JPH0249581A - 耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬 - Google Patents
耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬Info
- Publication number
- JPH0249581A JPH0249581A JP63199639A JP19963988A JPH0249581A JP H0249581 A JPH0249581 A JP H0249581A JP 63199639 A JP63199639 A JP 63199639A JP 19963988 A JP19963988 A JP 19963988A JP H0249581 A JPH0249581 A JP H0249581A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycerol
- activity
- lpl
- lipoprotein lipase
- triglyceride
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
- Y10S435/906—Streptomyces venezuelae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、熱安定性に優れ、かつグリセロール生成活性
の割合が高い性質を有するリポプロテインリパーゼとそ
の製造法及びそれを用いたトリグリセリド定量用試薬に
関するものである。
の割合が高い性質を有するリポプロテインリパーゼとそ
の製造法及びそれを用いたトリグリセリド定量用試薬に
関するものである。
（従来の技術）
リポプロテインリパーゼ（以下ＬＰＬという）は、 １
９４３年Ｉｆ ａ ｈ ｎによる赤血球循環量の研究に
おいて食餌性脂血症のイヌにヘパリンを注射すると。
９４３年Ｉｆ ａ ｈ ｎによる赤血球循環量の研究に
おいて食餌性脂血症のイヌにヘパリンを注射すると。
血液の濁りが減少したことからクリアリング ファクタ
ー（Ｃｌｅａｒｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）としてその存在
が指摘された。その後そのメカニズムが血液中のリポプ
ロティンのグリセリドの氷解によるものであることが明
らかとなって以来、各種動物組織中から検出され、動物
体内の脂質代謝において重要な役割を果たしている酵素
であることが知られている。
ー（Ｃｌｅａｒｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）としてその存在
が指摘された。その後そのメカニズムが血液中のリポプ
ロティンのグリセリドの氷解によるものであることが明
らかとなって以来、各種動物組織中から検出され、動物
体内の脂質代謝において重要な役割を果たしている酵素
であることが知られている。
１９６６年、有高らにより、微生物にも動物由来のＬＰ
Ｌと類似の酵素が存在していることが報告され〔アグリ
カルチュラルアンドバイオロジカルケミストリー （八
ｇｒ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、） ３０，５１５（１９６
６））微生物Ｌ Ｐ Ｌと称されるに至った。この微生
物ＬＰＬは、大量生産が可能であることから、その利用
研究が盛んで、特ｃｖｈ液の生化学的検査項目の一つで
ある血中Ｉ・リグリセリドの定量用として開発されてい
る。
Ｌと類似の酵素が存在していることが報告され〔アグリ
カルチュラルアンドバイオロジカルケミストリー （八
ｇｒ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、） ３０，５１５（１９６
６））微生物Ｌ Ｐ Ｌと称されるに至った。この微生
物ＬＰＬは、大量生産が可能であることから、その利用
研究が盛んで、特ｃｖｈ液の生化学的検査項目の一つで
ある血中Ｉ・リグリセリドの定量用として開発されてい
る。
従来、ＬＰＬを生産する微生物は、シュードモナス属、
ムコール属、ストレプトミセス属、セラチア属、エアロ
モナス属、バチルス属〔アグリカルチュラルアンドバイ
オロジカルケミストリー（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、）、３１，９２４ 、（１９６７）、特公昭４１７８
３６号公報、特公昭５８−３７８３５号公報参照。〕リ
リゾプス属アグリカルチュラルアントバイオロジカルケ
ミストリ− （１９７９） 、特公昭５８ − ３７８３４号公報参
照。〕等広い属にわたっており，シュードモナス属，ム
コール属及びリゾプス属については，精製の後，諸性質
が明らかにされている。しかしながら、これらの全ては
，常温性微生物であり．生産されたＴ−ｐ ｒ。
ムコール属、ストレプトミセス属、セラチア属、エアロ
モナス属、バチルス属〔アグリカルチュラルアンドバイ
オロジカルケミストリー（Ａｇｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、）、３１，９２４ 、（１９６７）、特公昭４１７８
３６号公報、特公昭５８−３７８３５号公報参照。〕リ
リゾプス属アグリカルチュラルアントバイオロジカルケ
ミストリ− （１９７９） 、特公昭５８ − ３７８３４号公報参
照。〕等広い属にわたっており，シュードモナス属，ム
コール属及びリゾプス属については，精製の後，諸性質
が明らかにされている。しかしながら、これらの全ては
，常温性微生物であり．生産されたＴ−ｐ ｒ。
も当然ながら安定化に優れないものであった。
一方．ＬＰＬを含むリパーゼ類は，基質であるトリグリ
セリド中の３つのエステル結合に対し特異性を示すこと
が今までに明らかになっている。
セリド中の３つのエステル結合に対し特異性を示すこと
が今までに明らかになっている。
ＬＰＬを血中トリグリセリドの定量に利用する場合，生
成したグリセロールを他の共役酵素により検出系に導く
方が望ましく．シたがって，トリグリセリド量に対応し
たグリセロールを生成さす為には，３つのエステ結合を
選択性な（加水分解する酵素が好まし。ＬＰＬの位置特
異性に関しては，グリセロール生成活性の脂肪酸生成活
性に対する割合として表わした場合シュードモナス属の
もので１．９７％という低い値が現在まで報告されてい
る中で最高値である（特開昭５９−１８７７８０号公報
参照）。
成したグリセロールを他の共役酵素により検出系に導く
方が望ましく．シたがって，トリグリセリド量に対応し
たグリセロールを生成さす為には，３つのエステ結合を
選択性な（加水分解する酵素が好まし。ＬＰＬの位置特
異性に関しては，グリセロール生成活性の脂肪酸生成活
性に対する割合として表わした場合シュードモナス属の
もので１．９７％という低い値が現在まで報告されてい
る中で最高値である（特開昭５９−１８７７８０号公報
参照）。
（発明が解決しようとする課題）
近年，診断用検査薬として酵素法の占める割合は増加す
る一方であるが．酵素を用いた場合酵素が蛋白質である
ことに由来する失活現象は避けがたい問題で，試薬自体
の安定性を大きく左右する重要な問題である。
る一方であるが．酵素を用いた場合酵素が蛋白質である
ことに由来する失活現象は避けがたい問題で，試薬自体
の安定性を大きく左右する重要な問題である。
最近５ このような問題を解決する為に好熱性細菌由来
の耐熱性酵素を組込んだ診断用検査薬が開発され，試薬
の不安定性の問題は飛躍的に改善されている。
の耐熱性酵素を組込んだ診断用検査薬が開発され，試薬
の不安定性の問題は飛躍的に改善されている。
しかしながら、ＬＰＬにおいては．前記したとおりその
