JPH02500084A - 殺菌性及び／又は静菌性ペプチド類、それらの単離方法、それらの生産及びそれらの応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 殺菌性及び／又は静菌性ペプチド類、それらの単離方法、それらの生産及びそれ らの応用本発明は新規殺菌性及び／又は静菌性ペプチド類に関する。

それは又、それらの単離方法、それらの生産及びそれらの生物学的応用にも関す る。

昆虫類は動物王国の最も古い群内にある。それらの今日における存在及びしばし ば小空間内の数多くの群内における生活様式はそれらが感染症に対して有効な防 御系を発達させてきたことを示唆する。

少なくとも数個の種類の昆虫類は血体腔の細菌感染に応答してそれらの血リンパ に現われる数個の抗菌因子を有することが知られている（フリースＦＲＩＥＳ− １９８４年：参考文献１）。

昆虫の血球により媒介された細胞応答は殆んど直ちに外来物質な食菌作用、節形 成及びカプセル化により血体腔から除去させることを可能にする。この細胞防御 系は残存細菌を殺し、昆虫を引続く細菌の挑戦に対して保護する体液抗菌因子の 産生よりなる体液（無細胞）応答により補助される（タンＤＵＮＮ　−１９８６ 、参考文献２）、これらの体液因子が近年多くの注目をあびた。その上未知の機 能を有する幾つかの因子例えばハイアロ・ホラ・セクロビア（Ｈｙａｌｏ　ｐｈ ｏｒａ　ｃｅｃｒｏｐｉａ）（アンダーソン　ＡＮＤＥＲＳＯＮ−１９８７年二 参考文献３）。

殺菌性タンパク質の３種の族が異った昆虫種の幼虫及びサナギの両段階から単離 された即ちリゾチーム類、セクロビン類及びアクシン類である。

リゾチーム類は約１５３００〜１６２００の分子量を有するニワトリ卵白リゾチ ームに類似する特性を有する塩基性タンパク質である（タンＤＵＮＮ−１９８６ 年Ｓｏｌ考文性ペプチド類である。それらは数種の昆虫類から単離され、ボーマ ン（ＢＯＭＡＮ　）等、１９８６年（参考文献４）において総説されている。そ のようなタイプのペプチドはまたヨーロッパ特許圧！ｉＥＰ、Ａ、０１８２２７ ８　（ワクナガ製薬に、に、）の主題でもあり、そこでは開示されているペプチ ドはザルコトキシン（Ｓａｒｃｏｔｏｘｉｎ）　Ｉである。

アクシン類は約２００００〜２３０００の分子量を有するタンパク質であり、六 つの関連成分がＨ，セクロビア（Ｈ。

ｃｅｃｒｏｐｉａ）から単離された（ボーマンＢＯＭＡＮ等−１９８６年：参考 文献４）。

アタシン一様タンパク質もまたマンズカ・セフスフ（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔ ａ　）において見出された（バールバートＨＵＲＬＢＥＲＴ等−１９８５年：参 考文献５）。

最近、セクロビンー及びアクシン一様物質もまたグロシナ・モルシタンス（Ｇｌ ｏｓｓｉｎａ　ｍｏｒｓｉｔａｎｓ）　（力−ヤＫＡＡＹＡ等−１９８６年；参 考文献６）及びセレリオ・オイホルビアｘ　（Ｃｅｌｅｒｉｏ　ｅｕｐｈｏｒｂ ｉａｅ）　（ジャロスＪＡＲＯＳＺ−１９８６年：参考文献７）において報告さ れた。

より最近には、その他の昆虫起源の新規殺菌性ペプチド類例えば双翅類ホルミア ・テラノーバ（Ｐｈｏｒｍｉａｔｅｒｒａｎｏｖａｅ）からの誘発性免疫タンパ ク質であるジブテリシン類（ケッピＫｅｐｐｉ等１９８６年、参考文献１４：デ イマルックＤｉｔｎａｒｃｑ等、１９８８年、参考文献１５）及びミバエセラチ チス・カビフタ（Ｃｅｒａｔｘｔｉｓ　ｃａｐｉｔａｔａ）からの殺菌性誘導性 免疫化合物（ホスドレントウエイトＰｏｓｔｌｅｎｔｈｗａｉｔ等、１９８８年 、参考文献１６）などが報告された。他方、新駅広宿主範囲抗生物質ペプチド類 、所謂マゲイニン類がカエル、キセノパス・ラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅ ｖｉｓ）から単離された（ザフロスＺａｓ１ｏｆｆ等、１９８８年；参考文献１ ７）。

全ての上記殺菌性ペプチド類の一次配列のいずれも本発明の主題である新規殺菌 性及び／又は静菌性ペプチド類に対する有意な同族性を示さない。

更に、これらの上記タンパク質類は１種以上の細菌に対して広スペクトル殺菌作 用を有するようである。

例えば、リゾチーム類はグラム０クイプのある種の細菌に対して殺菌作用を有す る。

本発明の一つの目的は異った或いはより広い殺菌及び／又は静菌特性を有する新 規因子を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、これらの因予め単離方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、これらの因子の製造方法を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、これらの因子の生物学的応用に関する。

この分野において本発明者等により行われた実験は蜜蜂の血リンパ中に数個の新 しい抗菌因子の族が誘発され得るとの表明に導いた。これらの抗菌因子の殆んど はその他の昆虫類に誘発しうる既に公知の抗菌因子により現在所有されていない より大きい殺菌及び／又は静菌特性を有するペプチド類により構成される。

免疫蜜蜂の血リンパから単離可能な静菌或いは殺菌特性を有する本発明による組 成物は、その組成物が熱的に安定であり且つ活性リゾチーム類、セクロビン類、 ジブテリシン類、マガイニン類及びアクシン類とは区別される該特性を有する因 子を含有するという事実により特徴付けられる。該因子はそれらの抗菌特性が約 １００℃における約５分間を越える熱処理により影響を及ぼされない点において 「熱的に安定」である。

本発明による好ましい組成物は非免疫蜜蜂の血リンパ中には存在せず、又それら の活性スペクトル及びそれらのアミノ酸組成物及び／又は−次アミン配列に関し てリゾチーム類、セクロビン類、ジブテリシン類、マガイニン類及びアクシン類 とは区別され、実質的にそれらを含まない１個或いは数個のペプチド類により主 として形成される。

本発明による好ましい精製組成物は、非免疫蜜蜂の血リンパ中に存在するペプチ ド類及びリゾチーム類、セクロビン類、ジブテリシン類、マガイニン類、アクシ ン類を実質的に含まない。

前期説明において、「免疫」という言葉は、蜜蜂が外来物質例えば生育可能な（ Ｅ、ｃｏｌｉ）細菌或いは同一誘発特性を有する不活性粒子の注射により、その ような注射を受けなかった蜜蜂−以下「非免疫蜜蜂」と称する−には存在せず、 又該免疫蜜蜂の血リンパから単離することのできる数多くの因子特に殺菌或いは ｎ菌特性或いは両者を有する因子、特にペプチド類を産生ずるように蜜蜂が誘発 されたことを意味するものと理解されるべきである。

免疫蜜蜂はそれらの血リンパ中にリゾチーム、アクシン類及びセクロビンに類似 した数個の抗菌因子を含有することが示された。

しかしながら、免疫蜜蜂の血リンパはアクシン類と異り、熱的処理、約１００” Ｃにおける約５分間の処理によっては影響を及ぼされず、又化学的にセクロビン 類、マガイニン類、ジブテリシン類及び熱的に安定なりゾチーム類似体とは区別 されるその他の因子を含有することが判明した。

これらの因子は非−免疫蜜蜂の血リンパ中には存在しないペプチド類から実質的 に形成される組成物中に存在する。

本発明による組成物は実質的に熱的に不安定なタンパク質例えば１００℃におけ る５分間の熱的処理により不活性化されるタンパク質を実質的に含まない、且つ セクロビン類、マガイニン類、ジブテリシン類及び熱的に安定なりゾチーム類似 体を実質的に含まない組成物を得るために熱的処理特に約１００℃において約５ 分間の処理により精製することができる。

上記成分を実質的に含まない本発明の組成物は、予め熱的に１００℃で分間処理 された免疫蜜蜂の血リンパから出発して、該熱処理血リンパをトリフルオロ酢酸 （極性溶媒）の０．１％（容量）溶液中において稀釈し、得られた溶液をシリカ に共有的に結合したＣ４−脂肪族、Ｃ１８−脂肪族或いはジフェニルリガンドの いずれかを有するシリカの球状ビーズにより形成される非極性静止相（例％ＶＹ ＤＡＣ２１４ＴＰ　５４　、　ＶＹＤＡＣ２１８ＴＰ５４或いはＶＹＤＡＣ２１ ９ＴＰ　５４の名称で市販されている逆相ＨＰＬＣ用カラム充填）上に吸収し、 静止相上に吸収された因子を該０．１％のトリフルオロ酢酸よりなる溶媒中のア セトニトリルの溶液により′溶出することよりなり、該アセトニトリル濃度が約 ５〜約４０容量％の範囲の値に活性ペプチドを溶出するように調整されることを 特徴とする方法により得ることができる。

本発明の組成物中に存在する種々の因子は逆相高速液体クロマトグラフィ　（Ｈ ＰＬＣ）を用いて相互に単離可能である。

本発明に従えば、精製組成物はトリフルオロ酢酸（極性溶媒）の０．１％溶液か らシリカに共有的に結合したＣ４−脂肪族、Ｃ１８−脂肪族或いはジフェニルリ ガンドを有する球状ビーズにより形成される非極性静止相（ＶＹＤＡＣ２１４Ｔ Ｐ　５４　、ＶＹＤＡＣ２１８ＴＰ　５４或いはＶＹＤＡＣ２１９ＴＰ　５４　 ）名称テ販売すレテイル逆相ＨＰＬＣ用カラム充填物）上に吸収された際に該０ ．１％のトリフルオロ酢酸よりなる溶媒中の次第に増大する濃度のアセトニトリ ル溶液の勾配により、特に該アセトニトリル濃度が初めはより低い濃度にあり、 約５〜約４０容量％の範囲の値に到達する勾配により溶出される場合に該非極性 静止相から脱着することのできるペプチド類により実質的に形成される。

