JPS60502086A - ヒトの結合組織活性化ペプチド−３およびその類似体を生産するための組換え体および生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの結合組織活性化ペプチド−■およびその類似体を生産するための組換え体 および生産方法 技術分野 本発明は遺伝子工学の分野に関する。更に詳しくは、本発明はヒトの結合組織活 性化ペプチド−■および新規なその類似体のための合成遺伝子、その遺伝子をク ローンおよび発現するためのプラスミドベクター、および結合組織活性化ペプチ ド−■およびその類似体の微生物学的生産に関する。

技術的背景 ヒトの結合組織活性化ペプチド（ＣＴＡＰｓ　）は、結合組繊細胞を活性化し得 る天然に存在するポリペプチド群である。このペプチドは小板およびリンパ球に 存在しており、有糸分裂、グリコサミノグリカンおよびヒアルロン酸合成、プロ スタグラシンＥ２　および環状ＡＭＰの形成、プラスミノーゲン活性因子の排泄 、線維芽細胞の走化性、グルコースの輸送および解糖を刺２ 激する。ＣＴＡＰは結合組織を再生するための医薬として研究されている（例え は傷の治療）。カスター・て知られている１つのＣＴ　Ａ、　Ｐのアミノ酸配列 およびＣＴＡＰ−１［の生物学的特性について報告している。

これらの研究で報告されたＣＴＡＰは小板から得られたものである。小板からの 抽出法は、研究の目的で少量のＣＴ　Ａ　Ｉ’　−Ｍを得るには有用な方法であ るが、多量のこのペプチドを生産するためには実際的な方法ではない。本発明の １つの目的は、細菌での発現によるＣＴＡＰ−■およびＣＴＡＰ−１［類似体の 生産方法を提供することにある。この方法には、細菌中でＧＴＡＰ−■を効率よ く発現させるために設計されたＣＴＡ　Ｐ−ＩＩＩおよびＣＴＡＰ−１［類似体 をコードしている新規な合成遺伝子、およびこれらの遺伝子をコリシンＥ１発現 コントロール領域と共に含有している発現プラスミドが関連している。

一コリシンＥ１調節領域のコントロール下にある外来性遺伝子を含んでいる組換 えプラスミドはセルカー・イー（５ｅｌｋｅｒ、　Ｅ、　）らにより記載されて いるＣ　Ｊ、バク７　ＩＪオ／ｌ／　（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　）　（１９ ７７）　１２９　：３８８−３９４）。

米国特許第４，３５６，２７０　号は、哨乳類のポリペプチドをコードしており 細菌による発現に好適な多数のコドンから成る遺伝子の発現に関するものである 。ゴウツ・エム（Ｇｏｕｚ　、　Ｍ、　）およびガラティール・シー（Ｇａｕｔ ｉｅｒ、　Ｃ，）は大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１　）中での遺伝子発現のためのコド ン使用データについて報告している（ヌクル・アンラド・レス（Ｎｕｃｌ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ　）（１９８３）アミノ酸を介して内性のアミノ酸配列に外来性 のポリペプチドを結合させた融合タンパク質を微生物学的に生産するための組換 え体およびその方法について一般的に記載している。

本発明の開示 本発明の１つの目的は、ＣＴＡＰ−１［、または２１位のメチオニンがロイシン で置き換わっているＣＴＡＰ−■の類似体（突然変異タンパク質）（以下ＣＴＡ Ｐ−ｌ［−Ｌｅｕ　２１　という）を暗号化しており、以下の配列の暗号鎖を持 ったＤＮＡ配列を有する合成遺伝子を提供することにある 「ここで、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはノドシン、Ｔはヂミン、Ｉ−１は Ｔ、ＣまたはＧＸＪはＣまたはΔ、ＬはＴまたはＡ、ＭはＣまたはＧ、ＰはＡま たはＧ、ＱはＣまたはＴを表す」。

この遺伝子の好ましい態様は以下のＤＮＡ配列を含んでいる− ＴＧＡＣ ＡＣＴＧ ［ここで、Ａ、Ｇ、Ｃ，ＴおよびＪは前記と同意義であり、Ｋは、■に応じてＴ またはＧを表す。ＪがＡでありＫがＴである場合、この遺伝子はＣＴ　Ａ　Ｐ　 −Ｉｌｌをコードしている。、■がＣでありＫがＧであ、ろ場合、この遺伝子は ＣＴＡＰ−１１１Ｌｅｕ２１をコートしている。］ 本発明のもう１つの目的は、ヒトのＣＴＡＰ−Ｉｌｌまたはその２１位のメチオ ニンかロイツノで置き換わった突然変異タンパク質を、微生物学的に生産するの に使用されるＤＮＡフラグメントであって、その構造Ｔ　Ａ、　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ 　ＣＴ　Ｇ　ＣＡ　ＧＡ　Ｔ　Ｔ　Ａ　ＣＴ　Ｇ　Ａ　ＣＧ　Ｔ　Ｃ’ｒＴ　Ａ 　Ａを有するアダプタ−フラグメントか端末に存在することを特徴とするＤＮＡ フラグメントを提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、レプリケータ−１表現型マーカー遺伝子（遺伝標識 ）、プロモーター、レプレッサー結合のためのオペ１／−タ一部位、リポソーム 結合部位および翻訳開始コドンからなる発現コントロール配列、およびこの発現 コントロール配列と正しい解読和尚にある構造遺伝子、を含んでいる組換えプラ スミドベクターであって、その発現コントロール配列がコリランＥ１発現コント ロール配列であり、構造遺伝子かコリシンＥ１のためのものであることを特徴と する組換えプラスミドベクターを提供することにある。

上記の組換えプラスミドベクターの好ましいものは、ＰＢＲ３２２、およびコリ シンＥ１発現コントロール配列とＰＢＲ３２２のＰｓｔ　Ｉ部位においてＰＢＲ ３２２に挿入されたコリシンＥ１のための構造遺伝子を含んでいるＤ　Ｎ　Ａフ ラグメントからなるＰＢＲ３２２誘導体である。

さらに本発明のもう１つの目的は、 （ａ）上記のＰＢＲ３２２誘導体をＳａｃ　■で消化して線状プラスミドＤＮＡ を得、 （ｂ）その線状プラスミドＤＮＡをバクテリオファージＴ４　ＤＮＡポリメラー ゼを用いてｄＴＴＰの存在下で処理し、 （Ｃ）この（ｂ）で得られた線状プラスミド生成物を５１ヌクレアーゼで処理し 、 （ｄ）この（りで得られる線状プラスミド生成物をＥｃｏＲｌで消化し、そして （ｅ）この（ｄ）の消化物から大きい線状ＤＮＡプラスミドフラグメントを回収 することにより製造される、上記のＣＴＡＰ−ＩＩＩ遺伝子を含んでいる誘導可 能なプラスミド発現ベクターを製造するのに有用な線状組換えプラスミドを提供 することにある。

本発明のさらにもう１つの目的は、細菌性発現コントロール配列、その発現コン トロール配列の下流にあり、その解読和尚にあってそのコントロール下にあるヘ テロローガスな構造遺伝子、およびその構造遺伝子の前にある翻訳開始コドンお よび構造遺伝子の末端に位置する翻訳停止コドンを含有している組換えプラスミ ド発現ベクターであって、その構造遺伝子がＣＴＡＰ−■またはＣＴＡＰ−：［ ［−Ｌｅｕ２１　のための上記の遺伝子であることを特徴とする発現ベクターを 提供することにある。

さらにもう１つの目的は、上記の組換えプラスミド発現ベクターで形質転換した 大腸菌を提供することにある。

さらにもう１つの目的は、上記の形質転換した大腸菌を培養培地で発育させ、大 腸菌のＳＯＳ系を誘導する試剤の発現−誘導可能量を培地に添加することにより ＣＴＡＰ−１［またはＣＴ　Ａ　Ｐ　−ｍ　−Ｌｅｕ　２１の発現を誘導するこ とからなるＣＴＡＰ−］１［またはＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ　２１　の製造法を提 供することにある。

さらにもう１つの目的は、ＣＴＡＰ−］［の２１位のメチオニンか別のアミノ酸 で置き換わったＣＴＡＰ−］１［の突然変異タンパク質である、ＣＴＡＰ−１Ｉ 活性を有するタンパク質を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、 （ａ）アミノ酸残基を介して下記（ｂ）と結合している有用なポリペプチド（該 アミノ酸残基は、その有用なポリペプチドには存在しない特異な開裂部位となる アミノ酸残基である）、 （ｂ）コリシンの細胞毒性は持っていないがコリシンの帯電性（ｃｈａｒｇｅ　 ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　）は保持しているコリンンフラグメント、 を含有している融合タンパク質を提供することにある。

本発明のもう１つの目的は、 （ａ）有用なポリペプチドを上記の融合タンパク質の形で生産する細菌性形質転 換体を増殖させ、（ｂ）この形質転換体を粉砕し、 （Ｃ）その粉砕体をｐＨ約９〜１０５で固相のカチオン交換媒体と接触させ、 （ｄ）その固相のカチオン交換媒体から結合しなかった粉砕体を分離し、 （ｅ）カチオン交換媒体から融合タンパク質を溶出させ、 （りこの融合タンパク質を該開裂部位で開裂させ、そして （ｇ）工程（ｆ）の開裂産物から有用なヘテロローガスポリペプチドを回収する 、 工程からなる微生物学的に有用なヘテロローガスポリペプチドを生産する方法を 提供するものである。

さらに本発明のもう１つの目的は、ＣＴＡＰ−１［よりもイン・ビボにおけるβ −スロンボグロブリンへの変換を受けくにいＣＴＡＰ−■の突然変異タンパク質 であって、ＣＴＡＰ−■の生物活性を有するタンパク質を提１０ 供することにある。この１つの態様は、その末端の２−へリツクス構造を保持す るアミン末端に融合した非極性ポリペプチドフラグメントを持っているＣＴＡＰ −■からなる突然変異タンパク質である。別の態様においては、この突然変異タ ンパク質はＣＴＡＰ−■のアミノ末端に近接したトリプンンー感受性部位を構成 しているアミノ酸の１個またはそれ以上が削除されているか、別のアミノ酸で置 換されているＣＴＡＰ−］１［である。

本発明のもう１つの目的は、タンパク質の有用性に対して必須でない少くとも１ 個のメチオニンを含んでいるアミノ酸配列を有する有用なタンパク質の臭化／ア ン非感受性突然変異体であって、そのメチオニン（単数または複数）が他のアミ ノ酸で置換されている突然変異体を提供すること（こある。

図面の簡単な説明 図面において、第１図はＣＴＡＰ−］［のアミノ酸配列であり、Ｎ−末端修飾類 似体（ＣＴＡＰ−１［−ＮＭＯＤと呼ばれる）の添加されたペンタペプチドか犬 カッコ内Ｇこ示されており、ＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ２１　のＭｅ　ｔ　−＋　 Ｌｅｕ　置換はカッコ内に示しである。

第２図は、第１図のＣＴＡＰ−Ｈのアミノ酸配列をコーー　特表昭ＧＯ−５０２ ０８Ｇ　（６）−ドしている多義的な（確定していない）ヌクレオチド配列であ る。第２図および本明細書のその他の箇所で使用したヌクレオチドの略号は前記 の通りの意味を有する。

第３図は、ＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ２１　のための遺伝子のクローニングおよび 発現に使用される、３′−および５′一アダプター配列を含んでいるＣＴＡ、Ｐ −■−Ｌｅｕ　２１の合成遺伝子の好ましい１態様の暗号鎖のヌクレオチド配列 を示している。相当するアミノ酸配列をヌクレオチド配列の下に示した。

第４°図は、第３図のヌクレオチド配列の制限エンドヌクレアーゼ開裂地図であ る。

第５図は、３′−および５′−アダプター配列を含んでいるＣ　Ｔ　Ａ　Ｐ　− １［−Ｌ　ｅ　ｕ　２１のための好ましい合成遺伝子の完全な二本鎖配列を示し ている。

第６図は、第５図に示した合成遺伝子を組立てるための結合戦術を示す図式であ る。

第７図は、第５図の合成遺伝子を含有している発現ベクターを製造するのに使用 されるプラスミドづフタ−ｐ　Ｕ　Ｃ８／　ＣＴ　Ａ　Ｐ　−Ｉ［の模式図であ る。

第８図は、第５図の合成遺伝子を含有している発現２ ベクターを製造するのに使用されるプラスミドクローニングベクターｐ　Ｎ　Ｐ 　５の模式図である。

第９図は、ｐＮＰ５の線状化した誘導体、ｐＮＰ５−ＬＢＲの調製のための工程 図であり、これは合成ＣＴＡＰ−］１［遺伝子またはＣＴＡＰ−］１［類似体を 暗号化している遺伝子群を含有しているＤＮＡフラグメントと結合される。

