JPH0249711B2 - Kobunshiniseitaikobunshioketsugosaseruhoho - Google Patents
KobunshiniseitaikobunshioketsugosaseruhohoInfo
- Publication number
- JPH0249711B2 JPH0249711B2 JP11465883A JP11465883A JPH0249711B2 JP H0249711 B2 JPH0249711 B2 JP H0249711B2 JP 11465883 A JP11465883 A JP 11465883A JP 11465883 A JP11465883 A JP 11465883A JP H0249711 B2 JPH0249711 B2 JP H0249711B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polymer
- biopolymer
- activated
- amino group
- reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセルロース等の水酸基を有する高分子
に酵素、蛋白質等のアミノ基を有する生体高分子
を結合させる方法に関する。
に酵素、蛋白質等のアミノ基を有する生体高分子
を結合させる方法に関する。
従来より、酵素や蛋白質を担体である高分子物
質に化学的に結合させて固定化した固定化酵素等
をバイオリアクターや液体クロマトグラフイー用
カラム充填剤として利用することが行われてい
る。例えば１個以上の水酸基を有する多糖類など
の高分子に好ましくはPH8〜13のアルカリ性条
件下でハロゲン化シアンを作用させることにより
活性化し、次にこれにアミノ基を有する生体高分
子を弱アルカリ性条件で反応させて結合させる方
法や多糖高分子の一種であるアガロースに塩化Ｐ
−トリエンスルホニルを作用させて活性化し、こ
れに求核置換反応によつてペルオキシダーゼやア
ルコールデヒドロゲナーゼをそれぞれ18％及び25
％程度の活性固定化率で固定化することが知られ
ている。
質に化学的に結合させて固定化した固定化酵素等
をバイオリアクターや液体クロマトグラフイー用
カラム充填剤として利用することが行われてい
る。例えば１個以上の水酸基を有する多糖類など
の高分子に好ましくはPH8〜13のアルカリ性条
件下でハロゲン化シアンを作用させることにより
活性化し、次にこれにアミノ基を有する生体高分
子を弱アルカリ性条件で反応させて結合させる方
法や多糖高分子の一種であるアガロースに塩化Ｐ
−トリエンスルホニルを作用させて活性化し、こ
れに求核置換反応によつてペルオキシダーゼやア
ルコールデヒドロゲナーゼをそれぞれ18％及び25
％程度の活性固定化率で固定化することが知られ
ている。
しかしながら、上記のうちハロゲン化シアンを
用いる方法においては、該ハロゲン化シアンは猛
毒であるので取扱いに注意を要し、使用後の排水
の処理にも手間がかかり、又、活性化された高分
子と生体高分子との反応はアルカリ性で行う必要
があるので、アルカリ条件下で失活するような生
体高分子は使用出来ないという欠点があり、後者
の場合については活性固定化率が低いという欠点
がある。
用いる方法においては、該ハロゲン化シアンは猛
毒であるので取扱いに注意を要し、使用後の排水
の処理にも手間がかかり、又、活性化された高分
子と生体高分子との反応はアルカリ性で行う必要
があるので、アルカリ条件下で失活するような生
体高分子は使用出来ないという欠点があり、後者
の場合については活性固定化率が低いという欠点
がある。
本発明は上記の如き現状にかんがみ、ハロゲン
化シアンの如き有毒な試薬を用いずともよく、さ
らにアルカリ性の条件下で失活する様な生体高分
子を失活させることなく高分子担体に結合させる
ことが出来、かつ高い活性固定化率で生体高分子
を水酸基を有する高分子に化学的に結合すること
の出来る方法を提供することを目的としてなされ
たものであり、その要旨は第１級又は第２級のア
ミノ基を含有する生体高分子を共有結合により水
酸基を含有する高分子に結合させる方法におい
て、上記高分子を塩化スルフリルと、次いでイミ
ダゾールと反応させたのち、これを上記生体高分
子と反応させることを特徴とする高分子に生体高
分子を結合させる方法に存する。
化シアンの如き有毒な試薬を用いずともよく、さ
らにアルカリ性の条件下で失活する様な生体高分
子を失活させることなく高分子担体に結合させる
ことが出来、かつ高い活性固定化率で生体高分子
を水酸基を有する高分子に化学的に結合すること
の出来る方法を提供することを目的としてなされ
たものであり、その要旨は第１級又は第２級のア
ミノ基を含有する生体高分子を共有結合により水
