JPH0248231B2 - Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho - Google Patents
ShinkikishiranaazeoyobisonoseizohoInfo
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- JPH0248231B2 JPH0248231B2 JP16600883A JP16600883A JPH0248231B2 JP H0248231 B2 JPH0248231 B2 JP H0248231B2 JP 16600883 A JP16600883 A JP 16600883A JP 16600883 A JP16600883 A JP 16600883A JP H0248231 B2 JPH0248231 B2 JP H0248231B2
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- Japan
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- culture
- bacterial species
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Description
本発明は新規キシラナーゼＷおよびその製造
法に関し、更に詳更にはバチルス（Bacillus）属
に属する新規キシラナーゼＷ生産菌を培養し、
該培養物より新規キシラナーゼＷを分離、採取
することを特徴とする新規キシラナーゼＷの製
造法に関するものである。 キシラナーゼは主としてβ―１，４結合キシロ
ースから成る多糖キシランを加水分解してその構
成成分であるキシロースや低分子のキシロオリゴ
糖を生成する作用を有する酵素で、動植物中に広
く存在している。微生物にもキシラナーゼを生成
するものがあり、これまでに酵母、カビ、細菌、
放線菌などの酵素について研究されてきた。一
方、近年、バイオマスの利用するキシラナーゼの
有用性が注目されている。即ち、キシランは木材
やイネ科植物などに存在し、その含有量もセルロ
ースに次いで多く、また加水分解生成物のキシロ
ースは食品、医薬品の原料などに広い用途があ
る。このような目的に使用しうる酵素は安価な原
料から大量に生産され、かつ酸、アルカリや熱に
対して安定であることが望まれる。しかしながら
現在までこれらの条件を全て満たすキシラナーゼ
は見出されていない。 本発明者らはこれらの条件に適合する性質を有
する酵素キシラナーゼを生産する方法について鋭
意研究の結果、バチルス属に属する新規微生物
が、従来知られていない特徴的な理化学的性質を
有する新規キシラナーゼを生産することの知見を
得、本発明を完成するに至つた。 本発明はバチルス（Bacillus）属に属し、PH８
―11の強アルカリ性培地で45゜―55℃の高温度に
おいて生育しうる好アルカリ性好熱性細菌を培養
し、培養物より安定PH範囲が4.5―10.0、安定温
度範囲が最高60℃の耐アルカリ性耐熱性キシラナ
ーゼを採取する方法に関するものである。該キシ
ラナーゼ製造法において使用する細菌種は、PH８
―11の強アルカリ性培地にのみ生育でき、特にPH
９―10において最大の生育量と酵素生産を示し、
かつ温度は最高55℃まで生育でき、特に45゜―50
℃において最大の生育量と酵素生産を示す両性質
を併せもつ好アルカリ性好熱性の、新たに分離同
定されたバチルス（Bacillus）属細菌である。さ
らに、該細菌を用いて該酵素を生産する際の培地
としては、炭素源として小麦〓のみ約４％を含有
する強アルカリ性培地を用いることができる。従
来、本発明のごとくバチルス属の好アルカリ性好
熱性細菌を用いて強アルカリ性培地にて高温度に
て培養する方法は全く知られていない。このよう
な培養条件下では、菌体生育が極めて速く、培養
時間を短縮でき、また雑菌汚染が防止されるので
培養管理上も有利である。 以下、本発明について詳述する。 まず本発明において用いる微生物は、キシラナ
ーゼＷの生産能を有するバチルス（Bacillus）
属に属する菌種であり、その一例として、バチル
ス・エスピー（Bacillus sp.）No.W1およびNo.W3