第１０図は、本発明の誘導性プラスミド発現ベクターを調製するため、ｐ　Ｎ　 Ｐ　６−Ｌ　Ｂ　Ｒと結合するためのＣＴＡＰ−ＩＩＩ−Ｌｅｕ　２１遺伝子挿 入体を作成するための模式的工程図である。

第１１図は、発現プラスミドｐ　Ｎ　Ｐ　６　／　Ｃ，Ｔ　Ａ　Ｐ　−ｍ−ＮＭ ＯＤ　を作成するのに使用される方法の模式的工程図である。

第１２図は、発現プラスミドｐ　Ｎ　Ｐ　５△ＲＩ　／　Ｃｏｌ　：ＣＴＡＰ− ｍ−Ｌｅｕ２１を作成するのに使用される方法の模式的工程図である。

本発明の実施態様 本発明には天然のヒトのＣＴＡＰ−■の数種の修飾体が含まれる。その１つはＣ ＴＡＰ−ＩＩＩのアミノ酸配列の２１位のメチオニンが置き換わったものである 。このメチオニンは、この分子の生物活性または安定性に悪影響を与えることの ないアミノ酸で置換することができる。類似の疎水性の性質および非環状側鎖を 持ったアミノ酸、例えばロイシン、インロイインおよびバリンなどが好ましい。

特に好ましいのはロイシン置換である。この内部のメチオニンを置換すると、そ の修飾されたタンパク質（本明細書において、この修飾された分子を一般に類似 体または突然変異タンパク質と呼ぶ）を、メチオニン残基（こおいて特異的にポ リペプチド鎖を開裂するシアン化臭素のような試薬に対して非感受性にする。こ のように非感受性になると、細胞性物質または抽出物を上に述べた試薬によって 消、化することにより、その細胞性物質または抽出物から突然変異タンパク質を 純化したり、あるいはその突然変異タンパク質がメチオニンによってそのパー計 ナーと結合している融合タンパク質の形で生産される場合には、そのパートナ− の融合配列から分離したりすることが可能となる。

本発明のこの態様は、ポリペプチドの有用性にとって必須でない１またはそれ以 上のメチオニンを含有している、ＣＴＡＰ−Ｉ［ＩおよびＣＴＡＰ−■類似体以 外の有用なポリペプチドにも適応し得ることは理解されるであろう。このような ポリペプチドにおけるメチオニン（単数または複数）の削除または置換は、ヌク レオチドから、メチオニン枯渇ポリペプチドをコードしている遺伝子を合成した り、あるいは天然のまたは組換えの遺伝子配列の部位特異性突然変異より達成す ることができる。

天然のＣ：ＴＡＰ−１［のもう１つの修飾は、生物学的性質に悪影響を与えるこ となく、得られた突然変異タンパク質がインビボにおけるβ−ＴＧへの変換を、 天然のＣＴＡＰ−１［より受けにくくなるようにアミノ酸配列を変更することで ある。このような変換を行なうには、２−へワックス立体配置をとりやすく、従 って末端の立体配置を保持しやすい一般的に非極性のポリペプチドフラグメント を、天然のＣＴＡＰ−１［のアミノ末端に付加したり、そして／または天然のＣ ＴＡＰ−］１［のアミノ末端に近接したトリプシン感受性部位を構成しているア ミノ酸の１もしくはそれ以上を削除または置換する。このアミノ末端への非極性 フラグメントの付加は、このフラグメントのためのコドンを含むような遺伝子を 合成するか、またはこのタンパク質の内性部分またはリーダー配列がそのような フラグメントであるような融合タンパク質の形でポリペプチド、を合成すること により達成することができる。このフラグメントは主に疎水性または両側性の非 環状アミノ酸残基、例えばロイシン、メチオニンおよびイソロイシンで構成され ている。このフラグメントは、それが全体として非極性である限り、スレオニン およびグルタミンのような非疎水性の残基を含んでいてもよい。このフラグメン トは大きい必要はなく、通常、便宜的に４〜１０残基を含んでいる。このような 修飾はタンパク質のインビボ１こおける半減期、および相関的にその生物活性お よび治療有効性を延長させる。トリプシン感受性部位における１もしくはそれ以 上のアミノ酸の削除または置換は、遺伝子の初めからの合成、または天然のある いは組換えのＣＴＡＰ−１１１遺伝子の部位特異性突然変異によって達成するこ とができる。

もう１つの修飾は、融合タンパク質の形のＣＴＡＰ−ｍｔたはＣＴＡＰ−］１［ 突然変異タンパク質であって、そのタンパク質の内因性部分がコリシンの帯電性 を持っている生物学的に不活性なコリシンＥ１であり、その融合部位が容易に開 裂し得るものであるようなＣＴＡＰ−■またはＣＴＡＰ−１［突然変異タンパク 質を製造することである。このようなタンパク質は、適当なターミネータ−を持 ったＣＴＡＰ−１［またはＣＴＡＰ−１［突然変異タンパク質遺伝子を、コリン ン発現コントロール配列と構造遺伝子を持ったベクターの、コリシンのカルボキ シ末端をコードしているコリンン構造遺伝子の末端近くの適当な制限部位に挿入 した発現ベクターを吏用することによって製造することができる。この融合タン パク質はコリシンの帯電性を保持しているので（コリシンＥ１は大部分のその他 の細菌性タンパク質と較べて高い等電点（＞９．５）を有しており、高いｐＨに おいてカチオン交換媒体に結合するがその他の細菌性タンパク質は結合しない） 、カチオン交換媒体を使って、約９〜１０．５のｐＨ、好ましくは約９．５のｐ Ｈでイオン交換クロマトグラフィーにより、これを容易に分離することができる 。通常のカチオンイオン交換ｍ１ｌＬ例えばＣＭ−セルロース、Ｐ−セルロース マタはＳＥセルロースあるいは架橋デキストラン−またはポリアクリルアミド− を基礎とするイオン交換ゲル、例えはＣＭ−セファデックスまたはＳＰ−セファ デックスを使用することができる。使用されるイオン強度は、使用する個々の媒 体によって変わる。この分離においては、通常のイオン交換分離装置（例えば、 カラム）および平衡法および溶出法が用いられる。

融合タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーで分離した後、その融合タンパ ク質を、融合部位において開裂する開裂剤で処理することにより、ＣＴＡＰ−Ｉ ＩＩまたはＣＴＡＰ−ＩＩＩ突然変異タンパク質を分離する。例えば、そのタン パク質の２つのセグメントがメチオニン残基によって融合しており、そしてそれ がメチオニンを含まない突然変異タンパク質である場合は、タンパ゛り質を臭化 シアンで処理すればよい。

同様の方法で、その他の有用なポリペプチドとコリシンフラグメントとの融合タ ンパク質を製造し、イオン交換クロマトグラフィーにより分離し、そして開裂さ せ、有用なポリペプチドを得ることができるということは容易に理解されるであ ろう。

また周知の如く、組換えＤＮＡの細菌中での発現によって生産されるＣＴＡＰ− １［およびＣＴＡＰ−１［類似体はそのアミノ末端にイニシアルメチオニン残基 を持っていてもよい。

本発明によって生産されたＣＴＡＰ−■およびＣＴＡＰ１８ −ｍ突然変異タンパク質（トリプシンに対して非感受性にされたものを除く）は 、トリプシンまたはプラスミンで処理することにより、β−ＴＧおよびβ−ＴＧ 突然変異タンパク質に変換することができる。β−ＴＧは走化性体である。

以下にＣＴＡＰ−ＩＩＩ、ＣＴＡＩ’−ＩＩＩ突然変異タンパク質およびコリン ンフラグメントとＣＴＡＰ−１１１突然変異タンパク質との融合タンパク質が関 連する本発明の具体的な態様◆こついて詳細をこ説明する。

計画 遺伝暗号を使って、ＣＴＡＰ−ＩＩＩのアミノ酸配列（第１図）を第２図に示し た多義的暗号配列に逆翻訳した。

ＣＴＡＰ　−］１ｌ−Ｌｅｕ２１をコードしている構造遺伝子の最終的な確定的 ヌクレオチド配列（第３図）は以下のようにして決定した。

細菌中でハイレベルの発現を達成するのに好適なコドンを選択することにより、 多義的ヌクレオチド配列から１個の確定的配列を導いた。この変換は、エンドヌ クレアーゼＢａｍＨ工およびＸｂａ、ｌのための２つの特異な制限部位をこの配 列に導入するように行なった。

特表昭Ｇｏ−５０２０８Ｇ　（８） この変換には、２８位のＧｌｙのための非最適コドン（ＧＧＧ）および６３位の Ｌｅｕのための非最適コドン（ＣＴＡ）の使用が含まれる。これらの部位は、遺 伝子を合成してその遺伝子をサブクローンし、合成した遺伝子の配列を確認し、 そしてその遺伝子か突然変異タンパク質（類似体）をコードするように修飾する ための別の戦術をとり得るよう（こ加えたものである。得られた配列を、相補配 列および繰り返し配列の両者を検出するように設計されたコンピュータープログ ラムを使って分析した。この情報を使って、遺伝子を合成するのに使用されるオ リゴヌクレオチドの正しい結合を妨害する可能性のある配列内ホモロギーの領域 を確認し、それに基いて遺伝子を改良した。

アダプター配列は、構造遺伝子の両末端が適切な開始および停止信号、制限部位 およびその遺伝子をクローンするための粘着性ＥｃｏＲ１：末端を与えるように 、以下のようにデザインした。

遺伝子のカルボキシ末端暗号末端に添加したアダプター配列は、２個の縦列（タ ンデム）の翻訳停止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ）、ＰｓｔＩ認識配列（ＣＴＧＣＡ Ｇ）、およびＥｃｏ　Ｒ■認識配列の部分（ＡＡＴＴ）を含むように０ デザインした。遺伝子のアミン末端に付加されるアダプター配列は、翻訳開始コ ドン（ＡＴＧ）、Ｐｖｕ　ＩＩ認識配列（ＣＡＧＣＴＧ）、およびＥｃｏ　ＲＩ 認識配列の部分（ＡＡＴＴ）　を含むようにデザインした。

最終的な配列をコンピューターにより分析し、その配列が翻訳されてＣＴＡ　Ｐ 　−■−Ｌｅｕ　２１タンパク質の正しいアミノ酸配列に翻訳され得ることを確 認した。

構造遺伝子およびアダプター配列のすべての既知の酵素に対する制限エンドヌク レアーゼ地図を第４図に示す。矢印は、その部位の名称がカッコ内に記載されて いない場合は、開裂部位の５′−側を示している。カッコは認識部位だけが知ら れていることを表す。

第５図は、合成ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ２１構造遺伝子およびアダプター配列のた めの完全なりＮＡ配列を示している。第６図に示したように、この遺伝子は３つ のフラグメントに分けた。フラグメントエはＥｃｏＲｌ　からＢａｍＨＩまで、 フラグメント■はＢａｍＨＩからＸｂａ■まて、フラグメント■はＸｂａ　工か らＥｃｏＲｌ　までである。各フラグメントは図面に示したように、ざらζこ小 さいオリゴヌクレオチドに分けた。全部で３８オリゴヌクレオチドであった。第 ６図の星印は、オリゴヌクレオチドの境界線を示している。このオリゴヌクレオ チドはフォスフオトリエステル法（オーツカ・イー（０ｈｔｓｕｋａ、　Ｅ、　 ）ら、ヌクレイツク・アシッド−レス（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　） 　（１９８２）　１０　：６５５３−６５７０）によって合成した。粗製のオリ ゴヌクレオチドを、２０％のアセトニトリルを含有している０、　１　Ｍ〜０． ４ＭＫＨ２ＰＯ４緩衝液の３０〜４５分間のグラジェントにより、イオン交換Ｈ ＰＬＣを使って精製した。生成物のピーグを集め、脱塩し、乾燥し、蒸留水中で 再構成した。精製したオリゴヌクレオチドの大きさおよび同質性を、３〜３．５ ％のクロスリンカ−を使った２０％のアクリルアミドゲルを用いたゲル電気泳動 により確認した。純度９５％以下のオリゴヌクレオチドは、逆相ＨＰ　ＬＣまた はプレパラテイブケル電気泳動のいずれかによりさらに精製して所望の純度にし た。