酸基を含有する高分子に結合させる方法におい
て、上記高分子を塩化スルフリルと、次いでイミ
ダゾールと反応させたのち、これを上記生体高分
子と反応させることを特徴とする高分子に生体高
分子を結合させる方法に存する。
本発明において用いられる水酸基を含有する高
分子としては、多糖類やその誘導体が挙げられ、
例えばデキストラン、セルロース、デンプン、デ
キストリン、アガロースなどの多糖類や、ヒドロ
キシエチルセルロースの様な多糖類の水酸基含有
誘導体が好適に用いられる。
分子としては、多糖類やその誘導体が挙げられ、
例えばデキストラン、セルロース、デンプン、デ
キストリン、アガロースなどの多糖類や、ヒドロ
キシエチルセルロースの様な多糖類の水酸基含有
誘導体が好適に用いられる。
本発明にもとづいて、生体物質を多糖類等の水
酸基を含有する高分子担体に結合させるには、ま
ず、該高分子を塩化スルフリルと反応させて、高
分子の水酸基を式（）の如く変化させ、 Ｒ−OH塩化スルフリル ――――――――→ Ｒ−OSO2・Cl （） 次いで、これにイミダゾールを加えて反応し
て、式（）の如く１−イミダゾリル−スルホナ
ート誘導体を形成させ、 高分子の水酸基を活性化させる。（Ｒは高分子
残基） なお式（）の反応は通常、水分を十分除いた
高分子を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の適
宜な有機媒質に懸濁若しくは溶解させ、−40〜−
50℃に冷却させた状態で塩化スルフリルを滴下し
て行うのが好ましい。
酸基を含有する高分子担体に結合させるには、ま
ず、該高分子を塩化スルフリルと反応させて、高
分子の水酸基を式（）の如く変化させ、 Ｒ−OH塩化スルフリル ――――――――→ Ｒ−OSO2・Cl （） 次いで、これにイミダゾールを加えて反応し
て、式（）の如く１−イミダゾリル−スルホナ
ート誘導体を形成させ、 高分子の水酸基を活性化させる。（Ｒは高分子
残基） なお式（）の反応は通常、水分を十分除いた
高分子を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等の適
宜な有機媒質に懸濁若しくは溶解させ、−40〜−
50℃に冷却させた状態で塩化スルフリルを滴下し
て行うのが好ましい。
又、式（）の反応は、上記において塩化スル
フリルを滴下したのち、大過剰のイミダゾールを
加えて、徐々に温度を室温まで上昇させながら行
うのが好ましい。
フリルを滴下したのち、大過剰のイミダゾールを
加えて、徐々に温度を室温まで上昇させながら行
うのが好ましい。
かくして生成した１−イミダゾリル−スルホナ
ート誘導体は生体高分子中のアミノ基と中性附近
で式（）の如くに反応して、 （は生体高分子残基を示す） 共有結合によつて安定に結合した高分子−生体
高分子結合物を与える。
ート誘導体は生体高分子中のアミノ基と中性附近
で式（）の如くに反応して、 （は生体高分子残基を示す） 共有結合によつて安定に結合した高分子−生体
高分子結合物を与える。
なお、上式（）では第１級アミノ基（−
NH2）を有する生体高分子が活性化された高分
子担体と結合する機構を示したが、第２級アミノ
基（NH）を有する生体高分子についても、上
式（）と同様の機構で活性化高分子と結合す
る。
NH2）を有する生体高分子が活性化された高分
子担体と結合する機構を示したが、第２級アミノ
基（NH）を有する生体高分子についても、上
式（）と同様の機構で活性化高分子と結合す
る。
従つて、本発明においては、結合せんとする第
１級又は第２級のアミノ基を有する例えば酵素、
蛋白質等の生体高分子を中性附近のPH値を有す
る媒質、好ましくは緩衝液に溶解したものに、上
記で用意した水酸基を含有する高分子の活性化物
すなわち１−イミダゾリルスルホナート誘導体を
加えて撹拌すれば上記結合物を得ることが出来
る。
１級又は第２級のアミノ基を有する例えば酵素、
蛋白質等の生体高分子を中性附近のPH値を有す
る媒質、好ましくは緩衝液に溶解したものに、上
記で用意した水酸基を含有する高分子の活性化物
すなわち１−イミダゾリルスルホナート誘導体を
加えて撹拌すれば上記結合物を得ることが出来
る。
又、本発明においては、上記の如くして生体高
分子を結合させたのち、セルロース等の高分子に
なお残存する活性点をブロツクしておくのが好ま
しく、このためには、0.05％程度の２−メルカプ
トエタノールを含む約PH8のトリス塩酸緩衝液
に浸漬すればよい。
分子を結合させたのち、セルロース等の高分子に
なお残存する活性点をブロツクしておくのが好ま
しく、このためには、0.05％程度の２−メルカプ
トエタノールを含む約PH8のトリス塩酸緩衝液
に浸漬すればよい。
上記の如くして本発明にもとづいて用意された
