JPH0249596A - ヒト前立腺上皮細胞の表面に特異的に反応するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ヒト前立腺上皮細胞の表面に特異的に反応す
るモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマ、および該モノクローナル抗体の製造
方法に関する。

従来技術 近年、未知もしくは既知の抗原で免疫した動物の抗体産
生細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞の融合によって、該
抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を製造する
方法が開発され、種々の抗原に対してこのようなモノク
ローナル抗体が作成されている。このようにして得られ
たモノクローナル抗体は極めて有用である。例えば、腫
瘍関連抗原に対して特異性の高いモノクローナル抗体か
得られれば、これを、該腫瘍の有無の診断あるいはその
存在部位の確認に用いることかでき、また、該腫瘍の治
療にも用いることかできると考えられている。従って、
多数の腫瘍について、腫瘍関連抗原に特異的に反応する
モノクローナル抗体の作成が試みられているか、得られ
た抗体が種々臓器の正常細胞と反応する例か多く、また
そうでない場合であっ′ても、多数の該腫瘍患者に必ず
しも共通して反応しない、という２つの問題点を克服で
きていない。本発明に関連する前立腺癌についても、そ
の腫瘍関連抗原に特異的に、かつ多数の患者に共通して
反応するモノクローナル抗体はいまた作成されていない
。

発明の目的 このような状況下、本発明者等は、腫瘍関連抗原にこだ
わることなく、ヒト前立腺の」二皮組織を共通して認識
するモノクローナル抗体の作成を試み、その結果、ヒト
前立腺の全ての上皮細胞に特異的に存在する「分化抗原
」を認識するモノクローナル抗体であって、正常前立腺
細胞、肥大症前立腺細胞、および検討した限りの全ての
前立腺癌症例の癌細胞と反応するモノクローナル抗体を
得た。

即ち、本発明は、ヒト前立腺」二皮細胞の表面抗原に特
異的に反応するモノクローナル抗体、該モアクローナル
抗体を産生ずるハイブリトーマ、および該モノクローナ
ル抗体の製造方法を提供するものである。

発明の構成および効果 本発明に係るモノクローナル抗体、および該抗体を産生
ずるハイブリドーマは、以下のようにして製造すること
ができる ）前立腺、例えばヒト前立腺肥大症患者もしくは前立腺
癌患者から摘出した前立腺、から上皮組織片を取り、こ
の組織片を抗原として動物を免疫し、 ）該動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞とを融
合させ、ヒト前立腺上皮細胞の表面に特異的に反応する
モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマを選択し
、 １１１）該ハイブリドーマを適当な条件下で培養し、該
モノクローナル抗体を回収する。

工程１）の動物の免疫は、前立腺から上皮組織片を分離
し、これを抗原として動物に投与し、定期間経過後さら
に同一の抗原で動物を処理することによって行うことか
できる。通常、この上皮組織片は生理食塩水に懸、淵さ
せて動物に投与する。

また、全前立腺を細断して生理食塩水にｊ１４調させ、
上皮組織片を分肉１（することなくこの盾、濁液をその
まま抗原として用いてもよい。

免疫する動物種としては、マウス、ラット等、種々の動
物が用いられ得るが、不ズミ種属のものが好ましく、中
でもＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスが特に好ましい。

工程ｌｌ）の細胞融合は、工程ｉ）で免疫された動物の
抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞とを用い、常法に
よって行うことができる。

抗体産生細胞としては、上記Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウス
の肺細胞が最も好ましいが、これ以外に、例えば、マウ
スのリンパ節細胞や末梢リンパ球、ラットのリンパ球も
使用することができる。

ミエローマ細胞としては、マウスのミエローマ細胞株Ｘ
６３−Ａｇ８−６．５．３が好ましいが、Ｘ６３−Ａｇ
３、ＮＳ　１−Ａｇ４／ｉ　ＭＰＣ，−１１，２１０，
ＲＣＹ３なとの細胞株も用いることができる。