（以下単にそれぞれW1およびW3という）と呼称
される微生物が挙げられる。 以下これらの微生物につき詳述する。 (1) 好アルカリ性好熱性細菌W1およびW3の分離
方法 本発明方法に用いられる上記２菌種は、以下
の方法により分離された。 まず、日本国内各地より採取した土壌試料か
ら、第１表に示す組成のアルカリ性基本培地に
塞天15.0〔ｇ／〕およびキシラン10.0〔ｇ／
〕または小麦〓40.0〔ｇ／〕を加えた固形
培地を用いて、55℃の恒温器内にて２―３日間
培養して出現した細菌コロニーを分離する。次
に、分離した細菌を、第１表に示した基本培地
にキシラン10.0〔ｇ／〕を加えた液体培地を
用いて47℃の恒温振とう機にて２日間培養し、
その培養物について下記の方法によりキシラナ
ーゼ活性を測定し、その活性の強力なものに選
択した。標記の２細菌はこのような方法により
分離し、そして純化したものである。 第１表 基本培地組成 組 成 ｇ／ 酵母エキス 5.0 ポリペプトン 5.0 K2HPO4 1.0 MgSO4・7H2O 0.2 PH 10.0 （Na2CO3にて調節） キシラナーゼ活性は、基質として0.5％キシ
ランをPH8.0のマツキルベン緩衝液（0.1Mクエ
ン酸―0.2Mリン酸二ナトリウム）に懸濁し、
超音波にて均一に分散したもの0.5mlに、培養
濾過液の希釈したもの0.05mlを加え、60℃にて
10分間反応させ、生成した還元糖を３，５―ジ
ニトロサリチル酸試薬法により定量し、１分間
に1μmolのキシロースを生成する酵素量を１単
位（Ｕ）とした。 このようにして分離、選択、純化された細菌
W1、W3の２種類は後述のようにバチルス
（Bacillus）属細菌と同定され、昭和58年９月
７日付工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託
された。その微生物寄託番号は、W1が第7220
号、W3が第7222号である。 (2) W1およびW3の菌学的性質 菌学的性質は２菌種ともPH10のアルカリ性培
地に47℃で生育させ、“Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology”（1974）および
“The Genus Bacillus”（1973）に記載の方法
に基づいておこなつた。 〔a〕 形 態 菌形は２菌種とも桿状で、大きさ（0.3〜
0.5）×（2.0〜5.0）μm、単一または連鎖状を
なす。細胞はグラム陽性、非抗酸性、運動性
があり、楕円形の胞子を形成する。 〔b〕 培地における生育状態 イ） 肉汁寒天平板培養：２菌種とも集落は
円形で扁平状ないし凸円状に隆起し、周辺
は全縁、表面は滑らから半透明である。 ロ） 内汁寒天斜面培養：２菌種とも生育は
良好で糸状ないし疣状に生育する。表面は
平滑で、半透明である。いずれも培地に色
素を生産しない。 ハ） 肉汁液体培地：２菌種とも菌生育にと
もないいくぶん混濁を呈し、粘調性のある
軟らかい沈滓を生ずる。菌環は形成しな
い。 ニ） 肉汁ゼラチン培養：２菌種ともゼラチ
ンを液化する。 ホ） リトマスミルク：ミルクをペプトン化
する。 〔C〕 生理学的性質 イ） 硝酸塩の還元 ：２菌種とも 陽性 ロ） 脱窒反応 ：２菌種とも 陰性 ハ） VPテスト ：２菌種とも 陽性 ニ） インドールの生成 ：２菌種とも 陰性 ホ） 硫化水素の生成 ：２菌種とも 陰性 ヘ） でん粉の加水分解 ：２菌種とも 陰性 ト） カゼインの加水分解
：２菌種とも 陽性 チ） 無機窒素の利用：２菌種とも アンモ
ニウム塩、硝酸塩を利用できる。 リ） 色素の産生 ：２菌種とも 陰性 ヌ） ウレアーゼ ：２菌種とも 陰性 ル） オキシダーゼ ：２菌種とも 陽性 オ） カタラーゼ ：２菌種とも 陽性 ワ） 酸素に対する態度
：２菌種とも 好気性 カ） くえん酸の利用：Simmon's培地およ
びChristensen's培地に生育するがKoser's
培地に生育しない。但し、W1のみ
Simmon’ｓ培地に生育しない。 ヨ） Ｏ―Ｆテスト
：好気的および嫌気的に酸を生成 タ） 耐塩性 ：NaCl10％で生育する。 レ） 生育範囲（PHおよび温度）：PH８―
11；最適PH９―10。温度28―55℃；最適温
