JPH0249582A - 菌体内のリパーゼ活性を高める培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は微生物菌体を用いる酵素反応方法に関する。更
に詳しくは、油脂類のエステル交換反応、加水分解反応
、更には、脂肪酸とグリセロール、脂肪酸とアルコール
類、モノグリセリドまたはジグリセリドと脂肪酸の間な
どでのエステル合成反応等に微生物菌体内に包蔵された
リパーゼを利用するに際し、微生物菌体内のリパーゼ活
性を高める培養方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、上述の如きリパーゼを利用するエステル交換反応
、エステル合成反応、加水分解反応には精製酵素あるい
は粗酵素、即ち菌体外酵素が利用されている（例えばＡ
、Ｒ，Ｍａｃｒａｅ、　Ｊ、Ａｍ、Ｏｆｌ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、　６０，２４３　（１９８３）、　：　Ｒ，
Ａ、Ｗｉｓｄｏｍ　ｅｔ　ａ＋、、　Ｂｉｏｔｅｃｎｏ
ｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　２９．１０８１　（１９８７）
：特公昭５７２８５１９：　　特開昭５２−１０４５０
６：特開昭６０−２５１８９１：特開昭６０−２０３１
９６など）。更に、これらリパーゼは、酵素の回収利用
、安定化をはかるためにセライト等の支持担体に固定化
して利用されている。

しかし乍ら、本発明者らの検討結果によれば、この様な
固定化酵素法では反応基質と酵素の接触機会が充分に提
供されず、工業的には充分な反応速度が得られない、精
製酵素の価格が高いなど、経済的に非常に不利である。

本発明者らは上述の如き精製酵素を利用する際の欠点を
解決する方法として、リパーゼ生成能を有する微生物を
培養しリパーゼを菌体内に包蔵させたまま、直接菌体を
リパーゼ酵素として利用する方法をすでに報告している
。更に菌体を利用する上記方法においては、微生物保持
材と共に培養し微生物保持材に付着、固定化増殖させる
ことによって、その活性を上昇させ得ることもすでに報
告している（例えば特ｌｌＮ昭６１−２９３’７５４　
）。

〔発明が解決しようとする問題点〕

微生物保持材に固定化増殖させる方法においては、安定
して高いリパーゼ活性が得られることは既に報告してい
る通りだが、これらの方法は単純な回分培養であり、培
養初期に多量の基質（栄養物）を仕込む必要がある。し
かし、この様な回分培養においては菌体収率が非常に低
いことから、これらの基質が全て有効に菌体生産及びリ
パーゼ生産に利用されておらず、従って工業的に不必要
にリパーゼ製造コストを上昇させている。そこで工業的
、経済的には培地栄養源を有効にリパーゼ生産に寄与さ
せ、無駄なく利用する方法の開発が要請されている。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上述の如き課題を解決し、微生物保持材を
含む培養系に適用され得る培地栄養源の有効利用法につ
いて鋭意検討した結果、流加培養において比基質供給速
度（微生物保持材内に固定化された単位菌体量光たり、
単位時間に供給される栄養物の量）と微生物保持材に固
定化された菌体のエステル交換活性の間に一定の相関関
係が存在することを見出した。そして、菌体増殖に合わ
せて基質流加量を変化させ、比基質供給速度を最適範囲
にコントロールすることによって、基質を無駄なく利用
でさるばかりでなく、その活性を回分培養に比べて更に
上昇させ得ることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明はリパーゼ生成能を有する微生物を微生物
保持材と共に培養するに際し、比基質供給速度を一定の
値にコントロールすることを特徴とする、菌体内のリパ
ーゼ活性を高める流加培養方法を内容とするものである
。

本発明における具体的な培養操作は次の如くである。即
ち、予め微生物保持材が加えられた培養槽を公知の方法
、例えば蒸気殺菌で殺菌する。次に少量の栄養源（打機
窒素＃）、無機塩、例えば、ＮａＮＯ３ｏ、　１％、Ｋ
Ｈ，Ｐｏ、　０．１％、ＭｇＳＯ４４１１□００．０５
％、及び菌体内のリパーゼ活性を高めるために加えられ
る基質関連物質を含んだ水溶液を別の容器で同様に殺菌
した後、無菌的に培養槽に加える。