起源を問わず耐熱性であるものはなく。
起源を問わず耐熱性であるものはなく。
試薬の安定性を改善する為に耐熱性のＬＰＬが強く望ま
れていた。
れていた。
また、ＬＰＬを血中トリグリセリドの定量に利用する場
合には，少量の添加量で済み，かつ反応終了までの時間
が短縮できるようなグリセロール生成活性の割合が高い
ものが望まれているが，これも前記したとおり低いもの
しか知られていない。
合には，少量の添加量で済み，かつ反応終了までの時間
が短縮できるようなグリセロール生成活性の割合が高い
ものが望まれているが，これも前記したとおり低いもの
しか知られていない。
（課題を解決するための手段）
本発明者らは，耐熱性で，かつグリセロール生成活性の
割合が高い微生物ＬＰＬを求めて鋭意研究した結果．静
岡県伊豆熱用温泉の土壌より分離した好熱性放線菌に属
するストレプトミセス（Ｓｔ−叩圏互ｃｅｓ）７８２５
（微工研菌寄第９９８３号（１’ｌＥＩ？Ｍ Ｐ９９
８３） ）が、上記の性質を有する１．、 Ｐ Ｌを生
産することを見出し，本発明を完成するに至った。
割合が高い微生物ＬＰＬを求めて鋭意研究した結果．静
岡県伊豆熱用温泉の土壌より分離した好熱性放線菌に属
するストレプトミセス（Ｓｔ−叩圏互ｃｅｓ）７８２５
（微工研菌寄第９９８３号（１’ｌＥＩ？Ｍ Ｐ９９
８３） ）が、上記の性質を有する１．、 Ｐ Ｌを生
産することを見出し，本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は．以下の理化学的性質を有する耐熱
性のＬＰＬ並びに好熱性放線菌を培養し。
性のＬＰＬ並びに好熱性放線菌を培養し。
培養物から耐熱性のＬＰＬを採取することを特徴とする
耐熱性のＬＰＬの製造法及びＬＰＬを含有する体液中の
トリグリセリドを定量するトリグリセリド定量用試薬に
おいて，ＬＰＬが請求項１記載のＬＰＬであることを特
徴とするトリグリセリド定量用試薬を要旨とするもので
ある。
耐熱性のＬＰＬの製造法及びＬＰＬを含有する体液中の
トリグリセリドを定量するトリグリセリド定量用試薬に
おいて，ＬＰＬが請求項１記載のＬＰＬであることを特
徴とするトリグリセリド定量用試薬を要旨とするもので
ある。
（イ）作用
リポプロティン中のトリグリセリドに作用し。
グリセロールと脂肪酸に加水分解する。
（Ｕ）耐熱性（熱安定性）
約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理したのちの活性が
処理前の活性の約１００％の値を保持している。
処理前の活性の約１００％の値を保持している。
（ハ）グリセロール生成活性の割合
グリセロール生成活性の割合が脂肪酸生成活性に対して
少なくとも約１５％有する。
少なくとも約１５％有する。
本発明のＬＰＬは、約６０℃の緩衝液中で約１５分間処
理したのちの活性が処理前の活性の約１００χの値を保
持しているという優秀な性質を有している。このときの
緩衝液の濃度及びｐｌ＋は、特に限定されないが、一般
には濃度は５ｍＭないし５００ｍＭであり、ｐｌ（ば４
ないし７である。特に本発明においては、酢酸緩衝液（
ｐｌ＋ ５．０）を用いることが好ましい。
理したのちの活性が処理前の活性の約１００χの値を保
持しているという優秀な性質を有している。このときの
緩衝液の濃度及びｐｌ＋は、特に限定されないが、一般
には濃度は５ｍＭないし５００ｍＭであり、ｐｌ（ば４
ないし７である。特に本発明においては、酢酸緩衝液（
ｐｌ＋ ５．０）を用いることが好ましい。
本発明のＬＰＬの理化学的性質は次のとおりであるが、
これはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｃｅｓ）
７８２５ ＜微工研菌寄第９９８３号）から得られた理
化学的性質である。
これはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｃｅｓ）
７８２５ ＜微工研菌寄第９９８３号）から得られた理
化学的性質である。
（８１作用：リポプロティンのトリグリセリドに作用し
、グリセロールと脂肪酸に加水分解する。
、グリセロールと脂肪酸に加水分解する。
リポプロティンとしては２人エリボブロチインに限らず
、ヒト由来の天然血中リポプロティンも含まれる。
、ヒト由来の天然血中リポプロティンも含まれる。
（ｂｌｌ基質特異性裏表１に示すような各種トリグリセ
リドボブロチインに対して以下のような活性を有する。
リドボブロチインに対して以下のような活性を有する。
表−１基質特異性
ｔｅｌ至適ｐ＋＋：第１図に示すとおり８．０〜９．０
である。
である。
安定ｐＨ：第２図に示すとおり４．０〜７．０ （６０
’Ｃ３０分処理）である。
’Ｃ３０分処理）である。
（ｄ１作用適温：第３図に示すとおり５０〜６０ ”ｃ
である。
である。
（Ｑ）耐熱性二第４図に示すとおり約６０℃の緩衝液中
で約１５分間処理したのちの活性が処理前の活性の約１
００％の値を保持している。
で約１５分間処理したのちの活性が処理前の活性の約１
００％の値を保持している。
（ｆｌ阻害、 Ｚｎ”＋ Ｆ、＋、 Ｌ２＋ （
各１ ｍＭ）で３０〜４０％阻害、またＮａＣｊ！（３
Ｍ）の存在下で約４０％、デオキシコール酸（１０ｍＭ
）の存在下で約４０％、プロタミン硫酸（４００μｇ／
ｍ ｊ！ ）存在下で約３０％阻害される。
各１ ｍＭ）で３０〜４０％阻害、またＮａＣｊ！（３
Ｍ）の存在下で約４０％、デオキシコール酸（１０ｍＭ
）の存在下で約４０％、プロタミン硫酸（４００μｇ／
ｍ ｊ！ ）存在下で約３０％阻害される。
（ｇ１分子量：３万〜５万（ゲル濾過法）。
（ｈｌ力価の測定法：測定原理は、オリーブ油で調製し
た人エリボブロチインを基質としてこれに酵素を作用さ
せ、生成するグリセロールを定量するものである〔クリ
ニカ・キミ力・アクタ（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔ
ａ） ２２，３９３ （１９６８）参照。〕。
た人エリボブロチインを基質としてこれに酵素を作用さ
せ、生成するグリセロールを定量するものである〔クリ
ニカ・キミ力・アクタ（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔ
ａ） ２２，３９３ （１９６８）参照。〕。
基質ニオリーブ油５ｇと５％（Ｖ／Ｖ） ）リドンＸ
−１００溶液５ｍｎとの混合液を１０分間超音波処理
し、エマルジョンとする。
−１００溶液５ｍｎとの混合液を１０分間超音波処理
し、エマルジョンとする。
メタ過ヨウ素酸溶液：２５ｍＭメタ過ヨウ素酸１２ｎｌ
とイソプロパツール２０ｍ７！とを混合し、ＩＮ酢酸で
全量を１００ｍｊ２とする。
とイソプロパツール２０ｍ７！とを混合し、ＩＮ酢酸で
全量を１００ｍｊ２とする。
アセチルアセトン溶液：２．４−ペンタンジオン０．７
５ｍｊ！とイソプロパツール２．５ｍｊ！とを混合し、
２Ｍ酢酸アンモニウムで全量を１００ｍ＃とする。
５ｍｊ！とイソプロパツール２．５ｍｊ！とを混合し、
２Ｍ酢酸アンモニウムで全量を１００ｍ＃とする。
上記基質７０μｌと０．５Ｍグリシンバッファー （ｐ
Ｈ８，５） ２０μｌと１０％ＢＳ八５０μへと水５５
μｌとを試験管にとり、３７℃で予備加温する。酵素溶
液（約１０Ｕ／ｎｕに調製）５μβを添加し、３７℃で
１０分間反応させる。
Ｈ８，５） ２０μｌと１０％ＢＳ八５０μへと水５５
μｌとを試験管にとり、３７℃で予備加温する。酵素溶
液（約１０Ｕ／ｎｕに調製）５μβを添加し、３７℃で
１０分間反応させる。
反応終了後、沸腋水中に１０分間浸し１反応を停止させ
、放冷後イソプロパツール４００μｌを添加−１よく攪
拌する。遠心後、上清１００μｌにイソプロパツール２
ｍ１ｌを加え、これにメタ過ヨウ素酸溶液１ｎｌとアセ