度45―50℃。 ソ） 炭素源の利用：２菌種とも Ｄ―グル
コース、Ｄ―マンノース、Ｄ―フラクトー
ス、シユクロースおよびトレハロースより
好気的および嫌気的に酸を生成する。しか
し、ガスの発生はない。 ツ） 核酸（DNA）塩基組成：DNAのGC
含有量〔mol％〕は、W1、42.2％；W3、
42.9％。 以上の菌学的性質をもとに、前記文献中に２
菌種W1、W3を検索したところバチルス
（Bacillus）属に属することが明らかとなつた
が、いずれの菌種も、PH８―11のアルカリ性域
においてのみ生育できる点において公知の菌種
とは明らかに異なり、また後述のように45℃以
上の高温においてキシラナーゼ産生が最大とな
る点において文献記載の好アルカリ性バチルス
（Bacillus）属細菌とも異なり、区別される。
よつて、２菌種とも公知の菌種とは一致せず、
これらをバチルス（Bacillus）属の新菌種とし
て設定するのが適当であるとの結論に達した。 (3) キシラナーゼの製造方法 〔a〕 酵素生産に対するPHの影響 ２菌種W1、W3は、すでに述べたようにPH
８―11において生育できる。そこで、第１表
に示した基本培地にキシラン10.0〔ｇ／〕
を加えた液体培地を調製し、そのPHを７から
11までに調整したものを用いて培養し、キシ
ラナーゼの生産量を調べた。その結果を第２
表に示す。
法に関し、更に詳更にはバチルス（Bacillus）属
に属する新規キシラナーゼＷ生産菌を培養し、
該培養物より新規キシラナーゼＷを分離、採取
することを特徴とする新規キシラナーゼＷの製
造法に関するものである。 キシラナーゼは主としてβ―１，４結合キシロ
ースから成る多糖キシランを加水分解してその構
成成分であるキシロースや低分子のキシロオリゴ
糖を生成する作用を有する酵素で、動植物中に広
く存在している。微生物にもキシラナーゼを生成
するものがあり、これまでに酵母、カビ、細菌、
放線菌などの酵素について研究されてきた。一
方、近年、バイオマスの利用するキシラナーゼの
有用性が注目されている。即ち、キシランは木材
やイネ科植物などに存在し、その含有量もセルロ
ースに次いで多く、また加水分解生成物のキシロ
ースは食品、医薬品の原料などに広い用途があ
る。このような目的に使用しうる酵素は安価な原
料から大量に生産され、かつ酸、アルカリや熱に
対して安定であることが望まれる。しかしながら
現在までこれらの条件を全て満たすキシラナーゼ
は見出されていない。 本発明者らはこれらの条件に適合する性質を有
する酵素キシラナーゼを生産する方法について鋭
意研究の結果、バチルス属に属する新規微生物
が、従来知られていない特徴的な理化学的性質を
有する新規キシラナーゼを生産することの知見を
得、本発明を完成するに至つた。 本発明はバチルス（Bacillus）属に属し、PH８
―11の強アルカリ性培地で45゜―55℃の高温度に
おいて生育しうる好アルカリ性好熱性細菌を培養
し、培養物より安定PH範囲が4.5―10.0、安定温
度範囲が最高60℃の耐アルカリ性耐熱性キシラナ
ーゼを採取する方法に関するものである。該キシ
ラナーゼ製造法において使用する細菌種は、PH８
―11の強アルカリ性培地にのみ生育でき、特にPH
９―10において最大の生育量と酵素生産を示し、
かつ温度は最高55℃まで生育でき、特に45゜―50
℃において最大の生育量と酵素生産を示す両性質
を併せもつ好アルカリ性好熱性の、新たに分離同
定されたバチルス（Bacillus）属細菌である。さ
らに、該細菌を用いて該酵素を生産する際の培地
としては、炭素源として小麦〓のみ約４％を含有
する強アルカリ性培地を用いることができる。従
来、本発明のごとくバチルス属の好アルカリ性好
熱性細菌を用いて強アルカリ性培地にて高温度に
て培養する方法は全く知られていない。このよう
な培養条件下では、菌体生育が極めて速く、培養
時間を短縮でき、また雑菌汚染が防止されるので
培養管理上も有利である。 以下、本発明について詳述する。 まず本発明において用いる微生物は、キシラナ
ーゼＷの生産能を有するバチルス（Bacillus）
属に属する菌種であり、その一例として、バチル
ス・エスピー（Bacillus sp.）No.W1およびNo.W3
（以下単にそれぞれW1およびW3という）と呼称