リパーゼ生成能を有する微生物は公知の方法で前培養さ
れ、無菌的に植菌される。１０〜２０時間回分培養され
た後、あらかじめ別の容器で殺菌された有機窒素源を主
成分とする栄養物を比基質供給速度が０．０３〜０．１
ｇ栄養物／ｇ−ｃｅｌｌ−ｈｒ、好ましくは０．０４〜
０．０８　ｇ栄養物／ｇ−ｃｅｌｌ−ｈｒの範囲になる
ように菌体増殖に合わせて、その流量を連続的あるいは
断続的（１〜５時間毎、好ましくは１〜３時間毎）に変
化させながら供給する。

本発明において、微生物保持材内で固定化増殖している
菌体の濃度をオンラインで測定することは出来ないが、
本発明者らの検討によれば、後記参考例１及び２で示す
如く、予め実験的に求めた微生物保持材内での菌体増殖
モデル式、あるいは実験式を用いて予測可能である。ま
た菌体の呼吸活性を利用して、即ち排ガス中のＣ（ｈ、
　Ｏｘ濃度を測定して、微、生物保持材内の菌体濃度を
予測することも可能である。更に該保持材内での菌体の
増殖は基質（栄養物）の流加量に依存せず、同一培養操
作条件下（例えば通気量、撹拌速度、ｐＨ等）では一定
であり、従って予め一定流量で流加培養を行い菌体の増
殖速度を予測することが可能である。後に実施例で示す
ように、定流量流加培養においても何分培養と同程度の
比較的高リパーゼ活性の萌Ｉｔが得られるので、工業的
なデメリットは最少比に押さえられる。この様にして測
定、予測される微生物保持材内での菌体増殖速度を基準
にして、計算機等のプロセンサーを用いて流量を連続的
あるいは断続的に変化させ、比基質供給速度を上述の最
適範囲にコントロールする。その結果、実施例でも示す
ように、微生物保持材に固定化することによって高めら
れた活性は一層高められ、培養全般を通じ、安定して回
分培養時の１゜３〜１．５倍の活性を有する、微生物保
持材に固定化された菌体が得られる。

本発明に用いられる微生物としては、リパーゼ生産能を
有する微生物であればすべて用いることが出来るが、リ
ゾプス（Ｒｈ　１ｚｏｐｕｓ）属としては、例えばリゾ
プス・キネンシス（Ｒｈ、　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ＴＦ
ｏ　４７６８）　、リゾプス・デレマー（Ｒｈ、　ｄｅ
ｌｅｍａｒ　ＩＦｏ　４６９７、　ＡＴＣＣ９３７４，
４８５Ｂ）、リゾプス・ジャボニカス（Ｒｈ、　ｊａｐ
ｏｎｉｃｕｓ　ＩＦｏ　４５７Ｂ）　、リゾプス・オリ
ゴスポラス（Ｒｈ、　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ　ＩＦＯ
８６３１）　、リゾプス・ニベウス（Ｒｈ、　ｎ１ｖｅ
ｕｓ　ＩＦＯ４７５９）、リゾプス・ジャヴアニカス（
Ｒｈ、　ｊａｖａｎｔｃｕｓ　ＩＦＯ５４４１）など；
ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属としては、例えばムコール１
ジヤヴアニカス（Ｍｕｃｏｒ　ｊａｖａｎｉｃｕｓ　Ｉ
Ｆｏ　４５６９）など；アスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ）属としては、例えばアスペルギルス・ニガ
ー（Ａｓｐｅ−ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　ＩＦＯ４
３４３，６３４１，６４２８）など；ジョートリクム（
Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属としては、ジョートリクム・
カンデイダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕ
ｍＴＦＯ４５９７，４５９８，４６０２）など；キャン
ディダ（Ｃａ−ｎｄｉｄａ）属としては、キャンディダ
・シリンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｏｒ
ａｃｅａ　ＡＴＣＣ１０５７１＋　１４８３０２０１１
６、２０２６３．２０３０６）など；コリネバクテリウ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属としては、コ
リネバクテリウム・イクイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　ｅｑｕｉ　ＩＦＯ３７３０）など；スタフィロ
コッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属としては
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐ−ｈｙｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＩＦＯ３０６０）等がそ
の代表的なものとして挙げられ、いずれも容易に入手す
ることが出来る。

本発明において流加される基質（栄養物）としては、ア
ミノ酸またはアミノ酸およびペプチドを主成分とする有
機窒素源ならばいかなるものも利用できるが、代表的な
これらの有機窒素源としてポリペプトン、イーストエキ
ス、マルトエキス、イーストペプトン、プロエキス、肉
エキス、コーンステイープリカー等を挙げることが出来
る。