多糖類等の高分子と酵素や蛋白質等の生体高分子
との結合物は、固定化酵素等としてバイオリアク
ターや、胆汁酸等の生体物質分析用の液体クロマ
トグラフイーに用いられる固定化酵素による反応
カラムの充填剤として使用出来るのであり、この
使用に際して酵素等生体高分子は高分子担体に共
有結合によつて強固に結合しているので簡単に分
解されず、広いPH範囲においても安定に使用さ
れ得るのである。
多糖類等の高分子と酵素や蛋白質等の生体高分子
との結合物は、固定化酵素等としてバイオリアク
ターや、胆汁酸等の生体物質分析用の液体クロマ
トグラフイーに用いられる固定化酵素による反応
カラムの充填剤として使用出来るのであり、この
使用に際して酵素等生体高分子は高分子担体に共
有結合によつて強固に結合しているので簡単に分
解されず、広いPH範囲においても安定に使用さ
れ得るのである。
本発明方法は上述の通りの方法であり、とく
に、１個以上の水酸基を含有する高分子を塩化ス
ルフリルと、次いでイミダゾールと反応させて活
性化したのち、これを第１級又は第２級アミノ基
を含有する生体高分子と反応させ、上記高分子と
生体高分子とを共有結合により結合させる方法で
あるので、本発明方法によれば、従来法の如く毒
性の高いハロゲン化シアンなどの試薬を用いずと
もよく、安全に反応を行うことが出来、又、結合
反応を中性の条件で行い得るのでアルカリ性で失
活する様な生体高分子についても高分子担体に結
合させて利用することが出来、しかも高い活性固
定化率で高分子担体に酵素等の生体高分子を結合
させることが出来るという効果を奏するのであ
る。
に、１個以上の水酸基を含有する高分子を塩化ス
ルフリルと、次いでイミダゾールと反応させて活
性化したのち、これを第１級又は第２級アミノ基
を含有する生体高分子と反応させ、上記高分子と
生体高分子とを共有結合により結合させる方法で
あるので、本発明方法によれば、従来法の如く毒
性の高いハロゲン化シアンなどの試薬を用いずと
もよく、安全に反応を行うことが出来、又、結合
反応を中性の条件で行い得るのでアルカリ性で失
活する様な生体高分子についても高分子担体に結
合させて利用することが出来、しかも高い活性固
定化率で高分子担体に酵素等の生体高分子を結合
させることが出来るという効果を奏するのであ
る。
以下本発明につき、実施例にもとづいて説明す
る。
る。
実施例
担体の活性化：セルロースビーズ（商品名セル
ロフアイン700M、生化学工業社製）を蒸留水で
洗浄後、脱水したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（DMF）中で平衡化したものから、セルロースビ
ーズ2.6ｇを取り出し、DMF60mlに撹拌、懸濁
し、ドライアイス−エタノール浴で−40℃に冷却
した。ゆるやかに撹拌しながらこれに塩化スルフ
リル1.6mlを滴下すると反応液は淡黄色になつた。
30分後、イミダゾール10.8ｇを添加し、撹拌しな
がら室温に戻し、セルロースビーズを別して取
り出し、DMF、蒸留水、DMFの順に洗浄し、吸
引脱水を十分に行つて活性化セルロースビーズを
用意した。
ロフアイン700M、生化学工業社製）を蒸留水で
洗浄後、脱水したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（DMF）中で平衡化したものから、セルロースビ
ーズ2.6ｇを取り出し、DMF60mlに撹拌、懸濁
し、ドライアイス−エタノール浴で−40℃に冷却
した。ゆるやかに撹拌しながらこれに塩化スルフ
リル1.6mlを滴下すると反応液は淡黄色になつた。
30分後、イミダゾール10.8ｇを添加し、撹拌しな
がら室温に戻し、セルロースビーズを別して取
り出し、DMF、蒸留水、DMFの順に洗浄し、吸
引脱水を十分に行つて活性化セルロースビーズを
用意した。
酵素の固定化：次に、3α−ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ（3α−HSD）12.6mgを
PH7.0の0.1リン酸緩衝液２mlにとかしたものに、
上記で用意した活性化セルロースビーズ0.62ｇを
加え、撹拌しながら室温にて反応させた。２時間
後別し、セルロースビーズ上に残つている活性
点をブロツクするため、0.05％の２−メルカプト
エタノールを含むPH8.0の0.1Mトリス塩酸緩衝
液に浸漬した。４℃にて２時間静置後、別し、
0.05％の２−メルカプトエタノール及び0.1mMの
EDTAを含むPH7.0の100mMリン酸緩衝液中に
保存した。
イドデヒドロゲナーゼ（3α−HSD）12.6mgを
PH7.0の0.1リン酸緩衝液２mlにとかしたものに、
上記で用意した活性化セルロースビーズ0.62ｇを
加え、撹拌しながら室温にて反応させた。２時間