される微生物が挙げられる。 以下これらの微生物につき詳述する。 (1) 好アルカリ性好熱性細菌W1およびW3の分離
方法 本発明方法に用いられる上記２菌種は、以下
の方法により分離された。 まず、日本国内各地より採取した土壌試料か
ら、第１表に示す組成のアルカリ性基本培地に
塞天15.0〔ｇ／〕およびキシラン10.0〔ｇ／
〕または小麦〓40.0〔ｇ／〕を加えた固形
培地を用いて、55℃の恒温器内にて２―３日間
培養して出現した細菌コロニーを分離する。次
に、分離した細菌を、第１表に示した基本培地
にキシラン10.0〔ｇ／〕を加えた液体培地を
用いて47℃の恒温振とう機にて２日間培養し、
その培養物について下記の方法によりキシラナ
ーゼ活性を測定し、その活性の強力なものに選
択した。標記の２細菌はこのような方法により
分離し、そして純化したものである。 第１表 基本培地組成 組 成 ｇ／ 酵母エキス 5.0 ポリペプトン 5.0 K2HPO4 1.0 MgSO4・7H2O 0.2 PH 10.0 （Na2CO3にて調節） キシラナーゼ活性は、基質として0.5％キシ
ランをPH8.0のマツキルベン緩衝液（0.1Mクエ
ン酸―0.2Mリン酸二ナトリウム）に懸濁し、
超音波にて均一に分散したもの0.5mlに、培養
濾過液の希釈したもの0.05mlを加え、60℃にて
10分間反応させ、生成した還元糖を３，５―ジ
ニトロサリチル酸試薬法により定量し、１分間
に1μmolのキシロースを生成する酵素量を１単
位（Ｕ）とした。 このようにして分離、選択、純化された細菌
W1、W3の２種類は後述のようにバチルス
（Bacillus）属細菌と同定され、昭和58年９月
７日付工業技術院微生物工業技術研究所へ寄託
された。その微生物寄託番号は、W1が第7220
号、W3が第7222号である。 (2) W1およびW3の菌学的性質 菌学的性質は２菌種ともPH10のアルカリ性培
地に47℃で生育させ、“Bergey's Manual of
Determinative Bacteriology”（1974）および
“The Genus Bacillus”（1973）に記載の方法
に基づいておこなつた。 〔a〕 形 態 菌形は２菌種とも桿状で、大きさ（0.3〜
0.5）×（2.0〜5.0）μm、単一または連鎖状を
なす。細胞はグラム陽性、非抗酸性、運動性
があり、楕円形の胞子を形成する。 〔b〕 培地における生育状態 イ） 肉汁寒天平板培養：２菌種とも集落は
円形で扁平状ないし凸円状に隆起し、周辺
は全縁、表面は滑らから半透明である。 ロ） 内汁寒天斜面培養：２菌種とも生育は
良好で糸状ないし疣状に生育する。表面は
平滑で、半透明である。いずれも培地に色
素を生産しない。 ハ） 肉汁液体培地：２菌種とも菌生育にと
もないいくぶん混濁を呈し、粘調性のある
軟らかい沈滓を生ずる。菌環は形成しな
い。 ニ） 肉汁ゼラチン培養：２菌種ともゼラチ
ンを液化する。 ホ） リトマスミルク：ミルクをペプトン化
する。 〔C〕 生理学的性質 イ） 硝酸塩の還元 ：２菌種とも 陽性 ロ） 脱窒反応 ：２菌種とも 陰性 ハ） VPテスト ：２菌種とも 陽性 ニ） インドールの生成 ：２菌種とも 陰性 ホ） 硫化水素の生成 ：２菌種とも 陰性 ヘ） でん粉の加水分解 ：２菌種とも 陰性 ト） カゼインの加水分解
：２菌種とも 陽性 チ） 無機窒素の利用：２菌種とも アンモ
ニウム塩、硝酸塩を利用できる。 リ） 色素の産生 ：２菌種とも 陰性 ヌ） ウレアーゼ ：２菌種とも 陰性 ル） オキシダーゼ ：２菌種とも 陽性 オ） カタラーゼ ：２菌種とも 陽性 ワ） 酸素に対する態度
：２菌種とも 好気性 カ） くえん酸の利用：Simmon's培地およ
びChristensen's培地に生育するがKoser's
培地に生育しない。但し、W1のみ
Simmon’ｓ培地に生育しない。 ヨ） Ｏ―Ｆテスト
：好気的および嫌気的に酸を生成 タ） 耐塩性 ：NaCl10％で生育する。 レ） 生育範囲（PHおよび温度）：PH８―
11；最適PH９―10。温度28―55℃；最適温
度45―50℃。 ソ） 炭素源の利用：２菌種とも Ｄ―グル
コース、Ｄ―マンノース、Ｄ―フラクトー
ス、シユクロースおよびトレハロースより
好気的および嫌気的に酸を生成する。しか