また培地中には、菌体内のリパーゼ活性を高めるために
グリセライドまたは脂肪酸などの基質関連物質が誘導物
質として予め加えられる。このような基質関連物質とし
ては、オリーブオイル、茶油、魚油などのトリグリセラ
イド頻；オレイン酸、リノール酸、リルン酸などの脂肪
酸類；オレイルアルコール、リノールアルコール等の高
級アルコール類；オレイン酸メチル、カプリン酸エチル
等のエステル類をその代表的なものとして挙げることが
出来る。

更に培地中には予め微生物保持材、例えば１〜２０００
μｍの多孔質粒子が仕込まれ、微生物は該粒子内あるい
は粒子表層近くで増殖し、菌体内のリパーゼ活性が飛躍
的に上昇する。

このうな微生物保持材としては、微生物の持つ粘着力、
吸着力により微生物の吸着増殖を可能ならしめる任意の
材料が使用できる。例えば高分子多孔質材料としては、
ポリエチレンまたはポリプロピレンなどのポリオレフィ
ン系；ブタジェンまたはイソプレンなどのジエン系；ポ
リ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、アクリルアミド
またはポリスチレンなどのビニル重合体、ポリエーテル
、ポリエステル、ポリカーボネートまたはポリアミドな
どの縮合系、ポリウレタン、シリコン及びフッ素系樹脂
などの材料；無機材料としてはセラミックス、ガラス、
活性炭、及び多孔質金属や金属繊維加工材料；また有機
材料としてはセルロース、或いはセルロースに化学処理
を施したエチルセルロース、メチルエチルセルロース、
ハイドロプロピルセルロースなどが使用できる。いずれ
の材料においても微生物を良好に該保持材に固定化させ
るためには、空隙率が１０〜９９％、孔径が１〜２００
０μｍの範囲にある多孔質材料か、空隙率が１０〜９９
％である金属加工材料等を使用するのが好ましい。

このような微生物保持材は、微生物の種類及び培養条件
等によって適宜選択でき、形状については例えば球状、
ブロック状あい゛はシート状等に加工して使用すること
ができる。寸法については、微生物の種類、培養条件、
反応器の種類等によって異なるが、球状であれば概ね直
径１〜１００ｍｍ、ブロック状のものであれば一辺が概
ね１〜１００ｍｍのものが使用される。

微生物保持材の添加量としては、５〜４０容量％が微生
物の増殖及び固定化の条件として好まし本発明において
、培養槽への通気は空気、酸素あるいは両者の混合ガス
が用いられ、培養槽としては、撹拌機型または無撹拌機
型、気泡塔型のあらゆる形式のものが適用できるが、通
常、微生物保持材に固定化増殖させるには、無撹拌機型
の培養槽が操作面及びコスト面から一層好ましい。

更に本発明においては微生物保持材とともに培養するの
で、前述の様に菌体内のリパーゼ活性を高めるために加
えられ基質関連物質、即ちグリセライド類や脂肪酸類は
、例えば微生物保持材として親油性の高分子材料、例え
ばポリウレタン等を用いる場合、これらの基質関連物質
は微生物保持材内に吸収される。従って、基質関連物質
が多量に微生物保持材内に吸収されると、微生物保持材
内への酸素、基質の移動抵抗が大きくなり、微生物保持
材内での増殖に対してマイナス要因となるばかりでなく
、ひいては微生物保持材内での増殖が不可能となるため
リパーゼ生成は促進されなくなる。従って、微生物保持
材を用いる場合に加えられる基質関連物質の量は好まし
くは０．２〜８％、より好ましくは０．２〜２％が良い
。

更に微生物保持材内での安定した増殖を保ち、微生物の
微生物保持材からの剥離を抑制するためには、培養液中
の乱流強度及び培養液中の微生物保持材の濃度が重要な
因子となる。従って、微生物保持材内でのリパーゼを生
成する微生物の安定した増殖を維持するための乱流強度
としては、撹拌機型の培養槽では撹拌レイノルズ数で好
ましくは１０２〜１０７、より好ましくは１０３〜１０
５となる撹拌条件で操作される。