細胞融合法としては、ポリエチレングリコール法、ＨＶ
Ｊ法、電気融合法なとを挙げることができる。

また、得られたハイブリドーマの選択は、例えば、以下
のようにして行うことができる。即ち、ハイブリドーマ
を適当な培地で培養し、その培養液とヒト前立腺および
他の臓器、例えば腎とを反応させ、フルオレセインイン
チオシアネート（ＦＩＴＣ）等てラベルしたウサギＩｇ
Ｇ抗マウスＩｇで処理し、蛍光顕微鏡等て観察し、そし
て前立腺の上皮組織とは反応するが、間充織とは反応せ
ず、かつ腎なとの他の臓器とも反応しない抗体を産生ず
るハイブリドーマを選択すればよい。次いで、選択した
ハイブリドーマを限界希釈法によってクローニングする
。

工程１１１）のモノクローナル抗体の回収は、例えば、
工程１１）で得られたクローンをマウスの腹腔内に移植
した後、その腹水液から常法によって行うことができる
し、大量培養装置を用いてハイブリド−マクローンを培
養した培養液からも常法とうり回収することができる。

また、回収した抗体を、硫安塩析、分子ふるい、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー等によって精製してもよい。

本発明のモノクローナル抗体は、後記実施例に示すよう
に、ヒト前立腺の全ての上皮細胞に特異的に存在する「
分化抗原」を認識するモノクローナル抗体である。この
抗体は、正常前立腺、肥大症前立腺、および前立腺癌の
上皮細胞表面と反応する。本発明に係るモノクローナル
抗体は、上記のような性質に基づいて、以下のような用
途に利用される。

１）前立腺癌症例での転移巣の検査 前立腺癌症例の多くではリンパ節、次いで骨への腫瘍細
胞の転移が認められる。従って、前立腺癌摘出手術では
、「転移しているかもしれない」リンパ節を摘出してお
く術式か採られることが多い。

リンパ節摘出手術中に本発明の抗体を用いて迅速な検査
を行えば、どこまでリンパ節を摘出すれば良いかが簡単
にわかる。また、術後に検査することによって以後の治
療方針を決定することができる。この検査は後記実施例
に示した如く既に実験的に実施され、そして成功をおさ
めている。

２）前立腺癌における術前検査 前立腺癌と診断された患者に、９９ｍＴｃ・１３１■・
ｌｌｌＩｎなどのアイソトープで標識したモノクローナ
ル抗体を投与すると、抗体は前立腺上皮およびそれに由
来する腫瘍細胞に集積してゆく。

次いて、シンチグラフィーを実施すると、転移巣の部域
があればこれを検出することができる。その結果、手術
不能の症例と判断されるものと可能と判断されるものに
分別することができ、また手術可能な症例においては患
者に最も適した術式を決定することができる。

３）前立腺癌の診断 前立腺上皮細胞が異常に増殖すると、本発明の抗体によ
って認識される抗原が血中に放出されると予想され、前
立腺癌患者においては、血中抗原量が高レベルであると
考えられる。従って、本杭体を蛍光試薬、酵素、ラジオ
アイソトープ等で標識して血中もしくは血清中の抗原を
検出することによって、前立腺癌の有無を診断すること
ができる。

４）手術後の治療 抗癌剤等の細胞毒をモノクローナル抗体に結合させて投
与すると、微小な転移巣ならば消滅させることができる
と考えられている。従って、本抗体と適切な細胞毒とを
結合させ、原発巣および中程度以上の転移巣を摘出した
患者に投与することによって、治癒もしくは余命の延長
をもたらすことがてきる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するか
、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 （ａ）マウスの免疫 ヒト前立腺肥大症患者から摘出した前立腺約１ｇを、リ
ン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７，３）中、ハサミで細切し
た。よくピペッティングしたのぢ室温で静置しておくと
上皮組織は浮遊したままであるが、間充織は２〜３分で
沈降する。この浮遊している上皮組織片を集め、その約
１／３をマウスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃの腹腔に注射して免
疫し、残りを１０％ＤＭＳＯ１９０％ウシ胎児血清中で
凍結保存した。凍結保存しておいた細胞を用い、３週間
隔でさらに２回免疫し、最終免疫の３日後にマウスの肺
細胞を取り出した。