し、ガスの発生はない。 ツ） 核酸（DNA）塩基組成：DNAのGC
含有量〔mol％〕は、W1、42.2％；W3、
42.9％。 以上の菌学的性質をもとに、前記文献中に２
菌種W1、W3を検索したところバチルス
（Bacillus）属に属することが明らかとなつた
が、いずれの菌種も、PH８―11のアルカリ性域
においてのみ生育できる点において公知の菌種
とは明らかに異なり、また後述のように45℃以
上の高温においてキシラナーゼ産生が最大とな
る点において文献記載の好アルカリ性バチルス
（Bacillus）属細菌とも異なり、区別される。
よつて、２菌種とも公知の菌種とは一致せず、
これらをバチルス（Bacillus）属の新菌種とし
て設定するのが適当であるとの結論に達した。 (3) キシラナーゼの製造方法 〔a〕 酵素生産に対するPHの影響 ２菌種W1、W3は、すでに述べたようにPH
８―11において生育できる。そこで、第１表
に示した基本培地にキシラン10.0〔ｇ／〕
を加えた液体培地を調製し、そのPHを７から
11までに調整したものを用いて培養し、キシ
ラナーゼの生産量を調べた。その結果を第２
表に示す。
【表】
なお、培養はPH７―11の各培地10mlを試験
管に分注し、２菌種をそれぞれ接種して45℃
にて47時間振とうした。培養物から遠心分離
機により菌体を除去して得た上澄液について
は酵素活性を測定した。酵素活性の測定法は
前記の通りであるが、ここではPH8.0に代り
PH6.0のマツキルベン緩衝液を使用した（以
後の検討においても同様である）。第２表に
示したように２菌種ともPH乃至10において酵
素産生は最大となる。このように２菌種を用
いてキシラナーゼを生産するには、培地の初
発PHを８乃至10に調製すれば良いことが明ら
かにされた。 〔b〕 酵素生産に対する温度の影響 次に酵素生産に及ぼす温度の影響について
述べる。前項〔ａ〕の液体培地をPH10に調製
したものを試験管に分注し、温度30―51℃に
て47時間振とう培養してキシラナーゼ生産を
比較した。この結果を第３表に示す。なお、
酵素活性の測定法は前項〔ａ〕に記した通り
である。
管に分注し、２菌種をそれぞれ接種して45℃
にて47時間振とうした。培養物から遠心分離
機により菌体を除去して得た上澄液について
は酵素活性を測定した。酵素活性の測定法は
前記の通りであるが、ここではPH8.0に代り
PH6.0のマツキルベン緩衝液を使用した（以
後の検討においても同様である）。第２表に
示したように２菌種ともPH乃至10において酵
素産生は最大となる。このように２菌種を用
いてキシラナーゼを生産するには、培地の初
発PHを８乃至10に調製すれば良いことが明ら
かにされた。 〔b〕 酵素生産に対する温度の影響 次に酵素生産に及ぼす温度の影響について
述べる。前項〔ａ〕の液体培地をPH10に調製
したものを試験管に分注し、温度30―51℃に
て47時間振とう培養してキシラナーゼ生産を
比較した。この結果を第３表に示す。なお、
酵素活性の測定法は前項〔ａ〕に記した通り
である。
【表】
【表】
第３表から明らかなように、２菌種とも温
度42゜乃至48℃において培養したとき酵素産
生は最大となる。このように２菌種によるキ
シラナーゼ生産には培養温度を42゜乃至48℃
に設定すれば良いことが明らかにされた。 以上、〔ａ〕および〔ｂ〕の結果より、新
菌種バチルス・エスピー（Bacillus sp.）No.
W1、No.W3によるキシラナーゼ生産の最適培
養条件は、PH８乃至10、温度42゜乃至48℃に
あることが判明した。 〔c〕 培地の炭素源の影響 酵素生産に対する培地の炭素源の影響につ
いて述べる。第１表に示した基本培地に各種
の炭素源（糖類および小麦〓）を加えて培養
し、培養物の酵素活性を測定した結果を第４
表に示す。なお、培養条件は前項までの結果
より、培地をPH10に調製し、培養温度を45℃
に設定した試験管を用いて47時間振とう培養
した。
度42゜乃至48℃において培養したとき酵素産
生は最大となる。このように２菌種によるキ
シラナーゼ生産には培養温度を42゜乃至48℃
に設定すれば良いことが明らかにされた。 以上、〔ａ〕および〔ｂ〕の結果より、新
菌種バチルス・エスピー（Bacillus sp.）No.
