤＴＴ １０μ４１！、１０ｍＭｄＧＴＰ２ μ
ｆ、 ゴＩｔ−ｄＧＴＰ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｃｏｒｐ。
ｒａｔｉｏｎ） ２０ｕ ｌ 、 ＤＮＡ （０，０４
Ｍｇ／ ｕ ｌ ） ２５ｕ １および末端デオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼ（Ｂｅｔｈｓｄａ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ
、。
Ｍｇ／ ｕ ｌ ） ２５ｕ １および末端デオキシヌ
クレオチジルトランスフエラーゼ（Ｂｅｔｈｓｄａ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ
、。
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 ＭＯ） （１２Ｕ／
ｕ ｌ ） ５ ｕ ｌを含む反応混合物中の直鎖状ｐ
ＢＲ３２２分子に、ポリ（ｄＧ）ホモポリマーを加えた
。
ｕ ｌ ） ５ ｕ ｌを含む反応混合物中の直鎖状ｐ
ＢＲ３２２分子に、ポリ（ｄＧ）ホモポリマーを加えた
。
全ＤＮＡが２．０ μｇであり、かつヌクレオチドトリ
ホスフェートがｄＣＴＰであることを除いて、同様の反
応混合物中のＣｏｌＥ１剪断断片に、ポＩＪ （ｄＣ）
ホモポリマーを加えた。上記の反応は、３７°Ｃにて。
ホスフェートがｄＣＴＰであることを除いて、同様の反
応混合物中のＣｏｌＥ１剪断断片に、ポＩＪ （ｄＣ）
ホモポリマーを加えた。上記の反応は、３７°Ｃにて。
それぞれ２分間および３分間行い、 ＥＤＴＡを２０ｍ
Ｍまで加えることにより停止させ、そしてフェノールで
抽出した。ＣｏｌＢ１− （ポリ（ｄＣ） ）断片を、
蒸留水１１５μｆに再溶解し、 ０．５Ｍ Ｎａｃｌ
４０μｍ、 ５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７，２５） ４
０μ！、および直を真状ｐＢＲ３２２−〔ポリ（ｄＧ）
） ＤＮＡ溶液（０，１μｇ／μｆ）３μ！を加える
ことにより、直鎖状ｐＢＲ３２２−（ポリ（ｄＧ） ）
分子にアニーリングした。アニーリング混合物を合物を
７０’Ｃで１５分間インキュベートした後、５時間以上
にわたって４０’Ｃまで冷却した。この混合物を４５゛
Ｃに一晩保持し９次いで室温に冷却した。
Ｍまで加えることにより停止させ、そしてフェノールで
抽出した。ＣｏｌＢ１− （ポリ（ｄＣ） ）断片を、
蒸留水１１５μｆに再溶解し、 ０．５Ｍ Ｎａｃｌ
４０μｍ、 ５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７，２５） ４
０μ！、および直を真状ｐＢＲ３２２−〔ポリ（ｄＧ）
） ＤＮＡ溶液（０，１μｇ／μｆ）３μ！を加える
ことにより、直鎖状ｐＢＲ３２２−（ポリ（ｄＧ） ）
分子にアニーリングした。アニーリング混合物を合物を
７０’Ｃで１５分間インキュベートした後、５時間以上
にわたって４０’Ｃまで冷却した。この混合物を４５゛
Ｃに一晩保持し９次いで室温に冷却した。
ｌＥ、ｃｏｌｉ ２９４へ形質転換するために、Ｌ−ブ
ロス中で一晩増殖させた培養物を、新鮮なし一グロス培
地中に１：１００の割合で希釈し、ＯＤ６゜。が０．６
になるまで、振盪しなから３７゛Ｃで培養した。この時
点で、培養物３５Ｉｄを、４°Ｃにて１２０分間６．０
０Ｏｒｐｍで遠心分離し、ペレットを０．０５Ｍ Ｃａ
Ｃ１ｇ ２０ｍ１中に再懸濁した。これらの細胞を氷上
で１５分間インキュベートした後、 ４．０００ ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離することにより採集した。これら
の細胞を、 ０．０５ＭＣａＣ１□４ ｍｌに再懸濁し
、アニーリング混合物５０μ２と、 １０ｍＭ ＭｇＣ
ｈおよび１０ｍＭ ＣａＣＩｚを含む１ｈＭ）リス−１
１ｃＩ （ｐＨ７，５） １５０ μ２とを加えるこ
とにより調製したＤＮＡ溶液２００ μ２に混合した。
ロス中で一晩増殖させた培養物を、新鮮なし一グロス培
地中に１：１００の割合で希釈し、ＯＤ６゜。が０．６
になるまで、振盪しなから３７゛Ｃで培養した。この時
点で、培養物３５Ｉｄを、４°Ｃにて１２０分間６．０
０Ｏｒｐｍで遠心分離し、ペレットを０．０５Ｍ Ｃａ
Ｃ１ｇ ２０ｍ１中に再懸濁した。これらの細胞を氷上
で１５分間インキュベートした後、 ４．０００ ｒｐ
ｍで１０分間遠心分離することにより採集した。これら
の細胞を、 ０．０５ＭＣａＣ１□４ ｍｌに再懸濁し
、アニーリング混合物５０μ２と、 １０ｍＭ ＭｇＣ
ｈおよび１０ｍＭ ＣａＣＩｚを含む１ｈＭ）リス−１
１ｃＩ （ｐＨ７，５） １５０ μ２とを加えるこ
とにより調製したＤＮＡ溶液２００ μ２に混合した。
この混合物を０°Ｃで２５分間インキュベートし１次い
で５０°Ｃで１０秒問および室温で１０分間インキュベ
ートした。この時点で、Ｌ−ブロス１４−を加え、そし
て培養物を３７゛Ｃで３０分間振盪した。次いで、 １
．２５ｍｇ／ｍｌのテトう升イクリン）容；夜４８０
ＩＩ Ｅ ＠、 この１１１養物に１Ｊ■え、さらに
３０分間インキキュートを続行した。１００／！Ａの分
ＪＩＩ量を、Ｌ−ブロス２５ｍ１．１゜５９６寒天、お
よび２５ ｔｉ ｇ／ ｄテトラサイクリュノを含む新
たに調製した寒天板上にプレートした。さらに、２５μ
ε／Ｒ１のアンピシリンを含む寒天−Ｆにプレートする
ことにより、テＩ・ラサイクリン百１性（Ｔｅ’ ）形
質転換体のアンピシリンに対する感受性（Ａρ“）を調
べた。
で５０°Ｃで１０秒問および室温で１０分間インキュベ
ートした。この時点で、Ｌ−ブロス１４−を加え、そし
て培養物を３７゛Ｃで３０分間振盪した。次いで、 １
．２５ｍｇ／ｍｌのテトう升イクリン）容；夜４８０
ＩＩ Ｅ ＠、 この１１１養物に１Ｊ■え、さらに
３０分間インキキュートを続行した。１００／！Ａの分
ＪＩＩ量を、Ｌ−ブロス２５ｍ１．１゜５９６寒天、お
よび２５ ｔｉ ｇ／ ｄテトラサイクリュノを含む新
たに調製した寒天板上にプレートした。さらに、２５μ
ε／Ｒ１のアンピシリンを含む寒天−Ｆにプレートする
ことにより、テＩ・ラサイクリン百１性（Ｔｅ’ ）形
質転換体のアンピシリンに対する感受性（Ａρ“）を調
べた。
次いで、 Ｔｃ’ Ａｐ’形質転換体コロニーを、コリ
シンの自発産生についてスクリーニングした。単一のコ
ロシーを、Ｌ−寒天機上にスポットし、３７°Ｃで一晩
培養した。これらのコロニーをクロロホルムス気に曝す