ＨＰＬＣはポリペプチド類を疎水性相互作用により吸収する非極性静止相（カラ ム充填物）を用いて行うのが有利である。

この相互作用は水性可動相−以下に溶液Ａと称する一中において有機溶媒−以下 、溶液Ｂと称するーのパーセンテージを増大することにより崩壊することができ る。

溶液Ａは水中０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ　）溶液よりなり、溶液Ｂは 溶液Ａ中７０％アセトニトリル（λ１ｅｃＮ）よりなるのが有利である。

アセトニトリルは毎分１％の溶液Ｂ或いは毎分０．７％のＭｅＣＮに対応する１ ｍ２／分の流速で規則的且つ累進的に添加される。

水溶液Ａはα−アミノ基及び塩基性アミノ酸側鎖がプロトン化されてペプチド類 をより極性を小さくし、且つ特に塩基性及び中心ペプチド類の増大する保持が生 ずるように低ｐＨ（＝２）を有する。

カラム充填物はシリカベースであり球状シリカビーズの表面に共有的に結合した 炭化水素リガンドにより構成される。

本発明の抗菌因子を単離するためには、異った充填物を用いることができる。

これらは例えばリガンドがＣ４炭化水素鎖により構成され、１００キログルトン までの小ペプチド類に対して良好な分解を与える０４カラム充填物、２０個まで の残基の小ペプチドに対して高選択性を有するＣ１ａカラム充填物、及び疎水性 において０４鎖と多少間等であるが、しかし、芳香族残基に対してよりよい吸収 を与えるジフェニルリガンドよりなる充填物などがある。

以下において、Ｃ４、Ｃ１８及びジフェニル使用カラムは標準タイプ（２５０Ｘ ４．６ｍｍ　）のものであり、それぞれＶＹＤＡＣ２１４ＴＰ　５４　、　ＶＹ ＤＡＣ２１８ＴＰ　５４及びＶＹＤＡＣ２１９ＴＰ　５４の名称で市販されてい る。

ＵＶ検出はより小さいペプチド類に対しては、２１４ｎｍの波長において、及び より大きいタンパク質に対して２８０ｎｍの波長において行われる。

本発明による精製組成物のクロマトグラフィは本質的にペプチド類により構成さ れる数個の抗菌因子の存在を示す。

Ｃ４−脂肪族リガントを有するシリカの球状ビーズにより形成される非極性静止 相に吸収されるこれらの因子の各々はその濃度が各因子に対して異るアセトニト リルの勾配により溶出された場合に該非極性静止相から脱着される。

言葉の容易さのために、以下にｒｂｅｅｌＪと称される第一の因子は約８．４％ のＭｅＣＮ濃度で脱着される。

言葉の容易さのために以下にｒｂｅｅ２Ｊと称される第二の因子は約２０．３％ の濃度で脱着される。

言葉の容易さのために以下にｒｂｅｅ３Ｊと称される第三の因子は約２１％の濃 度で脱着される。

言葉の容易さのために、以下にｒｂｅｅ４Ｊと称される第四の因子は約２２．４ ％の濃度で脱着される。

言葉の容易さのために以下にｒｂｅｅ５Ｊと称される第五の因子は約２３％の濃 度で脱着される。

言葉の容易さのために以下にｒｂｅｅ６Ｊと称される第六の因子は約２４．５％ の濃度で脱着される。

言葉の容易さのために以下にｒｂｅｅ７Ｊと称される第七の因子は約２５．６％ の濃度で脱着される。

言葉の容易さのために、以下にｒｂｅｅ８Ｊと称される第への因子は約３３．６ ％の濃度で脱着される。

言葉の容易さのために以下にｒｂｅｅ９Ｊと称される第九の因子は約３４％の濃 度で脱着される。

言葉の容易さのために以下にｒｂｅｅｌＯＪと称される弟子の因子は約３６〜３ ９％の濃度で脱着される。

本発明の精製組成物のクロマトグラフィは１０個のピークを示し、主ピークはｂ ｅｅ　６、ｂｅｅ　８、ｂｅｅ　９に対応する。

同一条件下にＣ−１８カラム上のＨＰＬＣを用いると、ｂｅｅ６は次の二成分に 分離することができた：その脱着が約２５．２％のＭｅＣＮａ度で起こり、劣位 ピークに対応するｂｅｅ　６ａ及び優位ピークに対応するその脱着が約２５．５ ％のＭｅＣＮａ１度で起こるｂｅｅ　６ｂ、　ｂｅｅ　６ａはｂｅｅ　６の全量 の約５％を表わす。

なお、以下で述べる特異性及び活性はｂｅｅ　６即ちｂｅｅ　６ａ及びｂｅｅ　 ６ｂの混合物のそれである。

同一条件下にジフェニルカラム上でＨＰＬＣをめると、ｂｅｅ　８は次の三成分 に分離することができた：その脱着がそれぞれ約３２．９％、３３．４％、３４ ．２％のｖＩｅＣＮ濃度で起こるｂｅｅ　８ａ、　ｂｅｅ　８ｂ、　ｂｅｅ’８ ｃで、ｂｅｅ　８ｂが優位ピークに相当する。

ジフェニルカラムを用いるとｒｂｅｅ　ＩＯＪは約３３．８％の濃度で脱着され る。

本発明の幾つかの抗菌ペプチド類のアミノ酸配列が決定された。よって、本発明 はより詳細には次式を有するペプチド類 ：　ＨｔＮ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｘ−Ｔｙｒ−１１ｅ− Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ− Ｚ−ＯＨ（式中％Ｘはバリル又はインロイシル残基及びＺはロイシル又はインロ イシル残基であ或いは上記アミン配列の一部を先行配列及び殺菌或いは静菌特性 或いは両者と共に共有するその他のペプチド類に関する。言葉の容易性のために 、約１０〜２０個の残基を有するこのタイプのペプチド類をアとダニシン類と称 する。

本発明の好ましいアビダニシン類は次のアミノ酸配列を有する： ＨＪ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ− Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −１１ｅ−ＯＨ（ｂｅｅ　６ａ）。

ＨＪ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ− Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −Ｌｅｕ−ＯＨ（ｂｅｅ　ａｂ）。

ＨＪ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｉ　１ｅ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ −Ｐｒｏ−Ｇ　ｉｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ｂｅｅ　７）。

本発明によるもう一つの好ましいタイプのペプチド（ｂｅｅ９）は下記相対比率 の下記アミノ酸よりなる： Ｐｒｏ：１０又は１Ｉ Ｇｌｙ　：　５ Ａｌａｌミ ニ−ｓ　：　１又は２ Ａｒｇ　：　２ 好ましいペプチドは次式を有する： ＨｚＮ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　−Ｔ ｈｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ　１ｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｐｒｏ　一本発明は又次 の配列を含有する３０〜４０個のアミノ酸残基のへブチド： Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ− Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ− Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　１ｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ− Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ或いはその 部分にも関し、該部分はなお該ペプチドの静菌或いは殺菌特性或いはその両者を 有する。

これらのペプチド類は以下にアバニシン類と称する。

本発明によるもう一つの好ましいタイプのペプチド（ｂｅｅ　８ｂ）は下記相対 比率の下記アミノ酸を含んＴｙｒ　：　６又は７ Ｐｈｅ　：　７ Ｈｉｓ　：　１又は２ Ｌｙｓ　：　６ Ａｒｇ　：　９又は１０ このペプチドはその中心領域が下記の逐次配列及び残基（シアノーゲンーブロマ イド（ＣＮＢｒ）切断及びトリプシン消化により決定）： １１−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｇ ｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ　−Ｉ　ｌ 　ｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ− Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｔｙ ｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅ ｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−：２）−Ｙ−Ａｒｇ− Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ及び（式中、Ｘはグリシン或 いはりジン残基であり、Ｙはプロリン或いはグリシン残基であり、Ｚはアルギニ ン或いはア゛スパラギン酸残基であり、 及び該配列及び残基（１）、（２）、及び（３）はそれぞれ単一アミノ酸残基に より相互に分離されている）を含有し：そのＮ−末端部分が下記配列ニ ーＳｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ −Ｌｙｓ−を含″み： 及びそのＣ−末端部分が下記配列ニ ーＧｌｙ−Ｓｅｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−１１ｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ −を含む 約８０〜約１００個のアミノ酸残基を有するペプチド群の一員である。

完全ペプチド類の殺菌及び／又は静菌特性を有するこれらの約８０〜約１００個 のアミノ酸残基を有するペプチド類をヒメノブタニシンと称する。

本発明によるもう一つの好ましいペプチド（ｂｅｅｌｏ）は下記相対比率の下記 アミノ酸を含んでなる：Ａｓｎニア＆８ Ｔｈｒ：３ Ｓｅｒ：４＆５ このペプチドは約５５〜約６０個のアミノ酸残基、例えば５７個のアミノ酸残基 を含んでなり、そのＮ−末端アミノ酸領域が下記逐次配列及び残基を含んでなる ペプチド群の一員である： ４）ＮＨ，−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−； ５）　−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ− Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｔ−Ａｌａ−： ６）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−； ？）−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈ ｉｓ−；８）−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−： （式中、該配列及び残基（４）、（５１，（６）、（７）、ｆ８）、（９１及び （１０）はそれぞれ、その殆どがシスティン残基によりなるものと思われる単一 アミノ酸残基により相互に分離されている）また、そのＣ−末端領域は下記アミ ノ酸配列よりなり（全ペプチドのスクフィロコツカルＶ８−プロテアーゼの酵素 切断により明らかにされた配列断片により決定）： １１　）　−Ｌｙｓ−Ｓ　ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ− Ｉ　ｌ　ｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ　−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａ ｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−：１２）　−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−；及び １３）Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＯＨ；後者の配列は おそらくペプチドのＣ−末端配列と思われる。