（ｂ）細胞融合および抗体の産生 上記（ａ）で得たマウス牌細胞とマウスミエローマ細胞
（Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３）とを、３７°Ｃで５０
％ポリエチレングリコール（Ｍｗ１５００ＤＢＨ社）を
用いて融合させた。得られた融合細胞を９６ウエルマイ
クロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に０．１ｍ（１ツツ
蒔き、ＲＰＭ１１６４０培地（日水社）に１５％ウシ胎
児血清（Ｆ　１ｌｔｒｏｎ社）を添加したＨＡＴ選択培
地て培養を続けた。約２週間で必要量のモノクローナル
抗体か培地中に分泌される。

（Ｃ）抗体のスクリーニングおよびウェルの選択ヒト前
立腺肥大症患者の前立腺、およびヒＩ−正常腎を未固定
のままそれぞれＯ，Ｃ，Ｔ、　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｍｉ
ｌｅｓ社）に包埋し、液体窒素で凍結した。低温ミクロ
トーム（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ社）を用いて６〜８μ厚の凍
結切片を作製し、Ｎ　ｅｏｐｒｅｎｅを塗布したスライ
ドガラスに添イ」シた。９６ウエルマイクロプレート中
の培養液０．１ｘ１２を取り出して凍結切片に加え、約
３０分後に生理食塩水で洗浄し、ＦＩＴＣでラベルした
ウサギＩｇＧ抗マウスＩｇ（２次抗体；　ＤＡＫＯ社）
で３０分間処理した。次いで、洗浄した後、蛍光顕微鏡
にコン社）を用いて培養液中の抗体が反応する組織部位
を観察した。前立腺において、間充織と反応せずに上皮
組織と反応し、かつ腎組織とは全く反応しない抗体が産
生されているウェルを選択した。

（ｄ）ハイブリドーマのクローニング 上記（ｃ）で選択したウェル中の抗体産生細胞（ハイブ
リドーマ）を限界希釈法によってクローニングした。そ
の結果、前立腺上皮に極めて特異的に反応する抗体を産
生ずるクローンが独立して４種類得られた。各クローン
はそれぞれ別の抗原決定基を認識することがわかった（
ある１種のクローンが産生ずる抗体の抗原への結合は、
他のクローンが産生ずる抗体によって阻害されない）。

上記４種のクローン、ｈＰｒｏ−１、ＩＯＧ、　ｈＰｒ
ｏ−４１、ＯＨ、ｈ　Ｐ　ｒｏ−５，１０Ｆおよびｈ　
Ｐ　ｒｏ−１，５Ｆ　（それぞれモノクローナル抗体、
Ｐｅｓ川、Ｐｅ５−２、Ｐｅ５３およびＰｅ５−４を産
生ずる）は、それぞれ微工研条寄第１９８６号（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−１９８６）、微工研菌寄第１０１６９号（Ｆ
ＥＲＭ　Ｐ−１０１６９）、第１０１７０号（ＦＥＲＭ
　Ｐ−１０１７０）および第１０１６８号（ＦＥＲＭ　
Ｐ−１０１６８）として寄託されている（寄託日、昭和
６３年８月２日）。

（ｅ）抗体の特異性 上記（ｄ）で得たクローンが産生ずるモノクローナル抗
体４種の内の３種（Ｐｅｓ−１，２および３）はＩ　ｇ
Ｇ　、クラスに属し、残る１種（Ｐｅｓ−４）はＩｇＧ
　２ａクラスに属することがわかった。