ことにより死滅させ２次いで０．７９６寒天ｒ：Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ−１２，ＣＬ１４２の一晩培養物０．１−と
を含むし一ブロス５−を重層した。寒天を硬化させた後
、これらのプレートを３７゛ｃで一晩・インキュへ一ト
シた。周囲に阻止円を有するコロニをコリシン産生体（
Ｃｏｔ”）として記録し５た。
シンの自発産生についてスクリーニングした。単一のコ
ロシーを、Ｌ−寒天機上にスポットし、３７°Ｃで一晩
培養した。これらのコロニーをクロロホルムス気に曝す
ことにより死滅させ２次いで０．７９６寒天ｒ：Ｅ、ｃ
ｏｌｉ Ｋ−１２，ＣＬ１４２の一晩培養物０．１−と
を含むし一ブロス５−を重層した。寒天を硬化させた後
、これらのプレートを３７゛ｃで一晩・インキュへ一ト
シた。周囲に阻止円を有するコロニをコリシン産生体（
Ｃｏｔ”）として記録し５た。
少量のクリアートライゼートをアガロースゲル電気泳動
で分析することにより、 Ｔｃ’ Ａｐ’ Ｃｏｌ’形
質転換コロニーを、！４１１！！！えブラスミＦの存在
に・ついてスクリーニングした。プラスミドのサイズは
。
で分析することにより、 Ｔｃ’ Ａｐ’ Ｃｏｌ’形
質転換コロニーを、！４１１！！！えブラスミＦの存在
に・ついてスクリーニングした。プラスミドのサイズは
。
１．３６Ｘ１０６〜３５．８ Ｘ １０’ダルトンの範
囲内のサイズを有する８つのプラスミド標準物（Ｍａｒ
ｅｉｎａＦ、［、、ら（１９７８）、 Ｐ！ａｓｍｉｄ
上： ４１１−４２０ ）を用いて、ＤＮＡの電気泳動
によるアガロースゲル中の移動度を測定することにより
決定した。
囲内のサイズを有する８つのプラスミド標準物（Ｍａｒ
ｅｉｎａＦ、［、、ら（１９７８）、 Ｐ！ａｓｍｉｄ
上： ４１１−４２０ ）を用いて、ＤＮＡの電気泳動
によるアガロースゲル中の移動度を測定することにより
決定した。
形質転換クローンを２ｐの培地で増殖させた。
り１ｊアートライゼートを上記のように調製した。
に清を膵５ＩＲＮａｓｅ Ａ （１００ｕ ｆＸ／
滅： ３７”Ｃニて３０分間）で処理し７次いでフェノ
ールで抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、 Ｔ
ＥＮ ｉｌｌ液液再溶解させた。
滅： ３７”Ｃニて３０分間）で処理し７次いでフェノ
ールで抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、 Ｔ
ＥＮ ｉｌｌ液液再溶解させた。
制限酵素は、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｉｒ１ｃ、 （ＢＲ、ｃ）から市販調製物として入手し
た。 ＢＲＬ二こより指定された条件を用いて、このＤ
ＮＡを、 Ｐｓｔｌ 、 ＥｃｏＩ？ Ｉ 、 Ｓｍｑ
ＩおよびＳａｃ １７にて消化した。
た。 ＢＲＬ二こより指定された条件を用いて、このＤ
ＮＡを、 Ｐｓｔｌ 、 ＥｃｏＩ？ Ｉ 、 Ｓｍｑ
ＩおよびＳａｃ １７にて消化した。
試料を、１％アガロースゲルにかけ、５Ｖ／ｃｍの一定
電圧で４時間電気泳動に供した。制限断片の分子量は、
ＨｉｎｄｌｌｌおよびＨａｅ ＩＩＩで消化したバク
テリオファージλＤＮＡの標準移動パターンと比較して
決定した。
電圧で４時間電気泳動に供した。制限断片の分子量は、
ＨｉｎｄｌｌｌおよびＨａｅ ＩＩＩで消化したバク
テリオファージλＤＮＡの標準移動パターンと比較して
決定した。
■換えプラスミドのｐＢＲ３２２部分のハエ１部位への
挿入断片のサイズを確立するために、Ｐｓｔｌを用いた
制限分析を採用した。第４図は、形質転換クローンの１
′つである。 ｐＮＰ６と名付けられた組換えプラスミ
ドの制限酵素地図である。ＮＰ６−２９４と名付けられ
た。この形質転換りｔ：ｚ −：／の試料は、 １９８
３年８月２４日付でＡＴＣＣに寄託された。この試料に
はＡＴＣＣ受理番号３９４１８が与えられた。この寄託
はブダペスト条約に基づいて受理され、その規定に従っ
て維持され、第３者に分譲されうる。
挿入断片のサイズを確立するために、Ｐｓｔｌを用いた
制限分析を採用した。第４図は、形質転換クローンの１
′つである。 ｐＮＰ６と名付けられた組換えプラスミ
ドの制限酵素地図である。ＮＰ６−２９４と名付けられ
た。この形質転換りｔ：ｚ −：／の試料は、 １９８
３年８月２４日付でＡＴＣＣに寄託された。この試料に
はＡＴＣＣ受理番号３９４１８が与えられた。この寄託
はブダペスト条約に基づいて受理され、その規定に従っ
て維持され、第３者に分譲されうる。
Ｅ、ｃｏｌｉ ＮＰ６−２９４株（ｐＮＰ６）を増殖さ
せ、 ＤＮＡ ５００ｕｇをＴＥＮ １１衝液３．９
ｄに調節し、 ＣｓＣｌ ３．４５ ｇとエチジウＪ、
プロミド保存液（５■／滅）０．１ｍＲとを加えること
により、プラスミドＤＮＡをさらに精製した。この混合
物を５Ｗ５０．１ｔＶ−タ（Ｂｅｅｋｍａｎ）用の６肖
酸セルロースチューフ′にｆ多し、１０’Ｃにて４０時
間３６．０００ｒｐｍで遠心分離した。プラスミドＤＮ
Ａのハンドを、長波長紫外線ランプ下に置き、側面から
このチューブを７１１＋することによりシリンジで取り
出した。このＤＮＡ試料を、ブタノールで５回抽出し、
４゛Ｃにて２４時間ＴＥＮ緩衝液１００容呈（×３）に
対して透析した。次いで、エタノール２゜５容量および
３Ｍ酢酸すトリウム１／１０容量でＩＮＮΔを沈澱させ
た。
せ、 ＤＮＡ ５００ｕｇをＴＥＮ １１衝液３．９
ｄに調節し、 ＣｓＣｌ ３．４５ ｇとエチジウＪ、
プロミド保存液（５■／滅）０．１ｍＲとを加えること
により、プラスミドＤＮＡをさらに精製した。この混合
物を５Ｗ５０．１ｔＶ−タ（Ｂｅｅｋｍａｎ）用の６肖
酸セルロースチューフ′にｆ多し、１０’Ｃにて４０時
間３６．０００ｒｐｍで遠心分離した。プラスミドＤＮ
Ａのハンドを、長波長紫外線ランプ下に置き、側面から
このチューブを７１１＋することによりシリンジで取り
出した。このＤＮＡ試料を、ブタノールで５回抽出し、
４゛Ｃにて２４時間ＴＥＮ緩衝液１００容呈（×３）に
対して透析した。次いで、エタノール２゜５容量および
３Ｍ酢酸すトリウム１／１０容量でＩＮＮΔを沈澱させ
た。
ＰしＷ付１Ｎ亜−Ａ−Ｒ＝ＩＯ調製
プラスミドｐＮＰ６は、２つのＥｃｏＲ■制限部位を含
み、その一方はコリシンＥＩＸ！ｉ伝子のカルボキシル
末端領域に位置し、他方はもとのｐＢＲ３２２ベクター
のテトラサイクリン耐性遺伝子の近傍に位置する。
み、その一方はコリシンＥＩＸ！ｉ伝子のカルボキシル
末端領域に位置し、他方はもとのｐＢＲ３２２ベクター
