JPH0247966B2

JPH0247966B2 -

Info

Publication number: JPH0247966B2
Application number: JP59113234A
Authority: JP
Inventors: Gurigoriebichi Morozofu Buyachesurafu; Hatsukerebichi Habinson Buradeimiru
Original assignee: RENIN GOSU PEDAGOGICHESUKII INST IMENI EE AI GERUTSUENA
Current assignee: RENIN GOSU PEDAGOGICHESUKII INST IMENI EE AI GERUTSUENA
Priority date: 1985-07-02
Filing date: 1984-06-04
Publication date: 1990-10-23
Also published as: DE3421789A1; GB2177402A; DE3421789C2; JPS60258120A; FR2583982A1; FR2583982B1; GB8516697D0; CH659586A5

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野）本発明は胸腺製品の製造方法に関し、そしてこ
のものは、ヒトにおける撹乱された免疫過程の回
復、再生、造血、凝血、並びに炭水化物、脂肪及
び蛋白質代謝の正常化のために有用である。（従来技術）ヒト及び動物の胸腺組織の抽出物中に、生物の
成長及び発達、並びに幾つかの免疫過程及び代謝
過程に顕著な影響を与える生理的に活性な物質が
存在することが知られている（Comsa T.，
Amer.J.Med.Sci.250，79，1965；Goldstein A.
等、J.Immunol.，140，359，1970；ソ連発明者
証出願第459227号；米国特許第4120951号を参照
のこと）。文献から得られるデータに従えば、子牛の胸腺
からの抽出物〔チモシン（thymosin）〕は、ある
種の腫瘍性及び先天性免疫不全症の症例におい
て、ヒトの免疫系の機能の回復のための治療目的
で使用される〔Goldstein A.等、Transplant
Proc.7，１（Suppl.1），681，1975；及びサカイ
等、Cancer 36，３，97，３，1975〕。胸腺製品を患者に投与することにより、生物の
撹乱された免疫反応が回復する。現在まで、胸腺
組織から得られた生理的活性物質の治療効果、及
び医療の実際におけるその使用が検討されている
が、不十分である。 1000〜14000ドルトンの分子量を有するポリペ
プチドの複合体（約30の成分から成る）を含んで
成る（Hooper等、Ann.N.Y.Acad.Soi.，249，
125，1975）胸腺組織からの医薬製品、すなわち
チモシン（thymosin）（Goldstein A.等、Pro.
Nat.Acad.Sci.USA，69，７，1800，1972）が当
業界において知られている。チモシンの製造のた
めに次の方法が用いられる（Hooper等、1975）。子牛の胸腺を0.15MのNaCl溶液中でホモジナ
イズし、14000Gで遠心分離し、上清液を分離し、
そして80℃の温度で加熱し、生成した沈澱を去
し、残留溶液に５溶量のアセトンを加える。得ら
れた沈澱をフイルター上で乾燥し、次に再度溶解
し、そして硫酸アンモニウムを用いてまず25％飽
和で塩析し、次に50％飽和で塩析する。塩析操作
により得られた沈澱を過し、セフアデツクスＧ
−25のカラム中で脱塩し、そして凍結乾燥する。
精製のこの段階において標品中に含有されるポリ
ペプチドの得られた複合体は最も顕著な生物学的
活性、すなわち細胞免疫を刺激する能力を有する
（Hooper等、1975）。この標品をさらに精製すれば生物学的活性が低
下する。この方法により製造されたチモシンは、3.5〜
6.7の等電点及び1000〜14000ドルトンの分子量を
有し、そして実質的に支配的な量のアスパラギン
酸及びグルタミン酸を含む（合計量がチモシンの
50重量％に達する）酸性ポリペプチドの複合体を
含有する。しかしながら、チモシン製造のためのこの方法
はむしろ複雑であり、そして多段階的である（合
計10段階）点に注意すべきである。操作の数はこ
の方法を工業的に適用する場合の幾つかの困難性
（限外過、セフアデツクスパツキングの使用）
と関連する。この方法によつては高収量で医薬製
剤、すなわちチモシンを得ることができない。チ
モシンはまた、多くの患者において幾つかの副作
用及びアレルギー反応を生じさせる。チモシンの