後別し、セルロースビーズ上に残つている活性
点をブロツクするため、0.05％の２−メルカプト
エタノールを含むPH8.0の0.1Mトリス塩酸緩衝
液に浸漬した。４℃にて２時間静置後、別し、
0.05％の２−メルカプトエタノール及び0.1mMの
EDTAを含むPH7.0の100mMリン酸緩衝液中に
保存した。
固定化率の算出：かくして得られた3α−HSD
固定化セルロースビーズの固定化率を調べるた
め、上記3α−HSD溶液の固定化に用いる前と固
定化後における酵素活性を、PH9.5の20mMピロ
リン酸緩衝液（25℃）中で、補酵素ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド及び基質（コール酸）
の存在下に測定すると、固定化前の酵素活性は
0.275ユニツト／0.1ml、固定化後の酵素活性は
0.0174ユニツト／0.1mlであり、従つて固定化率
は93.7％と算出された。
固定化セルロースビーズの固定化率を調べるた
め、上記3α−HSD溶液の固定化に用いる前と固
定化後における酵素活性を、PH9.5の20mMピロ
リン酸緩衝液（25℃）中で、補酵素ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチド及び基質（コール酸）
の存在下に測定すると、固定化前の酵素活性は
0.275ユニツト／0.1ml、固定化後の酵素活性は
0.0174ユニツト／0.1mlであり、従つて固定化率
は93.7％と算出された。
固定化酵素の活性測定：PH9.5の20mMピロリ
ン酸緩衝液（25℃）中で、補酵素ニコチンアミド
アデニンヌクレオチド1mM及び基質（コール酸）
1mMの存在下に、精秤した固定化酵素を添加、
撹拌して反応させ、活性を調べた所、8.9ユニツ
ト／ｇの比活性値が測定された。
ン酸緩衝液（25℃）中で、補酵素ニコチンアミド
アデニンヌクレオチド1mM及び基質（コール酸）
1mMの存在下に、精秤した固定化酵素を添加、
撹拌して反応させ、活性を調べた所、8.9ユニツ
ト／ｇの比活性値が測定された。
Claims (1)
- １ 第１級又は第２級のアミノ基を含有する生体
高分子を共有結合により、水酸基を含有する高分
子に結合させる方法において、上記高分子を塩化
スルフリルと、次いでイミダゾールと反応させた
のち、これを上記生体高分子と反応させることを
特徴とする高分子に生体高分子を結合させる方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11465883A JPH0249711B2 (ja) | 1983-06-24 | 1983-06-24 | Kobunshiniseitaikobunshioketsugosaseruhoho |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11465883A JPH0249711B2 (ja) | 1983-06-24 | 1983-06-24 | Kobunshiniseitaikobunshioketsugosaseruhoho |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS606703A JPS606703A (ja) | 1985-01-14 |
| JPH0249711B2 true JPH0249711B2 (ja) | 1990-10-31 |
Family
ID=14643315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11465883A Expired - Lifetime JPH0249711B2 (ja) | 1983-06-24 | 1983-06-24 | Kobunshiniseitaikobunshioketsugosaseruhoho |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0249711B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016098313A (ja) * | 2014-11-21 | 2016-05-30 | セイコーエプソン株式会社 | セルロース系材料、液状組成物、造形物および造形物の製造方法 |
-
1983
- 1983-06-24 JP JP11465883A patent/JPH0249711B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS606703A (ja) | 1985-01-14 |
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