のテトラサイクリン耐性遺伝子の近傍に位置する。
第２の部位を欠＜ ｐＮＰ６の誘導体は以下のようにし
て構築した。直鎖状分子（２つの部位のうち一方のみで
切断した）が得られるように、制限反応条件下でｐＮＩ
’６をＥｃｏｌ？ ｌで消化した。ｐＮＰ６の直鎖状分
子をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｉ￥いてＤ
ＮＡポリメラーゼ１およびデオキシリボヌクレオチドト
リホスフエートと反応させて１本鎖末端を充填した。得
られた分子は、Ｔ４リガーゼを用いて平滑末端連結反応
で環化させ１次いで前記のようにＥ、ｃｏｌｉ ２９４
を形質転換するために使用した。
て構築した。直鎖状分子（２つの部位のうち一方のみで
切断した）が得られるように、制限反応条件下でｐＮＩ
’６をＥｃｏｌ？ ｌで消化した。ｐＮＰ６の直鎖状分
子をアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｉ￥いてＤ
ＮＡポリメラーゼ１およびデオキシリボヌクレオチドト
リホスフエートと反応させて１本鎖末端を充填した。得
られた分子は、Ｔ４リガーゼを用いて平滑末端連結反応
で環化させ１次いで前記のようにＥ、ｃｏｌｉ ２９４
を形質転換するために使用した。
コリシン産生形質転換体は、前記のように選択された。
個々のクローンからＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで消化
することによりコリシン遺伝子内に単一の未処理Ｅｃｏ
Ｒ１部位を含むＤＮＡであることを同定した。単一のＥ
ｃｏＲ１部位の位置は、さらに制限エンドヌクレアーゼ
マツピングにより確認された。
することによりコリシン遺伝子内に単一の未処理Ｅｃｏ
Ｒ１部位を含むＤＮＡであることを同定した。単一のＥ
ｃｏＲ１部位の位置は、さらに制限エンドヌクレアーゼ
マツピングにより確認された。
ＮＦ２−Ｃｏｌ ５０４ −ＰＦ ４の旧３配列決定
ベクターから合成ＰＦ−４遺伝子を取り出し、プラスミ
ドｐＮＰ６ΔＲ１の単一ＥｃｏＲ［部位にクローン化し
た。第４図に示すｐＮＰ６− Ｃｏ ｌ （５０４）Ｐ
Ｆ４と名付けられた。この組換えＤＮＡプラスミドは、
ＰＦ−４タンパク（７０アミノ酸）とコリシンの残基１
〜５０４とを融合させた大きなタンパク（５７４アミノ
酸）を産生ずる能力を有している。このプラスミドを含
む細胞を、培地中で増殖させ、マイトマイシンＣで処理
して、融合タンパクの合成を誘導した。
ベクターから合成ＰＦ−４遺伝子を取り出し、プラスミ
ドｐＮＰ６ΔＲ１の単一ＥｃｏＲ［部位にクローン化し
た。第４図に示すｐＮＰ６− Ｃｏ ｌ （５０４）Ｐ
Ｆ４と名付けられた。この組換えＤＮＡプラスミドは、
ＰＦ−４タンパク（７０アミノ酸）とコリシンの残基１
〜５０４とを融合させた大きなタンパク（５７４アミノ
酸）を産生ずる能力を有している。このプラスミドを含
む細胞を、培地中で増殖させ、マイトマイシンＣで処理
して、融合タンパクの合成を誘導した。
小規模の実験（第５図、レーン２および３Ｈこよると、
融合タンパクは全細胞クンノククの約１０〜２０％の割
合で産生される。しかしながら、へ、（リンアフィニテ
イクロマトグラフイーによりＰＦ−４融合タンパクから
のＣＮＢｒ切断生成物の精製および特徴付けは、誤った
ジスルフィド結合の形成とコリシン断片の干渉とにより
再現できなかった。収率が低いことは、このプラスミド
の構築が不安定でありうるために、より大きな培地容量
（例えば。
融合タンパクは全細胞クンノククの約１０〜２０％の割
合で産生される。しかしながら、へ、（リンアフィニテ
イクロマトグラフイーによりＰＦ−４融合タンパクから
のＣＮＢｒ切断生成物の精製および特徴付けは、誤った
ジスルフィド結合の形成とコリシン断片の干渉とにより
再現できなかった。収率が低いことは、このプラスミド
の構築が不安定でありうるために、より大きな培地容量
（例えば。
１回分が１２１）を用いることにも関係した。
ＮＦ２−Ｃｏｌ （１５０） −ＰＦ ４のｉ！ＩＭ正
しく折りたたまれた活性なＰＦ−４タンパクの収率は、
主としてコリシンセグメントのサイズを減少させること
により向上した。部分的なＥｃｏＲＶ消化条件下で約１
，０００塩基対のＤＮＡを欠失させることにより、 ｐ
ＮＰ６ Ｃｏｌ （５０４） ＰＦ ４から中間
サイズの融合遺伝子が構築された。ｐＮＰ６− Ｃｏ
ｌ （５０４）ＰＦ−４には、３つのＥｃｏＲＶ制限部
位が存在する；２つはコリタンＥ１構造遺伝子内に存在
し、他の１つは第４図に示したように、テトラサイクリ
ン遺伝子内に存在する。形質転換体がＴｃ’で選択され
るため、コリシン遺伝子からＥｃｏＲＶ断片を欠失させ
た所望の形質転換体のみが得られる。得られたプラスミ
ドは、 Ｃｏｌ （１５０） −ＰＦ ４と名付けられ
るが。
しく折りたたまれた活性なＰＦ−４タンパクの収率は、
主としてコリシンセグメントのサイズを減少させること
により向上した。部分的なＥｃｏＲＶ消化条件下で約１
，０００塩基対のＤＮＡを欠失させることにより、 ｐ
ＮＰ６ Ｃｏｌ （５０４） ＰＦ ４から中間
サイズの融合遺伝子が構築された。ｐＮＰ６− Ｃｏ
ｌ （５０４）ＰＦ−４には、３つのＥｃｏＲＶ制限部
位が存在する；２つはコリタンＥ１構造遺伝子内に存在
し、他の１つは第４図に示したように、テトラサイクリ
ン遺伝子内に存在する。形質転換体がＴｃ’で選択され
るため、コリシン遺伝子からＥｃｏＲＶ断片を欠失させ
た所望の形質転換体のみが得られる。得られたプラスミ
ドは、 Ｃｏｌ （１５０） −ＰＦ ４と名付けられ
るが。
ＰＦ−４コ一ド配列に先行するコリシンの１５０個のア
ミノ酸のみをコードし、コリシンセグメントおよびＰＦ
−４を連合する単一のメチオニン残基を含む。このコリ
シンセグメントをＰＦ−４クンバクに融合させると１回
収率や精製手順を特に向上させる。
ミノ酸のみをコードし、コリシンセグメントおよびＰＦ
−４を連合する単一のメチオニン残基を含む。このコリ
シンセグメントをＰＦ−４クンバクに融合させると１回
収率や精製手順を特に向上させる。
プラスミドｐＨＰ６− Ｃｏ ｌ （１５０） −ＰＦ
−４を含むｉＥ、ｃｏ目２９４細胞は、（少なくとも
１２１までの容量で）再現して培養され、マイトマイシ
ンＣで誘発すると。
−４を含むｉＥ、ｃｏ目２９４細胞は、（少なくとも
１２１までの容量で）再現して培養され、マイトマイシ
ンＣで誘発すると。
全細胞タンパクの約２０％のＣｏｌ （１５０） Ｐ
Ｆ ４ ｆａ合物を産生じた。
Ｆ ４ ｆａ合物を産生じた。
（以下余白）
ＮＦ２−Ｃｏｌ（５７−ＰＦ４のｉ、製プラスミドｐＮ
