JPH099962A - アルギン酸分解酵素とその製造法ならびにアルギン酸分解法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 緑膿菌バイオフィルムの主成分であるアルギ
ン酸をより強力に分解する酵素を生産する微生物を探索
し、その生産菌の培養液から得られるアルギン酸分解酵
素を提供する。 【構成】 バチルス属に属するアルギン酸分解能を有す
る微生物が産生しアルギン酸を分解するアルギン酸分解
酵素、バチルス属に属するアルギン酸分解能を有する微
生物を培養し培養物からアルギン酸分解酵素を採取する
アルギン酸分解酵素の製造法、及びバチルス属に属する
アルギン酸分解能を有する微生物を培養しその培養物、
培養物から得られた粗酵素又は精製酵素をアルギン酸に
作用させてアルギン酸を分解するアルギン酸の分解法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バチルス属に属する微
生物によって生産されるアルギン酸分解酵素、その製造
法及びその酵素を用いてアルギン酸を主成分とするバイ
オフィルムを溶解することによる呼吸器感染症の治療な
らびにアルギン酸を分解あるいは低分子化させる方法に
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、緑膿菌を中心とする呼吸器感染症
の急激な難治性・慢性化は化学療法上、極めて深刻な問
題となりつつある。この難治性化の本体として感染菌に
よって産生されるglycocalyxと生体成分との複合体から
なるバイオフィルムの形成を挙げることできる。アルギ
ン酸を主成分とするバイオフィルムの産生により生体内
における菌の生息圏形成という新たな状況が生じ、この
ことが化学療法剤の菌体内への透過性を妨げ、薬剤耐性
の要因となっている。バイオフィルムが関与する難治性
感染症として人工医療材に起因する感染症、尿路感染
症、心内膜炎やびまん性汎細気管支炎をはじめとする呼
吸気感染症が挙げられるが、従来の化学療法剤では効果
が低く、画期的な治療薬、治療方法の開発が望まれてい
る。これまでに種々の化学療法剤の開発がなされている
が、バイオフィルムに直接作用する有効な薬剤、酵素製
剤の開発ならびに治療方法による試みはなされていな
い。

【０００３】一方で本研究は、アルギン酸をモノマーあ
るいはオリゴマーのウロン酸に分解することによってバ
イオマス資源として利用する方法が考えられる。アルギ
ン酸の水溶液は非常に粘性が高く、その水溶液は水溶液
中のカルシュウムなどと金属塩をつくりゲル化するため
アルギン酸を分解することが困難である。そこで微生物
酵素を用いてアルギン酸を分解する試みがなされつつあ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、緑膿菌
バイオフィルムの主成分であるアルギン酸をより強力に
分解する酵素を生産する微生物を探索し、その生産菌の
培養液から得られるアルギン酸分解酵素によるアルギン
酸の分解効果について検討を行った。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の目的達成のため、
本発明者らはglycocalyxの本体であるアルギン酸を分
解、低分子化させる酵素、即ち、アルギン酸リアーゼ産
生菌を土壌微生物中から積極的に探索し、バチルス属に
属する一菌株バチルスsp.ATB−１０１５株を分離するこ
とに成功した。

【０００６】本発明は、バチルスsp.ATB−１０１５株の
産生するアルギン酸分解酵素とその製造法ならびにアル
ギン酸に作用させて分解せしめることを特徴とする微生
物酵素によるアルギン酸の分解法である。

【０００７】本菌株の分離法は予め土壌にアルギン酸ナ
トリウム水溶液を処理することでその土壌から炭素源と
してアルギン酸を資化しうる分解酵素生産菌を取得する
もので、効果的に目的とする菌を分離することができる
点で有用な方法である。