オリゴヌクレオチド１〜１４（第６図）を、それぞれ以下のプロトコールに従っ て、３２Ｐ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼと反応させることにより、 放射線で標識した： オリゴヌクレオチド　０．０４０Ｄ ”２Ｐ−ＡＴＰ　（Ｉ　Ｑμｃｉ　７ｍＭ）　１０　ｐｌキナーゼ／リガーゼ緩 衝液　１５μｌ （５０ｍＭトリフ、−ＨＣ４（ｐＨ７，６）、ｌＱｍＭＭ　ｇ　Ｃ（１２，１０ ｍＭジチオトレイット）ポリスクレオチドキナーゼ　１μ４ オリゴヌクレオチドおよびＡＴＰを乾燥し、キナーゼ緩衝液に溶解した。酵素を 加え、３７℃で１時間インキュベートした。キナーゼ処理したオリゴヌクレオチ ド類を１つのバイアルびんに入れ、９５℃の水浴中に１０分間入れ、次いで水浴 を除々に室温まで冷却した。ｌ　ＱＱｍＭ　のＤＴＴ／ｌ　ＱｍＭＡＴＰのＩＯ Ｘ溶液を加え、次いてＴ４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼ５単位を加えた。

この反応混合物を１２℃で一夜（〜１６時間）インキュベートした。

この反応混合物全体を、１５％、１．５８の非変性ポリアクリルアミドゲル上で 、−夜２５０Ｖで操作して精製した。生成物をＰＢＲ３２２ＤＮＡのＨａｅｌ［ 消化物と比較しなからオートラジオグラフィーを行なって位置決定を行なった。

ゲル上の適切な領域を電気泳動によりＤＥ８１Ｆ紙に移した（トランスプロット ）。適当なバンドをＴＥ緩衝液中の１ＭＮａｃ、５を実ってＰ紙から溶出した。

ＤＮＡをエタノール沈殿させ、次いで水に溶解した。

生成物の１部の溶液を、分析用変性１５％ポリアクリルアミドゲル上でその同質 性についてチェックした。

別の１部をＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼで処理し、その生成物の自己結合を行なった （４℃で５〜６時間）。次いで、この反応混合物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ 　’？；”処理し、反応混合物゛を分析用ゲル電気泳動により分析した。次いで 、生成物のバンドをクローンし、その配列決定を行上記の方法を使って、オリゴ ヌクレオチド１５〜２８をキナーゼ処理して結合させた。この反応の収率は低か った。そこで、このグループを２つのサブグループ（■Ａ、１５〜２１および［ Ｂ、２２〜２８）に分け、別々に結合させた。次いで、これらの２つのサブグル ープからの生成物を結合させた。最終の生成物（１，，０３ｂｐ）を自己結合さ せ、適当な制限酵素で処理した。この物質をクローンし、配列決定した。

オリゴヌクレオチド２９〜３９をキナーゼ処理し、結合させた。この生成物を分 析用ゲルで分析した結果、３つのバンド（互いに接近している）が観察された。

自己結合、次いでＸｂａ　ＩおよびＥｃｏＲＩて処理した結果、３つのバンドの １つだけが期待した挙動を示した。このバンドをクローンし、配列決定を行なっ た。

Ｍｌ、３　クローニング／配列決定 合成−ｙ−ｙグメントＩ　（ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ）をＭｌ、３ｍｐ８　にク ローンし、配列決定した。１６個の独立したクローンの内３個か正しい配列を持 っていた。その他のものは少くとも１個の塩基が置換されていた。

合成フラグメント■（ＢａｍＨＩ、ＸＩ）ａＩ）をＭ１３ｍｐ１１にクローンし 、配列決定した。１６個の独立したクローンの内１４個に正しい配列が確認され た。その他の２個は、１個の塩基置換を有していた。

合成フラグメントＩＩＩ（ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ）をＭｌ、３ｍｐＩＪにクロー ンし、配列決定を行なった。８個のクローンの内８個とも正しい配列を持ってい た。

完全な遺伝子の組立て クローンしたフラグメント■または■のための１本鎖Ｍ１３　を、万能プライマ ーおよびタレナウポリメラーゼを吏って２本鎖（こし、次いでフラグメント■に ついてはＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨｆ１て消化し、フラグメント■についてはＢ ａｍＨ：［およびＸｂａＩて消化した。この挿入物を６％のアクリルアミド小型 平板ケルから電気溶出し、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩて切断したｍ　ｐ　８に結合さ せた。数種の形質転換体が、正しい（■モ■）挿入物を有していることが確認さ れた。

クローンしたフラグメント（■モＩＩ　）および■のための１本鎖Ｍ１３を、上 記と同様にして２本鎖にし、ＥｃｏＲＩ　およびＸｂａＩで消化した。精製した 挿入物をケル精製、電気溶出して合体させ、ＥｃｏＲＪ　て切断したｍｐ３　に 結合させた。７つのクローンが正しい（■モ■モ］ＩＩ　）挿入物を有している ことが確認された。両方の方向性のものが存在しまた。

■モ■＋■の挿入体を含んだ１本鎖Ｍ１３を」−記の如くして２本鎖にし、Ｅｃ ｏＲＩ　て消化した。２８４ｂｐ挿入体をゲル電気泳動により、消化物から精製 した。

合成ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ　２１遺伝子フラグメントのプラスミドｐＵＣ８（Ｐ −Ｌハイオケミカルズ（Ｂｌｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）　、ミルウォーキー（ Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ＷＩ　）約５ｔＣ１を、５０　ｍＭ　ト　リ　ス　−　 ＨＣｌ　（ｐＴ−Ｔ　７，５　）　、　６　ｍＭＭｇｃ４２．５０ｍＭ　ＮａＣ ４および］、　ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ　を含有している溶液５０μｅ中、ＥｃｏＲＩ 　を用いて３７℃で６０分間消化した。終濃度が２０ｍＭとなるようにＥＤＴＡ を加えて反応を停止させ、フェノール／クロロポルム（３／１）で抽出し、エタ ノールで沈殿させた。

合成遺伝子フラグメント１０ピコモル（ｐＭ）およびＥｃｏＲＩ−消化ｐＵＣ８ プラスミドＤＮＡ１ｐＭ（２，５／、Ｆ）　を、２０　ｍＭ　ト　リ　ス　−　 ＨＣｅ　（ｐＨ７，６）　、　ｌ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭ　ＤＴＴ　 １５ｍＭＡＴＰおよび１部単位の１′４　ＤＮＡリガーセの１００　μｉ容中、 １０℃で１６時間結合させた。この反応混合物の１部（５μ４）を使用し、以下 に記載するようにして直接形質転換を行なった。

形質転換実験のための宿主はＥ、ｃｏｌｉＫ１２株ＪＭ８３でめった。この株は その染色体に組込まれたφ８ｏ上にＩａｃ　Ｚ△Ｍ１５　を持っている（　ａｒ ａ、△Ｉａｃ−ｐｒｏ　。

ｓｉｒ　Ａ　、　ｔｈｉ　、φ８ＱＩａｃＺ△Ｍ１５）（Ｕ、メッンング（Ｍｅ ｓｓｉｎｇ　）　、　ｒ　１本鎖ＤＮＡバクテリオファージＭ１３を基礎とする 多目的クローニング系」、リコンビナント・ディー・エヌ・エイ・テクニカル・ ブリティン、Ｎ　Ｉ　Ｈパブリケーノヨン（Ｒｅｃｏｍｌ）ｉｎａｎＬ　Ｄ　Ｎ 　Ａ　ＴｅｃｈｎｉｃａｌＢｕｌｌｅＬｉｎ、　Ｎ　Ｉ　ＨＰｕｂｌｉｃａｔｉ ｏｎ　）　７％　７９−９９．２、（１，９７９，）１１；、　２　：　４３　 ４８　）。

Ｌ−ブロス（高圧滅菌したのち、１召当たり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エ キス、１．０ｇのＮａＣ１，２ｍｌの１−、　ＯＮａＯＨ，１０＋ｄの２０％グ ルコースを添加したもの）中で一夜増殖させた培養物を、新たに調製したＬ−フ ロス培地に入れて１：１００の割合で希釈し、ＯＤ　が０．６となるまで、３７ ℃で振盪しなからイ００ ンキュベー、トした。次いで、培養物３５＋＋＋ｌを６００　Ｏｒｐｍで、４℃ で、１０分間遠心し、ペレットを０．０５　ＭＣａＣ（１２ｉ−ｏ　ｍｌｉこ再 ）ヒ濁した。細胞を氷上で１５分間インキュベートしたのち、４０００ｒｐｍで １０分間遠心して集めた。次いて、細胞をｏ、ｏ　５Ｍ　ＣａＣｌ２４　ｍｌに 再懸濁し、５μ召のライケーション混合物（前記参照）、および１０ｍＭのＭ　 ｇ　Ｃ（！、２とｌＱｍＭのＣａ　Ｃ１２を含んでいる１５０μ、ｇの１０ｍＭ ）リス−ＨＣｅ（ＰＨ７５）を加えることにより調製したＤＮＡ溶液２００μｌ と混合した。この混合物を０℃で２５分間インキュベートし、５０℃で１０秒間 インキュベートしたのち、室温で１０分間インキュベートした。この時点でＬ− ブロス１４ｍ１！を加え、この培養混合物を３７℃で３０分間振盪させた。次い で、アンピシリン溶液４８０μ５　（１，２５■／ｍｌ）を培養物に加え、さら に３０分間インキュベーションを続けた。

この内１００μ召を、２ＹＴ（ｌｅ当たり、バクト・トリプトン１６　ｇ、バク ト酵母エキス１０ｇおよびＮａＣ１５ｇ）を含有しており、使用直前に５０πｇ ／ｍｌのアンビンリン５０μＣおよび２６ｉｏＸｇａｌ　（５−フロモー４−ク ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトンド）５０μＣを添加した、調製した ての寒天平板に塗抹した。

コロニーが直径０．５〜２厘となるまで平板を３７℃でインキュベートした。Ｘ ｇａｌ　を含んでいるこの指示平板上で、挿入物を持たないプラスミドを含んだ 細菌は青色のコロニーを形成するか、組換えプラスミドを含んでいる細菌は白い コロニーを作る。いくつかの白色コロニーに付き、少棗の澄明にした溶解物をア カロースケル電気泳動によって分析することにより、組換えプラスミドの存在に ついて直接スクリーニングした。

単一のコロニーをＬ−ブロス培地１ｍ６中で、３７℃で一夜増殖させた。培養物 をエッペンドルフ小型遠心管に入れて５分間遠心し、ｌ、ＱｍＭのＥＤＴＡおよ び１゜ｍＭのＮ　ａＣｌ　を含むｐＨ７，５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ ＴＥＮ緩衝液）３２５μ召に再懸濁した。０２５ＭのＥＤＴＡ８０μ召と１０％ のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ　）　４−０μβを加え、この混合物を さらに５分間６５℃でインキュベートし、さらに氷」二で３時間インキュベート した。次いで、この混合物をエツペンドルフ小型遠心管中で５分間遠心した。上 清をフェノールで抽出し、核酸をエタノールで沈殿させた。この沈殿を′丁ＥＮ 緩衝液５０μｇｉこ再溶解した。この溶液の５μｅを、既述した方法てＥＣ０Ｒ Ｔ　て消化し、５％ポリアクリルアミ゛ド平平板ゲル電気泳動−より分析した。

一連の既知の大きさのＤＮＡフラクメントｉこ対するその電気泳動移動率を測定 することにより決定した挿入物の大きさは、約２８５塩基対であった。この挿入 物を含有する組換えプラスミドをｐＵＣｇ　／ＣＴＡＰ−■−Ｉ−ｅｕ　２１　 と命名した。第７図は、ＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ　２１挿入物の位置を示すプラ スミドの模式図である。このプラスミドを含有している形質転換大腸菌のザンプ ルは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）１２３０１ 、パークローン・ドライフ、ロックビレ、マ’）　−ラフ　１’　（Ｐａｒｋｌ ａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）、３０ ＵＳＡ　２０８５２に１９８４年８月９日寄託された。この→ノーンプルの寄託 番号は、Ａ　Ｔ　ＣＣ７６３９７９３である。

この寄託はブタペスト条約に基いてなされたものであり、その規定に従って保管 され、第３者に利用可能となる。

この挿入物の完全なヌクレオチド配列は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　）の酵素的 配列法を使って確認された（サンｐＮＰ５およびその誘導体であるｐＮＰ５△Ｒ １およびＰＮＰ６−ＬＢ艮の組立てに使った一般的な戦略は以下の通りである。

開環状ＣＯβＥＩ　−Ｋ　３０　ＤＮＡ分子を切断して、平均サイズが２０００ 塩基対であるＤＮＡフラグメントの正規分布を得た。これらのフラグメントを、 ターミナルトランスフェラーゼおよびポリ（Ｇ）：ポリ（Ｃ）ティリング法（ポ リバー（Ｂｏｌｉｖａｒ　）　、　Ｆ、ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、（１９７７） ２：９５−１１３）を使ってｐＢＲ３２２のアンピシリン部位の１個のＰｓｔ、 ｌ：部位をこクローンした。