このタイプのペプチド類或いはなお完全ペプチドの静菌及び／又は殺菌特性或い はその両者を有する該ペプチドの部分なヒメナエシン類と称する。

本発明は又上記好ましいものとはあるアミノ酸の置換よりなる或いは好ましいペ プチドの短縮或いは延長よりなり、該ペプチドの本質的殺菌或いは静菌特性或い はその両者を変更しないような修飾により異る任意の等価のペプチド類にも関す るものである。

ヒメノブタエシンｂｅｅ　８及びヒメナエシンｂｅｅ　１０のアミノ酸配列は又 該ペプチド類をコード化するｍＲＮＡを下記の如＜　ｃＤＮＡクローニング及び スクリーニングにより同定することにより間接的に得ることができる。

即ち、全ＲＮＡは免疫化された蜂から説明されるように単離され、ポリＡ−含有 ＲＮＡ画分をオリゴ（ｄＴ）クロマトグラフィ（マニアティスＭａｎｉａｔｉｓ 　ｅｔ　ａｌ、１９８２年−参考文献２７）を用いて精製する。　ｃＤＮＡライ ブラリーは幾つかの公刊された方法の任意のものを用いて構築することができる （ゴーシュＧｈｏｓｈ等、１９７８年−参考文献２３：マニアティスＭａｎｉａ ｔｉｓ等、１９８２年−参考文献２７：オカヤマＯｋａｙａｍａ及びバーブＢｅ ｒｇ　。

１９８２年−参考文献２９；ランドＬａｎｄ等、１９８１年−参考文献２５ニガ フラーＧｕｂｌｅｒ及びホフマンＨｏｆｆｍａｎ。

１９８３年−参考文献２４）、該ペプチド類のアミノ酸配列の実質的部分は公知 であるので、合成オリゴデオキシヌクレオチドプローブはソフトウェアパッケー ジ（インテリジエネティック社ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、１ ９８５年）を用いて部分的ペプチド配列に適合するように設計することができる 。Ａ、Ｔ及びＣに水素結合を形成するデオキシイノシンをこれらのオリゴデオキ シリボヌクレオチド類の合成においてゆらぎ位置に用いる（オンツカ０ｎｔｓｕ ｋａ等、１９８５年−参考文献２８；アンド−Ａｎｄｏ及びナトリ　Ｎａｔｏｒ ｉ　、　１９８８年−参考文献３０；リドホルムＬｉｄｈｏ１ｍ等、１９８７年 −参考文献２６）。

標識化後、これらのオリゴデオキシリボヌクレオチド類を用いてパイプリグイゼ ーションによりｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（マニアティスＭａ ｎｉａｔｉｓ等、　１９８２年−参考文献２７）、該オリゴデオキシリボヌクレ オチドプローブとハイブリダイズするそのようなｃＤＮＡの部分を次いで無関係 ｃＤＮＡから分離し、配列決定され及び該ＤＮＡ部分のヌクレオチド配列と出発 ペプチド配列が得られ、それにより該ヌクレオチド配列がアミノ酸或いはペプチ ド残基の未だ未同定のものから同定のための情報を提供する。

本発明のペプチド類は上記の如く免疫蜜蜂の血リンパから単離することができる か、或いは特に化学的方法により合成的に調製できることは勿論である。特に１ 本発明によるペプチド類はペプチド合成の分野における通常の技術により調製さ れる。この合成は均質溶液或いは同相において行われる。

例えば、Ｅ、ブンシュ（ＥＪｕｎｓｃｈ）　、　ｖｏｌ、１５−　Ｉ及びＩＩ　 ＴＨＩＥＭＥ　、シュツットガルト、１９７４年により編集された＋Ｍｅｔｈｏ ｄｅｎ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ＋という標題の論文に おけるヒユーベンワイル（ＨＯＵＢＥＮＷＥＹＬ）により説明された均質溶液に おける合成技術が用いられてよい。

この合成方法は２対２の逐次アミノ酸を必要順序において逐次縮合するか、或い は予め形成されたアミノ酸及び断片を縮合し、及び数個の既に適当な順序にある アミノ酸残基な含有すること、或いはまた予め調製された数個の断片を含有させ ることよりなるが、通常ペプチド結合の形成、特にカルボキシル官能基の活性化 後に関与する該アミノ酸残基或いは断片の一つのアミノ官能基及び次の残基或い は断片のカルボキシル官能基或いはその反対を除いて、これらのアミノ酸或いは 断片の有する全ての反応性官能基を予めペプチド類の合成において周知の方法に 従って保護することの注意がとられなければならないことが了解されるべきであ る。別法として、カルボジイミドタイプ、例えばｌ−エチル−３−（３−ジメチ ルアミノプロピル）−カルボジイミドなどの通常のカップリング試薬を用いるカ ップリング反応を使用することができる。この反応に含まれるアミノ酸が分岐鎖 或いはアミノ基を有する場合には、後者は保護されなければならない（例えば、 グルタミン酸の場合にはｔ−ブチルエステル基により）、或いはリジンの場合に はｔ−ブチルオキシカルボニルにより。

アミノ酸対アミノ酸による漸進的合成によ′る場合には、合成は、好ましくは、 Ｃ−末端アミノ酸と所望配列における隣接アミノ酸に対応するアミノ酸との縮合 により開始して次第にＮ−末端アミノ酸に至る。

本発明のもう一つの好ましい技術に従えば、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　 ｐｈａｓｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）　Ｊと称される記事（Ｊ 、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、４５．２１４９−２１５４）におけるＲ、　Ｄ、メ リフィールド（Ｒ，Ｄ、　ＭＥＲＲＩＦＩＥＬＤ）により説明されている技術が 用いられる。

メリフィールド法に従って、ペプチド鎖を製造するためには、鎖の第一のＣ−末 端アミノ酸をそのカルボキシル基を介して適当な多孔性重合体樹脂に固定し、そ のアミン官能基を次いで例えばｔ−ブチルオキシカルボニル基により保護する。

このＣ−末端アミノ酸のアミン官能基の保護基を、次いで樹脂を酸で洗浄するこ とにより除去する。ｔ−ブチルオキシカルボニル基よりなる保護基はトリフルオ ロ酢酸による樹脂の処理によって除去することができる。

次いで、所望ペプチド配列の第二のアミノ酸残基な与える第二のアミノ酸をその Ｃ−末端アミノ酸残基を介して樹脂に固定された第一〇Ｃ−末端アミノ酸の脱保 護アミン官能基にカップリングさせる。好ましくは第二のアミノ酸のカルボキシ ル官能基は例えばジシ′クロヘキシルカルボジイミドにより活性化されるのに対 し、そのアミン官能基は例えばｔ−ブチルオキシカルボニルにより保護されるの がよい。

このようにして所望ペプチド鎖の最初の二つのアミノ酸よりなる第一の部分が次 いで得られ、その末端アミン官能基が保護される。前期と同様にして、アミン官 能基を脱保護し、次いで同一条件下に第三のアミノ酸の固定を行う。

このように、ペプチド鎖を究極的に形成する逐次アミノ酸が、樹脂に結合された 漸進的に成長するペプチド部分を予め脱保護されたアミン基に各度毎に次々と固 定される。

全部の所望ペプチド鎖が形成されると、ペプチド鎖に関与する異ったアミノ酸の 保護基が除去され、ペプチドが樹脂から例えばフッ化水素酸を用いて脱離される 。

本発明のペプチド類は又組換えＤＮＡ技術によっても製造することができる。

より詳細には、本発明はＤＮＡ配列を含む適当なベクター、例えば本発明のペプ チド類のいずれかを含むペプチド配列をコード化するｃＤＮＡ、（該ＤＮＡ配列 はプロモーターの制御下におかれ、該ペプチド配列の該ＤＮＡ配列の発現を行う ように細胞宿主機械により認識される停止シグナルが続く）を含有する適当なベ クターで予め形質転換された細胞宿主を培養し、及び探索するペプチドを細胞培 養液の発現生成物から回収すること有利な宿主細胞はラクトバシルス、Ｅ、コリ 或いはアグロバクテリウム菌株に属する。

好ましくは、そのように産生されるペプチドの静菌或いは殺菌作用により影響を 及ぼされない宿主菌株が用いられる。

また、特に宿主細胞がそのように産生されたペプチドの静菌或いは殺菌作用によ り影響を及ぼされやすい場合には誘発性プロモーターを用いるのが好ましい。

或いはまた、本発明のペプチドをコード化するＤＮＡがまたベクターにより供給 され、また培養培地内に産生されたペプチドを排出し、該ペプチドが次いでそれ から分離されるベクターシステムが用いられる。

或いはまた、本発明のペプチドをコード化するＤＮＡ配列は該ブロモ−クーの制 御下におかれるより長いペプチドをコード化するより長いペプチドＤＮＡ配列の 一部とされ、該より長いペプチドは細胞宿主に関して毒性活性を有しないハイブ リッドタンパク質により構成される。該より長いペプチドのもう一つの実施態様 において、後者はそれ自体決定プロテアーゼにより特異的に切断可能である決定 ペプチド断片（産生目的のペプチド内には対応部分を有さない）により包囲され ている０本発明の方法は後者の場合においては細胞宿主から回収されたより長い ペプチドを該決定プロテアーゼにより切断し、及び本発明のペプチドをそれから 回収する工程を含んでなるものである。