Ｐ６ Ｃｏｌ （１５０） ＰＦ ４における５ｓ
ｔｎとＥｃｏＲＶ制限部位との間の領域を欠失させるこ
とにより、コリシン融合ペプチドのサイズを、さらに５
７個のアミノ酸からなるセグメントへ減少させた。精製
ｐＮＰ６−Ｃｏｌ（１５０） ＰＦ４ ロＮＡを、
５ｓｔＩ［制限酵素で直鎖状分子に開裂させ５次いでＴ
４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＣＴＰで処理した。この
処理条件下では、ポリメラーゼの３°−５′エキソヌク
レアーゼ活性により、プラスミドＤＮＡの５ｓＬＩＩ生
成末端が平滑末端に変換された。この反応の生成物ＤＮ
Ａを、 ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断し、得られた大きな
りＮＡ断片を精製し、 ＤＮＡ リガーゼ反応で環状Ｄ
ＮＡに変換し５次いでｐＮＰ６ Ｃｏｔ（１５０）
ＰＦ ４について述べたように、細胞を形質転換する
ために使用した。
Ｐ６ Ｃｏｌ （１５０） ＰＦ ４における５ｓ
ｔｎとＥｃｏＲＶ制限部位との間の領域を欠失させるこ
とにより、コリシン融合ペプチドのサイズを、さらに５
７個のアミノ酸からなるセグメントへ減少させた。精製
ｐＮＰ６−Ｃｏｌ（１５０） ＰＦ４ ロＮＡを、
５ｓｔＩ［制限酵素で直鎖状分子に開裂させ５次いでＴ
４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＣＴＰで処理した。この
処理条件下では、ポリメラーゼの３°−５′エキソヌク
レアーゼ活性により、プラスミドＤＮＡの５ｓＬＩＩ生
成末端が平滑末端に変換された。この反応の生成物ＤＮ
Ａを、 ＥｃｏＲＶ制限酵素で切断し、得られた大きな
りＮＡ断片を精製し、 ＤＮＡ リガーゼ反応で環状Ｄ
ＮＡに変換し５次いでｐＮＰ６ Ｃｏｔ（１５０）
ＰＦ ４について述べたように、細胞を形質転換する
ために使用した。
得られたプラスミドは、 ｐＮＰ６−Ｃａｌ（５７）
ＰＦ４と呼ばれるが、ＰＦ−４コ一ド配列に先行する
コリシンの５７個のアミノ酸をコードし、そしてコリシ
ンセグメントとＰＦ−４とを連結する単一のメチオニン
残基を含んでいる。
ＰＦ４と呼ばれるが、ＰＦ−４コ一ド配列に先行する
コリシンの５７個のアミノ酸をコードし、そしてコリシ
ンセグメントとＰＦ−４とを連結する単一のメチオニン
残基を含んでいる。
Ｐ、ヒｆｆｌ製
タンパク抽出物を、 ｐＮＰ６−Ｃｏｔ （１５０）
ＰＦ ４から１Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎＨＣｌ）また
は２５１１Ｍトリス。
ＰＦ ４から１Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎＨＣｌ）また
は２５１１Ｍトリス。
１０ｍＭ ＥＤＴＡ 、 ５０ｍＭグルコース、 ｐＨ
８，０（ＴεＧ）中で誘導細胞を超音波処理することに
よって調製した。
８，０（ＴεＧ）中で誘導細胞を超音波処理することに
よって調製した。
融合タンパクは、不溶画分中に見い出された。７Ｍの尿
素または６Ｍ ＧｎＨＣｌ中でＰＦ−４融合タンパクを
可溶化した後、このタンパク試料を、 ＣＮＢｒ切断反
応のために蒸留水に対して充分に透析した。透析の間に
沈澱した融合タンパクを遠心分離によって採集した。こ
の沈澱物を凍結乾燥し９次いで７０％ギ酸に溶解し７そ
して１００〜ｔ、ｏｏｏ倍モル過剰のＣＮＢｒと、室温
にて１８時間反応させた。
素または６Ｍ ＧｎＨＣｌ中でＰＦ−４融合タンパクを
可溶化した後、このタンパク試料を、 ＣＮＢｒ切断反
応のために蒸留水に対して充分に透析した。透析の間に
沈澱した融合タンパクを遠心分離によって採集した。こ
の沈澱物を凍結乾燥し９次いで７０％ギ酸に溶解し７そ
して１００〜ｔ、ｏｏｏ倍モル過剰のＣＮＢｒと、室温
にて１８時間反応させた。
ＣＮＢｒ反応混合物を凍結乾燥し、蒸留水に再懸濁し、
そして再び凍結乾燥した。このタンパク混合物を、 ６
Ｍ ＧｎＨＣｌを含む０．０５Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ
８，２）に溶解した。還元剤（例えば、ジチオスレイト
ールまたはβ−メルカプトエタノール）を、最終濃度が
約０．１Ｍになるまで添加し、混合物を２０°Ｃと３７
°Ｃとの間の温度にて１〜４時間インキュベートした。
そして再び凍結乾燥した。このタンパク混合物を、 ６
Ｍ ＧｎＨＣｌを含む０．０５Ｍ トリス緩衝液（ｐＨ
８，２）に溶解した。還元剤（例えば、ジチオスレイト
ールまたはβ−メルカプトエタノール）を、最終濃度が
約０．１Ｍになるまで添加し、混合物を２０°Ｃと３７
°Ｃとの間の温度にて１〜４時間インキュベートした。
次いで、得られた）容液を、還元剤を使用せずに同じ緩
衝液に対して透析した。このタンノ々り／８液は、ＰＦ
−４９ｆｆ度が約０．２ｍｇ／ｄになるように。
衝液に対して透析した。このタンノ々り／８液は、ＰＦ
−４９ｆｆ度が約０．２ｍｇ／ｄになるように。
かつ酸化および還元グルタチオンの２：１混合物の最終
濃度が１ｍＨになるように調製した。タンパクの折りた
たみ反応は、室温にて１０〜２０時間進行させた。この
間、タンパク７容液は、 ０．５ Ｍ ＮａＣｌを含む
、 １０〜５０容噴の０．０５ Ｍ ！−リス緩衝液（
ｐＨ８，２）に対して透析した。これらの条件により、
正しいジスルフィド結合を形成し、かつ本来の構造に折
りたたまれたＰＦ−４が８０％以−Ｆの収率で得られた
。
濃度が１ｍＨになるように調製した。タンパクの折りた
たみ反応は、室温にて１０〜２０時間進行させた。この
間、タンパク７容液は、 ０．５ Ｍ ＮａＣｌを含む
、 １０〜５０容噴の０．０５ Ｍ ！−リス緩衝液（
ｐＨ８，２）に対して透析した。これらの条件により、
正しいジスルフィド結合を形成し、かつ本来の構造に折
りたたまれたＰＦ−４が８０％以−Ｆの収率で得られた
。
ヘパリンアフィニティクロマ［・グラフィー折りたたみ
混合物を５続いて蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した
。次いで、タンパクをＧｎＨＣＩまたＮａ（ｌまたは硫
酸コンドロイチンに高濃度（〉１０ｍｇ／ｄタンノマク
）でン容解し、ヘパリンアフィニエティクロマトグラフ
ィーによる精製の直前に。
混合物を５続いて蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した
。次いで、タンパクをＧｎＨＣＩまたＮａ（ｌまたは硫