【０００８】このようにして分離された菌はアルギン酸
を主要炭素源とする培地組成、例えば、アルギン酸ナト
リウム（０.５％）、ペプトン（０.５％）、酵母エキス
（０.１％）、NaCl（０.５％）、寒天（１.５％）にお
いてより良く生育する。本生産菌はグラム染色陽性の好
気性の桿菌である。本菌は芽胞を形成し耐熱性である。
走査型電子顕微鏡による形態観察（１２,０００倍）で
は長さ２.５−２.９μｍ、幅０.５−０.９μｍの円垂形
で、鞭毛は有していない。以上の菌学的諸性状から本菌
はバチルス属に属する。

【０００９】本菌株をアルギン酸ナトリウム（０.５
％）、ペプトン（０.５％）、酵母エキス（０.１％）、
NaCl（０.５％）、MgSO₄・7H₂O（０.１％）及びKH₂PO
₄（０.１％）からなる培地１００ｍｌの入った５００ｍ
ｌ容三角フラスコに植菌し、２４時間培養を行う。この
種培養液を３Ｌの上記培地の入った５Ｌ容ジャーファメ
ンターに植菌し、２７℃にて３６時間通気撹拌培養を行
う。このようにして得られた培養液を菌体と培養上清に
分離し、上清液を得る。この上清液から以下の方法によ
ってアルギン酸分解酵素を精製した。培養上清液を硫安
沈殿を行った後に透析を行い、粗酵素液を得る。本粗酵
素液をDEAE−セルロースカラムクロマトグラフィーにて
精製を行い、酵素活性を有する分画を得る。次いで、セ
ファクリルＳ−２００クロマトグラフィーにかけ酵素活
性画分を得る。

【００１０】本酵素活性の至適ｐＨは７.０付近であ
る。本酵素の安定ｐＨは６.０−８.０であり、至適温度
は３７℃である。熱安定性については２０ｍＭリン酸緩
衝液中（ｐＨ７.０）で６０℃、３０分間処理で５０％
以上のアルギン酸分解酵素活性を保持した。本酵素の基
質特異性は褐藻類由来のアルギン酸に対し、高い分解活
性を示す一方で、緑濃菌由来のアルギン酸、即ち、テフ
ロンデイスク表面上に生産されるバイオフィルムに対し
ても高い分解、溶解活性を示した。本精製酵素はＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単一バンドを
与える。その分子量は４１,０００である。

【００１１】アルギン酸リアーゼについてはこれまでに
海洋細菌であるアルテロモナス sp.H-4（Nippon Suisan
Gakkaishi, 58 (3), 521-527 (1992)）、シュウドモナ
スsp. OS-ALG-9（J. Ferment. & Bioeng., 72 (2), 74-
78 (1991)）、フラボバクテリウム sp.（J. Ferment. B
ioeng., 72 (3) 152-157 (1991)）、 バチルス・サーキ
ュランス（Appl. Environ. Microbiol., 47 (4), 704-7
09 (1984)）、クレブジエラ・アロジーナス（Arch. Mic
robiol., 152, 302-308 (1989)）などの微生物によって
報告されている。今回、新たに分離されたバチルスsp.A
TB−１０１５株はこれまでに報告されている上記菌株と
はその属を異にしており、また、形態学的特性を異にし
ている。バチルス・サーキュランスとは同じ属に属する
が、sp.ATB−１０１５株は鞭毛を有していない点で形態
学的に異なる。バチルスsp.ATB−１０１５の生産する酵
素はSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分子量
４１,０００を示すのに対してバチルス・サーキュラン
ス由来の酵素では分子量５８,０００を有している点で
異なっている。また、本酵素はバチルス属以外の菌によ
って生産されるアルギン酸分解酵素とはいずれも分子量
を異にしている。

【００１２】以上のように、本酵素はこれまでに報告さ
れているアルギン酸分解酵素とはその性質を異にし、新
しい酵素である。本菌株は工業技術院生命工学工業技術
研究所においてすでに寄託されており、FERM P-14946の
寄託番号が付与されている。