幾つかのアビダニシン類特にｂｅｅ　６ｂの類似体であるａｐｉｄ　ＰＴ−１、 ｂｅｅ　６ｂの類似体であるＮＴ＋１及びｂｅｅ　７の同族体であるａｐｉｄＩ Ｉの化学合成の具体例を以下に示す、又、組換えＤＮＡ技術によるｂｅｅ　６ｂ の微生物産生の具体例も以下に示す。

本発明のペプチド類は各種細菌に対して殺菌或いは静菌特性或いはそれらの両者 を有することが示された。

これらの細菌の中でグラム゛細菌、例えばストレブトコッキ、及びグラム−細菌 例えばエルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ　）　、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ）は本発明のペプチド類の存在下において影響を及ぼされた。

本発明は又、ヒト或いは動物における治療及び予防の分野における、植物病原体 防除の分野における、及び食物及び飼料コントロールの分野における用途のため の組成物にも関する。

本発明の組成物は、本発明の物質組成物と共に適当な薬学的担体を含有するもの であるが、該物質組成物は組成物内に殺菌或いは静菌特性或いはその両者の発現 のために十分な投与量で存在する。

更に、本発明は上記物質組成物部ちペプチド類と共に適当な担体或いは該物質組 成物を産生するラクトバシルス細菌株が細菌感染症例えばクロマトリジウム感染 症に関して材料を保存するために食物或いは飼料などの材料中に導入されている 組成物に関する。これらの材料には農業及び／又は工業用食物及び／又は飼料、 或いはカッティング油などのその他の用途用のあらゆる種類の微生物分解性製品 が含まれる０食物としては、新鮮な肉、細分、発酵、及び非発酵向、ニワトリ、 サカナ、ミルクその他の酪農製品、商業的に製造された野菜、サラダ、ドレッシ ング、ソース、及び貯蔵時に腐敗にされされるあらゆるその他の食物が挙げられ る。飼料としては、サイレージ及び貯蔵に際して腐敗に曝されるあらゆるその他 の飼料が挙げられる。

好ましい組成物は適当な薬学的担体と共にアビダニシン類（ｂｅｅ　６及びｂｅ ｅ７）、ヒメノブクニシン（ｂｅｅ　８）　、アバニシン類（ｂｅｅ９）或いは ヒメナエシン（ｂｅｅ　１０）の任意のものをそれらの抗菌特性の発現に十分な 量で含有する。

本発明のその他の特徴及び利点は関連する図面を参照して行われる以下の開示に 照して、当業者に明らかとなる。

添付図面において、 一第１Ａ図はＥ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１の免疫リンパ（曲線Ｉ）及びブラ ンクリンパ（曲１１Ｂ）の存在下における培養液における６３０ｎｍ　（Ａ６３ ０ｒ＋ｍ）において測定された光学密度の変化により測定された該微生物の生育 に及ぼす効果対時間数（Ｈ）で表わされた時間を例示する曲線を示す。

一第１Ｂ図は免疫（Ｉ）及びブランクリンパ（Ｂ）のＩＥＦ−ＰＡＧＥを示す。

一第２Ａ図及び第２Ｂ図は、逆相ＨＰＬＣにおいて得られたそれぞれ加熱ブラン クリンパ（Ｂ）、及び加熱免疫リンパ（Ｉ）の比較クロマトグラフを示す。

−第３Ａ図は先のクロマトグラフィにおいて得られたヒメノブクニシン類の一つ （ｂｅｅ８）の更に分割を示すクロマトグラフである。

一第３Ｂ図はジフェニルカラムを用いる逆相クロマトグラフィにおいて得られた ヒメナエシン（ｂｅｅ　１０）の保持時間を示す。

一第３Ｃ図は０４カラム上におけるアビグエシン類の逆相分析を示し、図中、 １　＝ｂｅｅ　６ｂの合成類似体：　Ａｐｉｄ　ＰＴ−１２＝ｂｅｅ６ａ及びｂ ｅｅ　６ａの合成類似体：Ａｐｉｄ　ＮＴ＋　１及びＡｐｉｄ　Ｉａ３＝ｂｅｅ ６ｂ ４＝ｂｅｅ７゜ 一第３Ｄ図は０４カラム上の幼虫リンパの逆相分析を示す。

一第４Ａ〜４Ｄ図は第１図と同様にして行われたアッセイにおける異った微生物 に関するペプチドの殺菌効果を例示する曲線を示す。

一第５図はｂｅｅ　６ｂをコード化するＤＮＡ断片を含有する例示として与えら れた一連のプラスミドの造築を示す。

第２Ａ、　２Ｂ、　３．Ａ、３Ｂ、３Ｃ１３Ｄ図において、点線は次のものを示 す：図上に示された時間における勾配ｏ〜５％Ｂ　（０，１％ＴＦＡ中７０％Ｍ ｅＣＮ）　；流速＝１ｍ！２７分。

■　社貝」≦Ｌ友珠 成虫働き蜂は、動物生理学の実験室、ＧＥＮＴで生育されたコロニー（アビス・ メリフェラＡｐｉｓ　ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）から得られた。それらは３２±２℃ に維持されたり−ベフェルド（ＬＩＥＢＥＦＥＬＤ）篭に移され、砂糖水混合物 （１／ｌ）を自由に与えた。

■： 標準的アッセイ生物体はＥ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１、ミクロコツカス・リ ゾディクチカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　１ｙｓｏｄｅｉｋ−ｔｉｃｕｓ）　 ＬＭＧ　４０５０及びＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ５１４　ｐＵｃ１８であった。

加えて、免疫リンパから異った体液因子の抗菌特異性をスクリーニングするため に一連の細菌株を用いた。

これらの菌株は抗菌的に３３℃において寒天プレート上（ＬＰＧＡ、　ＮＡ或い は１０％ＴＳＡ　）で生育した。

ＬＰＧＡはペプトン、グルコース、酵母エキス及び寒天よりなる（参考文１１Ｊ １０）　、　ＮＡはＤＩＦＣＯ社−ブトロイド（米国）から市販されている栄養 寒天である。　ＴＳＡ（トリブチカーゼ大豆寒天）はＢＢＣ社−コッキーズビル （米国）から市販されている。

細菌懸濁液はＰＢＳ　（リン酸緩衝塩水：０．８％ＮａＣ１，０，０２％ＫＨｉ Ｐ０４．０．０２％ＫＣＩ、０．１１５％ＮａＪＰ０４）　０．１５Ｍ。

ｐＨ＝７．２を用いて作製した。

細菌濃度は計数室内でめた。生きた懸濁液はプレート計数により検証した。

ポリアクリルアミドゲル”’ＰＡＧＥ 自生タン自生タンパ気質動は下記のものを使用して行った。： ＊等電集中（ｐＨ３，５−１０）　ＬＫＢ　。

リンフ試料をワットマン（ＷＨＡＴＴＭＡＮＮ）試片（ｎ　３１１Ｍ）に適用し 、ゲル上に直装置いた。ゲルを１００ＯＶにおいて３時間４℃で操作した。

＊ガブリエル（ＧＡＢＲＩＥＬ）　１９７１年、参考文献８）により修正された 陰極不連続ＰＡＧＥ　（ｐｌ＝　４、１５％ＰＡＤ。

塩基性タンパク質用の自生系統を用いて殺菌活性が免疫リンパ内に存在すること を示した。

＊全てのゲルを溶液Ａ（１５％トリクロロ酢酸、３．５％スルホサル酸）中にお いて固定し、及びアンソルゲ（ＡＮＳＯＲＧＥ）　（１９８５年、参考文献９） に従って録染色するか或いはクーマシーブリリアントプルーＲ２５０で溶液ｂ　 （２５％エタノール及び８％酢酸）中において染色し、及び溶液亘を用いて脱染 色した。

底１ヱユ土ヱ ＊殺傷アッセイ ＰＢＳで稀釈されたブランク或いは免疫化蜂の全リンパ或いはＰＢＳで復元され た免疫リンパからの精製成分（７，５Ｐ％ＬＰＧは寒天なしのＬＰＧＡよりなる ）をマイクロクイクープレートに移し、対数期の細菌を接種した。

細菌の発達を光学密度の測定及びプレートカウント数により追跡した。

＊寒天拡散アッセイ 出発材料（加熱リンパ）に等しい最終容量にＰＢＳ中に再懸濁した全リンパ或い は精製成分を試験生物体を接種した寒天プレート上の３ｍｍのウェルに適用した 。

抗菌活性は生育阻止帯を（ｍｍで）測定することによりめた。細菌株は異った生 育速度を示したので、阻止帯は２４時間及び７２時間後に記録された。

＊自生（ＰＡＧＥ）ゲル上での抗菌アッセイバンドを抗菌活性で局在下するため に、ゲル（等電集中及び陰不連続）を直ちに洗浄しく　ＰＢＳ中で１０分間２回 、５０％アルコール、蒸留水及びＰＢＳ中で５分間１回：最終的にゲルをＬＰＧ Ａ　（１％寒天）を重層し、対数期細菌を接種し、３３℃でインキュベートした 。

■　・蜂の　疹血リンパの調蒙゛ −臼Ｉ疹」−」ｉ作 成虫働き蜂をＣＯ２で麻酔し、致死下投与量のＥ、　ｃｏｌｉで感染した。より 詳しくは、それらは無菌条件下に１ｕＩ２ＰＢｓに懸濁された３　Ｘ　１０’個 の対数期Ｅ、ｃｏｌｉＮＣＴＣ９００１を注射された。

面体腔内注射は予め７０％のエタノールで殺菌された小鱗片表面の背皮にハミル トン（ＨＡＭＩＬＴＯＮ］注射器を用いて行った。この操作は傷を溶融ワックス でシールすることにより終了した。