肥大症前立腺での、ＦＩＴＣ標識ウサギつｇＧ抗マウス
ｒｇの蛍光は、同定し得るすべての上皮細胞に一致して
みられ、また、細胞表層に局在しているようにみえた。

前立腺の間充識には蛍光は全くみられなかった（第１図
参照；第１図は前立腺組織の模式図であり、■は上皮細
胞、２は間充織を示す：上皮細胞表面の黒く塗った部分
が蛍光を発している部分である）。次に、正常な前立腺
についても調べたところ、肥大症前立腺の場合と同様の
反応性がみられた。また、ヒトの各種臓器、肝、肺、皮
膚、眼、結腸、膀胱などを上記（ｃ）の記載と同様にし
て凍結切片とし、モノクローナル抗体との反応性を調べ
た。スクリーニングに用いた腎には反応はもともと全く
みられなかったが、第１表に示す検索した限りのいかな
る臓器の組織にも反応性はみられなかった。

以上、得られた抗体は、前立腺上皮に特異的に反応し、
そして、すべての前立腺細胞と反応するが、その他の各
種臓器の細胞とは全く反応しないことかわかった。

尚、未固定の前立腺組織切片だけでなく、パラホルムア
ルデヒドまたはＰＬＰ（パラホルムアルデヒド・リジン
・過ヨウ素酸ナトリウム）固定の切片でも同様の結果が
得られた。

腎臓　　　　　　皮膚 膀胱　　　　　　リンパ節 華丸　　　　　骨 副翠丸　　　　　骨髄 精嚢　　　　　　赤血球 精管　　　　　　胃 精子　　　　　　小腸 女性尿道周囲線　結腸 子宮　　　　　　肝臓 乳腺　　　　　　膵臓 甲状腺　　　　　副腎 唾液腺　　　　　肺 腎細胞症 膀胱移行上皮癌 華丸腫瘍 胃癌 結腸癌 肝細胞症 肺腺癌 褐色細胞腫 尿道症 腎孟癌 （ｆ）大量の抗体の調製および精製 クローニングした抗体産生細胞を、あらかじめプリスタ
ン（Ａ　１ｄｒｉｃｈ社）処理したＢＡＬＢ／Ｃ７ウス
の腹腔に注射した。これにより、腹水中に大量のモノク
ローナル抗体が存在するようになる。

得られた腹水を２０〜５０％飽和硫安で粗精製した。１
．５Ｍ　グリンン（ｐＨ８，９）＋３Ｍ　ＮａＣ１！バ
ツフアーで満たしたアフィケループロテインＡ（５ｆｆ
ρケル：バイオラット社）のカラムに粗精製モノクロー
ナル抗体を加え、同バ、ファー１００Ｕで洗浄したのち
、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（１ｇＧ＋のときｐＨ６
，０、ＩｇＧ２．のときｐＨ４，０）で溶離した。こう
して得た抗体は９５％以上、通常は９９％に精製されて
いる。

（ｇ）抗原の存在部位の確認 精製したモノクローナル抗体を、標識試薬を用いてラベ
リングし、この抗体と生きた上皮細胞との反応性を調べ
た。ＦＩＴＣラベルにはＦ　１ｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１
ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒ　Ｉ　（ベ
タ１ゝン０デイツキフフフ社）を用い、＋′■ラヘルに
はＩ　ｏｄｉｎａｔｉ。

ｎ　ｂｅａｄｓ（Ｎ　Ｅ　Ｎ社）を用いた。ＦＩＴＣ標
識モノクローナル抗体は、肥大症前立腺をハサミで細切
したのちの生きた上皮細胞とよく反応することか蛍光顕
微鏡によって確かめられた。また、＋２Ｊ標識抗体も生
きた上皮細胞とよく反応することがわかった。このよう
に、得られた抗体は、上皮細胞の表面に存在する抗原と
反応することがわかった。