得られた組換えプラスミドを用いて、誘導性ＤＮＡ修−”　特表昭ＧＯ−５０２ ０８Ｇ　（１１）後糸（ｓｏｓ）のための野生型のＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２ 株を形質転換した。コリ７ン（Ｃｏｌ＋）を生産したデトラサイタリン耐性（Ｔ Ｃｒ）、アンピッリン感受性（ＡｐＳ）形質転換コロニーを選択し、そのプラス ミドＤＮＡを分析した。

ｐ　Ｎ　Ｐ　５　およびその誘導体は、外来性ポリペプチドを生産するための発 現ベクターとして使用した場合、Ｃｏ１Ｅ１親プラスミドより優れたいくつかの 長所を有する。

この親プラスミドは、コリシンＥ１免疫遺伝子および細胞溶解遺伝子を含んでい る。この親プラスミド暑こ基くベクターを含有している細胞を誘導すると、細胞 溶解遺伝子の活性化により細胞溶解が起こり得る。ｐＮＰ６（こは、この溶解遺 伝子および免疫遺伝子は存在しない。従って、誘導により細胞の溶解を起こさな い。また、Ｃ，ＴＡＰ−１［遺伝子のような構造遺伝子がＣｏｌ　Ｅ　１゜遺伝 子に挿入されている組換えベクターで形質転換した細胞は、コリシンＥ１を生産 しない。従って、このような形質転換体を、挿入物を含有していないベクターで 形質転換された細胞と区別することができる。というのは後者は細胞を死滅させ るコリシンを生産するからである。

５．０Ｘ１０６ダルトンの分子量を有し、約３３００ｂｐの２ 挿入物を含んでいるＴｃｒ、　Ａｐ’、Ｃｏｌ＋組換えプラスミドであるプラス ミドｐＮＰ５　（第８図）を発現ベクターとして使用するために選択した。この プラスミドは、調節領域（プロモーター、オペレーター、およびリボンーム結合 部位）およびコリシンＥ１のための構造遺伝子を含んでいる。この領域のヌクレ オチド配列および遺伝子は、ヤマダ・Ｍらにより記載されている（ＰＮＡＳ（Ｕ ＳＡ）（１９８２）７９：２８２７−２８３１）。プラスミドｐＮＰ５はＳａｃ ［て開裂すること（こより線状分子にすることができる。プラスミドｐ　Ｎ　Ｐ 　５　の唯一のＳａｃ　■部位は、コリシンＥ１遺伝子の開始点からＢｂｐのと ころに存在する。この部位ヘクローンした外来性遺伝子は、コリンンＥ１調節配 列のコントロール下に置かれる。形質転換体をマイトマイツンＣまたはその他の ＳＯＳ系活性化試薬、例えばアルキル化剤など、で処理することにより遺伝子の 発現を選択的に誘導することができる。

プラスミドｐ　Ｎ　Ｐ　５△ＲＩはｐＮＰ５　の誘導体であり、これは、このプ ラスミドのＰＢＲ３２２部分にあるＥｃ。

Ｒ工部位が削除されており、従ってコリシン構造’Ｒ伝千のカルボキシ末端から １９コドン上流に位置する唯一のＥｃｏ　ＲＩ部位を持ったプラスミドである。

このプラスミドは、コリシンフラグメント（１９個のカルボキシ末端アミノ酸を 欠いている）とＣＴＡＰ−１［またはＣＴＡＰ−］１［類似体の融合タンパク質 を生産するための発現ベクターを製造するのに有用である。ｐＮＰ５△ＲＩは、 ｐＮＰ５をＥｃｏＲｌ：て部分的に消化し、ＤＮＡポリメラーゼ反応により、線 状化したプラスミドの１本鎖Ｅｃｏ　Ｒｉ末端を満たし、得られたフラグメント を平滑末端結合し、そしてコリシン遺伝子を含有している組立て物を前記の方法 で同定する、という方法で組立てた。

合成ＣＴＡＰ−１Ｊ遺伝子またはＣＴＡＰ−１１１類似体遺伝子を含んでいる発 現ベクターを組み立てるのに使用することかできるプラスミドｐＮＰ５−ＬＢＲ の組み立ては、以下の如くして行なう。ますｐＮＰ５をＳａｃ　］Ｉエンドヌク レアーゼで開裂して線状分子（ｐＮＰ６−Ｌ）にした。

次いてｐ　Ｎ　Ｐ　５−　Ｔ−をｄＴＴＰの存在下てＴ４ポリメラーゼで処理し た後、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して平滑末端の線状分子（ｐＮＰ５−ＬＢ）を形 成させた。次いてｐＮＰ６−ＬＢ　をＥｃｏＲｌ　エンドヌクレアーゼで切断し て、コリシンＥ１遺伝子の５番目のコドンの残余から３４ ｐＮＰ６のＰ　ＢＲ３２２部分内のＥｃｏＲＩ　部位まてのＤＮＡセクメントを 除去した（ｐＮＰ５−ＬＢＲ）。

これらのプラスミドの組み立てを以下に詳述する。

Ｃａｌ　Ｅｌプラスミドの分離 ＪＣ：４１１株（Ｃｏ召ＥＬ−３０）を発酵器に入れたＭ９培地（１ｅ当たり１ 　、ｐ　（７）　ＮＨ４Ｃｄ、６ｇのＮａ２ＨＰＯ４，■−（２０，３ｙのＫＨ ２ＰＯ４，５ｙのＮａＣ，ｄ、３ｇのカザミノ酸、ｌ　ｍｌの１０％Ｍｇ５ｏ４ ；高圧滅菌後１０ｒｎｌの２０％グルコースおよび０．５　ｍｅのＩ　Ｍ　Ｃａ Ｃ７１！２を追加）中、細胞密度か約５　Ｘ　１０８ＣＦ　Ｕ　／ｍｅとなるま で増殖させた。クロラムフェニコールを終濃度が１００μｇ／ｍｌ　となる様（ こ加え、更に６時間、３７℃でインキュベートした。ンヤーペル（５ｈａｒｐｃ ｌｓ　）の連続流出入遠心機を使って細胞を回収した。ペレット１０，７（湿重 量）を、５ＱｍＭのＥ　Ｄ　ＴＡおよび１５％のンユクロースを含んでいる５Ｑ ｍＭのトリス−ＨＣ（Ｊ緩衝液（ｐｉ−１ｓ、ｏ　）　１８０ｍｌ　に懸濁した 。次いでリゾチーム０．１４　ｉを加え、その混合物を室温で１０分間放首した 。次きに１０％ＳＤＳ１６ｍｌおよび５Ｍ酢酸カリウム２０ｍ１を加えた。混合 物を氷上で３０分間インキュベートした後、５ｓ−３４０−ターおよびツルバー ル（５ｏｒｖａ、］　］　）遠心機を用いて°゛　品ｆｌＵＧＯ−５０２０８６ （１２）１２．０００　ｒｌ）ｎｌて３０分間遠心分離した。膵臓ＩＪホヌクレ アーゼＡ　４　＃Ｉｇを上清に加え、その混合物を３７℃で１時間インキュベー トした。この試料を、同容量の、０．ＩＭＦリス（ｐＨ８，０）で飽和したフエ か一ルで２回抽１１１３し、試料の１／１ｏ１５ｉの３．０Ｍ酢酸す）　ＩＪウ ムと２．５容量の冷エタノールを加えてＩ）　Ｎ　Ａを沈殿させ、−２０℃で一 夜インキユベートした。得られた沈殿を、ＨＢ−４０−クーを庚い、冷却した゛ ハレノ＜−ル遠ノｌ−＼機中、７．０００　ｒＰｍて５０分間遠心分離して回収 しすこ。ペレ・ントを、０．３　Ｍ　Ｏ）　ＮａＣ１と５ｍＭのＥＤＴＡを含む １０ｍＭ　トリスＨＣｅ　７１衝液（ＰＨ７，５）（ＮＥ緩衝液）５０Ｉ＋＋ｅ に溶解した。この試料を、ＮＥ緩衝液で平衡化したＢｌｏ−Ｇｅ１　Ａ、　５カ ラム（５Ｘ　１００ｃｒｎ、　Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ１リッ チモンド、カルフォルニアれ、ＤＮＡをＮＥ緩衝液で溶出した。流速６ｕｍｌ／ 時で２０１ｎｌのフラクションを集めた。キルフォード（Ｇｉｌｆｏｒｄ　）　 ２６００ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計を使って２６０μｍに於ける各フラクションの 吸光度を測定すること（こより、ＤＮＡの溶出をモニターした。宿主ＤＮＡとプ ラスミドｏ　Ｎ　Ａは一緒に、空容量中に回収した。ＤＮＡ含有フラクションを プールし、エタノールで沈殿させた。Ｉ−Ｔ　Ｂ　−　４０−ターを使い、冷却 したツルバール遠心機で、４０分間８．００Ｏ　ｒｐｍで遠心して沈殿を集め、 ０、　２　ＭのＮａＣｌを倉荷している１０ｍＭトリス−ＨＣ／緩衝液（　ＰＩ （７．８　）　５　ｍｌ　（こ再溶解した。このＤＮＡ試料をＲ　ｉ’　Ｃ　− 　５カラム（　０．　９　Ｘ　９　０　ａｎ　）に入れ、３０℃で加圧下に充填 した。１０ｍＭトリス−ｒ−ｉｃｇ緩衝液（ｐＨ　７．　８　）中の０．　６　 −　０．　７　Ｍ　ＮａＣｌのリニアークラジエント（全容量、１１）を用いて ＤＮＡを溶出した。０．８ｍｔ　７分の流速で２．　５　ｍｌづつのフラクショ ンを集めた。

伝導度計（輻射計、コペンハーケン）を使って、集めた個々の試料の伝導率を測 定することにより、そして垂偵アガロース平板ケル（　０．２　５　Ｘ　１　４ 　Ｘ　１　５，５ｃ７ｎ）を使ったアブ７０−スゲル電気泳動（こよりＤＮＡの 溶出をモニターした。この試料を、１ｍＭのＥＤＴＡと５ｍＭの酢酸すｌ−　Ｉ Ｊウドを含有している４０ｍＭのトリス塩基緩衝液（　’］’　Ａ　Ｅ緩衝液） で調製した１％アノｆ　ｏ−スケルに適用し２、５　Ｖ　／　ａｎの連続適用電 圧下で３時間電気ｉＵｔｌＪＬだ。スーパーコイルの、そして切れ目を持った（ ニック）環状ＤＮＡを含んでいるフラクションを別々に集め、冷エタノールで沈 殿させた。得られたＣａｌＥＩＤＮＡ分子の沈殿をそれぞれ１．０およびＱ，　 ５　ｍｌの一ｒ　Ｅ　Ｎ緩衝液に溶解した。

プラスミドｐＢＲ３２２の分離 上記のＣｏ／ＪＥＩプラスミドの分離に用し）だ方法ζこより、Ｅ．　ｃｏｌ　 ｉ　株２９４（ＰＢＲ　３２２）からシラスミド１）　ＢＲ　３　２　２を分離 した。

Ｇｏ（ｌ　Ｅ　Ｉ　ＤＮＡの剪断フラグメントの調製ニック環状ＣｏｌＥ　Ｉ　 ＤＮＡ　２　０　０μ召（０７μｙ／μ召）と０．３へ１酢酸ナトリウム２．　 ８　ｍｉを混合した。このＤＮＡ溶液をオムニミキサー（　Ｄｕｐｏｒ＋ｔ　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　、＝　、：１−トン、コネクチカット）の小型ホモケナ イサーセル（こ入れ、■）Ｎ　Ａを３　８，５　０　Ｑ　ｒ　ｐｒｎて２０分間 剪断した。剪断工程中、温度は０℃に保った。剪断したＤＮＡをエタノールで沈 殿させ、’Ｉ”　Ｅ　Ｎ緩衝液１００μＣに再溶解し、牛暢内ホスファターゼ（ ＣＩＴ）（ベーリンガーマンノ＼イム、インディアナポリス、インディアナ）で 処理した。

このＣ　Ｉ　Ｔによる処理は、２つの５００μｅの反応混合物中で行なった。各 反応混合物は、蒸留水３８０μｅ、１Ｍ　トＩＪ　７−ＨＣ５　緩衝液（　ｐＨ ８．０　）　５　０　１’（１、ｌＱｒｎＭ硫酸亜鉛５　ｐｌ，ＣＩＴ（ＩＯＬ Ｉ／μ召）５μＰ．ｒ含ンでイタ。３７℃で３０分間インキュベートした後、Ｃ ＩＴ５μｅ　を追加し、更（こ３０分間３７℃でインキュベートした。こ３８ の反応混合物を、同容量の緩衝液−飽和フェノールで２回抽出し、エタノールで ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡフラグメントの不均一な集団を、ンユクロース・グ ラジェント速度遠心法（こより精製し、大きさに従って分離した。５Ｗ４Ｑｏ− ター（Ｂｅｃｋｍａｎｎ　）用遠心管中、１ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ　Ａを含有してい る０、　３　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐｌ−（７，０）　中の２０％、１５％ 、１０％および５％ンユクロース３．４　ｄを連続的に積層することにより、不 連続ソユクロースグランエントを調製した。１００μβ中のＤＮＡ試料（０，２ ５μｇ／μｅ）をこのンユクロースグラジエントにのぜ、Ｉ−８−７０ベックマ ン超遠心機を用いて１０℃で２０時間、３５，０００　ｒＰｍで遠心した。