【００１３】本発明で用いる微生物は適当な培地中で生
育させることができる。例えば炭素源としてアルギン酸
のほか、グルコース、シュークロース、グリセリンのよ
うな炭水化物、窒素源としては硫酸アンモニウム、硝酸
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機態窒素ある
いは尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス
等のような有機態窒素を用いることができる。資化され
やすい炭素源（グルコース、グリセリンなど）を培地中
に加えることで緩慢に代謝される炭素源（この場合、ア
ルギン酸）の分解に関与する酵素の合成が抑制される場
合がある。その他の無機塩類としてはリン酸塩、マグネ
シュウム塩、カリ塩、マンガン塩、鉄塩等が用いられ
る。また本菌株の培養方法は慣用の方法で行われる。通
常、培養温度は２０−４０℃、ｐＨ６.０−８.０が好ま
しく、振盪もしくは通気撹拌によって好気的に１−５日
間培養される。

【００１４】このようにして得られた培養液から抽出、
精製されたアルギン酸分解酵素を海草由来のアルギン酸
もしくは緑膿菌由来のアルギン酸、即ち、バイオフィル
ムに作用させることによってアルギン酸を分解もしくは
低分子化させ、さらにはバイオフィルムを溶解させるこ
とができる。アルギン酸リアーゼ産生菌の選択、アルギ
ン酸の本酵素による分解、低分子化反応及び緑膿菌バイ
オフィルムの本酵素による溶解能は以下に示す方法によ
って調べることができる。

【００１５】１）アルギン酸ナトリウムを唯一の炭素源
とする寒天プレートに細菌コロニーを接種し、５日間培
養後、CaCl₂水溶液を加え放置後、コロニー周辺に形成
される白色ハロ及び透明ゾーンの大きさを測定（J. Fer
ment. Bioeng., 76 (5) 427-437(1993)）。 ２）アルギン酸リアーゼ処理によって高粘度のアルギン
酸が低分子化されることによる粘度低下の測定（Nippon
Suisan Gakkaishi, 55 (4) 709-713 (1989)）。 ３）酵素処理によるアルギン酸の分解、低分子化によっ
て産生される不飽和ウロニドの定量（Nippon Suisan Ga
kkaishi, 55 (4) 709-713 (1989)）。 ４）緑膿菌（臨床分離株）の産生するアルギン酸を主成
分とするバイオフィルムのアルギン酸リアーゼ作用によ
る溶解能の測定。

【００１６】特に、４）は本特許において新たに発明さ
れた方法である。本酵素活性測定法はバイオフィルムが
関与する難治性呼吸器感染症への本酵素による治療効果
を評価する上で有効な方法である。本法は実施例４に示
すようにテフロンデイスクを緑膿菌と一緒に４−７日
間、静置培養し、テフロンデイスク片の表面上に付着し
たバイオフィルムをアルギン酸リアーゼとインキュベー
トすることによってバイオフィルムの溶解能をトルイジ
ン・ブルー染色法により調べる方法である。

【００１７】アルギン酸リアーゼの産生微生物の培養液
から本酵素の抽出、精製は、一般に、硫安沈殿、透析、
セファクリル S-200 HRなどのゲルろ過、DEAE-セルロー
ス、DEAE-セファデックス、CM-セルロースなどの各種イ
オン交換樹脂クロマトグラフィーを効果的に組み合わせ
ることによって行うことが可能である。本発明によって
見い出された微生物、バチルスsp.ATB-１０１５及びそ
の培養液から精製されたアルギン酸分解酵素は医療や食
品分野での利用が期待される。本酵素は緑膿菌呼吸器感
染症であるびまん性汎細気管支炎（Diffuse panbronchi
olitis）や遺伝的呼吸器疾病である嚢胞性繊維症（Cyst
ic fibrosis）を始め呼吸器感染症などに対して噴霧吸
入法による治療が可能である。一方で本酵素は昆布など
の海草由来のアルギン酸を効率良く分解、低分子化する
ことから、これらはバイオマス資源として利用される
他、適当な大きさに分解されたものは植物や昆虫の食品
加工用素材として利用される。このことから、アルギン
酸分解酵素生産菌をアルギン酸を含む有機資材とともに
土壌に処理することにより農作物の増収を図ることが可
能であり、土壌改良材中の有用微生物としての利用が考
えられる。