チルアセトン溶液０．５ｍｌとを混合し、５０℃で３０
分間反応させた後。
、放冷後イソプロパツール４００μｌを添加−１よく攪
拌する。遠心後、上清１００μｌにイソプロパツール２
ｍ１ｌを加え、これにメタ過ヨウ素酸溶液１ｎｌとアセ
チルアセトン溶液０．５ｍｌとを混合し、５０℃で３０
分間反応させた後。
４０５ ｎｍにおける吸光度を測定する。盲検は、酵素
溶液無添加のものについて同様に処理して得られた値と
する。
溶液無添加のものについて同様に処理して得られた値と
する。
このようにして得られた値から、あらかしめ濃度既知の
グリセロール溶液を用いて求めておいた検量線より反応
液中のグリセロール量を定量する。
グリセロール溶液を用いて求めておいた検量線より反応
液中のグリセロール量を定量する。
酵素活性の表示は、１分間に１μｍｏｂのグリセロール
を生成する酵素量をＩＵとする。
を生成する酵素量をＩＵとする。
（ｉ）グリセロール生成活性の割合
グリセロール生成活性の割合が脂肪酸生成活性に対して
少なくとも約１５％有する。
少なくとも約１５％有する。
通常、活性は上述のようにグリセロール生成活性として
表わすが４ グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に
対する割合を知る為には、脂肪酸生成活性を求めること
が必要である。脂肪酸生成活性は、上記と同様の操作で
得られたイソプロパツール抽出液について、市販の遊離
脂肪酸測定用キット（例えば、和光純薬製ＮＥＦＡＣＴ
ｅｓｔ ）を用いて、生成脂肪酸を定量し、１分間に１
μ当量の脂肪酸を生成する酵素量を脂肪酸生成活性のＩ
Ｕとした。
表わすが４ グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に
対する割合を知る為には、脂肪酸生成活性を求めること
が必要である。脂肪酸生成活性は、上記と同様の操作で
得られたイソプロパツール抽出液について、市販の遊離
脂肪酸測定用キット（例えば、和光純薬製ＮＥＦＡＣＴ
ｅｓｔ ）を用いて、生成脂肪酸を定量し、１分間に１
μ当量の脂肪酸を生成する酵素量を脂肪酸生成活性のＩ
Ｕとした。
したがって、グリセロール生成活性の脂肪酸生成活性に
対する割合は、以下の弐にて算出した。
対する割合は、以下の弐にて算出した。
（ｊ）精製方法：後記のとおり。
（ｋｌ結晶構造及び元素分析：確認していない。
本発明のＬＰＬを製造するには１次のごとき方法を採用
することができる。ずなわら、好熱性放線菌を培養し、
その培養物から本発明のＬＰＬを採取することによって
得ることができる。
することができる。ずなわら、好熱性放線菌を培養し、
その培養物から本発明のＬＰＬを採取することによって
得ることができる。
本発明に使用する好熱性放線菌としては１本発明のＬＰ
Ｌを生産しうるちのであれば、いかなるものでもよい。
Ｌを生産しうるちのであれば、いかなるものでもよい。
その−例として、土壌より分離したストレプトミセス（
Ｓｔｒｅ ｔｏｍ ｃｅｓ）７８２５があげられ、その
菌学的性質を以下に示す。
Ｓｔｒｅ ｔｏｍ ｃｅｓ）７８２５があげられ、その
菌学的性質を以下に示す。
尚、菌学的性質を調べる実験方法は、放線菌の同定実験
法〔日本放線菌研究会場、 （１９７５）） 、 ａｔ
生物の化学分類実験法〔駒形和男編、 （１，９８２）
）に記載されている方法に従った。
法〔日本放線菌研究会場、 （１９７５）） 、 ａｔ
生物の化学分類実験法〔駒形和男編、 （１，９８２）
）に記載されている方法に従った。
（ａｌ形態
栄養寒天培地で５０℃で４日間スライド培養したものを
顕微鏡及び走査型電顕で観察した。
顕微鏡及び走査型電顕で観察した。
胞子形成菌糸の分岐法二単純分岐
胞子形成菌糸の形態二面状及びらせん状胞子の数：１０
胞子以上 胞子の表面構造及び大きさ：平滑、直径０．５〜１．０
μｍ Ｘ １．０〜１．５μｍ鞭毛胞子：無 胞子のう：無 胞子柄の着生位置：気菌糸上 菌核形成性：無 （ｂ）以下の各培地における生育状態 ５０ ’ｃで６日間培養後の観察である。
胞子以上 胞子の表面構造及び大きさ：平滑、直径０．５〜１．０
μｍ Ｘ １．０〜１．５μｍ鞭毛胞子：無 胞子のう：無 胞子柄の着生位置：気菌糸上 菌核形成性：無 （ｂ）以下の各培地における生育状態 ５０ ’ｃで６日間培養後の観察である。
■シュークロース・硝酸塩寒天培地
拡散性で平坦な乳白色のコロニー、粉状の茶色気菌糸が
うつすらと着生 ■グルコース・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー、気菌糸は着生せず ■グリセリン・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー、気菌糸は着生−已ず ■スターチ寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー、粉状の茶色気菌糸が
豊富に着生 ■チロシン寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー、粉状の白色気菌
糸がうつすらと着生、コロニー周囲の寒天中に茶色色素
を生成 ■栄養寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー、粉状の灰色気菌
糸が豊富に着生 ■イースト・麦芽寒天培地 拡散性でしわ状の乳白色のコロニー、粉状の灰色気菌糸
が豊富に着生 ■オートミール寒天培地 拡散性で平坦な白色のコロニー、気菌糸は着生せず （Ｃ）生理的性質 ■生育温度範囲：２５〜５５℃ ■ゼラチンの液化：有 ■スクーチの加水分解：有 ■脱脂牛乳の凝固・ペプトン化：無 ■メラニン様色素の生成：有 （ｄｌ各炭素源の同化性 ■Ｌ−アラビノース ± ■Ｄ−キシロース 廿 ■Ｄ−グルコース 叫 ■Ｄ−フラクトース 廿 ■シュークロース 千 ■イノシトール 竹 ■Ｌ−ラムノース 干 ■ラフィノース 干 ■Ｄ−マンニット 廿 廿：強く利用する。グルコースと同等もしくはより良い
。
うつすらと着生 ■グルコース・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー、気菌糸は着生せず ■グリセリン・アスパラギン寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー、気菌糸は着生−已ず ■スターチ寒天培地 拡散性で平坦な乳白色のコロニー、粉状の茶色気菌糸が
豊富に着生 ■チロシン寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー、粉状の白色気菌
糸がうつすらと着生、コロニー周囲の寒天中に茶色色素
を生成 ■栄養寒天培地 拡散性で盛上がった乳白色のコロニー、粉状の灰色気菌
糸が豊富に着生 ■イースト・麦芽寒天培地 拡散性でしわ状の乳白色のコロニー、粉状の灰色気菌糸
が豊富に着生 ■オートミール寒天培地 拡散性で平坦な白色のコロニー、気菌糸は着生せず （Ｃ）生理的性質 ■生育温度範囲：２５〜５５℃ ■ゼラチンの液化：有 ■スクーチの加水分解：有 ■脱脂牛乳の凝固・ペプトン化：無 ■メラニン様色素の生成：有 （ｄｌ各炭素源の同化性 ■Ｌ−アラビノース ± ■Ｄ−キシロース 廿 ■Ｄ−グルコース 叫 ■Ｄ−フラクトース 廿 ■シュークロース 千 ■イノシトール 竹 ■Ｌ−ラムノース 干 ■ラフィノース 干 ■Ｄ−マンニット 廿 廿：強く利用する。グルコースと同等もしくはより良い
。
±：利用するか否か疑わしい。コントロールよりわずか
に良いかグルコースよりはるかに劣る。
に良いかグルコースよりはるかに劣る。
午：利用しない。コントロールと同等でグルコースより
大きく劣る。
大きく劣る。
（ｅ）細胞壁の化学組成
細胞壁タイプ ■