（ｈ）抗原の単離 ヒト肥大症前立腺約０．２ｇを、１％ＣＩＡＰＳ（界面
活性剤）、４０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７，３）、
１５０ｍＭ　ＮａＣｌ２．５ｍＭＥＤＴＡ、およびプロ
テアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ、ロイペプチン、ペプスタチ
ン）よりなる可溶化バッファー０゜５１１Ｑで可溶化し
た。この液を、ＣＨＡＰＳＩＩ度が０．１％になるよう
に希釈した後、本実験とは無関係なモノクローナル抗体
（抗トリニトロフェニル、ＩｇＧ＋）を結合させたセル
ロースゲルのカラムを通過させた。次いで、本発明によ
って得られたモノクローナル抗体を２ｍｇ／ｍＱゲルの
濃度で結合させたセルロースゲル（Ａｆｆｉ−ｇｅｌ、
バイオラッド社）０．１ｍｆ２を加え、４°Ｃで２時間
振盪した。洗浄を繰り返した後、０．１Ｍクエン酸（ｐ
Ｈ２）、または０．５Ｍアンモニア（ｐＨ１１）を用い
て結合した抗原を溶離した。この試料につき５ＤＳ−ポ
リアクリルアミド（１２％アクリルアミド）を用いて電
気泳動を行い、銀染色キット（和光純薬社）を用いて現
像した。その結果を第２図に示すが、上皮細胞の表面に
存在する抗原は分子量的６９，０００のタンパクである
ことがわかった。第２図において、レーン１および４は
分子量マーカー、２お　、よび３は前立腺抗原を、本ｉ
の□抗体（Ｐ　ｅｓ−１’：）’ｌ”および無関係の抗
体それぞれ”を用い・て分離またパ結果を示している。

レーン２のに印が前立腺分化−抗原を示している。レー
ン１め□、マニ男−分子量ハ゛上から２００Ｋ、１１６
に１′９３に１６６ベ、４、　”５にであり、レーン４
のマー男−分子量は上か゛ら９３Ｋ、６６に、４５に、
３１に；　２２”Ｋである。

また、Ｐｅ５−２．３および４も同上抗原に結合するこ
とかわかった。

（ｉ）癌細胞との反応性 得られた抗体が癌細胞と反応するか否かぼ極めて興味の
もたれる問題である。高分化型前立腺癌３例、および低
分化型前立腺癌４例の凍結切片を−ンのうちの３種が産
生ずるモノクローナル抗体（ＰｅＳ−１，２および３）
はいずれもすべての症例の前立腺腫瘍細胞と強い反応性
を示した。Ｐｅ５１．２および３を用いた検索において
は、異常増殖を示す部域に存在する腫瘍細、胞も含めて
、すべ・　次に、前立腺癌のリンパ節への転移が認めら
れる症例に邑）工、抗体の反応性を調べた。組織学的に
明瞭な転移巣７！ｌ＜＋られる金側で、その転移巣に存
在、す諷すべての細胞に対して強い抗体の反応がみられ
た。９また、必ずしも転移が明瞭でないリンパ節の凍結
切片においても抗体の反応がみられる部域が存在した。

これは初期転移巣か検出されているものと判断される。

用いて検索した。前記（ｄ）で得られた４種のクロ

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係るモノクローナル抗体と肥大症前
立腺との反応性を、ＦＩＴＣ標識ウサギつＩｇＧマウス
Ｉｇを用いて調べた結果を示す模式図であり、第２図は
、本発明に係るモノクローナル抗体を用いて単離したヒ
ト肥大症前立腺に存在する抗原の分子量を、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドケル電気泳動によって調べた結果を示
す模式図である。 第１図において符号は次の通りである ■・・」二皮細胞、　２・・・間充織。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト前立腺上皮細胞の表面に特異的に反応するモノ
   クローナル抗体。 ２、請求項１記載のモノクローナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマ。 ３、ｉ）ヒト前立腺の上皮組織片を抗原として動物を免
   疫し； ｉｉ）該動物の抗体産生細胞と動物のミエローマ細胞と
   を融合させ、請求項１記載のモノクローナル抗体を産生
   するハイブリドーマを選択し；ｉｉｉ）該ハイブリドー
   マを適当な条件下で培養し、該モノクローナル抗体を回
   収する； ことを特徴とする、請求項１記載のモノクローナル抗体
   の製造方法。