無撹拌機型の気泡塔では、特に微生物保持材からの微生
物の剥離の問題は、通気ガスの吹き抜けが発生する通気
線速度までの範囲においては認められない。従って、使
用される気泡塔の形式、添加される微生物保持材の形状
、量により異なるが、気泡塔内で円滑に微生物保持材を
流動させうる最低通気量、即ち、微生物保持材の最小流
動化通気量で充分であり、具体的には、通常１ｃｍ／ｓ
ｅｃ、好ましくは１；５ｃｍ／ｓｅｃ以上の通気線速度
で操作される。菌体内のリパーゼの漏洩を防ぐという観
点からは１．２〜２．８　ｃｍ　／ｓｅｅの範囲が好ま
しい。

上述の様に培養して得られた微生物、即ち固定化微生物
は、生菌体のまま反応に使用することもできるが、菌体
から水分を除去し乾燥菌体とずれぼりパーゼは非常に安
定であり、長期間保存することができる。

微生物から水分を除去する方法としては、原則的には酵
素が失活しない温度（８０”Ｃ以下）で乾燥すればよい
が、単に水分を蒸発させると細胞組織の収縮が起こり非
常に堅くなり、組織内のリパーゼと外界との接触が断た
れて活性を発揮することが困難となる。従って、菌体を
乾燥させるには細胞組織の収縮を伴わない方法を採用す
るのが好ましい。このため、極性溶媒に菌体を浸して組
織内の水分を極性溶媒に置換した後、極性溶媒を蒸発さ
せる方法により、細胞組織の収縮を抑えて乾燥菌体を得
ることができる。この場合、乾燥方法としては真空ある
いは凍結乾燥、低温乾燥、温風乾燥等の公知の乾燥法が
使用できる。本発明に用いられる極性溶媒としては、水
と混合した場合に水と均一相となるものならいかなるも
のも利用できるが、その代表的なものとしてアセトン、
メチルエチルケトン、ジエチルケトン等のケトン類；メ
タノール、エタノール、イソプロパツール、ｎブタノー
ル等の低級アルコール頻；エチレングリコール、プロピ
レングリコール等のジオール頻；グリセロール等のトリ
オール類などが挙げられる。就中、アセトンやグリセロ
ールが酵素活性をほとんど低下させないので好ましい。

この様にして栄養物の比基質供給速度をコントロールし
て培養された微生物保持材に固定化された高リパーゼ活
性を有する菌体は、エステル交換、エステル合成、加水
分解反応等の各種のリパーゼ反応に供される。特に油系
でのエステル交換反応、エステル合成反応に供される場
合は、既に報告されているように、市販の水分センサー
（例えば、パナメトリックス■、水分センサー、商品名
ニジステムＩ等）を用いて、反応基質中の水分濃度をコ
ントロールして、副反応である加水分解反応が抑制され
る。

〔実施例〕

次に、本発明を参考例及び実施例を用いて説明するが、
もとより本発明はこれらにより何ら限定されるものでは
ない。

尚、以下の実施例において、微生物保持材に固定化され
た菌体は、培養液より分離後、水道水で２回洗浄し、次
いでアセトンで２回洗浄した後、常温で４８時間真空乾
燥した。

菌体に含有されるリパーゼ活性については未だ一般的な
測定法が確立されていないので、本発明においては反応
基質としてオリーブオイル：ステアリン酸メチル：ヘキ
サン＝１：４：２．５からなる混合物を用い、微生物保
持材に固定化された菌体を適量加えて４０°Ｃで一定時
間反応せしめ、生成したオレイン酸メチルの量より、１
分間光たり１μｌｌ１ｏ乏のオレイン酸メチルを生成す
る酵素量を１ユニツト（ＩＵ）とした。尚、微生物保持
材に結合した乾燥菌体量は、全体の重量から１０％（Ｖ
／Ｖ）ジ亜塩素酸ソーダに浸漬し、菌体を剥離して得た
微生物保持材の重量を差し引くことによって求めた。