上記の菌学的性質をバージエイのマニュアル・オブ・デ
タミネイティブバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版により検討した結果２
本国株は、ストレプトミセスμセ至ｌ卵μ、ｅｓ）属に
属するものと同定れた。さらに種の検索を行ったところ
、胞子の色胞子柄の形態、胞子の表面構造、メラニン様
色素の生産及び炭素源の利用性において、ストレプトミ
セス・ガルバス（Ｓｔｒｅ ｔｏｍ ｃｅｓ ｇａｌ
ｂｕｓ）の性質とほぼ一致した。しかし、Ｌ−アラビノ
ースの利用性および基体菌糸の色において差異が見られ
たので、ストレプトミセス・ガルバスに近縁の種である
が、同一種ではないと判断し、ストレプトミセス（Ｓｔ
ｒｅ ｔｏｍ ｃｅｓ）７８２５と命名して工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した（？ｆＸ工研菌寄第９
９８３号、 ＦＥＲＭ Ｐ−９９８３）。
タミネイティブバクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版により検討した結果２
本国株は、ストレプトミセスμセ至ｌ卵μ、ｅｓ）属に
属するものと同定れた。さらに種の検索を行ったところ
、胞子の色胞子柄の形態、胞子の表面構造、メラニン様
色素の生産及び炭素源の利用性において、ストレプトミ
セス・ガルバス（Ｓｔｒｅ ｔｏｍ ｃｅｓ ｇａｌ
ｂｕｓ）の性質とほぼ一致した。しかし、Ｌ−アラビノ
ースの利用性および基体菌糸の色において差異が見られ
たので、ストレプトミセス・ガルバスに近縁の種である
が、同一種ではないと判断し、ストレプトミセス（Ｓｔ
ｒｅ ｔｏｍ ｃｅｓ）７８２５と命名して工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託した（？ｆＸ工研菌寄第９
９８３号、 ＦＥＲＭ Ｐ−９９８３）。
次に本国を用いて本発明のＬＰＩ、を製造する方法につ
いて説明すると、本国は、誘導物質を含有する適当な栄
養培地を用いて１通常の液体培養を行うことにより本発
明のＬＰＬを培地中に分泌させることができる。培養終
了後、培養濾液を回収し２種々の方法により精製を行う
ことによって本発明のＬＰＬの標品を得ることができる
。
いて説明すると、本国は、誘導物質を含有する適当な栄
養培地を用いて１通常の液体培養を行うことにより本発
明のＬＰＬを培地中に分泌させることができる。培養終
了後、培養濾液を回収し２種々の方法により精製を行う
ことによって本発明のＬＰＬの標品を得ることができる
。
すなわち、まず１本国の培養方法について具体的に説明
すると１本国によるＬＰＬの合成は誘導的に行われる為
、培地中に誘導物質を添加することが望まれる。誘導物
質としては、油脂類及び脂肪酸が用いられ、油脂類の具
体例としてラード。
すると１本国によるＬＰＬの合成は誘導的に行われる為
、培地中に誘導物質を添加することが望まれる。誘導物
質としては、油脂類及び脂肪酸が用いられ、油脂類の具
体例としてラード。
バター、魚油、鯨油などの動物性油脂、あるいはオリー
ブ油、大豆油、米ぬか油、綿実油、ごま油のような植物
性油脂、また脂肪酸の具体例としてオレイン酸、パルミ
チン酸、リルン酸などがあげられる。これらの誘導物質
は０．１〜３％添加するのが良好であるが、この範囲に
限定されるものではない。それ以外の培地組成としては
、放線菌の培養で通常用いられる炭素源、窒素源及び無
機塩類等を用いればよい。炭素源としては１例えばグル
コース、グリセロール、可溶性デンプンなどが使用でき
る。また窒素源としては１例えばペプトン、尿素、硫安
、コーンステイープリカー、脱脂大豆粉、イーストエキ
ス、肉エキス等が使用できる。無機塩類としては２例え
ばリン酸、カリウム、ナトリウム、硫酸マグネシウムな
どが用いられる。さらに、ＬＰＬの培地中への分泌を促
すために、界面活性剤の添加が有効である。特に非イオ
ン系界面活性剤であるツイーン４０．ツイーン６０、ツ
イーン８０等を０．０５〜０．５％培地に添加すること
がより望ましい。培地のｐＨとしては、中性付近とし９
通気攪拌などの好気条件で培養すれば良好な結果が得ら
れる。培養温度としては、３０℃付近から５０℃の範囲
で行えばよいが、培養日数を短縮できることから５０℃
付近で行行うのがより好ましい。このような条件で約４
日間培養することにより、培地中にＬＰＬを著量蓄積さ
せることができる。
ブ油、大豆油、米ぬか油、綿実油、ごま油のような植物
性油脂、また脂肪酸の具体例としてオレイン酸、パルミ
チン酸、リルン酸などがあげられる。これらの誘導物質
は０．１〜３％添加するのが良好であるが、この範囲に
限定されるものではない。それ以外の培地組成としては
、放線菌の培養で通常用いられる炭素源、窒素源及び無
機塩類等を用いればよい。炭素源としては１例えばグル
コース、グリセロール、可溶性デンプンなどが使用でき
る。また窒素源としては１例えばペプトン、尿素、硫安
、コーンステイープリカー、脱脂大豆粉、イーストエキ
ス、肉エキス等が使用できる。無機塩類としては２例え
ばリン酸、カリウム、ナトリウム、硫酸マグネシウムな
どが用いられる。さらに、ＬＰＬの培地中への分泌を促
すために、界面活性剤の添加が有効である。特に非イオ
ン系界面活性剤であるツイーン４０．ツイーン６０、ツ
イーン８０等を０．０５〜０．５％培地に添加すること
がより望ましい。培地のｐＨとしては、中性付近とし９
通気攪拌などの好気条件で培養すれば良好な結果が得ら
れる。培養温度としては、３０℃付近から５０℃の範囲
で行えばよいが、培養日数を短縮できることから５０℃
付近で行行うのがより好ましい。このような条件で約４
日間培養することにより、培地中にＬＰＬを著量蓄積さ
せることができる。
次に本発明のＬ Ｐ Ｌの精製方法に一ついて説明する
と、まず、培養終了後、培養液から菌体を除き濾液を回
収するが、菌体の除去は、遠心分離や濾過で行うことが
できる。濾液からの精製としては従来よく知られている
糸状菌の菌体外酵素などに用いられる精製方法が広く適
用できる。すなわち硫安塩析あるいはアセトン、アルコ
ール等を用いる有機溶媒沈殿などの種々の方法で不溶化
せして粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に精
製された酵素標品を得るには、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疏水性クロマト
グラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いることが
できる。本発明のＬＰＬは。
と、まず、培養終了後、培養液から菌体を除き濾液を回
収するが、菌体の除去は、遠心分離や濾過で行うことが
できる。濾液からの精製としては従来よく知られている
糸状菌の菌体外酵素などに用いられる精製方法が広く適
用できる。すなわち硫安塩析あるいはアセトン、アルコ
ール等を用いる有機溶媒沈殿などの種々の方法で不溶化
せして粗酵素標品を得ることができる。さらに高度に精
製された酵素標品を得るには、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疏水性クロマト
グラフィー等の各種クロマトグラフィーを用いることが
できる。本発明のＬＰＬは。
疏水性が強い為に、特に疏水性クロマトグラフィーを用
いた場合、精製倍率が高くなり、より好ましい。上記の
ような方法により１本発明のＬＰＬの標品が得られる。
いた場合、精製倍率が高くなり、より好ましい。上記の
ような方法により１本発明のＬＰＬの標品が得られる。
本発明のＬＰＬは２熱に対して非常に安定であるから、
従来のＬＰＬと比較して、これを長期間保存することが