酸コンドロイチンに高濃度（〉１０ｍｇ／ｄタンノマク
）でン容解し、ヘパリンアフィニエティクロマトグラフ
ィーによる精製の直前に。
０．２〜０．４のイオン強度に希釈した。クロマトグラ
フィーカラムは、市販のヘパリンアガロース（ＢｉｏＲ
ａｄ）を用いて調製した。ヘパリンは、他のグＪコサミ
ノグリカン（例えば、硫酸コンドロイチン）と置換して
もよい。従って、ここで用いられているように、「ヘパ
リン」という用語を使用する場合には、関連する化合物
も含まれる。
フィーカラムは、市販のヘパリンアガロース（ＢｉｏＲ
ａｄ）を用いて調製した。ヘパリンは、他のグＪコサミ
ノグリカン（例えば、硫酸コンドロイチン）と置換して
もよい。従って、ここで用いられているように、「ヘパ
リン」という用語を使用する場合には、関連する化合物
も含まれる。
タンパクは、低イオン強度の緩衝液（ｐＨ６，５）中で
カラムにかけ、このカラムをＮａＣｌの直線勾配で溶出
した。折りたたまれた姐換えＰＦ−４は、 １．２Ｍと
１．４Ｍとの間のＮａＣｌ濃度度で熔解された。この濃
度は。
カラムにかけ、このカラムをＮａＣｌの直線勾配で溶出
した。折りたたまれた姐換えＰＦ−４は、 １．２Ｍと
１．４Ｍとの間のＮａＣｌ濃度度で熔解された。この濃
度は。
ヒトの血小板から単離されたＰＦ−４に相当する位置で
ある。折たたまれていないか、あるいは誤って折たたま
れたＰＦ−４は１著しく低いＮａＣｌ濃度（通常０．７
Ｍまたはそれ以下のＮａＣＩで溶融された。
ある。折たたまれていないか、あるいは誤って折たたま
れたＰＦ−４は１著しく低いＮａＣｌ濃度（通常０．７
Ｍまたはそれ以下のＮａＣＩで溶融された。
この手順を用いて調製されたｔｉｎえＰＦ−４は、逆相
ＨＰＬＣ，アミノ末端配列、アミノ酸組成、およびヒト
ＰＦ−４抗血清に対する反応性による分析ではヒトＰ
Ｆ −，１とは区別できなかった。
ＨＰＬＣ，アミノ末端配列、アミノ酸組成、およびヒト
ＰＦ−４抗血清に対する反応性による分析ではヒトＰ
Ｆ −，１とは区別できなかった。
ｉ的り吐ｑ処ｉ籾
精製ＰＦ−４タンパクは、典型的には１例えば創傷治癒
を刺激するためにヒトへ投与するのに通常薬学的に許容
しうる担体と共に処方される。典型的には、従来の局所
処方物（例えば、クリーム。
を刺激するためにヒトへ投与するのに通常薬学的に許容
しうる担体と共に処方される。典型的には、従来の局所
処方物（例えば、クリーム。
ペースト、ゲル、スプレー、軟膏、および膚薬）の形で
、所望の部位に投与し得る。このような処方物に使用さ
れる担体は良（知られており、ワセリン、ポリエチレン
グリコール、ゼラチン、ミリスチン酸イソプロピル、ポ
リビニルアルコールなどが含まれるが、これらには限定
されない。あるいは、精製ＰＦ−４タンパクは、調節放
出用の投薬形態を用いて投与してもよい。この投薬形態
は、典型的には、調節された割合で皮膚に放出されるよ
うに、 ＰＦ−４を含む包帯または皮膚貼付剤から構成
される。調節機構は、拡散、浸透、溶解、侵食。
、所望の部位に投与し得る。このような処方物に使用さ
れる担体は良（知られており、ワセリン、ポリエチレン
グリコール、ゼラチン、ミリスチン酸イソプロピル、ポ
リビニルアルコールなどが含まれるが、これらには限定
されない。あるいは、精製ＰＦ−４タンパクは、調節放
出用の投薬形態を用いて投与してもよい。この投薬形態
は、典型的には、調節された割合で皮膚に放出されるよ
うに、 ＰＦ−４を含む包帯または皮膚貼付剤から構成
される。調節機構は、拡散、浸透、溶解、侵食。
またはイオン導入であり得る。ＰＦ、−４の局所処方物
は、少種の添加剤（例えば、皮膚軟化薬、安定剤。
は、少種の添加剤（例えば、皮膚軟化薬、安定剤。
界面活性剤、皮膚透過性改良剤、および顔料）を含んで
いてもよい。処方物中のＰＦ４の濃度は、処方された用
量と治療される表面積とに相関関係がある。この濃度は
２通常、投薬形態の０．０００１〜１重量％の範囲内で
ある。いずれにしても、この投すＶは、所望の薬理効果
（例えば、走化性など）を生して、創傷の治癒を促進さ
せるのに充分である。
いてもよい。処方物中のＰＦ４の濃度は、処方された用
量と治療される表面積とに相関関係がある。この濃度は
２通常、投薬形態の０．０００１〜１重量％の範囲内で
ある。いずれにしても、この投すＶは、所望の薬理効果
（例えば、走化性など）を生して、創傷の治癒を促進さ
せるのに充分である。
精製ＰＦ−４クンバクはまた。 Ｉｉ！￥！瘍阻害剤と
して適用するために処方してもよく、新生物細胞（特に
肺、胸部、皮膚などの癌腫および肉腫）の増殖速度を減
少させるために、インビトロまたはインビボで使用して
もよい。ＰＦ−４処方物は、増殖速度を減少させるため
に、新生物部位へＰＦ−４処方物を適用することによっ
て、新生物を有すると疑われる宿主に投与されうる。適
用方法には１局部投与。
して適用するために処方してもよく、新生物細胞（特に
肺、胸部、皮膚などの癌腫および肉腫）の増殖速度を減
少させるために、インビトロまたはインビボで使用して
もよい。ＰＦ−４処方物は、増殖速度を減少させるため
に、新生物部位へＰＦ−４処方物を適用することによっ
て、新生物を有すると疑われる宿主に投与されうる。適
用方法には１局部投与。
および注射や、カテーテルなどによる導入を含む全身投
与が含まれる。
与が含まれる。
全身投与処方物は、当該分野では一般的に知られており
、緩衝液または生理食塩水、あるいは他の適切な賦形剤
中の処方物も含まれる。用量は。
、緩衝液または生理食塩水、あるいは他の適切な賦形剤
中の処方物も含まれる。用量は。
全身投与であるかまたは局部投与であるかによって、様
々である。用量濃度は、−最に、約０．１ｕｇ〜１．０
００μｇ／ｋｇであり、ヒトを含む大きな哺乳動物に対
する総用量は、１回の治療における用量あたり約０．Ｏ
１〜１０ｔｇである。
々である。用量濃度は、−最に、約０．１ｕｇ〜１．０
００μｇ／ｋｇであり、ヒトを含む大きな哺乳動物に対
する総用量は、１回の治療における用量あたり約０．Ｏ
１〜１０ｔｇである。
本発明に関連する技術分野の当業者に明白な。
本発明の上記実施態様の変形例は、添付の特許請求の範
囲内の含まれるものとする。例えば、適切なレプリカお
よびマーカー機能および適切な制限部位を有する。ρＢ
Ｉ？３２２以外のプラスミド中に、コリシンＥ１調節配
列および構造遺伝子配列を組込むことも本発明の範囲内
に含まれる。
囲内の含まれるものとする。例えば、適切なレプリカお
よびマーカー機能および適切な制限部位を有する。ρＢ
Ｉ？３２２以外のプラスミド中に、コリシンＥ１調節配
列および構造遺伝子配列を組込むことも本発明の範囲内