参考例１；微生物保持材内の菌体濃度を予測する方法 微生物保持材内の菌体濃度を予測する実験式の作成例を
示す。

例えば、実施例２で用いた気泡塔において予め通気線速
度を１．５〜４．　Ｏｃｒｎ　／　ｓｅｃ　、基質流加
量を０．５〜３．０ｇ−肉エキス／ｈｒ、微生物保持材
の添加量を１０００〜１８００個／ｌの範囲で変化させ
て培養し、微生物保持材内での菌体増殖への影響を調べ
た結果、上記の条件内では、微生物保持材内の菌体増殖
は殆ど影響を受けず、下記（１）式で表現できる； Ｋｔ＋　ＣＬ　−ｔｉ、１） Ｘｂｓｐ　：微生物保持材１個当たりの菌体濃度（ｍｇ
／保持材） Ｘｍｂｓｐ　　：微生物保持材１個当たりの菌体濃度の
最大値：定数（４，２ｍｇ／保持材） Ｋｔ：定数（２７，８ｈｒ、　ｔ（Ｉｌ＝２４ｈｒＯ時
）ｔｉｎ’培養時間（ｈｒ） Ｌｉｎ：基質の流加開始時間：定数（２４ｈｒ）（１）
式を用いて微生物保持材内の菌体濃度を予測し、比基質
供給速度を０．０５　ｇ−肉エキス／ｉ　ｇ　−ｃｅｌ
ｌ−ｈｒにコントロールして培養すればよい。

同様にして、使用する微生物の種類、培養槽の形式、微
生物保持材の種類、形状等に応じて（１）式のような実
験式を作成し、微生物保持材内の菌体濃度の予測式とし
て利用できる。

参考例２ 微生物保持材内の菌体濃度予測式と利用できる増殖モデ
ル式の１例を示す。

微生物は微生物保持材の表層近くに密に生物膜を形成す
るので、バイオフィルム増殖モデルが適用可能である。

即ち、バイオフィルム内での基質濃度の変化は下記（２
）式で表される；また、バイオフィルムの厚さの変化は
、下記（３）式で表される； Ｓｆ：バイオフィルム内の基質濃度（ｍｇ−基質／１）
Ｄｆ：バイオフィルム内の基質の拡散係数（ｃＪ／５ｅ
ｃ）シｍ：基質の最大比消費速度（ｍｇ−基質／ｇ−ｃ
ｅｌｌ−ｈｒ）Ｋｓ　：　Ｍｏｎｏｄの飽和定数（ｍｇ
−基質／りｍ０：維持定数（■−基質／ｇ−ｃｅｌｌ−
ｈｒ）Ｙｏ：菌体収率（ｍｇ−ｅｅｌ　ｌ　／　ｍｇ−
基質）Ｚ、　Ｌｆ：バイオフィルムの厚さ（ｃｍ）従っ
て、上記のパラメーター（Ｄｆ、　　νｍ、　Ｋｓ、　
ｍｏ、Ｙｏ）を適用される培養系について求め、（２）
、（３）式を連立させて計算機等を用いて解くことによ
り、微生物保持材内の菌体増殖カーブを得ることができ
、そのカーブを比基質供給速度をコントロールする際の
微生物保持材内の菌体濃度の予測式として利用すること
ができる。

実施例２に示した培養系の場合、（２）、（３）式の近
偵解は（１）の実験式とよく一致した。

実施例１ 微生物としてアスペルギルス・ニガーＩＦＯ４３４３を
用い、グルコース１％、ポリペプトン７％、ＮａＮＯ３
０，１％、ＸＨｚＰ０４０．１％、Ｍｇ５Ｏ，・７１１
□００．０５％からなる培地で３０°Ｃで２４時間前培
養を行い種母を調製した。

５Ｉ！、撹拌槽ジャーファーメンタ−（いわしや生物化
学■製、ＭＢＣ−５、撹拌翼径８ｃｍ）を用いて、次の
条件で定流量流加培養を行った。

仕込培地組成：ＮａＮＯ３０゜１％、ＫＩｌｚＰＯｎ　
０．１％、ＭｇＳＯ４・７ｎｚｏ　ｏ、　０５％、オリ
ーブオイル６．５％ 流加培地組成及び流加流量：酵母エキス７０ｇ／ｌ　　
　０．６５ｇ／ｈｒ ＰＨ：５．６、撹拌数：２０Ｏｒｐｍ、通気量＝０．５
ｖｖｍ　、温度３０℃ 微生物保持材として１辺６ｍｍのブロック状のナイロン
（空隙率９５〜９８％、孔数４０ケ／２５ｍｍ）を１０
００個／ｊ２−培地の濃度（１７，７Ｖ／Ｖχ）で加え
た。１２０時間の培養期間中、適宜サンプリングして微
生物保持材に固定化された菌体の濃度及びリパーゼ活性
を測定した。