できる。このため３本発明のＬＰＬを利用する場合、非
常に有効である。例えば血液の生化学的検査項目の一つ
である血中のトリグリセリドを酵素法によって測定する
定量用試薬にＬＰＬが使われていることはよく知られて
いる。
従来のＬＰＬと比較して、これを長期間保存することが
できる。このため３本発明のＬＰＬを利用する場合、非
常に有効である。例えば血液の生化学的検査項目の一つ
である血中のトリグリセリドを酵素法によって測定する
定量用試薬にＬＰＬが使われていることはよく知られて
いる。
その測定原理は、血中のトリグリセリドをＬ Ｐ Ｌに
より加水分解し２生成したグリセロールを酵素法により
定量するものである。このグリセロールを定量するには
、グリセロールキリー−ゼを用い生成物であるＡＤＰや
グリセロール３リン酸を共役酵素系で定量するか、グリ
セＩ：ｌ−ル脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨの増加を直接
定量するか、あるいはグリセロール酸化酵素を用い、生
成される過酸化水素を発色糸に導き定量すればよいが、
その中でも共役酵素系で定量することが好ましい。
より加水分解し２生成したグリセロールを酵素法により
定量するものである。このグリセロールを定量するには
、グリセロールキリー−ゼを用い生成物であるＡＤＰや
グリセロール３リン酸を共役酵素系で定量するか、グリ
セＩ：ｌ−ル脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨの増加を直接
定量するか、あるいはグリセロール酸化酵素を用い、生
成される過酸化水素を発色糸に導き定量すればよいが、
その中でも共役酵素系で定量することが好ましい。
この共役酵素系としては７例えばグリセ１：１−ルキナ
ーゼ、グリセロール３リン酸酸化酵素及びパーオキシダ
ーゼの３種類の酵素を用いるが、これらの酵素のメーカ
ーや起源は特に限定されず、試薬中に２００〜５００１
Ｊ程度含有さ・Ｕればよい。
ーゼ、グリセロール３リン酸酸化酵素及びパーオキシダ
ーゼの３種類の酵素を用いるが、これらの酵素のメーカ
ーや起源は特に限定されず、試薬中に２００〜５００１
Ｊ程度含有さ・Ｕればよい。
また、緩衝液も特に限定されるものではないが共役酵素
の作用に適している弱酸性領域の緩衝液を用いることが
好ましく、濃度も１０〜１００ｍＭが適当である。グリ
セロールキナーゼの反応に必要なＡ Ｔ Ｐ Ｎａｚ・
３１１ｚＯ及びＭ ｇ ＣＩＩ ２ ＪｌｌｚＯは各々
２０〜３０ｍｇ及び３〜５０■添加すればよい。
の作用に適している弱酸性領域の緩衝液を用いることが
好ましく、濃度も１０〜１００ｍＭが適当である。グリ
セロールキナーゼの反応に必要なＡ Ｔ Ｐ Ｎａｚ・
３１１ｚＯ及びＭ ｇ ＣＩＩ ２ ＪｌｌｚＯは各々
２０〜３０ｍｇ及び３〜５０■添加すればよい。
さらにパーオキシダーゼの基質となる４アミノアンチピ
リンと色原体を添加するが１色原体としては、フェノー
ル誘導体、アニリン誘導体及びトルイジン誘導体等の中
から任意に選択することができる。また１色原体の溶解
性を増すために、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を
加える方がより好ましい。
リンと色原体を添加するが１色原体としては、フェノー
ル誘導体、アニリン誘導体及びトルイジン誘導体等の中
から任意に選択することができる。また１色原体の溶解
性を増すために、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を
加える方がより好ましい。
以上のようにして調製した定量用試薬１ｍｌに血清を希
釈せずに数μｌ添加し、さらに本発明のＬＰＬ （５〜
１０ Ｕ／ ｍｌｌ ）を数μ！添加した後。
釈せずに数μｌ添加し、さらに本発明のＬＰＬ （５〜
１０ Ｕ／ ｍｌｌ ）を数μ！添加した後。
キュベツト中でインキュベートすることにより血清中の
トリグリセリドの量に対応して色原体の発色が生じるの
で、その発色を吸光度で測定することにより、トリグリ
セリドを定量することができる。
トリグリセリドの量に対応して色原体の発色が生じるの
で、その発色を吸光度で測定することにより、トリグリ
セリドを定量することができる。
（実施例）
以下に本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１
ペプトン０．５％（重量％を表ず、以下同様）ＫＨｚＰ
Ｏ４０，１％、 Ｎａ２ＩＩＰＯ４’ １２１１２００
．１％、 ｈｓＯ４・７１１□Ｏ０，０５％、酵母エキ
ス０．０３％、オリーブ油０．２％、ツウイーン４０
０．５％、 ｐｌ＋ ７．０よりなる培地１００ｍ＃を
５００ｍＡ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分
間オートクレーブ滅菌した。
Ｏ４０，１％、 Ｎａ２ＩＩＰＯ４’ １２１１２００
．１％、 ｈｓＯ４・７１１□Ｏ０，０５％、酵母エキ
ス０．０３％、オリーブ油０．２％、ツウイーン４０
０．５％、 ｐｌ＋ ７．０よりなる培地１００ｍ＃を
５００ｍＡ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分
間オートクレーブ滅菌した。
他方、同組成の培地５ｍｌでストレプトミセス（Ｓｔｒ
ｅｔｏｍｃｅｓ ） ７８２５ （ｍ工研菌寄第９９８
３−号。
ｅｔｏｍｃｅｓ ） ７８２５ （ｍ工研菌寄第９９８
３−号。
ＦＥＲＭ Ｐ−９９８３）を試験管培養した。
この培養液を前記培地に植菌し、５０℃で３日間回転振
と・う培養し、ジャーファーメンタ−の種培養とした。
と・う培養し、ジャーファーメンタ−の種培養とした。
同様の前記培地２βを３４容のジャーファーメンタ−に
仕込み、１２１ ℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、
これに種培養１００ｍＡを植菌後、５０℃、 ４００
ｒｐｍ 、 ＩＶＶＭの通気条件下で培養した。
仕込み、１２１ ℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、
これに種培養１００ｍＡを植菌後、５０℃、 ４００
ｒｐｍ 、 ＩＶＶＭの通気条件下で培養した。
培養開始後３日目の培養濾液をアッセイしたところ、０
．２ Ｕ／ｍ！！のＬＰＬが蓄積されていた。この時点
で培養を終了し、濾過により菌体を除き培養濾液を回収
した。
．２ Ｕ／ｍ！！のＬＰＬが蓄積されていた。この時点
で培養を終了し、濾過により菌体を除き培養濾液を回収
した。
あらかしめ２５ｍＭリン酸バッファーｐｌ＋７．０で平
衡化したフェニルセファロースカラム（サイズ４゜４ｃ
ｍφ×１００Ｉｎ）に培養濾液をアプライしたところＬ
Ｐ Ｌが吸着されたので、同ハ・ツファーで十分洗浄
した後、１％トリトンＸ−１００を含む同バッファーに
切り換えた。１％トリトンＸ−１００含有バッファーに
より、ＬＰＬかシャープなピークとして溶出された。そ
の活性画分を回収し、限外澱、過法により濃縮した後、
０．１％トリトンＸ−１００含有同バッファーで平衡化
したセファデックスＧ７５カラ１、（サイズ２．″′岬
φＸ９Ｑｃｍ）にアプライしたｉＬ ｌ−リＩ・ン含
有同バッファーを送液したところ、タンパクピークと活
性ピークが一致した。
衡化したフェニルセファロースカラム（サイズ４゜４ｃ
ｍφ×１００Ｉｎ）に培養濾液をアプライしたところＬ
Ｐ Ｌが吸着されたので、同ハ・ツファーで十分洗浄
した後、１％トリトンＸ−１００を含む同バッファーに
切り換えた。１％トリトンＸ−１００含有バッファーに
より、ＬＰＬかシャープなピークとして溶出された。そ
の活性画分を回収し、限外澱、過法により濃縮した後、
０．１％トリトンＸ−１００含有同バッファーで平衡化