療法的有効性及び医療の実際においてこれを適用
する可能性は十分に研究されていない。（発明が解決しようとする問題点）この発明は、アルカリ性ポリペプチドを含有
し、薬理学的作用の広いスペクトルを有し、他方
において副作用及び適用に対するアレルギー反応
が除去されている、胸腺に基礎を置く医薬製剤を
提供することを目的とする。この発明の他の目的は、免疫不全の症例におい
て高い臨床的効果を保証するアルカリ性ポリペプ
チドの分離を含んで成る、単簡な方法により高収
量を保証する、胸腺からの医薬製剤の製造方法を
提供することである。（問題点を解決するための手段）これらの目的は、600〜6000ドルトンの分子量
を有するポリペプチドを含んでなる胸腺製品であ
つて、その10〜20重量％が７〜９の等電点及び
2000〜4000ドルトンの分子量を有するポリペプチ
ドであり、さらに3.5〜6.7の等電点を有するポリ
ペプチドを含有することを特徴とする製品を提供
することにより達成される。この発明の胸腺製品の医療の実際における使用
により、生物の低下した免疫反応性を刺激し、修
復過程の活性及び造血活性を強化し、そして生物
における感染過程及び破壊過程の進行を防止する
ことが可能になり、これにより多くの病気のより
効果的な治療又はこれらの病気のヒトにおける行
進を防止することが可能となる。この発明の胸腺
製品を病院において使用することにより、慢性疾
患及び撹乱された再生過程を有する患者の治療期
間を短縮することが可能となるであろう。このこ
とは、医療におけるこの発明の使用の効果に関連
する決定的要因となるであろう。この発明の胸腺製品は、この中にアルカリ性ポ
リペプチドが存在するため、公知の胸腺を基礎に
した製品と異なり、損傷された組織の再生過程を
刺激し、このことは創傷、潰瘍の治瘉期間の短縮
において示され、又は造血の刺激において、末梢
血中の白血球、栓球及び赤血球の含量が減少して
いる症例におけるこれらの数の増加によつて示さ
れる。この発明の胸腺製品はなんらの副作用又はアレ
ルギー反応も惹起しないが、チモシンの投与によ
り20〜30％の患者においてアレルギー反応が生ず
ることが文献から知られている。この発明はまた、胸腺製品の製造方法に関し、
この方法は胸腺組織をホモジナイズし、得られた
ホモジネートを沈澱及び上清液に分離し、後者を
有機溶剤により処理し、そして次に目的生成物を
分離することを含んで成り、この場合に前記の分
離に先立つて、胸腺組織のホモジネートを塩化亜
鉛の存在下で１〜10％酢酸水溶液により、少なく
とも24時間抽出することを特徴とする。この発明の方法は単純な方法であることを特徴
とし、そして商業的規模において容易に再現す
る。この方法は、大形の蛋白質及び他の高分子化
合物の加水分解、並びに胸腺からの製品の高い精
製程度における十分に高い収得を可能にし、そし
てこの製品は、ヒトに導入した場合、副作用又は
アレルギー反応を惹起しない。触媒量の塩化亜鉛の存在下で酢酸を用いる幾分
長時間の抽出の使用はアルカリ性ポリペプチドの
回収に寄与し、このポリペプチドは、製品中に存
在する場合、拡大された範囲の薬理学的効果を保
証する。最大の生物活性を有し、７〜９の等電点及び
2000〜4000ドルトンの分子量を有するポリペプチ
ドの最大の回収を保証する観点から、抽出を、48
〜72時間にわたり、PH2.5〜４において、５℃〜
15℃の範囲の温度において、酢酸当り0.2〜２
ｇの量の塩化亜鉛の存在下で行うのが好ましい。生物学的活性物質すなわちアルカリ性ポリペプ
チドの十分な回収のため、及び出発材料の保存の
ために、胸腺を、ホモジナイズするのに先立つて
−30℃〜−50℃のの温度にて少なくとも100時間
保持するのが好ましい。発明者等は、胸腺からの製品の性質を、H⁺形
のカルボキシル陽イオン形「ビオカーブ
（Biocarb）上でのイオン交換クロマトグラフ法
（N.N.Kuznetsova等、High−molecular
Comp.，18a，２，235，1976を参照のこと）、ゲ
ル過（Figh等、T.Biol.Chem.244，4989，
1969）、紙上又はポリアクリルアミド中でのゾー
ン電気泳動（常法に従つて）、並びにアミノ酸分
析（スタイン及びアームの方法、T.Biol.
Chem.176、307、1948による）により検討した。
イオン交換クロマトグラフ法により、回収された
化合物がその電気化学的性質を異にする３つの画
分を特定の比率で含有することが見出された。この発明の胸腺製品に含有される画分の物理化
学的性質を下記の第１表に示す。画分、、及びは、ゾーン電気泳動法によ
り同定される多数の成分を含んで成る。各画分の
分子量はセフアデツクスＧ−25を用いるゲル過
法により測定した。