【００１８】

【実施例】以下に実施例により本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ アルギン酸を分解する微生物の選択的な分離方法は、以
下によって行われた。所定の土壌に約３％のアルギン酸
ナトリウムを２−３カ月間、約２−３日おきに添加処理
した。この処理土壌約１ｇを滅菌水２ｍｌで混釈した。
混釈液試料１ｍｌをアルギン酸ナトリウムを唯一の炭素
源とする表１に示す培地組成と混釈し、シャーレに寒天
プレートを作成した。このプレートを２７℃、７日間、
インキュベートした。プレート上に生じたコロニーをさ
らに同組成のプレートに接種し、２７℃で５日間、イン
キュベートした後にプレート上に１Ｍ CaCl₂溶液を加
え、放置後、コロニー周辺に白色ハロ及び透明ゾーンを
形成したバクテリアをアルギン酸リアーゼ産生菌として
分離した。

【００１９】

【表１】

【００２０】本菌株をアルギン酸ナトリウムを炭素源と
する表２に示される液体培地１０ｍｌの入った大試験管
に接種した。３７℃にて２４時間培養した培養液を同組
成の培地１００ｍｌのはいった５００ｍｌ容三角フラス
コに移し、２７℃にて振盪培養を行い、４８時間目で培
養を中止した。培養液中に産生される菌体外アルギン酸
リアーゼ活性は昆布由来のアルギン酸ナトリウムの基質
液（５ｍｌ）と培養上清液（０.５ｍｌ）を３７℃で２
０分間反応後、オストワルド粘度計を用いる粘度測定に
よって求めた。粘度法によって求めた４８時間培養液の
酵素活性は２.０Units／ｍｌであり、本酵素は１０分間
にアルギン酸の粘度を９６％まで低下させる活性を示し
た。

【００２１】

【表２】

【００２２】実施例２ 実施例１において三角フラスコ培養によって得られた２
４時間培養液９０ｍｌを予めオートクレーブ内にて１２
０℃、１５分間、滅菌されたは３Ｌの同組成の培地を含
む５Ｌジャーファーメンターに接種した。培養経過を調
べるため、２７℃にて７２時間、好気的に通気撹拌（２
００rpm）培養を行った。培養中、培養液の発泡を防ぐ
ために消泡剤であるアデカノールを使用した。酵素活性
は実施例１で示した粘度法により求めた。菌の生育は培
養液１０ｍｌを３,０００rpmで１０分間に遠心分離し、
残存する菌体量で示された。１０時間目頃から菌の生育
が始まり、２４時間目で最大に達した。菌の生育ととも
に酵素の生産も上昇し、３６時間でほぼ最大に達した。
その以後は酵素の生産は定常状態になり、７２時間目で
も酵素活性は残存する。培養液中のｐＨは７.０からわ
ずかながら上昇し、４８時間以降、急に上昇し、７２時
間目にはｐＨ９.０に達した。３６時間培養液からのア
ルギン酸リアーゼの精製方法は実施例３で示した。