に含まれる。
（以下余白）
（発明の要約）
本発明により、血小板第４因子のような低発現の組換え
タンパクの発現を、融合遺伝子を構築することにより向
上させる方法が提供される。この遺伝子の融合は、 ＆
１１ｍえタンパクを特定するｍＲＮＡの領域とリボソー
ム結合部位を含むｍＲＮＡの領域との間で形成される好
ましくない二次構造が阻害されるように行なわれる。遺
伝子の融合は充分な長さのＤＮＡ部分を挿入して、好ま
しくない長鎖の折りたたみ相互作用（これは，リボソー
ム結合部位がリボソームに近づかないようにして、その
ことによりｍＲＮＡの翻訳を阻害する）を阻止するよう
に行なわれる。本発明は、さらに１組換え血小板第４因
子の発現１組換えＤＮＡベクターおよび該血小板第４因
子の微生物による生産および回収方法を提供する。
タンパクの発現を、融合遺伝子を構築することにより向
上させる方法が提供される。この遺伝子の融合は、 ＆
１１ｍえタンパクを特定するｍＲＮＡの領域とリボソー
ム結合部位を含むｍＲＮＡの領域との間で形成される好
ましくない二次構造が阻害されるように行なわれる。遺
伝子の融合は充分な長さのＤＮＡ部分を挿入して、好ま
しくない長鎖の折りたたみ相互作用（これは，リボソー
ム結合部位がリボソームに近づかないようにして、その
ことによりｍＲＮＡの翻訳を阻害する）を阻止するよう
に行なわれる。本発明は、さらに１組換え血小板第４因
子の発現１組換えＤＮＡベクターおよび該血小板第４因
子の微生物による生産および回収方法を提供する。
土−国皿夏■単屋脱所
第１図ハ、 ＣＴＡＰ −ｍ ｍＲＮＡ Ｏ）最初（９
２８０ヌクレオチドの予想二次構造である。Ｓ−Ｄはリ
ボソーム結合部位、そしてＴｉは翻訳開始コドン（ＡＵ
Ｇ ）を示す。Ｓ−ＤおよびＴｉ配列は肉太活字で示さ
れる。
２８０ヌクレオチドの予想二次構造である。Ｓ−Ｄはリ
ボソーム結合部位、そしてＴｉは翻訳開始コドン（ＡＵ
Ｇ ）を示す。Ｓ−ＤおよびＴｉ配列は肉太活字で示さ
れる。
第２図は、ＰＦ−４ｍＲＮＡの予想二次構造である。
第１図の説明はここでも適用される。
第３図はＰＦ−４の構築用に合成された合成りＮＡ配列
を示す。主要な２種の断片を創造するために使用される
１２オリゴヌクレオチド（連結によってＰｉ４をコード
する全配列を形成する）は、 ＤＮＡ配列上に描かれ、
その連結部位は矢印で示される。
を示す。主要な２種の断片を創造するために使用される
１２オリゴヌクレオチド（連結によってＰｉ４をコード
する全配列を形成する）は、 ＤＮＡ配列上に描かれ、
その連結部位は矢印で示される。
ヌクレオチド番号１５３における単一の変更は、この位
置でのアスパラギンまたはアスパラギン酸を特定してい
る。
置でのアスパラギンまたはアスパラギン酸を特定してい
る。
第４図は、第２図の合成遺伝子を含む発現ベクターを調
製する際に使用されるプラスミドｐＮＰ６−デルタＥｃ
ｏＲＴの制限部位と機能地図である。
製する際に使用されるプラスミドｐＮＰ６−デルタＥｃ
ｏＲＴの制限部位と機能地図である。
第５図は細胞抽出物の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＰＡＧＥ）分析図であって、数種の相異るコ
リシン−ＰＦ−４融合タンパクの発現を示す。レーンｌ
は分子量の標準；レーン２および３は５ プラスミドｐ
ＮＰ６：Ｃｏｌ （５０４） −ＰＦ−４のプラスお
よびマイナス誘導：レーン４および５はプラスミドｐＮ
Ｐ６：Ｃｏｌ （１５０） ＰＦ ４ ；レーン
６および７はプラスミドｐＮＰ６ ： Ｃｏｌ （５７
）−ＰＦ −４；レーン８および９はプラスミドｐＮＰ
６ ： Ｃｏｌ （５）Ｐｉ４ｉレーンｌＯおよび１１
はｐＮＰ６ ： ＰＦ −４を示す。
電気泳動（ＰＡＧＥ）分析図であって、数種の相異るコ
リシン−ＰＦ−４融合タンパクの発現を示す。レーンｌ
は分子量の標準；レーン２および３は５ プラスミドｐ
ＮＰ６：Ｃｏｌ （５０４） −ＰＦ−４のプラスお
よびマイナス誘導：レーン４および５はプラスミドｐＮ
Ｐ６：Ｃｏｌ （１５０） ＰＦ ４ ；レーン
６および７はプラスミドｐＮＰ６ ： Ｃｏｌ （５７
）−ＰＦ −４；レーン８および９はプラスミドｐＮＰ
６ ： Ｃｏｌ （５）Ｐｉ４ｉレーンｌＯおよび１１
はｐＮＰ６ ： ＰＦ −４を示す。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、そのアミノ末端をコードし開裂部位配列により隔て
られた第１のＤＮＡ配列および組換えタンパクをコード
する第２のＤＮＡ配列からなるハイブリッド遺伝子を構
築する工程と、該ハイブリッド遺伝子を有するベクター
で形質転換された宿主細胞を培養する工程と、該形質転
換細胞から融合タンパクを回収する工程とを包含する、
組換えタンパクの発現を向上させる方法であって， 該ハイブリッド遺伝子の第１のＤＮＡ配列として，該組
換えタンパクをコードするｍＲＮＡ領域と，リボソーム
結合部位を含むｍＲＮＡ領域とが、リボソームが該リボ
ソーム結合部位へ接近できなくなるような好ましくない
２次構造を形成するのを阻害するのに充分な長さのＤＮ
Ａ配列を選択すること、を包含する方法。 ２、前記第１のＤＮＡ配列として選択されたＤＮＡ配列
が約１５０〜約４５０個の範囲内の塩基対からなる請求
項第１項に記載の方法。 ３、前記組換えタンパクが血小板第４因子であり、前記
第１のＤＮＡ配列がコリシンＥ１構造遺伝子由来であり
、該コリシンＥ１構造遺伝子のカルボキシル末端が￥Ｅ
ｃｏ￥Ｒ I 制限酵素部位で切断されており、そして￥
Ｅｃｏ￥ＲＶ制限酵素断片が欠失している、請求項第１
項に記載の方法。 ４、全細胞タンパクの少なくとも１０％の隔合タンパク
を発現することからなる請求項第１項に記載の方法。 ５、リボソーム結合部位を特定する配列と、コリシンＥ
１構造遺伝子をコードしかつ翻訳開始コドンを含む第１
のＲＮＡ配列と、血小板第４因子をコードする第２のＲ
ＮＡ配列とを有する複合ｍＲＮＡ。 ６、血小板第４因子を微生物生産するための組換えプラ
スミド発現ベクターであって， ａ）プロモータ、オペレータ、リボソーム結合部位、開
始コドンおよび転写ターミネータを有する、コリシンＥ
１発現制御配列と、 ｂ）切断されたコリシンＥ１構造遺伝子、特異的な切断
部位および血小板第４因子からなる遺伝子融合物をコー
ドするＤＮＡ断片と、 ｃ）複製起点と、 を有する組換プラスミド発現ベクター。 ７、コリシンＥ１構造遺伝子の￥Ｅｃｏ￥ＲＶ制限酵素
断片が除去されている、請求項第６項に記載のプラスミ
ド発現ベクター。 ８、ｐＮＰ６−Ｃｏｌ（１５０）−ＰＦ４またはｐＮＰ