次に上述の定流量流加培養Ｑ菌体増殖カーブを基準にし
て、比基質供給速度が０．０４ｇ−酵母エキス／　ｇ　
−ｃｅ’ｌ　１．、−　ｈｒになるように２時間毎に流
加流Ｍをマイクロコンピュータを用いて変化させ１２０
時間培養した。

更に、比基質供給速度を一定にした場合に供給された酵
母エキス量を計算し、同量を初期に仕込んで回分培養を
実施した。

第１表に定流量流加培養、比基質供給速度を一定にした
培養、回分培養の菌体内リパーゼ活性を比較した。第１
表より比基質供給速度を一定にした場合、回分培養に比
べて培養全般を通し安定して活性が１．３〜１．５倍高
いことが分かる。定流量流加培養においては培養初期に
は高い活性が得られたが、次第に低下し、培養後半には
回分培養と同程度にまで低下した。これら３種類の培養
方法において、菌体増殖には差がなかった。

第　　　　１　　　　表 〔表中の数値は固定化された菌体のリパーゼ活性を示す
（Ｕ＊　１０”／ｍｇ）。以下同じ。〕実施例２ 微生物としてリゾージス・キネンシスＩＦ０４７６８用
いて、実施例１と同様にして種母を調製した。

第１図は、実施例２で培養槽として用いた気泡塔（Ｃｉ
ｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｂｅｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）の
概略断面図である。第１図に示した如く、この気泡塔（
１）は高さ（Ｈ）が４００Ｍ、内径（Ｄｌ）が１５０ｍ
ｍである。また、第２図は第１図に示されている気泡塔
内に設けられている気泡分散板（２）の平面図である。

気泡分散板（２）は直径（Ｄ２）が１５０柵であり、第
２図に示されているように直径３ｍｍの孔（３）が設け
られ、空気は第１図に矢印で示す方向に通気される。

第１図の気泡塔を用いて、通気量２４１　／ｍｉｎ、温
度３０″Ｃ，ｐＨ５，０の条件で培養した。なお供給培
地は実施例１の酵母エキスを肉エキスに換えたものを用
いた。またオリーブオイルの代わりにオレイン酸を２％
初期仕込液に加えた。

微生物保持材として１辺６論のブロック状のポリウレタ
ンフォーム（プリジストン■、商品名：ＨＲ−４０）を
仕込液中に１５００個／ｆｉ（２４゜５　Ｖ／Ｖχ）と
なるように加えた。

実施例１と同じ要領で流加量２．５ｇ−肉エキス／ｈｒ
の定流量流加培養、比基質供給速度を０．０１゜０．０
５，０．１３ｇ−肉エキス／ｇ−ｃｅｌｌ・ｈｒにコン
トロールした培養、及び回分培養を行い、第２表にそれ
らの活性を比較した。

実施例１と同様に、比基質供給速度を０．０５　ｇ肉エ
キス／ｇ−ｃｅｌｌ・ｈｒにコントロールすることによ
ってリパーゼ活性は１．３〜１．５倍増幅された。

また定流量流加培養では培養後期に最大活性が認められ
た。比基質供給速度が大きすぎる（０．１第 表 ３）或いは小さずぎる（０．０１）場合は、回分培養と
同程度の活性しか得られなかった。

実施例３ 微生物としてムコール・ジャバニカスＩＦＯ４５６９を
用いて実施例１と同様に前培養及び３種類の本培養を実
施した。なお供給培地は実施例１の酵母エキスをイース
ト・ペプトンに換えたものを用いた。

微生物保持材として球状のステンレス加工材料（直径５
ｍｍ、空隙率８０〜８５％）を仕込液中に１５００個＃
！　（１５，８Ｖ／Ｖχ）となるように加えた。定流量
流加培養の流加量は１．１ｇ−イースト・ペプトン／ｈ
ｒとし、比基質供給速度は０．０’６５ｇ−イースト・
ペプトン／ｇ−ｃｅｌｌ・ｈｒにコントロルした。

第３表に３種類の本培養の結果を示した。実施例１．２
と同様に、比基質供給速度をコントロールすることによ
ってリパーゼ活性は増幅された。

また定流量流加培養では培養中期に最大活性が認められ
た。

第　　　　３　　　　表 ケ／２５ｍｍ）を１０００個／ｌ−培地の濃度（１７、
７Ｖ／Ｖχ）で加えた。定流量流加培養の流加量は１．
６ｇ−プロエキス／ｈｒとし、比基質供給速度は０、０
３　’ｇ−プロエキス／ｇ−ｃｅｌｌ−ｈｒにコントロ
ールした。