０、５　ｍｌのフラクションを集め、エタノールで沈殿させた。沈殿をＴ　Ｅ　 Ｎ緩衝液５０μｅ　（こ再溶解し、アガロースケル電気泳動によって分析した。

バクテリオファージＩ）　Ｎ　ＡをＨｉｎｄｕエンドヌクレアーゼで処理して得 たＤＮＡフラ久メントを分子量標準として用いた。

コ（７）　）、　／ｆ（ｉｎｄｌＩ反応混合物は、蒸留水２７　Ｉｌｌ　、　５ ＸＨｉｎｄ■緩衝液（１，００ｍＭトリス−ＨＣ，５（ｐＨ７，４）、２．５ｍ ＭＮａ２ＥＤＴＡ　、　２０　ＱｍＭ　ＮａＣ１、５ｍＭ　ＤＴＴ　）　ｌ　Ｑ 　ｐｌ、λＤＮＡ　］μｇ　（０，７１１：９／１ｔ（１）、およびＨｉｎｄｌ ［溶液（２Ｕ　／１ｔｌ）″′　特表昭Ｇ　Ｏ−５０２０８Ｇ　（１３）２μβ を含んでいた。

平均２，０００ｂＰの剪断Ｃｏ、５ＥＩ　ＤＮＡフラク〜メントを含んでいるシ ュクロースグラジェントフラクションをプールし、エタノールで沈殿させ、ＴＥ Ｎ緩衝液に再溶プラスミドｐＢＲ３２２をＰｓＬＩて開裂して線状分子にした。

蒸留水５２０μ召、５ｘＰｓｔＩ緩衝液（５０ｍＭ）リ　ス　−ｄｃ６　（ｐ） （７，４）　、　Ｑ、５ｍＭ　Ｎａ２　ＥＤＴＡ　、５　ＱｍＭＮａＣ４、５ｍ Ｍ　ＤＤ　丁　、　ｓｏ％　グ　リ　セ　リ　ン、ｏ　１　ｓ　ｆｏ　ト　＋ノ トンｘ１００）２００μβ、ＰＢＲ３２２ＤＮＡ溶液（０，２５μＩ／μ召）２ ００μｅ　およヒＰｓｔ　Ｉ　（１２（Ｊ／ｌｔｌ　）　８０　μ（ｌ　全含有 する反芯混合物を３７℃で４時間インキュベートした。ＥＤＴＡ（２ＱｍＭ）を 加えて反応を停」Ｌさせ、同容量のフェノールで抽出した。ＤＮＡをエタノール 沈殿に付し、ＴＥＮ緩衝液に溶解させた。

ポリ（ｄＧ）ホモポリマー延長部分を、線状ｐＢＲ３２２分子に反応混合物〔蒸 留水６μ召、５ＱＱｍＭカコジル酸カリウム２０μｅ、ｌＱｍＭ塩化コノくルー ト１０μ召、　１ｍＭＤＴＴ　１０　ｐｌ　、ｌ　ＱｍＭ　ｄＧＴＰ　２ｆｉ（ １１Ｈ−ｄＧＴＰ　（＝ニーイングランド・ヌクレアーコーポレーション（Ｎｅ ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）　）　２０ μ７、ＤＮＡ（０，０４μｙ／μｅ）２５μ召およびデオキシヌクレオチド・タ ーミナルトランスフエラーセ（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（ＢｅＬｈ ｃｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ１ｘ＋ｒａＬｏｒｉｅｓ）　Ｉｎｃ、　Ｇａ ｉ［ｈｃｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　）（１，２Ｕ／　Ｉｌｌ　）　５１ ｚｌを含有する〕中で付加した。

ＤＮＡの総合有量か２．０Ｈｇであり、ヌクレオチドトリホスフェートがｄＣＴ Ｐである外は同様の反応混合物中で、ポＩＪ（ｄｃ）延長部分をＧｏ５Ｅ１剪断 フラク゛メン旨こ付加した。上記の各反応を、それぞれ３７°Ｃ【こおいて２分 、および３分間行った後、ＥＤＴＡを２ＱｒｎＭになるまで加えて反応を停止し 、フェノール抽出した。

Ｃｏｇ　Ｊε１−〔ポリ（ｄ（１：）：ｌフラグメントを蒸留水１１５μｅに溶 かし、０．５　Ｍ　ＮａＣ５４０１１ｉ、５０　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ ７，２５）　４．０　ｐｌおよび線状ｐＢＲ３２２［ｄでり（ｄ、Ｇ））ＤＮＡ 溶液（０，１μｙ／μｍ３μｌを加えること（こよって、線状ｐＢＲ３２２−［ ポリ（ｄＧ））とアニールした。このアニーリング混合物を７０℃で１５分間イ ンキュベートし、次いて５時間で４０℃に冷却した。この混合物を一夜４５℃に 保った後、室温まで冷却した。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　２９４を形質転換するために、Ｌ　−ブロス中で一 夜増殖させた培養物を、調製した（ま力）りのし−ブロス培地により、１：１０ ０の害１１合で希釈し、ＯＤ　が０．６になるまで、３７℃におＧ）で振盪しな 力（００ らインキュベートした。この時点て、培養物３５ｄｆ４°Ｃ（こおいて１０分間 、６，０００Ｈβｍで遠ｌ已＼分離し、１尋られたペレットを０．Ｏ５ＭＣλＣ １２２０ｍｅ　＋こ再懸濁しｔこ。

これらの細胞を氷上で１５分間インキュベートした後、４．０００　ｒ　Ｐｍて １０分間遠心分離して集めた。１尋られた細胞を再ひ０．０５　Ｍ　ＣａＣ，５ ゜４＋ｄｉこ懸濁し、これを、ア−−’Ｊ　７　り混合？／＋　５０　ｐ（ｌを 、１０　ｍＭ　ＭｇＣ４ｊ２および１０ｍ　Ｍ　Ｃａ、　ＣＩ　含有１０ｍＭト リス−ＨＣ，５（ｐｌ（７，５）　１５０μ召　に加えて調製したＤＮＡ溶液２ ００μβと混合した。

この混合物を０℃で２５分間インキュベートした後、５０℃で１０秒間、さらに 室温で１０分間インキュベートした。この時点て１−−ブロスｌ　４　ｍ、ｌを 加え、培養物を３７℃で３０分間振盪した。次１７）で、この培養物にテトラサ イクリン溶液（１，２５ｍｆｌ／ｍＡ’　）を４８０Ｈβ力口え、さら（こ３０ 分間インキュベーションを続けた。１００μ召を分取し、新しく調製した寒天平 板（Ｌ−ブロス２５ｍ１．１．５％寒天および２５μｇ　／　ｍｅテトラサイク １ノン含有）上で平板培養した。Ｔｃｒ形質転換体については、２５μｙ／ｍノ のアンピンリンを含んだ寒天上で平板培養することにより、アンピンリン耐性を も調べた。

次いでコリシンの自然生産のためにＴｃｒＡｐＳ形質転換コロニーをスクリーン した。Ｌ−寒天平板上に単一のコロニーをおき、３７℃で一夜インキユベートし た。

これらのコロニーをクロロホルム蒸気にさらして殺した後、０．７％寒天と一夜 培養したＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２、ＣＬ１４２　培養物０．　Ｉ　ＷＬｅとを含 有するし一ブロス５　ｍｌを積層した。寒天を固まらせた後、この平板を３７℃ で一夜インキユベートした。阻害帯に囲まれたコロニーをコリシン・プロデュー サーとしてしるしをつけた。

Ｔｃ　Ａｐ　Ｃａｌ　形質転換＝＋ｃ＋＝−ヲ、ｐ　Ｕ　Ｃ８／　ＣＴＡＰ−ｍ について上で述べた様に、アガロースゲル電気泳動にかけ、少量の透明なリゼイ ト（溶菌液）を分析することにより、組換えプラスミドの存在に関してスクリー ンした。′ プラスミドのサイズは、１．３６Ｘ１（）６〜３５．８Ｘ１０６ダルトンの範囲 内のサイズを有する８個のプラスミド標品を使用し、アカロースゲル内でのＤＮ Ａの電気泳動における移動度を測定することにより、決定した（Ｆ、Ｌ。

Ｍａｒｃｉｎａ　、　Ｄ、Ｊ、　Ｋｏｐｅｃｋｏ　、に、Ｒ，Ｊｏｎｅｓ　、　 Ｄ、Ｊ、　Ａｙｅｒｓ　、およびＳ、Ｍ、　ＭｃＣｏｗｅｎ″ア・マルティプル 、・プラスミド−コンテイニング・エシェリキア・コリ・ストレイン：コンテニ ング・ソース・オブ・サイズ・リファランス・プラス−′Ｖ・モレキュールス（ Ａ　ｍｕｌ　ｔｉｐｌｅ　ｐｌａｓｍｉｄ−ｃｏｎｉａｉｎｎｉｎｇ　Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　５ｔｒａｉｎ　：　Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｓｏｕｒ ｃｅ　ｏｆ　５ｉｚｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｍｏｌｅｃｕｌ ｅｓ　）’プラスミ　ド　（Ｐｌａｓｍｉｄ）（１９７８）１：４１７−４２０ ）　。

形質転換されたクローンを２召の培養液中で増殖させた。上記の如く透明なリザ イトが生成された。上澄みを膵ＲＮａｓｅ（膵リボヌクレアーゼ）Ａで処理しく １００μｇ／荒ｌ、３７℃で３０分間）、次いでフェノール抽出した。ＤＮＡを エタノールで沈殿させ、ＴＥＮ緩衝液に溶解させた。

制限酵素類は市販品をベセスダ・リザーチ・ラボラトリーズ・インコーホレイテ ッド（Ｂｅ　ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　 Ｉｎｃ、　（ＢＲＬ　）　）　がら入手した。ＤＮＡを、ＵＲＬの指定した条件 下でＰｓＬ　■、　ＥｃｏＲｌ：、Ｓｍａ　ｌ：およびＳａｃ　Ｈ消化した。試 料を、一定電圧（５Ｖ／α）の下で４時間、１％アガロースケル電気泳動に付し た。制限フラグメントの分子量は、Ｔ（ｉｎｄｌｌＩおよびＨａｅｌ［消化した バクテリオファージλＤＮＡによる標準移動パターンと比較してめた。

組換えプラスミドのｐＢＲ３２２部分のＰｓｔ　ｌ：部位に挿入されたフラグメ ント（類）のサイズを確定するためにＰｓｔ　工を用いた制限分析を行った。第 ８図（こ形質転換されたクローンの１つ、ｐＮＰ５と命名された組換えプラスミ ドの制限地図を示す。この形質転換されたクローン（Ｎ　Ｐ　６−２９４と命名 ）の標本は１９８３年８月２４日に、Ａ　’１７　ＣＧに寄託された。この標本 のＡＴＣＣ寄託番号は３９４１８である。この寄託はフダペスト条約に則ってな され、維持されるものであり、その規定に従い、第三者は入手することができる 。

」−記のＣｏ、５Ｅｌの場合と同様に大腸菌菌株ＮＰ５−２９４（ｐＮＰ６）を 増殖させ、プラスミドＤＮＡを単離した。こｄスーパーコイルＤＮＡ５０Ｑμｙ をＴＥＮ緩衝液で３．９　ｍｌに調整し、ＣｓＣ１３，４５ｇとエチジウム・ブ ロマイド・ストック溶液（５’７９　／　ｍｅ　）　０．１　ｍｅとを加えるこ とにより、更に精製した。この混合物を５ｗ５０．１０−ター（ベックマン）用 のニトロセルロース・チューブに入れ、３６，０００ｒＰｍにおい′Ｃ１１０℃ で４０時間遠心した。長波長ＵＶ光を用いてプラスミドＤＮ’Ａのバンドの位置 を定め、該チューブの側面から注射器を刺し込み、除去した。このＤＮＡ試料を ブタノールて５回抽出し、１００倍容のＴＥＮ緩衝液（Ｘ３）に対し、４℃で２ ４時間透析した。次いてこのＤＮＡに２．５容量のエタノールと１／１０容量の ３Ｍ酢酸ナトリウムを加えて沈殿を析出させた。