したセファデックスＧ７５カラ１、（サイズ２．″′岬
φＸ９Ｑｃｍ）にアプライしたｉＬ ｌ−リＩ・ン含
有同バッファーを送液したところ、タンパクピークと活
性ピークが一致した。
この活性画分を回収し、濃縮後５ＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動を行ったところ、単一なバンドが得られた
。
ミド電気泳動を行ったところ、単一なバンドが得られた
。
この酵素標品の比活性は、１．２Ｕ／Ｑ？であった。
なお、蛋白質量は、ワングースミス（Ｗａｎｇ−３ｍｉ
ｔｈ）法〔アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌ。
ｔｈ）法〔アナリテイカル・バイオケミストリー（Ａ
ｎａｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、） ６３．４１４ （１９７５） ）
で定量した。
で定量した。
得られた精製酵素を用いて、酵素の理化学的性質を調べ
たところ、前記したとおりの結果が得られた。
たところ、前記したとおりの結果が得られた。
特に、耐熱性に関しては、市販の他の微生物由来のＬＰ
Ｌに比較して、はるかに優れていた。すなわち、シュー
ドモナス属由来ＬＰＬ （東洋紡社製）をｐｎ ７．０
（この酵素が最も安定なｐＨ）で、アルカリ土類糸属
山来Ｌ Ｐ Ｌ、 （泡糊産業社製）をｐＨ８，０（こ
の酵素が最も安定なｐＨ）でそれぞれ６０℃で１５分間
処理した後の残存活性は、各々約７０％及び約０％であ
ったのに対して５本発明のＬ ＰＬは、 ｐｌｌ ５．
０ （この酵素が最も安定なｐｌｌ）で同様に処理した
後の残存活性が、はぼ１００％であった。
Ｌに比較して、はるかに優れていた。すなわち、シュー
ドモナス属由来ＬＰＬ （東洋紡社製）をｐｎ ７．０
（この酵素が最も安定なｐＨ）で、アルカリ土類糸属
山来Ｌ Ｐ Ｌ、 （泡糊産業社製）をｐＨ８，０（こ
の酵素が最も安定なｐＨ）でそれぞれ６０℃で１５分間
処理した後の残存活性は、各々約７０％及び約０％であ
ったのに対して５本発明のＬ ＰＬは、 ｐｌｌ ５．
０ （この酵素が最も安定なｐｌｌ）で同様に処理した
後の残存活性が、はぼ１００％であった。
次に本発明のＬＰＬのグリセロール生成活性の脂肪酸生
成活性に対する割合を測定したところ１６％という値が
得られ、シュードモナス属由来ＬＰＬ （東洋紡社製）
の１．９７％に比較し、はるかに高い値であった。
成活性に対する割合を測定したところ１６％という値が
得られ、シュードモナス属由来ＬＰＬ （東洋紡社製）
の１．９７％に比較し、はるかに高い値であった。
実施例２
実施例１で得られたＬＰＩ、を用いて調装した定量用試
薬で血中のｌ・リグリセリドを測定した。測定は、ＬＰ
Ｉ−により血中Ｉ・リグリセリドを加水分解し、生成し
たグリセロールをグリセロールキナーゼとグリセロール
−３−リン酸オキシダーゼとパーオキシダーゼとの共役
酵素系で測定した。
薬で血中のｌ・リグリセリドを測定した。測定は、ＬＰ
Ｉ−により血中Ｉ・リグリセリドを加水分解し、生成し
たグリセロールをグリセロールキナーゼとグリセロール
−３−リン酸オキシダーゼとパーオキシダーゼとの共役
酵素系で測定した。
グリセロール発色液
５％トリトンＸ −１００４ｍｌ。
Ｎ、 Ｎ −ソエチ）シーｍ−）ルイシン
４０ μ β４−アミノアンチピリン
４■ＡＴ Ｐ Ｎａ２・３Ｈｚ０ ２５
ｍｇＭｇＣＡ２・６１１□０ ４０■グ
リセロールキナーゼ ２００Ｕグリセトルー
３−リン酸オキシターセ ５００
Ｕパーオキシダーゼ ３００プルプロガリンＵ上記グ
リセロ一ル発色液を５０ｍＭ ＭＩＥＳバッファーｐＨ
６，５に溶かし、全量を２００ ｍｌにした。このグリ
セロール発色液１ｍｌに血清１０μｌを加え。
４０ μ β４−アミノアンチピリン
４■ＡＴ Ｐ Ｎａ２・３Ｈｚ０ ２５
ｍｇＭｇＣＡ２・６１１□０ ４０■グ
リセロールキナーゼ ２００Ｕグリセトルー
３−リン酸オキシターセ ５００
Ｕパーオキシダーゼ ３００プルプロガリンＵ上記グ
リセロ一ル発色液を５０ｍＭ ＭＩＥＳバッファーｐＨ
６，５に溶かし、全量を２００ ｍｌにした。このグリ
セロール発色液１ｍｌに血清１０μｌを加え。
３７℃で３分間ブレインキュベーションを行い５４５ｎ
ｍの吸光度を読み取った後、実施例１で得たＬ Ｐ Ｌ
（５〜ｌ ＯＵ／ｍ ｊ２に調整）を５μＡ添加し。
ｍの吸光度を読み取った後、実施例１で得たＬ Ｐ Ｌ
（５〜ｌ ＯＵ／ｍ ｊ２に調整）を５μＡ添加し。
３７”Ｃでインキュベーションを行い５４５ｎｍでの吸
光度を測定した。
光度を測定した。
１０分後、一定値に達した吸光度より、吸光度の増加分
（△Ａ３４５ ）を求め、以下の式によりトリグリセリ
ド量を算出した。
（△Ａ３４５ ）を求め、以下の式によりトリグリセリ
ド量を算出した。
トリグリセリド ｔＵ（■トリオレイン／ｄ［） ＝
△Ａ３４５Ｘ１．０１５Ｘ８Ｂ５．４５２８．２ Ｘ
Ｏ，５Ｘ Ｉ Ｘ Ｏ，０１Ｘ １０△Ａ３４５ ：
５４５ ｎｍの吸光度の増加分２８．２ ：色素の分子
吸光係数（／２７ｍ ｍｏｊｌ！／ｃｍ）０．５ ：
Ｈ２０□の１分子から形成される色素が１７２分子であ
ることによる係数 １：セルの光路長（印） ８８５．４５： ）リオレインの分子量上記の定量用試
薬で、市販の管理血清（和光純薬社製）２種類（１０４
＋ｗ／ｄ ７！、２８０ ｍｌｄ Ｒの表示）のトリグ
リセリド量を測定したとごろ、各々１０４ｍｇ／ｄ／！
、２８０ ｍｇ ／ ｄ ｊ２と求まった。
△Ａ３４５Ｘ１．０１５Ｘ８Ｂ５．４５２８．２ Ｘ
Ｏ，５Ｘ Ｉ Ｘ Ｏ，０１Ｘ １０△Ａ３４５ ：
５４５ ｎｍの吸光度の増加分２８．２ ：色素の分子
吸光係数（／２７ｍ ｍｏｊｌ！／ｃｍ）０．５ ：
Ｈ２０□の１分子から形成される色素が１７２分子であ
ることによる係数 １：セルの光路長（印） ８８５．４５： ）リオレインの分子量上記の定量用試
薬で、市販の管理血清（和光純薬社製）２種類（１０４
＋ｗ／ｄ ７！、２８０ ｍｌｄ Ｒの表示）のトリグ
リセリド量を測定したとごろ、各々１０４ｍｇ／ｄ／！
、２８０ ｍｇ ／ ｄ ｊ２と求まった。
一方、この管理血清を、水酸化カリウムでＬＪん化する
方法（クリニカ・キミ力・アクタ（Ｃｌ１ｎ。
方法（クリニカ・キミ力・アクタ（Ｃｌ１ｎ。
Ｃｈｉｍ、 Ａｃｔａ ）２２．３９３ （１９６８）
参照）でトリグリセリド量を算出したところ、各々１０
３ ｍｇ／ ｄ Ｉｌ 、 ２７９■／ｄβと求まり１
本発明のＬＰＬを用いた定量用試薬による値とよく一致
していた。
参照）でトリグリセリド量を算出したところ、各々１０
３ ｍｇ／ ｄ Ｉｌ 、 ２７９■／ｄβと求まり１
本発明のＬＰＬを用いた定量用試薬による値とよく一致
していた。
また１本発明のＬＰＬを用いて調製したトリグリセリド
定量用試薬において、吸光度が一定値に達するまでの時
間は約８分であったのに対し１本発明のＬＰＬに代えて
、シュードモナス属由来のＬＰＬ （東洋紡社製）を用
いて調製した定量用試薬においては、吸光度が一定値に
なるのに要する時間は２３分であった。
定量用試薬において、吸光度が一定値に達するまでの時
間は約８分であったのに対し１本発明のＬＰＬに代えて
、シュードモナス属由来のＬＰＬ （東洋紡社製）を用
いて調製した定量用試薬においては、吸光度が一定値に
なるのに要する時間は２３分であった。
これより１本発明のＬ Ｔ： Ｌを用いて調製した定量
用試薬は、測定時間を大幅に短縮させることが可能にな
った。
用試薬は、測定時間を大幅に短縮させることが可能にな
った。
さらに上記のグリセロール発色液に実施例１で得たＬＰ
Ｌ （８Ｕ／ ｍｊりを５μβ添加した本発明の定量用
試薬と、同グリセロール発色液にシュードモナス属由来