第４表に３種類の本培養の結果を示した。比基質供給速
度をコントロールすることによってリパーゼ活性はやは
り安定して増幅された。また定流量流加培養では培養後
期に最大活性が認められた。

第　　　　４　　　　表 実施例４ 微生物としてジョートリクム・カンデイダムＩＦＯ４５
９７を用いて、実施例１と同様に前培養及び３種類の本
培養を実施した。なお供給培地は実施例１の酵母エキス
をプロエキスに換えたものを用いた。

微生物保持材として１辺６ｍｍのブロック状のポリカー
ボネート（空隙率９０〜９５％、孔数５０実施例５ 微生物としてキャンディダ・シリンドラッセＡＴＣＣ１
０５７１を用いて、実施例２と同様に前培養及び３種類
の本培養を実施した。おな供給培地は実施例２の肉エキ
スをポリペプトンに換えたものを用いた。

微生物保持材として１辺６錘のブロック状ポリウレタン
フォーム（プリジストン■、商品名：ＨＲ−５０）を仕
込液中に１５００個／ｊ２（２４，５Ｖ／Ｖχ）となる
ように加えた。

定流量流加培養の流加量は１．６ｇ−ポリペプトン／ｈ
ｒとし、比基質供給速度は０．０６　ｇ−ポリペプトン
／ｇ−ｃｅｌｌ・ｈｒにコントロールした。

第５表に３種類の本培養の結果を示した。同様に比基質
供給速度をコントロールすることによってリパーゼ活性
は１．３〜１．５倍増幅された。また定流量流加培養で
は培養中期に最大活性が認められた。

第　　　　５　　　　表 微生物としてコリネバクテリウム・イクイ　ＴＦＯ３７
３０を用いて実施例５と同様に前培養及び３種類の本培
養を実施した。

結果を第６表に示した。実施例５と同様の結果が得られ
た。

第　　　　６　　　　表 実施例７ 微生物としてスタフィロコッカス・アウレウスＩＦ０３
０６０を用いて、実施例５と同様に前培養及び３種類の
本培養を実施した。

結果を第７表に示した。実施例５と同様の結果が得られ
た。

実施例６ 第　　　　７　　　　表 第　　　　８　　　　表 実施例８ 実施例２と同様の微生物、培養装置を用い、微生物保持
材として１辺６胴のブロック状のセルロース発泡体（酒
伊エンジニアリング■、商品名Ｃ３−ｎ）を用いて、実
施例２と同じ要領で回分培養、定流量流加培養、比基質
供給速度を０．０５　ｇ肉エキス／　ｇ−ｃｅｌｌ　−
ｈｒにコントロールした培養を実施した。

第８表にそれらの活性を比較したが、比基質供給速度を
適切な範囲内にコントロールすることによって菌体内リ
パーゼ活性は安定して高められた。

〔作用・効果〕

本発明における比基質供給速度はリパーゼ生成能を有す
る微生物と微生物保持材を含む培養系で培養する際に適
用し得る効果的な培養制御指標であり、比基質供給速度
を一定の範囲にコントロールすることによってリパーゼ
生産に必要な栄養物を無駄なく供給することが可能にな
るばかりでなく、微生物保持材による菌体内リパーゼ生
成促進作用をなお一層高め得る。従って、エステル交換
反応、エステル合成反応、加水分解反応などの種々のリ
パーゼ反応に使用されるリパーゼ固定化酵素触媒の生産
を極めて低コストで実現するものであり、工業的なリパ
ーゼの応用を可能ならしめるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２，５，６．７で用いた気泡塔の断面図
であり、第２図は第１図に示される気泡塔中に設けられ
ている気泡分散板の平面図である。 １・・・気泡塔、　　　　２・・・気泡分散板３・・・
孔

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リパーゼ生成能を有する微生物を微生物保持材と共
   に培養するに際し、比基質供給速度を一定の値にコント
   ロールすることを特徴とする、菌体内のリパーゼ活性を
   高める流加培養方法。 ２、比基質供給速度が０．０３〜０．１ｇ栄養物／ｇ−
   ｃｅｌｌ・ｈｒである請求項１記載の流加培養方法。