誘導体ｐＮＰ５△Ｒ１の製造 プラスミドｐＮＰ６は２個のＥｃｏＲ（制限部位を有しており、その１つはコリ リンＥ１遺伝子のカルボキシ末端領域に位置し、他の１つはｐ　Ｂ　Ｒ３２２ベ クター起源のテトラサイクリン耐性遺伝子の付近に位置している。

第２の部位を欠＜　ｐＮＰ６を以下の如くに組立てた。

ｐＮＰ６を制限された反応条件士でＥｃｏＲＪ　消化し、線状分子（これら２部 位の内、１個のみが開裂された分子）を生成させた。ｐＮＰ５の線状分子をアガ ロース電気泳動によって精製し、次いでＤＮＡポリメラーゼ■およびデオキゾリ ホヌクレオチド・トリホスフェートと反応させて一本鎖末端を埋めた。得られた 分子をＴ４リガーセを用いて平滑末端ライケーンヨン反応で環化４６ し、既述の如く、大腸菌２９４の形質転換に用いた。

コリノン産生性形質転換体を既述の如く選択した。

個々のクローンからＤＮＡを単離し、Ｅｃｏ　ＲＩて消化してコリンン遺伝子内 に無傷のＥｃｏＲｌ：部位を有するものを確認した。唯一のＥｃｏＲｉ　の位置 は、更に制限工ｐＮＰ６から１）ＮＦ２−ＬＢＲを製造するのに用いた工程の模 式図を第９図に示す。ｐＮＰ５を、このＤＮＡ　（９０，６１μｇ／Ｉｔ（１） 　４０　Ａｌと、蒸留水１ｏμｅおよヒ２　Ｘ　Ｓａｃ■緩衝液（１５ｍＭトリ ス−ＥＣ７（ｐＨ７，５）、ｌ　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ召２．１０ｍＭβ−メルカ プトエタ／　−／ｌ／、２００ｐ１７／ｍ１ＢＳＡおよヒＳａｃ　ＩＩ−（１０ （Ｊ／μｌ　）　３ｔｚｌ　）　５０ｔｔｌ）　と全混合することにより、Ｓａ ｃ　ｆｆ消化した。この反応混合物を３７℃で８時間インキュベートし、フェノ ール／クロロホルム（３’：１）で抽出した。

次いでこのＤＮＡをエタノール沈殿に付し、これを、５　０　ｍＭ　）　リ　ス 　−Ｈ（４（ｐＨ８，５）　、　７　ｒｎＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ（１２、ｌＱｍＭβ− メルカプトエタノール、１５　ｍＭ　ｍ酸アンモニウム、７　ｒｎ　Ｍ　Ｎ　ａ ２Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ、　、　２０　μｇＢ　Ｓ　Ａおよび０．１ｍＭ−′　特表昭 ＧＯ−５０２０８Ｇ　θ５）ｄＴＴＰ　を含有する溶液１００μＣ（こ溶かした 。Ｔ　４　ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）１単位を加え、得られた混合物を室温 で１０分間インキュベートした。０．２　Ｍ　Ｎａ２ＥＤ丁Ａ２５μｅを加えて 反応を止めた。この溶液を次の様にしてｄＴＴＰについて精製した：即ち、この ＤＮＡを０．１２Ｍりん酸ナトリウム（Ｐ　Ｂ）、１５％ホルムアミド中で６５ ℃においてヒドロキシアパタイト０．５．ｊ７と結合させ、０．１２　Ｍ　Ｐ　 Ｂ　３０　ｍｌで洗浄し、該ＤＮＡを０．５ＭＰＢで溶離し、水に対して透析し た後、エタノール沈殿に付した。

ＤＮｋを、３９ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，６）、５０ｍＭ　ＮａＣｊ／　、 １　ｍＭ　ＺｎＳＯ４および５％グリセリンを含有する溶液５０μ召に溶かした 。２単位の５１ヌクレアーゼを加え、この混合物を室温で５分間インキュベート した。ＥＤＴＡを最終濃度がｌＱｍＭとなる様に加え、この溶液をフェノール／ クロロホルム（３：１）で抽出し、エタノール沈殿に付した。得られたＤＮＡを １００ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７４）、５　ｒｒ＋　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ（１２ ，２ｍＭメルカプトエタノールおよび５　Ｑ　ｍＭ　ＮａＣｌ　を含有する溶液 ５０μβ（こ溶かした。ＥＣ０ＲＩ　５単位を加え、この混合物を３７℃で６時 間インキュベートシタ。０．１　Ｍ８ ＥＤＴＡ１５μβと１．０％５Ｄ５５ＡＣを加えて反応を止めた。大きいプラス ミドフラグメント（ｐＮ５−ＬＢＲ）を１％アガロースゲル」二、５Ｖ／（ｍｉ こおいて４時間電気泳動にかけ、精製した。このゲルを１μｇ／ｄ　のエチジウ ム・ブロマイドで染色した後、長波長のＵＶ光を照射し、Ｉ）　Ｎ　Ａフラグメ ントを観察した。スラブゲルのＩ）　Ｎ　Ａ−帯（ｐＮＰ５−ＬＢＲ）部分を切 り離し、該ＤＮＡを透析用の袋の中に電気溶離した。このＤＮＡをジエチルアミ ノエチル（ＤＥＡＥ）セルロースの１ｍカラムと結合させ、０．１５　Ｍ　Ｎａ Ｃ（ｌで洗浄し、１ＭＮａｃｌテＩｓ　離してエタノール沈殿に付すことにより 、さらに精製した。このＩ）　Ｎ　Ａを、最終的にＴＥＮ緩衝液に溶かし、使用 するまで一８５℃で保存した。

ｐＴＪｃ８　／ＣＴＡ　Ｐ　−ＩＩＩ−Ｌｅｕ　２１　がらの挿入物ＤＮＡの製 造工程の概要を第１０図に示す。ｐＮＰ（３の精製に用いたと同様の方法でプラ スミドｐ　Ｕ　Ｃ８／　ＣＴ　Ａ　Ｐ　−ｍ−Ｌｃｕ　２１　ＤＮＡを精製した 。エタノール沈殿の後、ＤＮＡ１、Ｏｐｊｌ　を　１０ｍＭ）　リ　ス　−１− ＩＣＩ？　（ＰＨ７，５可う・）、　５　ｍＭ　Ｍ　ｇＣ（１２，５ｒｒ＋　Ｍ 　β−メルカプトエタノール、５０ｍＭＮａＣｄおよび１００μｊｑ／ｍ１Ｂｓ Ａを含有する溶液に溶かした。

Ｐｖｕ　Ｈ５単位を加え、この混合物を３７℃で３時間イ７キ、：Ｌベ−トした 。ＤＮＡをフェノール、／クロロホルム（３：１）で抽出し、エタノール沈殿に 付シた。

ｐＮＰ５ベクターＤＮＡに関して述べた如く（こして、Ｔ４ポリメラーゼ（ｄＴ ＴＰおよびｄＣ；ＴＰを個別に用いて）、ｓ１ヌクレアーゼおよびＥｃｏＲＩエ ンドヌクレアーゼを用いる酵素反応を行った。得られたフラグメントは平滑末端 １個と、粘着性のＥｃｏＲｉ末端１個を有していた。このフラグメントの平滑末 端とｐ　Ｎ　Ｐ　−５−Ｌ　Ｂ　′Ｐ−の平、骨末端をライゲーションすること により、開始コドン、ＡＴＧがＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ　２１の構造遺伝子を有 する和尚に形成された。

発現プラスミドｐＮＰ５−ＬＢＲ／ＣＴＡＰ−１［−Ｌｃｕ２．．１−９合成Ｃ 丁ＡＰ−１’ｉフラクメントのｐＵＣ８へのクローニングで述へた標準的な手法 に従って約１ｐｍｏ１つつのベクターＰＮＰ６−ＬＢＲ（！：　ＣＴＡＰ−’３ ｒ−Ｌｅｕ２１遺伝子挿入物とを１０　Ｑ　ｐｌの反応系中でライケートさせ、 これを用いて大腸菌を形質転換し、テトラサイクリンによって選択した。コリン ンＥ１産生能カの損失を検出することにより、組換えプラスミドを含有するコロ ニーをスクリーンした。

単一のコロニーをＬ−寒天平板上にスポットし、３７℃で一夜インキユベートし た。クロロホルム蒸気にさらすことによってコロニーを殺した後、寒天０．７％ とＥ、　ｃｏｌｉ　Ｋ−１２、ＣＬＩ　４２　の−夜培養物０．１　ｍｌとを含 有するし一グロス５−を積層した。寒天が固化した後、平板を３７℃で一夜イン キユベートした。周囲に阻害帯のあるコロニーをコロンン・プロジューサー（産 生コロニー）としてしるしをつけた。阻害帯を形成しないコロニーは、前述の如 く、アガロースゲル電気泳動により透明なりサイトを調べることによって組換え プラスミドを含有していることが証明された。組換えＤＮＡを単離し、個所に制 限エンドヌクレアーゼＢａｍＨ工、Ｘ　Ｉ）　ａ　工　およびＰｓｔ　Ｉでそれ ぞれ消化した。

フラグメントのパターンはＣＴＡ、Ｐ−１［−Ｌｅｕ　２１遺伝子挿入物のそれ と同一であった。ＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ　２１遺伝子挿入物を含有する形質転 換体の１つをｐＮＰ５−ＬＢ　Ｒ／ＣＴＡ　Ｐ　−■−Ｌｅｕ　２１と命名した 。

発現プラスミドｐＵＣ８−Ｃｏｄ／ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ２１の製造 精製プラスミドｐＮＰ　６−ＬＢＲ／ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ　２１をエンドヌク レアーゼＰｓｔ　■で消化することにより生成される２つのフラグメントの内、 小さい方（′：２１００ｂｐ）は、コリシン制御領域とＣＴＡＰ　−１［−Ｌｅ ｕ　２１構造遺伝子とを含有している。このフラグメントを精製してプラスミド ＰＵＣ８の単一のＰｓｔ　■部位Ｇこクローンし、形質転換体をアンピンリンに 関して選択した。ｐＵＣ８−Ｃａｌ　／ＣＴＡＰ　−ｆｆｌ−Ｌｅｕ　２１と命 名された組換えプラスミドは、そのコピー数がｐＢＲ３２２の１０倍以上に増大 されているので、遺伝子の用量効率に基づけば、実質上、誘導特により多量のＣ ＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ　２１を与えることになる。

ＣＴＡＰ−ＩＩＩまたはＣＴＡＰ−１［同族体の誘導された合成 ｐＮＰ　５−ＬＢＲ／ＣＴＡＰ　−１［−Ｌｅｕ　２１　またはＵＣ３−Ｃｏｌ 　／ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ　２１株を、１０罰のＬ−ブｏス培地中、３７℃で一 夜、通気せずに増殖させた。次いでこの培養物を調製したでのＬ−ブロス培地で １：１００の割合各こ希釈し、通気しながら３７℃において、細胞密度か約５× １０８　細胞／ｍ１！（ＯＤ　＝０．６］Ｃ達する００ までインキュベートした。この時点で、マイトマイシフ　（ｍｉ＋ｏｍｙｃｉｎ 　）　Ｃを、最終濃度が２ｐｊｉ／ｍｌになる様に加え、さらに３．５時間イン キュベーションを続けた。

この培養物を０℃に冷却し、ＧＳＡローターとソーパー／Ｌ／　（５ｏｒｖａｌ ｌ　）遠心機を用いて６．００Ｏｒｐｍにおいて１５分間遠心することにより、 細胞を集めた。この細胞ペレットを一８５℃で冷凍保存した。

この様な増殖条件下テハ、ＵＣ８−Ｃａｌ／ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ２１　の場合 、培養液１召当り１０■以上のＣＴＡ、Ｐ−］ＩＩ−Ｌｅｕ　２１　が生産され た。

ＣＴＡＩ’−１１１／ＣＴＡＰ−ＩＪ同族体を産生ずる細胞を誘導した後、この 細胞からＣＴＡＰ−■／ＣＴＡＰ−］１［同族体を得る。まず最初に、培地を加 熱するか、あるいは培地に容易に除去し得る細胞毒性物質を加えることにより、 細胞を適宜殺し、次いて、必要ならは濾過または遠心して濃縮する。次に、音波 処理、ホモジナイゼーンヨン（均質化）、溶解、またはプレッシャー・サイクリ ング等の常法番と従って細胞壁を破壊する。破壊物中の粒状物を濾過または遠心 して除去する。沈殿またはクロマトクラフィーの如き常法に従って破壊物の液相 から核酸を除く。次いて、ヒト血小板から得る場合に用いる精製法と同様にして ＣＴＡＰ−１［または同族体を回収する。