【００２３】実施例３ 実施例２で得られた培養液は遠心分離によって菌体と培
養上清に分けた。培養上清液からのアルギン酸リアーゼ
の精製は表３に示す方法によって行った。各精製段階で
のアルギン酸リアーゼ活性は、分解生成物であるウロン
酸のλ２３５ｎｍのＵＶ吸収における吸光度から求め
た。また、酵素タンパク量はλ２８０ｎｍの吸収及び標
準として牛血清アルブミンを用いるLowry法によって求
めた。アルギン酸の上清液を７５％飽和硫安にて塩析
後、沈殿物は少量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.
０）にて溶解し、同緩衝液中で一晩、透析した。この粗
酵素液は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）にて平衡
化されたイオン交換樹脂、DEAE-セルロースカラムクロ
マトグラフィーに通塔した。活性分画を集め、限外ろ過
により濃縮して得られた粗酵素液を５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７.０）にて平衡化されたセファクリル S-200
HRにてゲルろ過した。活性分画を濃縮し、凍結乾燥を行
い、白色粉末を得た。本粉末は上述のDEAE-セルロース
カラムクロマトグラフィーにて再度精製された。培養上
清からの収率は５.８％であった。本精製酵素は、上述
の透析後の試料と比較して約２５倍の比活性を有した。
本精製酵素液は１２.５％SDS−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動の後、CBB染色された。本酵素は図１に示すよ
うにSDS−ポリアクリルアミドゲル上、既存の分子量マ
ーカーとの比較から４１,０００の分子量を有するタン
パクからなる単一のバンドを与えた。

【００２４】

【表３】

【００２５】実施例４ 緑膿菌の臨床分離株、Ｍ−３ムコイド株をミューラヒン
トン培地１０ｍｌを用い、大験管にて１８時間、液体培
養を行い、これを種培養液とした。この種培養液を１.
５％NaClと０.２％グルコースからなる培地組成（５ｍ
ｌ）の入ったシャーレに接種した。この際、予め、シャ
ーレ内には直径６ｍｍのテフロンシートデイスク片を一
緒に入れ、３７℃で５日間、静置培養を行った。アルギ
ン酸多糖からなるバイオフィルムが産生、付着したテフ
ロンデイスク片と上記アルギン酸分解酵素産生菌の培養
液、４００μｌを３７℃、２０分間インキュベートし
た。反応後、テフロンデイスクを取り出し、トルイジン
・ブルー溶液にて３０分間、染色した。培養上清液及び
精製された酵素液はいずれもテフロンデイスク片表面上
に付着したバイオフィルムを分解、溶解する結果、デイ
スク表面はほとんど染色されず、緑膿菌バイオフィルム
の溶解能を肉眼観察することができた。また、テフロン
デイスクと同時に血清などのタンパクや糖タンパクを添
加し、より生体内に近い条件下でバイオフィルムの溶解
能を調べることが出来る点で本法はin vivoでの評価に
つながるきわめて有用な検定方法である。

【００２６】

【発明の効果】本発明法によって見い出されたバチルス
属に属する新菌株が生産するアルギン酸リアーゼは緑膿
菌臨床分離株の産生するアルギン酸を効率良く分解、低
分子化することができるのでバイオフィルムの形成が起
因となっている慢性難治性の呼吸器感染症、尿路感染症
ならびに嚢胞性繊維症といった疾患に対して有用な治療
手段となりうる。また、本酵素は酸や熱に対して比較的
安定であり、かつ培養上清中に蓄積されことから大量に
供給が可能である。本酵素は海草由来のアルギン酸も分
解、低分子化することができるので、アルギン酸を含む
廃液ならびに食品物の処理に利用することが可能であ
り、さらに、アルギン酸の分解生成物のウロン酸はバイ
オマス資源としても有用であり、また、農作物の増収を
目的とした有用微生物として土壌改良材に用いられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルスsp. ATB-１０１５由来のアルギン酸リ
アーゼのSDS-PAGEによる分子量測定の結果を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バチルス属に属するアルギン酸分解能を
   有する微生物が産生し、アルギン酸を分解するアルギン
   酸分解酵素。
2. 【請求項２】 バチルス属に属するアルギン酸分解能を
   有する微生物を培養し、培養物からアルギン酸分解酵素
   を採取することを特徴とするアルギン酸分解酵素の製造
   法。
3. 【請求項３】 バチルス属に属するアルギン酸分解能を
   有する微生物を培養し、その培養物、培養物から得られ
   た粗酵素又は精製酵素をアルギン酸に作用させてアルギ
   ン酸を分解せしめることを特徴とするアルギン酸の分解
   法。