大きいリンパ試料が必要である場合には、蜂を予めＥ、ｃｏｌｉ９濁液に浸漬し た針を用いてそれらを傷つけることにより感染させた。

１工ヱ匹旦ｌ 「免疫化ｊ後２日後に免疫及びコントロール血リンパを熱−先鋭化ガラスキャピ ラリーを用いて腹部のセグメント間膜を破裂させることにより麻酔蜂からえられ た。

血リンパは血液リンパのメラニン化を防止するために数個のフェニルチオウレア の結晶を含有する氷−冷却管内にプールした。

血球を遠心分１ｉｉ！　（ｌｏｏｏｏｇＸ　１０分間）により除去し、リンパを 直ちに用いるか或いは一７０℃に凍結した。得られた調剤が以下に「免疫リンパ 」と称されるものを提供した。

「　蜂の血リンパ　に占　された体液　のジ 以下に述べる如く、致死下量のＥ、　ｃｏｌｉ！Ｅｌ菌が免疫化蜂内に蜂を引続 く細菌感染に対して保護する幾つかの因子（コントロール蜂中には存在しない） を誘発したことが見出された。

阻止帯アッセイにより、リゾチーム力値は傷付は或いは外来物質の注射に応答し て相当に増大することが判明した。他方、免疫リンパはＥ、ｃｏｌｉに対して殺 菌性であることが示された。

この結果を第１Ａ図に示すが、図中Ｅ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１のブランク リンパ（Ｂ）及び免疫リンパ（Ｉ）の存在下における生育曲線が表わされている 。

生きたＥ、　ｃｏｌｉの濃度は６３０ｎｍ　（ｎ　＝　７　）における光学密度 の測定から縦軸に演鐸されており、細菌濃度はプレートカウントで確認された。

リゾチームはある種のグラム゛細菌に向けられているので、その他の体液因子も 又グラム−Ｅ、ｅｏｌｉが阻止されたので含まれなければならなかった。これら の因子は感染後５〜１０時間後にリンパに出現した。これは又生存試験により確 認された蜜蜂における保護された「免疫」状態を得るために必要な最少時間であ った。

このＥ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１に向けられた体液因子は、５分間の煮沸が その殺菌活性に影響を及ぼさなかったので耐熱性であった。

Ｅ、ｃｏｌｉワクチン化働き蜂からの免疫リンパは又幾つかの菌株に対して殺菌 性であり、体液応答が特異的でないことを示した。

体液応答は生育可能な細菌を注射することによって活性化されたにすぎないもの ではなかった。熱−殺傷細菌及び墨汁及びラテックスビーズなどの不活性粒子も 又同様な活性を顕在化することが判明した。

ポリアク１ルアミドゲル０気゛ＰＡＧＥブランク蜂（Ｂ）及び免疫化蜂（Ｉ）の リンパを等電集中ＰＡＧＥ上で分析した０両試料の比較は免疫リンパにおける数 個の追加のタンパク質の存在を示した（第１Ｂ図）。

ゲルの生育可能なＥ、ｃｏｌｉ細菌による接種は主たる細菌分解活性はゲルの基 底領域に位置することを示した。

これらの観察に基づき、リンパ試料を更に電気泳動系において塩基性タンパク質 について検討した０円盤ゲルに異った細菌株を重１すると、次の三つのクイズの 体液殺菌性因子が観察された：リゾチーム（Ｍ、リゾディクチカスＭ、　１ｙｓ ｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓにより決定）及び二つの追加の因子、特にＥ、　ｃｏｌｉ 菌株（ＮＣＴＣ９００１及びに５１４ｐｕｃ１８　）に向けられたもの。

これらの３種の体液因子は又加熱免疫リンパ中にも存在した。　Ｅ、ｃｏｌｉ　 ＮＣＴＣ９００１に向けられた活性は未影響のままであった。他の二つの因子の 活性は熱処理に、より減少したもののなお検出可能であった。

ＩＩＩ　体゛−のＲＰ−ＨＰＬＣによる　製免疫リンパを先ず１００℃で５分間 煮沸した。

非免疫即ちブランク（Ｂ）及び免疫（Ｉ）蜂からの加熱リンパを逆相高速液体ク ロマトグラフィ（ＫＲＡＴＯＳ）により精製した。

溶媒Ａ（水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）　）を５０％（Ｖ／Ｖ　）の 最終濃度までリンパ試料に添加した０次いで精製を下記の如く行った。

溶液なＲＰ−０４カラム（０，４６Ｘ　２５ｃｍ）よりなるＫＲＡＴＯ５ＨＰＬ Ｃ系にかけ０．７％ＭｅＣＮ／分の勾配を有する溶媒Ｂ（溶媒Ａ中７０％アセト ニトリル（ＭｅＣＮ）　）中で１ｍρ／分の流速で溶出した。吸光度を２１４ｎ ｍにおいて追跡した。第２Ａ図及び第２Ｂ図上、Ｂはブランクリンパを表わし、 工は免疫リンパを表わし、及び傾斜点線は形成された勾配におけるアセトニトリ ルの濃度変化（％表示）を表わす。

分析試験は免疫リンパ（第２Ｂ図）に、ブランクリンパ（第２Ａ図）には存在し なかった９つのピークを示した。第２Ａ図において対応するピークの上の番号に より標識したこれらの因子は以下にそれぞれｂｅｅ　１、ｂｅｅ２、ｂｅｅ　３ 、ｂｅｅ　４、ｂｅｅ　５、ｂｅｅ　６、ｂｅｅ　７、ｂｅｅ８、ｂｅｅ　９と して称される集められたペプチド上に実質的に形成された。

体液応答は蜂に墨汁及びラテックスビーズを注射した場合にも同様にして活性化 された。これらの蜂からの「免疫」リンパも又ブランク蜂のリンパには存在しな い９つのピーク（より小さい程度であるが）を示した。この実験も又該ピークが 細菌溶解の生成物ではないことを確認した。

これらの異ったペプチドについて後に以下に示すように試験を行った。

次の精製工程において集められたピークの幾つがを更Ｇ：Ｃ１８或いはジ：７　 ｘ−ルカラｂ　（ＶＹＤＡＣＲＰ−Ｃ１８或いはＶＹＤＡＣＲＰ−ｄｉＯ）を用 いる時点において、及び以下に説明するのと同様なＨＰＬＣ操作を用いる時点に おいて溶液Ａ中に先ず再稀釈した後に更に精製した。

そのようなジフェニルカラムを用いてｂｅｅ　８は３種の成分即ち一緒に近接し て溶出するｂｅｅ　８ａ、　ｂｅｅ８ｂ及びｂｅｅ　８ｃにより構成されること が示された（第３図）。

ｂｅｅ　６も又Ｃ−１８カラムを用いて二つの画分に分解された。即ちｂｅｅ　 ６ａは劣位ピークに担当しくｂｅｅ　６の全量の５％）、及びｂｅｅ　６ｂは優 位ピークに相当する。

、のアミノ酸　析ｆＡＡＡ ｂｅｅ　６ａ、　ｂｅｅ　６ｂ、　ｂｅｅ　７、及びｂｅｅ　９のアミノ酸配列 並びにｂｅｅ　８ｂ及びｂｅｅ　１０の部分的アミノ酸配列及び基本的アミノ酸 組成を決定した。　ｂｅｅ　６ａ及びｂｅｅ　６ｂの得られた一次構造はトリプ シン及びキモトリプシン消化により確認された。

Ａ成アビグエシン類のＬｔｄ・Ａ成　び　オアビグニシン類ｂｅｅ　６ａ、　ｂ ｅｅ　６ｂ及びｂｅｅ　７を合成した。この化学的ペプチド合成は完全自動化ペ プチドシンセサイザー、モード４３０Ａ　（アプライド・バイオシステムズ社Ａ ＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ　Ｉｎｃ、、カリフオ）レニア州、フォス ターシティ−）を用いて行った。　１−ブチルオキシカルボニル（ｔＢＯＣ）　 −Ｎα−保護、Ｌ−立体配置アミノ酸を逐次Ａ、Ｒ，ミッチェル、Ｓ、Ｂ、Ｈ， ケント、Ｍ、エンゲルハルト及びＲ，Ｂ、メリフィールド（Ａ、Ｒ，Ｍｉｔｉｃ ｈｅｌｌ、Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｋｅｎｔ、Ｍ、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ　ａｎｄ　Ｒ，Ｂ 。

Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　１９７８年、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、４３．２８４５） に従ってｔＢＯＣ−Ｌ　−ＬｅｕＯＣＨｉ−フェニルアセトアミドメチル−（ポ リスチレン樹脂）にカップリングさせたが、ここにおいて適当な側鎖保護基はＡ ｒｇ（トルエンスルホニル）、Ｈｉｓ（トルエンスルホニル）及びＴｙｒ　（Ｂ ｒ−ベンジルオキシカルボニル）であった、出発樹脂（０，６６ｇのポリスチレ ン）の負荷は０．５ｍｍｏｆｆ　ｔＢＯｃ　−Ｌ　−Ｌｅｕであった。シンセサ イザーを各アミノ酸付加毎に２０カツプリングを行うように再プログラム化した 他は標準的アプライド・バイオシステムズの合成処法を用いた。ペプチド合成の 完結後、Ｎα−ｔＢＯｃ基を６５％のトリフルオロ酢酸で除去し、０．５ｇの中 和及び乾燥ペプチド樹脂を０．５ｎｌのｐ−クレゾール（フル力ＦＬＵＫＡ　、 ロンコムコマ、ニューヨーク）及び４．５ｎ＋４２の新たに蒸留した無水ＨＦ　 （ノースイースト・クリオジエエックスＮ０ＲＴＨＥＡＳＴ　ＣＲＹＯＧＥＮＩ ＣＳ、マサチューセッツ州、ニュートンビル）の混合物で一４℃で１時間切断し た。　ＨＦを排気後、ペプチドを４０ｍ２の２０％酢酸でポリスチレンから抽出 した。この溶液を次いで４０ｍ　４２ＣＨｇＣＩ２＊で３回抽出し、水相を水で ５倍に稀釈し、凍結乾固した。　９８ｍｇの全量粗製ペプチド粉末から６ｍｇを 、１ｍＩ２の０．１％トリフルオロ°酢酸（ＴＦＡ　）に溶解し、同−溶媒系で 平衡化されたＮＡＰ−１０カラム（ファルマシアＰＨＡＲＭＡＣＩＡ、ニュージ ャージ州、ビス力タウエイ）上でクロマトグラフを行った。ペプチド画分を次い で二つの別々の実験において、０．１％ＴＦＡで平衡化された（　Ｉ　Ｘ　５０ ｃｍ）ヌクレオゲンＮｕｃｌｅｏｇｅｎ　Ｃ−１８カラム（マシエレイ・アンド ・ナーゲルＭＡＣＨＥＲＥＹ　ＡＮＤＮＡＧＥＬ、デュレン　Ｆ、　Ｒ，Ｇ、　 ）上に注入し、０．１％ＴＦＡ中アセトニアセトニトリル勾配％／分）により４ ｍ２／分で溶出した。このＩ（ＰＬＣ系は二つの、モデル１１４Ｍポンプ、２１ ４ｎｍに設定されたモデル１６０ＵＶ−検出計セット及びモデル４２１コントロ ーラー（ベックマン・インストルメンツ社ＢＥＣＫＭＡＮ　ＩＮＳＴＲＵＭＥＮ ＴＳ、Ｉｎｃ、カリフォルニア州、バークレー）よりなった、主ピークの中心部 分を集めた。１％のこの画分についての、（０，４６ｘ゛２５ｃｍ）ＶＹＤＡＣ Ｃ４（２１４ＴＰ　５４　）分析カラム及び２１４ｎｍにおけるＵＶ−検出を用 いる標準的クラトスＫＲＡＴＯ３ＨＰＬＣ系を用いて、上記と同−溶媒系を用い て１ｍε／分で操作される再クロマトグラフィは２４．５％のアセトニトリル濃 度で溶出した単一対称ピークを与えた。真空チューブ内で６Ｎ　Ｈｌ　１０．１ ％フェノールを用いた気相加水分解後、後−力ラムニンヒドリン誘導化（ベック マンアナライザー）を用いる１％の精製ペプチドについてのアミノ酸分析及び− 次配列決定を行った。これらの配列は下記の通りであり、Ａｐｉｄ　ＮＴ＋１及 びＡｐｉｄ　Ｉａがそれぞれｂｅｅ　６ａの合成類似体であり、Ａｐｉｄ　ＰＴ −１及びＡｐｉｄ　Ｉｂがそれぞれｂｅｅ　６ｂの合成類似体であり、及びＡｐ ｉｄ　ＩＩがｂｅｅ　７の合成同族体である。

Ａｐｉｄ　ＮＴ＋ｌ　： ＨＪ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉ 　１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−１１ｅ−ＯＨ。

この合成アビダニシンはその天然類似体ｂｅｅ　６ａに対比して第３番目の位置 に追加のアスパラギン残基を有する・ ＨｔＮ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−Ｉ　１ ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−Ｉ　１ｅ−ＯＨＡｐｉｄ　ＰＴ−１＋ ＨＪ−Ｇ　ｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ −Ｇ　ｌ　ｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｌ ｅｕ−ＯＨこの合成アビダニシンはその天然類似体と対比して第９番目の位置に 一つのプロリン残基な欠失する。

Ａｐｄｉｄ　Ｉｂ： ＨＪ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ　−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉ　ｌｅ −Ｐｒｏ−Ｇ　ｌ　ｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＯＨＡｐｉｄ　ＩＩ　： ＨｔＮ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ −Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ −Ｌｅｕ−ＯＨ逆相ＨＰＬＣからの溶出プロフィールが決定された（第３Ｃ図） 、保持時間は天然ｂｅｅ　６ｂよりも相当に早く溶出するＡｐｉｄ　ＰＴ−１以 外は天然及び合成のアビグエシン類間に実質的差異を示さない。

°　ペプチド類ｂｅｅ１〜９　の村＝アッセイ精製ｂｅｅ　６、ｂｅｅ　８及び ｂｅｅ　９の殺菌活性を液体培地中におけるＥ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１の 生育阻止を引起こすそれらの能力をアッセイして試験した。

第４Ａ、４Ｂ、４Ｃ及び４Ｂ図は生育阻止対時間数（Ｈ）での時間によるこれら のペプチドのミクロコツカス・リゾディクチカスＭｉｃｒｏｃｃｏｃｕｓ　１ｙ ｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ　（Ｃ）、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１（Ａ、　Ｄ ）に及ぼす抗菌効果を示す。

ＰＢＳ　（７，５％ＬＰＧ）に再懸濁された精製因子（第４Ａ、４Ｂ、４Ｃ１４ Ｂ図）に１０４個の細胞（Ｃ）或いは１０”個の細胞（Ａ、Ｂ及びＤ）を接種し た。細菌の発育を６３０ｎｍにて光学密度（）を測定することにより計算した。

第４Ａ〜４Ｄ図の曲線上に、それらがそれぞれ関係するペプチドに従って番号を 付した（例、第４Ａ図の曲線６はｂｅｅ　６ａ及びｂｅｅ　６ｂの混合物のＥ、 ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１細胞に及ぼす阻止効果を示し、第４Ｂ図における曲 線８ｂはｂｅｅ　８ｂのＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ５１４に及ぼす阻止効果を示す。

曲線１はコントロールに対応する。該図面の各々における印字は関連するアッセ イが行われた生物体を示すものである。

これらの実験はｂｅｅ　６が試験生物体Ｅ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１に対し て強い活性を示したことを表わす、このＥ、　ｃｏｌｉ菌株は　ｂｅｅ　８及び ９或いはｂｅｅ　１．２．３゜及び４のいずれに対しても感受性でなかった。

ｂｅｅ　６、ｂｅｅ　８及びｂｅｅ　９については又液体培地内におけるその他 の細菌の生育を阻止する能力についてアッセイを行った。　ｂｅｅ　８ｂはＥ、 ｃｏｌｉ　Ｋ５１４に対して活性であった。

３−且止帯アッセイ ｂｅｅ６．８及び９の約３０個の細菌株に対する第一のスクリーニングはこれら の精製体液因子が加熱免疫蜜蜂リンパに存在する効率的な微生物殺菌活性を表わ すことを示している。二つの真核生物菌株（Ｓ、セレビジアエＳ、　ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ及びり、ハンセニイＤ、ｈａｎｓｅｎｉｉ　）も又それらの感受性に ついて試験され、耐性であることが判明した。

ｂｅｅ　６は多数の異った菌株に対して活性であることが判明した。この体液因 子は数個の植物関連細菌に対して高度に活性であることは興味深いことである。

Ａ、ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）　、Ｅ、カロトボラ（ Ｅ、　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）などの植物病原体が強く阻止され、共生細菌であ るＲ、レグミノサルム（Ｒ。

ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ　）はｂｅｅ　６及びｂｅｅ　８の両者に感受性で あった。

結果を以下の表に示す。

表１は多くの人及び動物病原体に対するｂｅｅ　６、ｂｅｅ　８、ｂｅｅ　９、 免疫自生リンパ及びニワトリリゾチームの阻止帯アッセイ（ｍｍで表示）を示す ０表２は同一ペプチド類の植物関連細菌に対する活性を示す。

表３はその他の細菌の感受性を表わす、これらの表１．２及び３において６はｂ ｅｅ　６ａ及びｂｅｅ　６ｂ（７）混合物を表わし、８はｂｅｅ　８ｂを表わし 、９はｂｅｅ　９を表わす。

（自生）免疫リンパ（Ｉ）に存在する全細菌分解活性をブランクリンパ（Ｂ）、 精製因子ｂｅｅ６．８及び９及び雌どり卵白リゾチーム（Ｌ）と比較した。

精製成分ｂｅｅ６．８及び９の殺菌活性はＢ、メガテリウム（Ｂ、　ｍｅｇａｔ ｅｒｉｕｍ）及びＲ，エキ（Ｒ，ｅｑｕｉ）を除いては試験細菌に対する免疫リ ンパの全活性を殆んど完全に説明することが可能であった。

ブランクリンパはおそらく　（蜂）リゾチームの基底レベルにより僅かに劣位の 抗菌活性を示すにすぎないことが判明した。他方、Ｂ、ズブチリス（Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓ）はブランクリンパによっては阻止されたが（Ｈどり）リゾチ ームによっては阻止されなかった。

Ｐ、パウシモビリス（Ｐ、ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ）はＩ及びＢリンパの両者 によりより遅い生育を示した。

これらの結果は又免疫リンパが数個の植物関連細菌に対して高度に活性であるこ とも確認する。即ちアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　、 エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ　）及びリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　）属 はｂｅｅ　６により強く阻止され、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　 ）属の３種のパソバールはｂｅｅ　８に対して感受性であった。

更に、これらの結果は殆んどの試験された病原体が自生免疫蜂リンパに対して感 受性であることを確認するが、しかし、クロストリゾイア（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉ ａ）及びストレプトコッキ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）は主体液因子（ｂｅｅ 　６．８及び９）に対して耐性であることが判明した。しかしながら、ストレプ トコッカスＢ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｂ　）はｂｅｅ　１０に対して感 受性であった。