６−Ｃｏｌ（５７）−ＰＦ４である、請求項第６項また
は第７項に記載のプラスミド発現ベクター。 ９、請求項第８項のプラスミド発現ベクターで形質転換
された￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥。 １０、Ｃｏｌ（１５０）−ＰＦ４またはＣｏｌ（５７）
−ＰＦ４からなる融合遺伝子産物。 １１、血小板第４因子を微生物生産する方法であって、 ａ）請求項第９項の￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥形質転換体を培養
する工程と、 ｂ）該形質転換体を破砕する工程と、 ｃ）融合タンパクを他の細胞タンパクから精製する工程
と、 ｄ）該融合タンパクを特異的な開裂部位で切断する工程
と， ｅ）該工程（ｄ）の切断された産物から血小板第４因子
を回収、精製する工程と、 を包含する方法。 １２、前記血小板第４因子がヘパリンアフィニティクロ
マトグラフィにより精製される請求項第１１項に記載の
方法。 １３、請求項第１１項の方法により生産される血小板第
４因子。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US143,731 | 1980-04-25 | ||
| US07/143,731 US5026639A (en) | 1988-01-14 | 1988-01-14 | Method to improve mRNA translation and use thereof for production of platelet factor-4 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02462A true JPH02462A (ja) | 1990-01-05 |
Family
ID=22505348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1007546A Pending JPH02462A (ja) | 1988-01-14 | 1989-01-13 | ｍＲＮＡの翻訳を向上させる方法および血小板第４因子を製造するための該方法の利用 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5026639A (ja) |
| EP (1) | EP0324556A3 (ja) |
| JP (1) | JPH02462A (ja) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5814602A (en) * | 1988-03-17 | 1998-09-29 | Novo Nordisk A/S | Heparin-binding proteins |
| WO1990002178A1 (en) * | 1988-08-29 | 1990-03-08 | THE UNITED STATES GOVERNMENT, as represented by THE DEPARTMENT OF HEALTH & SERVICES | A method of preparing an active human neutrophil chemotactic factor polypeptide |
| CH681625A5 (ja) * | 1988-12-08 | 1993-04-30 | Sandoz Ag | |
| US5800820A (en) * | 1989-01-10 | 1998-09-01 | Repligen Corporation | Methods and compositions for treatment of angiogenic diseases |
| US5086164A (en) * | 1989-01-10 | 1992-02-04 | Repligen Corporation | Novel methods and compositions for treatment of angiogenic diseases |
| US5187075A (en) * | 1989-01-26 | 1993-02-16 | Sri International | Cloning and expression of a variant gene of platelet factor 4 and compositions thereof to modulate immune responses |
| EP0423641A3 (en) * | 1989-10-18 | 1992-01-15 | Nippon Mining Company Limited | Expression vector, transformed microorganism, fusion protein and method for the production of platelet factor 4 or tgfalpha |
| JPH06506702A (ja) * | 1992-01-16 | 1994-07-28 | レプリゲン コーポレーション | 脈管形成性の病気の処置用の新規な方法と組成物 |
| US5824497A (en) * | 1995-02-10 | 1998-10-20 | Mcmaster University | High efficiency translation of mRNA molecules |
| US5981517A (en) * | 1996-05-09 | 1999-11-09 | Soft Drugs, Inc. | Androstene derivatives |
| US6068993A (en) * | 1997-07-02 | 2000-05-30 | Biobras Sa | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin |
| AU2001249170A1 (en) * | 2000-03-13 | 2001-09-24 | Aptagen | Method for modifying a nucleic acid |
| US9200251B1 (en) | 2011-03-31 | 2015-12-01 | David Gordon Bermudes | Bacterial methionine analogue and methionine synthesis inhibitor anticancer, antiinfective and coronary heart disease protective microcins and methods of treatment therewith |