W1、No.W3によるキシラナーゼ生産の最適培
養条件は、PH８乃至10、温度42゜乃至48℃に
あることが判明した。 〔c〕 培地の炭素源の影響 酵素生産に対する培地の炭素源の影響につ
いて述べる。第１表に示した基本培地に各種
の炭素源（糖類および小麦〓）を加えて培養
し、培養物の酵素活性を測定した結果を第４
表に示す。なお、培養条件は前項までの結果
より、培地をPH10に調製し、培養温度を45℃
に設定した試験管を用いて47時間振とう培養
した。
【表】
小麦〓 10 18 36
40 38 43
（＊）小麦〓／水 40 3 5
第４表から明らかなように２菌種とも培地
の炭素源にキシラン1.0％を用いたき顕著な
酵素生産を示し、またグルコースが炭素源の
ときは酵素生産はほとんどない。さらに小麦
〓４％を添加した場合、キシランまたはキシ
ロースを添加した場合と同等ないしそれ以上
の酵素生産が認められ、安価な炭素源として
小麦〓が有効に用いられることが明らかにさ
れた。なお、第４表の最下段（＊印を附し
た）に示した結果は、第１表に示した基本培
地の代りに水を用いて小麦〓４％を添加した
だけの培地を用いて同様の培養条件で培養し
た場合の酵素生産を示したものである。即
ち、 培地組成：小麦〓 40ｇ 水 1000ml PH 10 培養条件：45℃にて47時間振とう培養。 以上の検討の結果より、耐アルカリ性耐熱性
キシラナーゼ生産に用いる最も効果的な培地組
成とPHおよび培養温度は次の通り設定される。 培地組成：炭素源キシラン 10.0〔ｇ〕 （または小麦〓 40.0） 酵母エキス 5.0 ポリペプトン 5.0 K2HPO4 1.0 MgSO4・7H2O 0.2 水 1000ml 培地のPH：10.0（Na2CO3により調整） 培養温度：45℃ 培養方法：振とう培養または通気攪拌培養 (4) 酵素の精製方法と性質 前項までに述べた方法により得られた培養物
から酵素を分離精製する方法および酵素の性質
について説明する。 培養物から菌体を除去し、その清澄液に硫酸
アンモニウムを加えて酵素を沈澱せしめ、これ
を脱水乾燥して粗酵素粉末を得る。粗酵素粉末
をPH7.2の0.05Mトリス塩酸緩衝液に溶解して
DEAE―セルロースによりキシラナーゼ画分を
分離し、次にセフアデツクスＧ―100により濾
過して精製する。この精製酵素を濃縮し、凍結
乾燥すると目的の酵素キシラナーゼＷを得
る。かくしてW1およびW3の２菌種から得られ
た本発明の２種のキシラナーゼ、それぞれW1
およびW3は次のような理化学的性質を有する。 作用および基質特異性 キシラナーゼおよキシロオリゴ糖に特異的
に作用し、そのβ―１，４―キシロシド結合
を切断して、キシロースおよびキシロビオー
スを生成する。 至適PHおよび安定PH範囲 至適PHはPH6.0（第１図参照）、安定PH範囲
はPH4.5〜10.0（45℃、60分処理の場合、第３
図参照）にある。 力価の測定法 基質として0.5％キシランをPH8.0のマツキ
ルベン緩衝液（0.1Mクエン酸―0.2Mリン酸
二ナトリウム）に懸濁し、超音波により均一
に分散したもの0.5mlに、キシラナーゼＷ
を含む試料0.05mlを加え、60℃で10分間反応
させ、生成した還元糖を３，５―ジニトロサ
リチル酸試薬法により定量し、１分間に
1μmolのキシロースを生成する酵素量を１単
位（Ｕ）とする。 作用適温の範囲 PH6.0〜7.0において55〜70℃である（第２
図参照）。 熱安定性 10分間処理の場合、60℃まで安定である。 精製方法 キシラナーゼＷ生産菌培養物から菌体を
除去し、その清澄液に硫酸アンモニウムを加
えて酵素を沈澱させ、これを脱水乾燥して粗
酵素粉末を得る。粗酵素粉末をPH7.2の
0.05Mトリス塩酸緩衝液に溶解してDEAE―
セルロースにより分離し、さらにセフアデツ
クスＧ―100により濾過して精製する。 分子量 限外濾過法による分子量W1が49500、W3
が48000である。 阻害、活性化 銀イオン、銅イオンにより阻害される。 本発明に係る酵素は安定PH範囲が酸性側（PH
4.5）からアルカリ性側（PH10.0）までと広く、
至適作用温度が60℃ないし70℃にあり、さらに
反応生成物は主としてキシロースとキシロビオ
ースであるなどの特徴を有し、従来の酵素とは
相違する。 以下に本発明方法を実施例によつて説明する。 実施例 １ （培地組成）キシラン 1.0ｇ 酵母エキス 0.5 ポリペプトン 0.5 K2HPO4 0.1 MgSO4・7H2O 0.02 水 100ml PH 10.0 （Na2CO3にて調整） 上記組成の培地100mlを300ml容のフラスコに分
注し、121℃にて10分間蒸気殺菌した後、バチル
ス（Bacillus）属細菌No.W1（微工研菌寄第7220
号）、No.W3（微工研菌寄第7222号）をそれぞれ
別々のフラスコに接種して45℃で48時間振とう培
養した。培養物より菌体を除去した清澄液につい
てキシラナーゼ活性を測定したところ次の結果を
得た。 菌 種 酵素生産量〔Ｕ／ml〕 W1 92 W3 115 前記清澄液それぞれに硫酸アンモニウムを加え
て酵素を沈澱させ、これを脱水乾燥して、それぞ
れキシラナーゼW1およびW3の粗粉末を得る。こ