のＬＰＬＣ（東洋紡社製）８Ｕ／ｍｌ〕を５μｌ添加し
た従来の定量用試薬とをそれぞれ２５℃で４日間放置さ
せた後に、その定量用試薬で上記の管理血清のトリグリ
セリ１ζを定量した。
Ｌ （８Ｕ／ ｍｊりを５μβ添加した本発明の定量用
試薬と、同グリセロール発色液にシュードモナス属由来
のＬＰＬＣ（東洋紡社製）８Ｕ／ｍｌ〕を５μｌ添加し
た従来の定量用試薬とをそれぞれ２５℃で４日間放置さ
せた後に、その定量用試薬で上記の管理血清のトリグリ
セリ１ζを定量した。
その結果２本発明の定量用試薬は、測定開始８分後にト
リグリセリドを１００％検出することができたが、従来
の定量用試薬は、同じ８分後に８０％しか検出すること
ができなかった。
リグリセリドを１００％検出することができたが、従来
の定量用試薬は、同じ８分後に８０％しか検出すること
ができなかった。
（発明の効果）
本発明のＬＰＬば、従来知られているＬＰＬに比べ、は
るかに熱安定性に優れ、かつグリセロール生成活性の脂
肪酸生成活性に対する割合が高いので、検査試薬として
用いた場合、そのライフタイムが著しく延長されるとと
もに１検体の測定に要する時間が短縮されるため、産業
界に与えるメリットは甚大である。
るかに熱安定性に優れ、かつグリセロール生成活性の脂
肪酸生成活性に対する割合が高いので、検査試薬として
用いた場合、そのライフタイムが著しく延長されるとと
もに１検体の測定に要する時間が短縮されるため、産業
界に与えるメリットは甚大である。
第１図は２本発明のＬ Ｐ Ｌの至適ｐＨ曲線、第２図
は１本発明のＬＰＬのｐｏ安定性曲線、第３図は本発明
のＬＰＬの作用適温曲線、第４図は１本発明のＬＰＬの
熱安定性（耐熱性）曲線を示す。
は１本発明のＬＰＬのｐｏ安定性曲線、第３図は本発明
のＬＰＬの作用適温曲線、第４図は１本発明のＬＰＬの
熱安定性（耐熱性）曲線を示す。
Claims (3)
- （１）以下の理化学的性質を有する耐熱性のリポプロテ
インリパーゼ。 （イ）作用 リポプロテイン中のトリグリセリドに作用 し、グリセロールと脂肪酸に加水分解する。 （ロ）耐熱性（熱安定性） 約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理した のちの活性が処理前の活性の約１００％の値を保持して
いる。 （ハ）グリセロール生成活性の割合 グリセロール生成活性の割合が脂肪酸生成 活性に対して少なくとも約１５％有する。 - （２）好熱性放線菌を培養し、培養物から耐熱性のリポ
プロテインリパーゼを採取することを特徴とする耐熱性
のリポプロテインリパーゼの製造法。 - （３）リポプロテインリパーゼを含有する体液中のトリ
グリセリドを定量するトリグリセリド定量用試薬におい
て、リポプロテインリパーゼが請求項１記載のリポプロ
テインリパーゼであることを特徴とするトリグリセリド
定量用試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63199639A JP2693786B2 (ja) | 1988-08-09 | 1988-08-09 | 耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬 |
| EP89114726A EP0354551B1 (en) | 1988-08-09 | 1989-08-09 | Thermostable lipoprotein lipase, process for producng the same, and triglyceride determining reagent using the same |
| US07/391,017 US5173417A (en) | 1988-08-09 | 1989-08-09 | Thermostable lipoprotein lipase, process for producing the same, and triglyceride determining reagent using the same |
| DE68924738T DE68924738T2 (de) | 1988-08-09 | 1989-08-09 | Hitzestabile Lipoproteinlipase, Verfahren zu deren Herstellung sowie ein Reagenz zur Bestimmung von Triglyceriden, welches diese Lipase enthält. |
| US07/929,743 US5244798A (en) | 1988-08-09 | 1992-08-17 | Reagent for determining triglycerides comprising a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces |
| US07/929,744 US5232846A (en) | 1988-08-09 | 1992-09-03 | Method for producing a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63199639A JP2693786B2 (ja) | 1988-08-09 | 1988-08-09 | 耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0249581A true JPH0249581A (ja) | 1990-02-19 |
| JP2693786B2 JP2693786B2 (ja) | 1997-12-24 |
Family
ID=16411196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63199639A Expired - Lifetime JP2693786B2 (ja) | 1988-08-09 | 1988-08-09 | 耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5173417A (ja) |
| EP (1) | EP0354551B1 (ja) |
| JP (1) | JP2693786B2 (ja) |
| DE (1) | DE68924738T2 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK73592D0 (da) * | 1992-06-03 | 1992-06-03 | Novo Nordisk As | Nyt enzym |
| DE69333065T2 (de) * | 1992-12-22 | 2004-04-01 | Novozymes A/S | Alkalische lipase |
| FR2824334B1 (fr) | 2001-05-03 | 2003-10-10 | Coletica | Procede pour tester une substance eventuellement active dans le domaine de la lipolyse et son utilisation principalement cosmetique |
| EP1459064B1 (en) * | 2001-12-28 | 2008-02-13 | Polymer Technology Systems, Inc. | Test strip for determining concentration of triglycerides |
| EP1668124A2 (en) * | 2003-09-30 | 2006-06-14 | Goldschmidt GmbH | Thermostable hydrolase |