発現プラスミドｐ　Ｎ　Ｐ　５　／　ＣＴ　Ａ　Ｐ　−Ｉ［［−Ｎ　Ｍ　ＯＤの 製造ＰＵＣ８／ＣＴＡＰ−ＩＩＩ−Ｌｅｕ　２１　およびｐＮＰ５からのＰＮＰ ６／ＣＴＡＰ−ＩＩＩ’−ＮＭＯＤ　製造工程の概要を第１１図：こ示す。

精製ｐＵＣ８／ＣＴＡ、Ｐ　−ＩＩＩ−Ｌｃｕ　２１　プラスミドＤ　Ｉ’ＬＡ を、エンドヌクレアーゼＰｖｕ　ｆｌ　、次いでエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ： ［て完全に消化した。生成物をアガロースゲル電気泳動法で分離し、ＣＴＡＰ遺 伝子を含有する２７３ｂｐフラグメントを電気溶離した後、フェノール抽出し、 エタノール沈殿に付した（第１１図（Ａ））。

ｍ製ｐＮＰ６プラスミドＤＮＡをエンドヌクレアーゼＳａｃ　■で完全に消化し 、次いてＴ４　ポリメラーゼとデオキシンチジン・トリホスフェートで処理して ３′側の一本鎖末端を除去した。この反応生成物をエンドヌクレアーゼＥｃｏＲ ：［て消化し、生成した大きいＤＮＡフラグメントをアガロースケル電気泳動法 で精製した（第１１図（Ｂ））。

（Ａ）および（Ｂ）の最終生成物を等モル量つつの割合で混合し、Ｔ４　リガー ゼでライゲートした（第１１図（Ｃ））。この反応混合物を用いて大腸菌２９４ を形質転換し、数個のテトラサイクリン耐性形質転換体を選択した。これらのク ローンから得たプラスミドＤＮＡヲ制限エンドヌクレアーゼ消化、およびＤＮＡ 配列決定により分析し、正しい構造を有する組換え体を同定した。

発現プラスミドｐＮＰ６△ＲＩ　／Ｃａｌ　：　ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ２１の製 造 ｐＵＣ８／ＣＴＡＰ−■−Ｌｃｕ　２１およびｐＮＰ５△Ｒ■からのｐＮＰ６△ Ｒ４／ＣＴＡ、Ｐ　−ＩＩＩ−Ｔ−ｃｕ　２１の製造工程の概要を第１２図に示 ず。

精製ｐＵｃ３／ＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ　２１プラスミドＤＮＡをエンドヌクレア ーゼＥｃｏＲ］：　て完全に消化し、ＣＴＡＩ’　Ｊｌ［遺伝子を含有する２　 ８４　ｂｐフラグメントを得た。

このフラグメントをアガロースゲル電気泳動法で精製した（第１２図（Ａ））。

精製プラスミドｐ　Ｎ　Ｐ　５△Ｒ４（またはｐＮＰ６）をエンドヌクレアーゼ ＥｃｏＲ１：で完全に消化し、ベクターフラグメントをアガロースゲル電気泳動 法で精製した（第１２図（Ｂ））。

（Ａ）および（Ｂ）の最終生成物を等モル量つつ混合し、ライゲートシて大腸菌 ２９４の形質転換に用いた。テトラサイクリン耐性形質転換体からのＤＮＡをエ ンドヌクレアーゼＢａｍＨｆ１て消化することにより、ベクターＤＮＡ内におけ るＣＴＡＰ−■フラグメントのとり得る２方向の識別を試みた。方向性が正しけ れは、ＣＴＡＰ−Ｊ［タンパク質とコリシンＥ１の１−５０２のアミノ酸残基と の融合生成物が生産される（第１２図（Ｃ））。

ＣＴＡＰ−Ｈ−ＮＭＯ，Ｄ　の合成 ＣＴＡＰ−１［−ＮＭＯＤ　の合成並ひにその精製を誘導するために、発現プラ スミドｐＮＰ６／ＣＴＡＰ−ＩＩＩ−Ｌｅｕ２］−ＮＭＯＤを含有する細胞を使 用し、ＣＴＡＰ　−ＩＩＩ−Ｌｅｕ２１について的に述べた方法に従った。ＣＴ ＡＰ−］Ｉｆ−ＮＭＯＤのアミノ酸配列は、アミン末端に付加されたペンタペプ チドを大括弧で囲み、第１図に示されている。例示のペンタペプチドの末端メチ オニンは、細菌によるタンパク質生産に起因して生じたものである。このメチオ ニンは、発現後のプロセッシングの結果、消失すると解される。

コリンンーＣＴＡ　Ｐ　−Ｎ　−Ｌｅｕ　２１融合タンパク質の合成 Ｃｏｌ　：　ＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ　２１合成の誘導は、発現プラスミドｐＮ Ｐ６／Ｃｏｄ　：　ＣＴＡＰ−１Ｉ−Ｌｅｕ　２１を含有する細胞を使用し、前 にＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ　２１　＋こついて述ベロ た如くにして行った。

融合クンバク質の精製 Ｃｏｌ　Ｆ、　１　（１−５０２）　ＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ２１との融合物（ Ｃａｌ　：　ＣＴＡ　Ｐ−］［−Ｌｅｕ　２１　）　を含有する細胞抽出物は、 細胞を５ＱｍＭホウ酸ナトリウム（ｐＨ９，５）　に１、−５Ｘ１０１０細胞／ ｍ／！の濃度で溶解することにより、調製された。遠心して細胞片を除いた。Ｃ ａｌ　：　ＣＴＡＰ−ＩＩＩ−１、ｅｕ　２　］　は、カチオン交換クロマトグ ラフィーを使用し、量子の方法のいずれかによって精製された＝（１，）　ＣＭ −セフ　７デツクスＣ−５０（５０ｍＭホウ酸す）　ＩＪウム（ｐＨ９，５）で 平衡したもの）１ｙを細胞抽出液１００＋＋＋／！ｌこ加え、４℃において一夜 、静かに撹拌した。樹脂をＰ取し、これを、２８０　ｎｍにおける吸収に基いて 、タンパク質の放出が全く検出されなくなるまで、緩衝液により充分に洗浄した 。Ｇｏ、５：ＣＴＡ　Ｐ　−ｍ−Ｔ−ｃｕ　２１を０．４　Ｍ　ＮａＣ７含有緩 衝液で電気溶離した。

（２）　Ｃｏ、５　：　Ｃ：ＴＡＰ　−■−Ｌｅｕ　２１を、７７−７　ン７（ ７）ファースト・プロティン液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ　１．　Ｃ）系に より、細胞抽出物から精製した。抽出エキス１０〜１００ｒｎ／！を５０ｍＭホ ウ酸ナトリウム（ｐＨ９，５）内で、モノＳカラムに結合させ、０〜０．５ＭＮ ａＣ，５による線状グラジェントで溶離した。融合タンパク質は、約０．２５　 Ｍ　ＮａＣ１の付近で溶出した。

どちらの方法によっても、得られたＣｏｌ：ＣＴＡＰ−］１［−Ｌｅｕ２１の純 度は、変性条件下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動法で判定した結果、 一般に９０％以」二であった。

精製した融合タンパク質を、蒸留水に対して充分（こ透析し、凍結乾燥した。こ のタンパク質を７０％蟻酸に溶かし、メチオニン１モルに対して臭化７７７３０ ０モルの比率（すなわち、融合タンパク質（〜）当り、臭化シアン約２■の割合 ）で臭化シアンを加えた。

試料を室温で２２時間インキュベートした。次いでこの反応混合物を２倍容の蒸 留水で希釈し、凍結乾燥した。上記の一連の操作を１〜２回繰返し、酸および臭 化シアンを除いた。最後に、タンパク質を５ＱｍＭりん酸ナトリウム（ｐＨ６， ２）に溶かし、モノＳカラムを用いてＦ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより、精製した。タンパ ク質をりん酸緩衝液（ｐｉ（６，２）中、０〜Ｑ、　５　Ｍ　Ｎａ　Ｃ１溶液で 傾斜溶出することにより、分離した。精製ＣＴＡＰ−］］Ｔ−Ｌｅｕ２１は０． ２−０．３　ＭＮａＣｌの範囲内で溶出した。

ＣＴＡＰ−１［−Ｌｅｕ　２１　のβ−トロンボグロブリン−Ｌｅｕ１７（β− ’Ｉ−Ｇ　−Ｌｅｕ　ｌ　７　）　ヘノ変換Ｃ’ＦＡＰ−Ｊ［−Ｌｅｕ　２１　 は、プラスミンまたはトリプシンを用いて以下の方法に従い、アミン末端のテト ラペプチドをＬｙｓ４−Ｇｌｙ　５の位置てタンパク分解的に開裂することによ り、β−ＴＧ−Ｌｅｕ１７に変換され得る。

０、　１　５　Ｍ　Ｎ　ａＣｌ　７０．０１　Ｍ　）　リ　ス　−ＨＣｌ　（ｐ Ｈ７，５）　中、約ＣＬ　５　”ｇ／　ｍｅのＣＴＡＰ−■−Ｌｅｕ　２１　を 、１．５１．Ｕ、　／　ｍｅプラスミンと３７℃で１時間インキュベートするか 、またはＱ、　５　ｗ　／　ｗ％トリプンンと共に１０分間、インキュベートす る。−上記の如くモノＳカラムを使用し、Ｐ　ｐ　ｘ−ｃによってβ−ＴＧ−Ｌ ｅｕ１７を精製する。

精製したＣＴＡＰ−ＩＴＩまたはＣＴＡＰ−］［同族体は、ヒトに投与して結合 組織を再生させるために（例えば傷の治癒）、通常の薬学的に許容し得る担体と 共に、常法通り処方することができる。それは通常、例えはクリーム、ペースト １．ゲル、スプレー、点眼薬、および軟膏類等の一般的な局所適用に用いられる 処方をこ従って投与される。その様な処方に用いられる担体はよく知られており 、それらには、ワセリン、ポリエチレンクリコール、ゼラチン、ミリスチン酸イ ソプロピル、ポリビニールアルコール等が含まれるが、これらに限定される訳で はない。別法として、精製Ｃ；ＴＡＰ−Ｊｌ［またはその同族体を、例えは包帯 または皮膚貼剤に、その皮膚への放出速度がコントロールされる様にｌ、て含有 せしめてなる、放出用量抑制製剤の形を用いて投与してもよい。コントロールの 機構としては、拡散、浸透、溶解、侵食またはイオン浸透等がある。ＣＴＡ、Ｐ −■またはその同族体を含有する局所製剤には、添加剤として、皮膚軟化剤、安 定剤、界面活性剤、皮膚浸透性改変剤、および色素類等を少量含有せしめてもよ い。

製剤中のＣＴ、ＡＰ−■またはその同族体の濃度は指示用量および治療すべき表 面の面積に関連することになろう。その濃度は、通常、投与剤形の重量の０．０ ００１％〜１％の範囲とすることかできる。いずれの場合においても、投与量は 所望の薬理効果、例えはミトゲネンスの刺激作用、が表われ、傷の治ゆを促進す るのに充分な量とする。