| CN121260263A (zh) * | 2025-12-08 | 2026-01-02 | 浙江大学长三角智慧绿洲创新中心 | 一种基于混合深度学习模型的rna二级结构预测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
| JPS60502086A (ja) * | 1983-08-25 | 1985-12-05 | エス・ア−ル・アイ・インタ−ナショナル | ヒトの結合組織活性化ペプチド−３およびその類似体を生産するための組換え体および生産方法 |
| US4645828A (en) * | 1984-03-23 | 1987-02-24 | Oncogen | Platelet related growth regulator |
| JPH01503513A (ja) * | 1987-03-02 | 1989-11-30 | オンコゲン | 血小板関連増殖調節剤 |
-
1988
- 1988-01-14 US US07/143,731 patent/US5026639A/en not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-01-06 EP EP89300128A patent/EP0324556A3/en not_active Withdrawn
- 1989-01-13 JP JP1007546A patent/JPH02462A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0324556A3 (en) | 1990-05-30 |
| EP0324556A2 (en) | 1989-07-19 |
| US5026639A (en) | 1991-06-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR960002874B1 (ko) | 재조합된 사람의 내피 세포 성장 인자의 제조방법 | |
| US5004686A (en) | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof | |
| CA1341426C (en) | Process for the manufacture of thrombin inhibitors | |
| JP2501889B2 (ja) | α−インタ−フェロンを含有する薬学的組成物 | |
| FI86559B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av humant immuninterferon, daervid anvaendbara medel och dessas framstaellning. | |
| JP2553829B2 (ja) | 組換えコロニー刺激因子−１ | |
| US5047336A (en) | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing mullerian inhibiting substance-like polypeptides | |
| JPH02462A (ja) | ｍＲＮＡの翻訳を向上させる方法および血小板第４因子を製造するための該方法の利用 | |
| US5714581A (en) | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor | |
| JPS62501414A (ja) | ヒルジン様蛋白質をコードするｄｎａ | |
| US5180811A (en) | Proteins having a tnf action comprising tnf-fibromectin fusion protein | |
| JP2001029093A (ja) | インターロイキン−１インヒビター | |
| US5185431A (en) | Recombinant natural killer cell activator | |
| EP0281363A2 (en) | Platelet related growth regulator | |
| US5187075A (en) | Cloning and expression of a variant gene of platelet factor 4 and compositions thereof to modulate immune responses | |
| KR960015442B1 (ko) | 맥관인자 | |
| HK1005886A1 (en) | Expression signal-peptide-free staphylokinases | |
| EP0204302A2 (en) | Laminin and the production thereof | |
| US5248666A (en) | Methods for inhibiting neoplastic cell proliferation using platelet factor 4 | |
| CN111500611B (zh) | 一种阻断受体结合的核糖体失活蛋白减毒改造的方法 | |
| EP0153961A1 (en) | Recombinant materials and methods for producing human connective tissue-activating peptide-iii and analogs thereof. | |
| JPH03266986A (ja) | α―サルシン遺伝子 | |
| RU1838412C (ru) | Способ получени рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей бычий гормон роста, способ биосинтеза производного бычьего гормона роста | |
| KR970009082B1 (ko) | 인간 알파 아트리알 나트리 우레틱 인자(human α-arterial natriuretic factor; α-hANF)의 미생물학적 제조방법 | |
| JPH0829092B2 (ja) | 変異型ヒトリゾチーム |