れをPH7.2の0.05Mトリス塩酸緩衝液に溶解し、
DEAE―セルロースにより分離し、さらにセフア
デツクスＧ―100により濾過精製し、これを濃縮
後、凍結乾燥すると、精製キシラナーゼW1およ
びW3がそれぞれ得られる。
40 38 43
（＊）小麦〓／水 40 3 5
第４表から明らかなように２菌種とも培地
の炭素源にキシラン1.0％を用いたき顕著な
酵素生産を示し、またグルコースが炭素源の
ときは酵素生産はほとんどない。さらに小麦
〓４％を添加した場合、キシランまたはキシ
ロースを添加した場合と同等ないしそれ以上
の酵素生産が認められ、安価な炭素源として
小麦〓が有効に用いられることが明らかにさ
れた。なお、第４表の最下段（＊印を附し
た）に示した結果は、第１表に示した基本培
地の代りに水を用いて小麦〓４％を添加した
だけの培地を用いて同様の培養条件で培養し
た場合の酵素生産を示したものである。即
ち、 培地組成：小麦〓 40ｇ 水 1000ml PH 10 培養条件：45℃にて47時間振とう培養。 以上の検討の結果より、耐アルカリ性耐熱性
キシラナーゼ生産に用いる最も効果的な培地組
成とPHおよび培養温度は次の通り設定される。 培地組成：炭素源キシラン 10.0〔ｇ〕 （または小麦〓 40.0） 酵母エキス 5.0 ポリペプトン 5.0 K2HPO4 1.0 MgSO4・7H2O 0.2 水 1000ml 培地のPH：10.0（Na2CO3により調整） 培養温度：45℃ 培養方法：振とう培養または通気攪拌培養 (4) 酵素の精製方法と性質 前項までに述べた方法により得られた培養物
から酵素を分離精製する方法および酵素の性質
について説明する。 培養物から菌体を除去し、その清澄液に硫酸
アンモニウムを加えて酵素を沈澱せしめ、これ
を脱水乾燥して粗酵素粉末を得る。粗酵素粉末
をPH7.2の0.05Mトリス塩酸緩衝液に溶解して
DEAE―セルロースによりキシラナーゼ画分を
分離し、次にセフアデツクスＧ―100により濾
過して精製する。この精製酵素を濃縮し、凍結
乾燥すると目的の酵素キシラナーゼＷを得
る。かくしてW1およびW3の２菌種から得られ
た本発明の２種のキシラナーゼ、それぞれW1
およびW3は次のような理化学的性質を有する。 作用および基質特異性 キシラナーゼおよキシロオリゴ糖に特異的
に作用し、そのβ―１，４―キシロシド結合
を切断して、キシロースおよびキシロビオー
スを生成する。 至適PHおよび安定PH範囲 至適PHはPH6.0（第１図参照）、安定PH範囲
はPH4.5〜10.0（45℃、60分処理の場合、第３
図参照）にある。 力価の測定法 基質として0.5％キシランをPH8.0のマツキ
ルベン緩衝液（0.1Mクエン酸―0.2Mリン酸
二ナトリウム）に懸濁し、超音波により均一
に分散したもの0.5mlに、キシラナーゼＷ
を含む試料0.05mlを加え、60℃で10分間反応
させ、生成した還元糖を３，５―ジニトロサ
リチル酸試薬法により定量し、１分間に
1μmolのキシロースを生成する酵素量を１単
位（Ｕ）とする。 作用適温の範囲 PH6.0〜7.0において55〜70℃である（第２
図参照）。 熱安定性 10分間処理の場合、60℃まで安定である。 精製方法 キシラナーゼＷ生産菌培養物から菌体を
除去し、その清澄液に硫酸アンモニウムを加
えて酵素を沈澱させ、これを脱水乾燥して粗
酵素粉末を得る。粗酵素粉末をPH7.2の
0.05Mトリス塩酸緩衝液に溶解してDEAE―
セルロースにより分離し、さらにセフアデツ
クスＧ―100により濾過して精製する。 分子量 限外濾過法による分子量W1が49500、W3
が48000である。 阻害、活性化 銀イオン、銅イオンにより阻害される。 本発明に係る酵素は安定PH範囲が酸性側（PH
4.5）からアルカリ性側（PH10.0）までと広く、
至適作用温度が60℃ないし70℃にあり、さらに
反応生成物は主としてキシロースとキシロビオ
ースであるなどの特徴を有し、従来の酵素とは
相違する。 以下に本発明方法を実施例によつて説明する。 実施例 １ （培地組成）キシラン 1.0ｇ 酵母エキス 0.5 ポリペプトン 0.5 K2HPO4 0.1 MgSO4・7H2O 0.02 水 100ml PH 10.0 （Na2CO3にて調整） 上記組成の培地100mlを300ml容のフラスコに分
注し、121℃にて10分間蒸気殺菌した後、バチル
ス（Bacillus）属細菌No.W1（微工研菌寄第7220
号）、No.W3（微工研菌寄第7222号）をそれぞれ
別々のフラスコに接種して45℃で48時間振とう培
養した。培養物より菌体を除去した清澄液につい
てキシラナーゼ活性を測定したところ次の結果を
得た。 菌 種 酵素生産量〔Ｕ／ml〕 W1 92 W3 115 前記清澄液それぞれに硫酸アンモニウムを加え
て酵素を沈澱させ、これを脱水乾燥して、それぞ
れキシラナーゼW1およびW3の粗粉末を得る。こ
れをPH7.2の0.05Mトリス塩酸緩衝液に溶解し、
DEAE―セルロースにより分離し、さらにセフア
デツクスＧ―100により濾過精製し、これを濃縮
後、凍結乾燥すると、精製キシラナーゼW1およ
びW3がそれぞれ得られる。