数字は生育−阻止帯の直径（ｍｍ）を指す、数字が大きければ大きい種試験され たペプチドが同一線上で確認された菌株に対してより効果的である。

“−”は何等の阻止も見出されなかったことを意味する。“ＮＴ”は微生物に対 するアッセイが行われなかったことを意味する。

Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉＡＴＣＣ８０９０１３−−ＮＴ　Ｎ Ｔ　ＮＴＥｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔａｒｄａＡＴＣＣ１５９４７１３−６Ｎ Ｔ　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＢＥ９７　６　−−　８−　ＮＴ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅＬＮＧ２７８３　６　−　−　１０ 　−　ＮＴＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ＮＣＴＣ１１６０１１０−−１３ＮＴ　ＮＴＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ａｅｒｏｇ ｅｎｅｓ１９６１Ｅ　１１　５　−　１１　− Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｔｏｃａＫＯ２８−−ＮＴ　ＮＴ　ＮＴ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｕｃｏｓａ ＡＴＣＣ２５９９９−８−１１ＮＴ　ＮＴＰｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ ＡＵ８７　−　−−４　−　ＮＴ Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｏｒｇａｎｉｉ ＣｕＥＴＭ　７？−８３ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｍｏｎｔｅｖｉｄｅ。

８０／１４１　８　−　−　１０　−　ＮＴ８３／３４　９−−１０−　ＮＴ ＡＴＣＣ１７９９１−−−ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＳｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏ ｌａＡＴＣＣ２９８４４９−−９−− Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａＰＧＳ　Ｃ−１１０６’″　 ９　５　−　１０　−　ＮＴＢａｒｔ１９２４　−　−　−　１０　ＮＴ　ＮＴ ６８９ＩＢ　Ｌ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＤＳＭ３１２９　１６− 　４　１５　−’　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＡＴ ＣＣ１４３１５−−ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＡＴＣＣ２９７０７ ＮＣＰＰＢ１１０９　８　７　７　１６　９　６Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ　ｆａｓｃｉａｎｓＮＣＰＰＢ１４８８　５　４　ＮＴ６　６Ｅｒｗｉｎｉａ 　ａｍｙｌｏｖｏｒａ ＮＣＰＰＢ６３８　１　３　５　ＮＴ　ＮＴ　ＮＴＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔ ｏｖｏｒａｖａｒ、ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ　ＮＣＰＰＢ　５４９　１６　−　 −　１６　−Ｅｒｗｉｎｉａ　５ａｌｉｃｉｓ ＮＣＰＰＢ　２５３０　１８　５　−　１９　−Ｅｒｖｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏ ｖｏｒａｖａｒ、ｃａｒｏｔｏｖｏｒａＮＣＰＰＢ３１２　７　−　−　ＮＴ　 ＮＴ　ＮＴＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍＡＴＣＣ１１６ ９６°　ＮＴ Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ２Ｂ３１４　１８７　４　１５　− ６８９ＩＢ　Ｌ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＲＲＬＢ−２３７４５４９６ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｇｉｅｎｓｉｓＤＳＭ　３１３１ Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｅｖｏｒａｎｓＮＲＲＬＢ−５４６６−８− − Ｊａｎｔｈｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｉｖｉｄｕｍＳｎｅａｔｈＨＢ　−− −４− Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓＣＣＥＢ　５１８ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｅｐａｃｉａＡＴＣＣ２５４１６ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓＣｕＥＴＭ　８３−１０９ 表１．２　び３のπ″″＝ ６．８及び９：免疫因子、それぞれ　Ｂｅｅ　６　（ＡｐｉｄＩａ−Ｊ　、Ｂｅ ｅ　８及びＢｅｅ　９工：免疫自生リンパ（１０μｍ２） Ｂ：対照自生リンパ（１０μｌ２） Ｌ：ニワトリリゾチーム ＮＴ：試験されず。

（）：減少した成長を伴う病気 ＊　：　Ｂｅｅ　６及び自生免疫リンパの代りに合成ＡｐｉｄＩａ及び熱処理免 疫リンパに対する感受性を試験された細菌を示す。

Ｂｅｅ　６ｂの　造解析　びその作用接種の　９核磁気共鳴分光分析（ＮＭＲ） によるり、０中のＢｅｅ　６ｂの構造解析は一級配列解析を確認し、アミドプロ トンの極めて遅い放出を示した。これはアビグエシンがおそらくプロリン残基の 高含量によるものと思われる極めて強い構造を有することを示す、この後者の存 在は、二次タンパク質構造を制限し、α−らせん構造の存在を排除する（　Ｋａ ｉｓｅｒ及びＫｅｚｄｙ　、　１９８７−参考文献１８）、そのような種類のら せん構造はセクロピン類（Ｂｏｍａｎ等、１９８６−参考文献４　：　Ｂｏｍａ ｎ等１９８７−参考文献１９）及びマガイニンＪ　（Ｚａｓｌｏｆｆ等、１９８ ８−参考文献１７）の殺菌活性に対して本質的であることが判明した、これはア ビダニシン類が異った作用様式を有することを示唆する。

この作用様式における相違はアビダニシン類の膜との可能性のある相互作用を扱 う実験により確認された。

アビダニシンＡｐｉｄｌＩ及びヒメノブクエシンｂｅｅ　８ｂの活性を参考文献 １８に説明される方法に従って天然及び合成膜の両者について試験した。

天然膜は鱗翅目マンデュカ・セフスフ（Ｌｌａｎｄｕｃａｓｅｘｔａ　）の中腸 由来のものであり、この膜は中性であると考えられる０合成膜は陰性荷電リン脂 質を表わすジオレオイル（１８：１）−ホスファチジルセリンの単層である８表 面計数は２０ダインであり、ｐＨ＝７．５である。

ペプチド試料（２０μｇまで）を塩類なしの２ｒｒ＋ｊ２全容量のＴｒｉｓＪ衝 液に適用した。上記アビダニシン或いはヒメノプタニシンのいずれも試Ｍ１４に は如何なる影響も及ぼさなかった。これは又膜を妨害することが知られている（ サンナムＳａｎｎａｍｕ等１９８６−参考文献２０：ザスロフＺａｓｌｏｆｆ等 、１９８８−　ｇ考文献１７）セクロビン類、メリッチン（バーテンバークＢａ ｔｅｎｂｕｒｇ等、１９８７−　ｅ−考文献）及びマガイニン類（マリオンＭａ ｒｉｏｎ等、１９８８−参考文献２２）と対照的である。

Ａ成アビダニシン類の細ケ汗 凍結乾燥されたアビダニシン類ＡｐｉｄＩ　ａ　、　ＡｐｉｄＩｂ、Ａｐｉｄ　 ＨｌＡｐｉｄ　ＰＴ−１及びＡｐｉｄ　ＮＴ＋ｌをＰＢＳに再懸濁した。それら の全てはＥ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１に対して殺菌活性を有した。加えて正 確な濃度をアミノ酸分析により精密にめ、天然ｂｅｅ　６ｂの同等の試料を調製 し、液体培養液中における生育阻止アッセイ（ｍａｔ　＆Ｍｅｔｈ、　参照）に よる天然及び合成アビダニシンの両者の殺菌活性を比較することを可能にした。

結果を下表４に示す、最少阻止濃度（μｇ／ｍｌ２）を液体培養液中においてめ た。即ち２００ｕｆ２の栄養培地（トリブチカーゼ大豆ブロス或いは栄養ブロス に１０４個の対数期細菌を接種した。ペプチドの濃度はＯ〜２００μｇ／ｍ１２ の範囲であった。これらの値はｕ　ｇ　／　ｍ　１２を表わす、阻止が全く認め られなかった場合には最大値が与えられる（÷２００μｇ　／　ｍ　（２或いは ＋５０μｇ／ｍ！２）。

蜂リンパから精製されたｂｅｅ　６ｂ以外の全てのペプチドは化学的に合成した 。

全ての試験微生物は合成及び天然アビダニシン類の両者に対して類似の感受性を 示した。しかしながら、合成類似体ＮＴ＋　１及びＰＴ−１はある種の細菌に対 して活性がより低いことが判明した。

表Ａ 植物関連細菌　Ｉａ　Ｉｂ　ＩＩ　ＮＴ＋ｌ　ＰＴ−Ｉ　Ｉｂ”Ａｇｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＤＳＭ　３１２９　０．２　０．２　０ ．２　０．２　０．５　１Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｓｉｄｉｏｓ ｕｍＮＣＰＰＢ１１０９　５０　５０　１００１００　５０　１１００Ｃｏｒｙ ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ　ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｅｐｖ、ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎ ｓｅ　ＮＣＰＰＢ　１５７３＋５０　＋５０　＋５０＋５０　ＮＴ　ＮＴＥｒｗ ｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａｖａｒ　ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ ＬＭＧ２３ｇ５　１　１　０．５　１　ＮＴ　ＮＴＥｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔ ｏｖｏｒａｖａｒ　ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ ＮＣＰＰＢ　３１２　１　２．５　２．５　２．５　ＮＴ　ＮＴＥｒｗｉｎｉａ 　５ａｌｉｃｉｓ ＮＣＰＰＢ　２５３０　０．０２　０．０２　０．０２　０．０２　０．０５　 ０．０５Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ、ｔｏｍａｔ。