| CA2563507C (en) | 2004-04-16 | 2015-03-31 | Idexx Laboratories, Inc. | Canine pancreatic lipase |
| WO2006076034A2 (en) * | 2004-05-21 | 2006-07-20 | Bhanu, Kalra | Stabilized two component system for chemilumiescent assay in immunodiagnostics |
| AU2008312575B2 (en) * | 2007-10-15 | 2012-02-23 | Idexx Laboratories, Inc. | Feline pancreatic lipase |
| US20180179574A1 (en) * | 2015-09-03 | 2018-06-28 | The University Of Chicago | Systems and methods for characterization of hypertriglyceridemia |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3431175A (en) * | 1964-07-18 | 1969-03-04 | Amano Pharma Co Ltd | Method for the preparation of a lipoprotein lipase by cultivating organisms |
| US4283494A (en) * | 1978-04-26 | 1981-08-11 | Meito Sangyo Kabushiki Kaisha | Microbial lipase, process for its preparation and microbiologically pure culture therefor |
-
1988
- 1988-08-09 JP JP63199639A patent/JP2693786B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-08-09 EP EP89114726A patent/EP0354551B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-09 DE DE68924738T patent/DE68924738T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-08-09 US US07/391,017 patent/US5173417A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-08-17 US US07/929,743 patent/US5244798A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5244798A (en) | 1993-09-14 |
| DE68924738T2 (de) | 1996-05-02 |
| EP0354551B1 (en) | 1995-11-08 |
| JP2693786B2 (ja) | 1997-12-24 |
| EP0354551A2 (en) | 1990-02-14 |
| EP0354551A3 (en) | 1991-05-29 |
| DE68924738D1 (de) | 1995-12-14 |
| US5173417A (en) | 1992-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5232846A (en) | Method for producing a thermostable lipoprotein lipase from streptomyces | |
| US4241178A (en) | Process and composition for the quantification of glycerol ATP and triglycerides | |
| CA1054907A (en) | Method and composition for blood serum cholesterol analysis | |
| JPH0249581A (ja) | 耐熱性のリポプロテインリパーゼとその製造法及びそれを用いた定量用試薬 | |
| DE3249973C2 (ja) | ||
| US4999289A (en) | Lipase, its production and use for assay of triglycerides | |
| JPS60114193A (ja) | 新規なマルトースデヒドロゲナーゼおよびその製法それを用いる分析法 | |
| US4387163A (en) | Process for producing the enzyme cholesterol esterase and for hydrolyzing cholesterol esters of fatty acids by using the enzyme itself | |
| EP0148950A1 (en) | Process for preparing bilirubin oxidase | |
| WO1997031103A1 (en) | Method for determining 1,5-anhydroglucitol | |
| TW201918551A (zh) | Myrmecridium flexuosumNUK-21菌株及其生產之新穎乳糖氧化酵素與轉化乳糖酸方法 | |
| Sani et al. | Isolation, partial purification and characterization of α-amylase from Bacillus subtilis | |
| JP2647684B2 (ja) | トリグリセリドの分析用試薬および分析方法 | |
| JP2017158441A (ja) | カタラーゼ | |
| Fiedurek et al. | Catalase activity in arctic microfungi grown at different temperatures | |
| JP5470906B2 (ja) | カタラーゼ | |
| JPS6362195B2 (ja) | ||
| JPH03996B2 (ja) | ||
| SU1168103A3 (ru) | Способ определени общего холестерина в сыворотке крови | |
| Borisov et al. | Production and chracterization of lipase from Pseudozyma antarctica NBIMCC 8340 | |
| JPS62138191A (ja) | 微生物リポプロテインリパ−ゼの製造方法 | |
| JPS62239990A (ja) | 新規リパーゼ | |
| JPS633594B2 (ja) | ||
| JP3649765B2 (ja) | 新規なグリセロールキナーゼおよびその製造法 | |
| Pure | PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF MUCOR JANSENII LIPASE ISOLATED FROM COCOA PROCESSING PLANT EFFLUENTS IN ILE-OLUJI, ONDO STATE, NIGERIA |