本発明の２種のキシラナーゼについて、第１図
は至適PH範囲、第２図は作用適温の範囲、第３図
は安定PH範囲を示すグラフである。
は至適PH範囲、第２図は作用適温の範囲、第３図
は安定PH範囲を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するキシラナーゼ
W1及びW3から成る群から選ばれるキシラナーゼ
Ｗ。 作用および基質特異性 キシランおよびキシロオリゴ糖に特異的に作
用し、そのβ―１，４―キシロシド結合を切断
して、キシロースおよびキシロビオースを生成
する。 至適PHおよび安定PH範囲 至適PHはPH6.0、安定PH範囲はPH4.5〜10.0（45
℃、60分処理の場合）にある。 力価の測定法 基質として0.5％キシランをPH8.0のマツキル
ベン緩衝液（0.1Mクエン酸―0.2Mリン酸二ナ
トリウム）に懸濁し、超音波により均一に分散
したもの0.5mlに、キシラナーゼＷを含む試
料0.05mlを加え、60℃で10分間反応させ、生成
した還元糖を３，５―ジニトロサリチル酸試薬
法により定量し、１分間に1μmolのキシロース
を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。 作用適温の範囲 PH6.0〜7.0において55〜70℃である。 熱安定性 10分間処理の場合、60℃まで安定である。 精製方法 キシラナーゼＷ生産菌培養物から菌体を除
去し、その清澄液に硫酸アンモニウムを加えて
酵素を沈澱させ、これを脱水乾燥して粗酵素粉
末を得る。粗酵素粉末をPH7.2の0.05Mトリス
塩酸緩衝液に溶解してDEAE―セルロースによ
り分離し、さらにセフアデツクスＧ―100によ
り濾過して精製する。 分子量 限外濾過法による分子量はW1が49500、W3
が48000である。 阻害、活性化 銀イオン、銅イオンにより阻害される。 ２ バチルス属に属するキシラナーゼＷ生産菌
を培養し、該培養物よりキシラナーゼＷを分
離、採取することを特徴とするキシラナーゼＷ
の製造法。 ３ バチルス属に属するキシラナーゼＷ生産菌
が、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）No.W1
およびNo.W3から成る群から選ばれる特許請求の
範囲第２項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16600883A JPH0248231B2 (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16600883A JPH0248231B2 (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10415589A Division JPH0248232B2 (ja) | 1989-04-24 | 1989-04-24 | Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6058070A JPS6058070A (ja) | 1985-04-04 |
| JPH0248231B2 true JPH0248231B2 (ja) | 1990-10-24 |
Family
ID=15823176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16600883A Expired - Lifetime JPH0248231B2 (ja) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | Shinkikishiranaazeoyobisonoseizoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0248231B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57164876A (en) * | 1982-03-17 | 1982-10-09 | Honda Motor Co Ltd | Suspension system for front wheel of tricycle |
| JP2965322B2 (ja) * | 1990-05-31 | 1999-10-18 | サントリー株式会社 | 皮膚外用剤 |
| FR2672300B1 (fr) * | 1991-02-01 | 1994-09-23 | Agronomique Inst Nat Rech | Xylanase, souches de bacillus productrices de xylanase et leurs utilisations. |
-
1983
- 1983-09-09 JP JP16600883A patent/JPH0248231B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6058070A (ja) | 1985-04-04 |
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