【表】上記の画分のペプチドのアミノ酸組成を決定す
るために、自動アミノ酸分析器“LKB−3201”
（スエーデン）を使用した。測定方法は
Spackman D.H.等、Anal.Chem.1958，30，1190
〜1206に記載されている通りとした。この発明の胸腺製品のアミノ酸組成を第２表に
示す。

【表】

【表】 600〜6000ドルトンの分子量を有するこの発明
の胸腺製品の生物学的活性及び広範囲の薬理学的
効果は、この中に７〜９の等電点及び2000〜4000
の分子量を有しそして塩基性アミノ酸成分、例え
ばリジンの存在により特徴付けられるポリペプチ
ドが10〜20重量％存在することを関連する。この
発明の胸腺製品は、その物理化学的性質及びアミ
ノ酸組成に関し、1000〜14000ドルトンの分子量
を有しそしてかなり支配的なグルタミン酸及びア
スパラギン酸（これらの合計が製品の50重量％に
及ぶ）を含有する（Hooper等、Ann.N.Y.Acad.
Sci.，249，125、1975）ポリペプチドの複合体
（等電点3.5〜6.7）から成るチモシンと異なる。この発明の胸腺製品は次のようにして製造され
る。血管、血液凝固物及び脂肪組織を除去して胸腺
を清浄にし、水で洗浄し、そしてホモジナイズす
る。出発物質の転換を確実にし、そして生物学的活
性物質、すなわち等電点3.5〜6.7及び７〜９を有
するポリペプチドの収量を増加するため、ホモジ
ナイズに先立つて胸腺組織を−50℃〜−30℃の範
囲の温度に保持し、又は−20℃〜−１℃の温度に
おいて有機溶剤、例えばアセトン、クロロホル
ム、又はエタノールで処理するのが好ましい。胸腺組織のホモジネートを塩化亜鉛の存在下で
１〜10％酢酸水溶液により少なくとも24時間抽出
する。このような条件下での抽出は、2000〜
4000Dt（ドルトン）の分子量及び７〜９の等電点
を有するポリペプチドの最も十分な回収に寄与
し、そして胸腺製品を患者に適用した場合にアレ
ルギー反応を生じさせる蛋白質及び高分子化合物
の除去を確実にする。抽出のための最適条件は、
PHが2.5〜４、温度が５℃〜15℃、所要時間が48
〜72時間、そして塩化亜鉛の濃度が酢酸当り
0.2〜２ｇである。抽出が完了した後、得られた基材を沈澱と上清
液とに分離し、上清液を有機溶剤、例えばアセト
ン、クロロホルム、エタノールで処理し、次に、
生成した沈澱を回収する。後者を粉状に乾燥す
る。この粉状物は生物学的活性物質、すなわちポ
リペプチドを含有する。この粉末を酢酸に溶解し、この溶液を過によ
り無菌化し、そして１mlの無菌フラスコに注入
し、このフラスコをゴム栓で密閉する。１個のフ
ラスコが胸腺から得られた物質10mgを含む。こうして得られたこの発明の胸腺製品は、生物
学的活性物質、すなわち相互の比率が等電点3.5
〜6.7のポリペプチド90〜80重量％、及び等電点
７〜９のポリペプチド10〜20重量％である、分子
量600〜6000Dtのポリペプチドを含有する。この発明の胸腺製品は白色粉末、又は黄味を帯
びた白色粉末であり、５％酢酸溶液及び水に可溶
性であり、そしてアルコールに実質上溶解しな
い。このものは蛋白質を実質上含有せず、そして
１％水溶液のPHは５〜5.8である。胸腺製品は、
乾燥した遮光場所において、20℃以下の温度にて
２年間貯蔵される。胸腺製品は骨及び軟組織の化膿性炎症疾患、慢
性の外傷性及び造血性骨髄炎、骨折、熱傷病変、
栄養性潰瘍、床ずれ、組織の放射壊化、閉塞性ア
テローム性動脈硬化症、慢性肺炎、胃及び十二指
腸潰瘍、並びにそれぞれ胸腺の機能低下、癌患者
における放射線療法及び化学療法後における免疫
及び造血の阻害と関連する症状の治療に用いるこ
とができる。この発明の胸腺製品はまた、感染性
併合症、多量の抗生物質を伴う放射線療法又は化
学療法の過程における、外傷後及び手術後の免疫
造血、再生過程の阻害の予防のために使用するこ
とができる。このものはまた、抗細菌性療法に対
する不耐性、又はこの療法による効果の欠除の場
合に、及び生物における炭水化物、脂肪及び蛋白
質代謝の機能的撹乱に対する正常化剤として使用