本発明を実施するために上記の方法を、本発明に係る技術分野の人々にとって自 明な程度に修飾した方法も、後述の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものであ る。例えば、コリンンＥ１制御遺伝子および構造遺（コ　＜　ｖｎ　ＯＣコ　く ロ　（ ）−Ｉｌｌ　ａ＼　ωａ−＋　ａｒ−ぐＬＪ　ｃｆＪ　−＋ＬＩＩｊ　Ｌ３（Ｌ 　ｌ−［Ｊ　ＩＬ　ＬＪｏ　）−−＋　）−−のりＩしくψ　ＯＬ　ト喝　（Ｊ −Ｉ　ＣＯぐψＬＩζ　ａｒｔ　ｏ＝＞　ＬＩＣｔｑｏｔｘトー　１−　（”Ｉ ｌｌ　ｖｌ　Ｌｌｃ　ｆＪＬ　）−＋１１Ｊ　Ｉｌｌ　ＯＣ＋ＩＣ、−＋　ｅ７ ．１１１　Ｕ、−１ト（１）　−〇工　０口　Ｏ（口ζ ｏ　ＬＬ　ｃ３　ａ＋　（ｊ　Ｇ　０口　０　）−ＬＣＬＴｌ　）−＋　Ｃ＋Ｉ ｌｏ口＋−（Ｊａ＋口ｃ　ｃＩ−Ｉｃｅ　ひＩ（Ｊ（Ｌ　ドωｎ　ｌｊ　ｊ　Ｌ Ｊ＞　Ｉｊ　ｖ　）−１１ｅｒ　：ｊ嘘１−Φ　口＋−１Ｏ＼　く−ぐ− （ＪＪ　ＬＪロ　トｏ　ａｃｔ　ａｔｙ）−μ　ト（■Ｏψ　くコ　Ｕ九 ＵΦ　Ｌ３Ｉ１１　寸（−トル　りψ ）−１）　トの　−Ｏ′！：　口」　口（ζコ　ｌ−Ｌ　）−１−）−１１１ｃ ｎ−＞（＋−１口Ｊ：ｏ、ｅ　ｏｘ　９０− ＬＪ口　（ｆｌ−Ｃ）−トＬｌ　、Ｎｉ２口〈ゴ　の＋−μ　υλ　Ｑル　ト田 （−ロｕＪ：　ロー　トー　Ｕ− 口Ｌｌ　ζ）−Ｌ３０　＜ｘ　ａぐ　「０の）−ｋ　ＣＪ　１１＋　←λ　トφ 　（−１嗜へロー　＋−＋　Ｌｌ、−１ｏ　Ｌ　ａ　ｘＯ口　ぐｌ−Ｉ　１１口 　０（（」　匡くψ　口Ｉｌｌ　１”）ＣＪΦ　←工　ぐψζｈ　ＬＪｘ　ロヒ ー　ロー　（＼ （［Ｊ　１−ｔｊ　、−＋（［ｔ−＋　ＣＬＪ　ＣＪト−ロコ　）−、−１（Ｊ ＩＬ　のＯＬ：ｕ−ｔ　）−ａ＋　ｌ−１ｉｔ　（ｊ＋ｎ　ｍａ、−＋ＬｉｄＬ ＩＪＬＩＤ）Ｉ：Ｊ＜ｒ−ＩＬＩＬＩＬ）：ｌ　ｒ”＋ｕψ　（コ　くψ　トー トΦ　トＬＪ＼　ａ−＋　ａ＞　ｌ−ｍ１ｊＪ　）−ＬＩ　ＬＩＬＪ　（ｔＪ　 ＬＩＩｊ０　２０　３０　４０　５０ ＦＩＧ、　５ クラ２゛ンント　Ｉ ＦＩＧ、　６ ＣＴＡＰ−Ｌｅｕ２’１ ＦＩＧ、　８ ｐＵｃ−８／ＣＴＡＰ−Ｉエエ ＦＩＧ、　１０ 日Ｇ、　Ｉ　Ｉ　ＰＮＦ６／ＣＴＡＪＩ−ＩＩＩ−Ｎ　ｍｏ　ｔｐｙ１？Ｊ計Ｃ Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ−−３’ ５’−−ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＣＧＧ　−３’−Ｔ　Ａ　ＣＣＴ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　 Ｇ　ＣＧ　ＣＧ＝５’−−−Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＣＧ　Ｇ−□　３ １−Ｔ　Ａ　ＣＣＴττＧＧＧ＋− ５’＝Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＣＡ　Ａ　Ｔ　Ｔ−−一−−−−−−− −−−３’−Ｔ　Ａ　ＣＣＴ　Ｔ　Ｔ　（：　Ｇ　−一−ＡＡ丁τＣＡ　Ｇ　Ｃ Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ−一一一一一一一一−３’５’−−−−−−−−−−Ａ　Ｃ Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ−−−−＝−−−−−−−３瞥ＦＩＧ。Ｊ２（Ｃ） 　ＣＴＡＪ’／ＲＩ　＋　ｐＮＦ６／Ｒ工Ｔｈｒ　Ｇｕｙ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌ ｅｕ　ＭＥ丁国際調査報告 「 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号０発　明　者　ウォレー、ナヒド ・ニス　アメリン・ス

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■　ヒト結合組織−活性化ペプチド−川１１またはその第２１位のメチオニンが ロイシンで置換された突然変異タンパク質を暗号化している合成構造遺伝子であ って、遺伝子の暗号配列か、ヌクレオヂト配列・（ｊｉ：中；Ａ＝アデニン、Ｇ −グアニン、Ｃ・−シトシン、Ｔ−ヂミン、Ｉ−（−＝Ｔ、ＣまたはＧ、、Ｊ＝ ＣまたはＡ、Ｌ＝ＴまたはＡ、Ｍ＝ＣまたはＧ、Ｐ＝ＡまたはＧ、Ｑ＝Ｃまたは Ｔを表わす） で示されることを特徴とする合成構造遺伝子。 ２、遺伝子が配列 ＡＡＣＣＴＧＧＣＴＡＡＡＧＧＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＣＴＣＴＧＧＡＣＴＣＴ ＧＡＣＴＴＡＴＡＣＧＣＴＧＡＴＧＡＣ ＡＣＴＧ （式中、ＫはＪの如何により、ＧまたはＴを表わす）で示されるＤＮＡ配列を有 することを特徴とする第１項に記載の合成構造遺伝子。 ３、ヒト結合組織−活性化ペプチド−ＩＩ＋またはその第２１位のメチオニンが ロイシンで置換されている突６３ 然変異タンパク質を微生物学的に生産するのに用いるためのＤＮＡフラグメント てあって、塩基対：Ｃで先行され、配列： ＴＡＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧ Ａ、ＴＴＡＣＴＧＡＣＧＴＣＴＴＡＡ で示されるアダプターを末端に有する第２項に記載の構造遺伝子からなることを 特徴とするフラグメント。 ４、　レプリケータ−１表現型のマーカー遺伝子、および、プロモーター、オペ レーター、リポゾーム結合部位および翻訳開始コドンを含む発現コントロール配 列、並びに発現コントロール配列と正しい解読相内にある構造遺伝子を含有する 組換えベクターであって、該構造遺伝子の発現コントロール配列がコリシンＥ１ 配列であり、構造遺伝子がコリシンＥ１を暗号化していることを特徴とする組換 えベクター。 ５、ｐＢＲ３２，２の誘導体を含有する組換えプラスミドベクターであって、該 誘導体は、ｐＢＲ３２２のＰｓｔ工部位に挿入された、コリンンＥ１発現コント ロール配列とコリシンＥ１のための構造遺伝子からなるＤＮＡフラグメントを有 するものである、組換えプラスミドベクター。 °“　特表昭１１；０−５０２０８Ｇ　（２）６、誘導体がプラスミドｐ　Ｎ　 Ｐ　５であることを特徴とする第５項に記載の組換えプラスミドベタ外−０７、 ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲ■　部位か除去され、それにより、コリシンＥ１のため の構造遺伝子内に唯一のＥｃｏＲＪ部位が残存していることを特徴とする第５項 に記載の組換えプラスミドベクター。 ８　誘導体がｐ　Ｎ　Ｐ　５△ＲＩであることを特徴とする第７項に記載の組換 えプラスミドベクター。 ９、　線状組換えプラスミドであって、ａ）第６項に記載の組換えプラスミドを ＳａＣ■消化して線状プラスミドＤＮＡを得： ｂ）この線状プラスミドＤＮＡをｄＴＴＰの存在下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで 処理し； Ｃ）ｂ）で得た線状プラスミド生成物を５１ヌクレアーゼで処理し； ｄ）　ｃ）で得た線状プラスミド生成物をＥｃｏＲ］：で消化し；さらに、 ｅ）　ｄ）ステップの消化で得た大きい線状ＤＮＡフラグメントを回収する ことにより、製造されることを特徴とする組換えプラスミ　ド。 ５ １０、細菌性の発現コントロール配列、および、このコントロール配列の下流の その解読相内に位置し、該配列のコントロール下にあるヘテロローガスな構造遺 伝子、並ひに該構造遺伝子に先行する翻訳開始コドン、さらに該構造遺伝子の末 端に位置する翻訳終止コドンを含有する組換えプラスミド発現ベクターであって 、該構造遺伝子が第１項に記載の構造遺伝子であることを特徴とする発現ベクタ ー。 １１、発現コントロール配列かコリンンＥ１発現コントロール配列であることを 特徴とする第１０項に記載のプラスミド発現ベクター。 １２、構造遺伝モか第２項に記載の構造遺伝子であることを特徴とする第１０項 または第１１項に記載のプラスミド発現ベクター。 １３、誘導可能なプラスミド発現ベクターであって、ｔａ）　第２項に記載の構 造遺伝子と、（ｂｌ　第１０項に記載の線状組換えプラスミドとのライゲーショ ンによって生成されたものであることを特徴とするベクター。 １４　第１０項、第１１項、第１２項または第１３項のいずれかに記載のプラス ミド発現ベクターで形質転換された大腸菌またはその子孫。 １５、結合組織活性化ペプチド−■ま°たはその第２１位のメチオニンがロイシ ンで置換された突然変異タンパク質の製造方法であって、第１４項に記載の大腸 菌を培地中で増殖させ、該培地にＳＯＳ系活性化剤を加え、それによってペプチ ドの発現を誘導することを特徴とする方法。 １６、ＣＴＡＰ　ｌ［活性を有するタンパク質であって、該タンパク質が、ＣＴ ＡＰ−］ｌの第２１位のメチオニンが他のアミノ酸で置換されたヒトＣＴＡＰ− ＩＩＩの突然変異タンパク質であることを特徴とするタンパク質。 １７、メチオニンがロイシンで置換されていることを特徴とする第１６項に記載 のタンパク質。 １８、β−ＴＧ活性を有するタンパク質であって、β−ＴＧの第１７位のメチオ ニンが他のアミノ酸で置換されてなるヒトβ−ＴＧの突然変異タンパク質である ことを特徴とするタンパク質。 １９、メチオニンがロイシンで置換されていることを特徴とする第１８項に記載 のタンパク質。 ２０、第１６項に記載のタンパク質をトリプシンまたはプラスミンで処理するこ とを特徴とする第１８項に記載のタンパク質の製造方法。 ２１ （ａｌ　有用なポリペプチドであって、該有用なポリペプチド内には存在しない 特異的な開裂部位を特定するアミノ酸残基と結合した該ポリペプチドと、（ｂ） 　コリシンの細胞毒性は失なわれているがコリシンの帯電特性は保持しているフ ラグメント、とを含有することを特徴とする融合タンパク質。 ２２、該アミノ酸残基がメチオニンであり、有用なポリペプチドか、ＣＴＡＰ− ■の第２１位のメチオニンが他のアミノ酸で置換されたＣＴＡＰ−］［の突然変 異タンパク質であることを特徴とする第２１項に記載の融合タンパク質。 ２３、ＣＴＡＰ−■の第２１位のメチオニンがロイノンで置換されていることを 特徴とする第２２項に記載の融合タンパク質。 ２４、有用なヘテロローガスポリペプチドを微生物学的に製造する方法であって 、 （２Ｌ）第２１項に記載の融合タンパク質の形で有用なポリペプチドを生産する 細菌性形質転換体を増殖させ、（ｂ）　形質転換体を破壊し、 （Ｃ）　この破壊産物をｐＨ約　９〜１０，５において同相のカチオン交換媒質 と接触させ、 （ｄ）　固相カチオン交換媒質に結合しなかった破壊物を分離し、 ＋ｅｉ　カチオン交換媒質から融合タンパク質を溶離し、げ）融合タンパク質を その開裂部位において開裂させ、 （ｇ）　（ｆｌにおける開裂産物から有用なヘテロローガスタンパク質を回収す る、 ことからなる方法。 ２５、　’　ＣＴＡＰ−］［の生生活性を有するタンパク質であって、インビボ においてＣＴＡＰ−１［よりもβ−トロンボグロブリンへの変換を受け難いＣＴ ＡＰ−■の突然変異タンパク質であることを特徴とするタンパク質。 ２６、突然変異タンパク質が、ＣＴＡＰ−■のアミノ末端に無極性のポリペプチ ドフラグメントが融合し、該末端のアルファーヘワックス構造を保持しているＣ ＴＡＰ−１［からなることを特徴とする第２５項に記載のタンパク質。 ２７　フラグメントが、配列： （ｍｅｔ　）、　−ｇｌｕ　−ｔｈｒ　−１ｅｕ　−ｍｅｔ　−（式中、ｎはＯ または１を表わす） で示されるポリペプチドであることを特徴とする第２６項に記載のタンパク質。 ２８　突然変異タンパク質が、ＣＴＡＰ−■のアミノ末端近くのトリプシン感受 性部位を構成している１もしくはそれ以上のアミノ酸が削除され、または別のア ミノ酸で置換されたものである第２５項に記載のタンパク質。 ２９、そのアミノ酸配列中に、タンパク質の有用性にとって本質的なものではな いメチオニンを少くとも１個含有する、有用なタンパク質の突然変異タンパク質 てあって、該メチオニンか池のアミノ酸で置換されていることを特徴とする突然 変異タンパク質。 ３０、結合組織の再生のための組成物であって、治療」二有効な量の第１６．１ ７．２５．２６．２７または２８項に記載のタンパク質と薬学的に許容し得る担 体とを混合してなる組成物。