することができる。発明者等は、この発明の胸腺製品の簡単で安価
な製造方法を示唆した。この方法は商業的規模で
容易に実施することができ、高品位の製品を、例
えばチモシンの収量を５位以上の高い収量におい
て提供する。胸腺は一般に子ウシから得られる。しかしこれ
以外の若哺乳動物、例えばウマ、ブタ、ヒツジ、
クジラ等から得ることもできる。次に、この発明をさらに詳細に説明するため、
例を記載する。例１ 500ｇのウシ胸腺組織から血管、凝血、脂肪組
織を除去して清浄化し、次に水及びアセトンで洗
浄し、そしてこの後、胸腺に対して４：１の重量
比のアセトンに入れ−１℃において24時間保持
し、そしてホモジナイズする。得られた胸腺ホモ
ジネートを、３％酢酸水溶液中に１：６の重量比
で加える。酢酸当り１ｇの塩化亜鉛の存在下
で、PH3.2、10℃の温度にて72時間抽出を行う。
抽出が完了した後、基材を3000rpmにて20分間遠
心分離し、上清液を分離し、そして１：５の重量
比でアセトンを加える。生成した沈澱を過によ
り回収し、そしてアセトンで洗浄し、フイルター
上で乾燥する。得られた５ｇの白色粉末は生物学
的活性物質、すなわち600〜6000Dtの分子量を有
し、そして3.5〜6.7の等電点を有するポリペプチ
ド80重量％及び７〜９の等電点を有するポリペプ
チド20重量％から成るポリペプチドを含有してい
た。こうして胸腺から得られた製品は５％酢酸及び
水に可溶性の白色粉末であり、１％水溶液のPHは
5.5である。この発明に従つて胸腺製品の医薬を製造するた
めに、上記のようにして製造した粉末を500mlの
１％酢酸に溶解する。この製品の溶液を過によ
り無菌化し、そして１mlの無菌フラスコに注入
し、凍結乾燥し、そしてゴム栓で密閉する。結果
として、１本のフラスコは胸腺から得られた10mg
の物質を含有する。例２ 500ｇのウシ胸腺を、血管、凝血、脂肪組織を
除去することにより清浄にし、水及びクロロホル
ムで洗浄し、そして胸腺組織に対して８：１の重
量比でクロロホルムに入れ、−10℃の温度にて48
時間保持し、次にホモジナイズする。胸腺組織の得られたホモジネートを、１％酢酸
水溶液に、１：10の重量比で加える。酢酸当り
２ｇの塩化亜鉛の存在下で、PH４、15℃の温度に
て48時間抽出を行う。抽出が完了した後、基材を
24時間過し、上澄液を分離し、クロロホルムを
１：８の重量比で加える。生成した沈澱を過に
より回収し、そしてクロロホルムで洗浄し、次に
フイルター上で乾燥する。こうして得られた３ｇ
の白色粉末は、生物学的活性物質、すなわち600
〜6000Dtの分子量を有し、そして3.5〜6.7の等電
点を有するポリペプチド90重量％及び７〜９の等
電点を有するポリペプチド10重量％から成るポリ
ペプチドを含有する。得られた胸腺組織の製品は５％酢酸及び水に可
溶性の白色粉末であり、１％水溶液のPHは5.8で
ある。この製品の溶液を過により除菌し、そして１
mlの無菌フラスコに注入し、次に凍結乾燥し、そ
してゴム栓で密閉する。結果として、１本のフラ
スコは胸腺から得た物質10mgを含有する。例３ 500ｇのウシ胸腺組織を、血管、凝血、脂肪組
織を除去することによつて清浄にし、水で洗浄
し、そしてホモジナイズする。胸腺の得られたホ
モジネートを10％酢酸水溶液に、１：４の重量比
で入れる。酢酸当り0.2ｇの塩化亜鉛の存在下
で、PH2.5、５℃の温度において、24時間抽出を
行う。抽出が完了した後、基材を5000rpmにて10
分間遠心分離し、上清液を分離し、そしてこれに
エタノールを１：10の重量比で加える。生成した
沈澱を過により分離し、そしてエタノールで洗
浄し、次にフイルター上で乾燥する。こうして得
られた４ｇの白色粉末は、生物学的に活性な物
質、すなわち600〜66000Dtの分子量を有し、そ
して3.5〜6.7の等電点を有するポリペプチド87重
量％及び７〜９の等電点を有するポリペプチド13
重量％から成るポリペプチドを含有する。こうして得られた胸腺製品は５％酢酸に可溶性
の白色粉末であり、そして１％水溶液のPHは5.3
である。この胸腺製品の医薬を製造するために、粉末を
400mlの３％酢酸に溶解する。この溶液を過に
より無菌化し、そして１mlの無菌フラスコに注込
し、次に凍結乾燥し、そしてゴム栓で密封する。
結果として、１本のフラスコは胸腺から得られた
物質100mgを含有する。例４ 500ｇのウシ胸腺組織を、血管、凝血、脂肪組
織を除去することによつて清浄化し、水で洗浄
し、−30℃にて200時間保持し、この後ホモジナイ
ズする。胸腺の得られたホモジネートを１：５の
重量比において５％酢酸水溶液に入れる。酢酸
当り0.5ｇの塩化亜鉛の存在下で、PH４、12℃の
温度にて56時間抽出を行う。抽出が完了した後、
基質を4000rpmにて20分間遠心分離し、上澄液を
分離し、そしてこれに１：６の重量比でアセトン
を加える。生成した沈澱を遠心分離し、そしてア
セトンで洗浄し、フイルター上で乾燥する。5.5
ｇの得られた黄味を帯びた白色粉末は、生物学的
活性物質、すなわち600〜6000の分子量を有し、
3.5〜6.7の等電点を有するポリペプチド82重量％
及び７〜９の等電点を有するポリペプチド18重量
％から成るポリペプチドを含有する。胸腺から製造されたこの製品は黄色を帯びた白
色粉末であり、５％酢酸に可溶性であり、１％水
溶液のPHは5.2である。胸腺製品の医薬を製造するために、得られた粉
末を550mlの４％酢酸に溶解する。この製品の溶
液を過により無菌化し、そして１mlの無菌フラ
スコに注入し、そして凍結乾燥し、そしてゴム栓
で密閉する。結果として、１本のフラスコは胸腺
から得られた物質10mgを含有する。例５ 500ｇのウシ胸腺組織を、血管、凝血、脂肪組
織を除去することにより清浄にし、水で洗浄し、
−50℃にて100時間保持し、この後ホモジナイズ
する。胸腺の得られたホモジネートを１：７の重
量比で、２％酢酸水溶液に入れる。酢酸当り
1.5ｇの塩化亜鉛の存在下で、PH3.0、８℃の温度
において、60時間抽出を行う。抽出が完了した
後、基質を6000rpmにて10分間遠心分離し、上澄
液を分離し、そしてこれに１：10の重量比でエタ
ノールを加える。生成した残渣を過により回収
し、そしてエタノールで洗浄し、そしてフイルタ
ー上で乾燥する。得られた5.5ｇの白色粉末は、
生物学的活性物質、すなわち600〜6000Dtの分子
量を有し、そして3.5〜6.7の等電点を有するポリ
ペプチド80重量％及び７〜９の等電点を有するポ
リペプチド20重量％から成るポリペプチドを含有
する。得られた白色粉末は５％酢酸、及び水に可溶性
であり、１％水溶液のPHは5.4である。胸腺製品の医薬を製造するために、上記のよう
にして製造した粉末を570mlの２％酢酸に溶解す
る。この製品の溶液を過によつて無菌化し、そ
して１mlの無菌フラスコに注入し、次に凍結乾燥
し、そしてゴム栓で密封する。結果として、１本
のフラスコは胸腺からの物質10mgを含有する。

Claims

【特許請求の範囲】１ 600〜6000ドルトンの分子量を有するポリペ
プチドを含んで成る胸腺製品であつてその10〜20
重量％が７〜９の等電点及び2000〜4000ドルトン
の分子量を有するポリペプチドであり、さらに
3.5〜6.7の等電点を有するポリペプチドを含有す
る製品の製造に当り、胸腺組織をホモジナイズ
し、得られたホモジネートを沈澱と上清液に分離
し、これを有機溶剤で処理し、次に目的生成物を
分離することを含んで成る方法において、分離に
先立つて胸腺組織ホモジネートを、塩化亜鉛の存
在下酢酸の１〜10％水溶液により少なくとも24時
間にわたり抽出することを特徴とする方法。２前記の抽出を48〜72時間行うことを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の方法。３抽出のために塩化亜鉛を酢酸当り0.2〜2g
の量で使用することを特徴とする特許請求の範囲
第１項又は第２項に記載の方法。４抽出をPH2.5〜４、５℃〜15℃の温度におい
て行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項〜
第３項のいずれか１項に記載の方法。