ＮＣＰＰ８１１０６　Ｇ、２　０．１　０．１　１　０．１　０．ＩＰｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ、ｍａｃｕｌｉｃｏｌａ ＮＣＰＰＢ１７７６　０．５　０．５　Ｑ、５　２．５　ＮＴ　ＮＴＰｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅｐｖ、ｔａｂａｃｉ ＮＣＰＰＢ１２３７　０．５　０．５　１　２．５　ＮＴ　ＮＴＰｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍＡＴＣＣ１１６９６２５１０１０２５ＮＴ 　ＮＴＲｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ２Ｂ　３１４　０．１　０．０２ 　０．０２　０．１　０．０２　０．０２Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅ ｓｔｒｉｓｐｖ、ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ａ９０２　＋５０　５０　５０　＋５０　ＮＴ　ＮＴＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　 ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ、ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ＬＮＧ　９０５　＋５０　４５０　＋５０　＋５０　ＮＴ　ＮＴ下表　続き ヒト及び動物病原体　Ｉａ　Ｉｂ　ＩＩ　ＮＴ＋Ｉ　ＰＴ−Ｉ　Ｉｂ”Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ａｌｖｅｉ ＩＪＩＧ　６９２２　＋２００ Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉＡＴＣＣ８０９００，１５０，１５ ０，２０，２５０，３Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ ＮＣＴＣ９００１０，１０，１０，２０，２５０，５Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　Ｎ ｅｗｐｏｒｔＣＤ９４　０．２　０．２　０．２　１　５　０．５ＳａＬｍａｎ ｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒＬｕｍＡＴＣＣ２３５６５０，１０，１０，１０， １５０，１Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ ＣＰ　８７　０．１　０．１　’０．１　０．１　０．５０．（１５その他の細 菌 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＱＭＢ　１５５１　１５０　１００　 １００　１００１５０　＋２００Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ ＮＲＲＬ−Ｂ−２３７＋２００ 鎧畦旦Ｌ； Ｉａ：　ｂｅｅ　６ａの合成同族体 Ｉｂ　：　ｂｅｅ　６ｂの合成同族体 ＩＩ：ｂｅｅ７の合成同族体 ＮＴ＋１　：　ｂｅｅ　６ａの合成類似体ＰＴ−１：　ｂｅｅ　６ｂの合成類似 体ｂｅｅ６ｂ：精製天然ｂｅｅ　６ｂ ＮＴ：試験されず アビダニシン類の誘導体のｆｉ　或いは静　活Ａｐｉｄ　Ｉｂの純粋試料をトリ プシン及びキモトリプシンで切断した。トリプシンはＣ００Ｈ−末端ロイシン残 基を除去し、１７残基のへブチド（Ｔ４）を生ずる。キモトリプシンはペプチド を次の二つの部分に切断するニ ア個のアミノ残基よりなるアミノ末端部分（Ｃ９）及び１１個のアミノ残基より なるＣ０ＯＨ末端（ＣＩＯ）。

寒天拡散アッセイを用いるこれらの３個の断片についてＥ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ ９００１上には何等の殺菌活性も認めることができなかった。

これらの結果はアビダニシンＡｐｉｄ　Ｉｂの殺菌及び／又は静菌活性に対して Ｃ−末端が重要であるようであることを示している。これを更に分析するために 、それぞれ２　（Ａｐｉｄ　Ｉｂ２）　、　４　（Ａｐｉｄ　Ｉｂ４）或いは６ 　（ＡｐｉｄＩｂ６）　ＮＨｚ−末端残基を欠＜　Ａｐｉｄ　Ｉｂの異った切頭 類似体を化学合成により合成した。

Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｖ−Ｙ−Ｉ−Ｐ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｈ−Ｐ−Ｒ−Ｌ　 Ａｐｉｄ　ＩｂＮ−Ｒ−Ｐ−Ｖ−Ｙ−Ｉ−Ｐ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｈ−Ｐ−Ｒ −Ｌ　Ａｐｉｄ　Ｉｂ２Ｐ−Ｖ−Ｙ−Ｉ−Ｐ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｈ−Ｐ−Ｒ −Ｌ　Ａｐｉｄ　Ｉｂ４Ｙ−Ｉ−Ｐ−Ｑ−Ｐ−Ｒ−Ｐ−Ｐ−Ｈ−Ｐ−Ｒ−Ｌ　Ａ ｐｉｄ　Ｉｂ６表５：ＡｉｄＴｂの切頭類似体のヂ１　活性ｌよ五ヱユヱヱ ＮＣＴＣ９００１１８ｍｍ　１６ｍｍ　１４ｍｍ　９ｍｍ試験条件：２０μεＨ ２０／ウェルに再懸濁した１０ナマモルアビグニシンを用いて得られた 寒天阻止帯 これらの結果は欠失Ｎ−末端残基の数に応じて活性の低下を示すが、それらはＣ −末端と異り、Ｎ−末端が殺菌活性に対して主たる興味のものではないことを示 す。

成虫前・蜂から里離された　疫、ヱの静禾　び乙又呈玉ヱ１上 幼虫及びサナギの両者の免疫応答を成虫のそれと比較した。最初の比較は次のア ッセイ生物体に対する免疫リンパの下記化合物の殺菌活性について行われた： アビダニシン類（Ｂｅｅ　６ａ、　ｂｅｅ　６ｂ、　ｂｅｅ　７　）　：Ｅ、ｃ ｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１ ヒメノブタニシン類（Ｂｅｅ　８ｂ）　：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｈ５１４ヒメナエシ ン（Ｂｅｅ　１０）　：バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ ｔｅｒｉｕｍ　）　ＱＭＢ　１５５１゜おそらくペプチド類ではない免疫蜜蜂リ ンパにおける殺菌化合物：ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏ−ｃｏｃｃｕｓ　 ｅｑｕｉ　）　ＡＴＣＣ２５７２９これらの四つの生物体は免疫幼虫及びサナギ リンパに対して感受性であり、免疫成虫蜂リンパからうろことのできる同一の強 力な殺菌活性の存在を示唆した。

これは又幼虫においてのみ誘発されることのできる（ＥＰ　８５１１．４４４９ ．３）サルコトキシンＩなどのセクロビン類に関して異るものである。

この同様な殺菌活性が免疫成虫リンパに存在する同一免疫化合物により媒介され たのかどうかを調べるために成虫前リンパ試料を分析した。雄蜂及び働き蜂、幼 虫及びサナギの両者からのリンパを０４−カラム上の逆相ＨＰＬＣを用いて分析 した。これにより幾つかの因子の誘発が明確に示された（第３Ｄ図）１図上に免 疫因子ｂｅｅ　６、ｂｅｅ　８及びｂｅｅ　９が示される。しかしながら、成虫 リンパに対して幼虫免疫リンパ中にはアビダニシンｂｅｅ　７は見出されなかっ た。更に、アビダニシンｂｅｅ　６は全てＣ４、Ｃ１ｇ及びジフェニルカラム上 において相互に近接して溶出する数個の関連化合物よりなることが判明し、この 同族性はそれらを分離することを困難にした。一つの試料におけるｂｅｅ　６ａ 及びｂｅｅ　６ｂの異ったアビダニシン類の配列分析は成虫免疫リンパに加えて 幼虫免疫リンパは該アビダニシン類の前駆体を含有することを示した。これらの 前駆体は次の二つのクイブの配列を有する： 矢印は異った前駆体ペプチド間に見られる逐次プロセッシング部位を示す、これ はペプチド類の前駆体領域を分解して各々の第２の残基がプロリン或いはアラニ ンであるジペプチド類をもたらすジベプチジルペブチクーセ活性（ＤＰＡＰ−ａ ｓｅ）の段階的作用を示す−これらの二つの最大前駆体はＥ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴ Ｃ９００１上に殺菌活性を有しないことが判明した。切頭前駆体は全く成熟ペプ チドからは精製することができず、従って別々に試験することができなかった。

しかしながら、成熟アビグエシン類及びそれらの前駆体の推定量と得られた殺菌 活性の間の相関関係は切頭前駆体が成熟アビダニシン類よりも低い殺菌活性を有 する可能性を示す、これらの前駆体ペプチドは成虫ハチリンパ中には微量でのみ 存在した。

柁唸物系における毒性 多くの酵母（カンジグ）、真菌（ピチウム、フサリウム）、ダニ類（カニノルハ ブディティス）及び原生動物（トリコモナス、テトラヒメナ）についてそれらの 免疫蜜蜂・リンパに対する感受性を試験した。いずれの試験生物も影響を及ぼさ れないことが判明した。

アビグエシン類及びヒメノブタニシン類の哨乳動物毒性はＢａ１ｂ　Ｃマウスに それぞれ１ｏ及び１００μｇ／マウスを数回注射することにより試験した。何等 の毒性効果もみられなかった。しかしながら、これらのペプチド類を完全フロイ ンドアジュバント（参考文献３１）の存在下において注射した場合には弱い抗体 反応が顕在化した。一方、マウス牌臓細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで精製されたアピ グエシンｂｅｅ　６、ヒメノブクエシンｂｅｅ　８及びアバニシンｂｅｅ　９の 存在下において培養し、これらの因子は５ｕｇ／ｍｌ培地：　ＲＰＭ工＋５５１ ６ＦＣＳ　（７］ｍ１度で添加した。何等の毒性効果或いは生育阻止効果も４日 間のアッセイに際して見られなかった。

アピグエシン類の植物毒性も又試験した。タバコ葉原型質体を異った量の殺菌ペ プチドｂｅｅ　６ｂの存在下において液体培地中で２日間培養した。１ｏ６細胞 ７ｍ１２の原型質体懸濁液及びｌｏｎｇ／ｍβ〜５０μｇ／ｒｎ１２の範囲のペ プチド濃度を用いた。このインキュベーション期間の間何等の目に見える効果も 見られなかった。低融点アガロース中における固定化後、正常な細胞分裂及びカ ルス形成が起った。カルス組織を更に増殖させて非処理植物物質に対比して処理 植物物質の再生能力の可能性のある効果をめた。今までのところ、何等の目に見 える効果も観察されなかった。

前記結果は本発明が当業者に真核生物系に影響を及ぼすことなく、広範囲の微生 物の防除を可能にする十分な範囲のペプチド類を提供することを示す。

破壊或いは抑止されるべき微生物に応じて当業者は特に幾つかの微生物の防除が 同時に探索される場合に最も有効な適当なポリペプチド歓いは関連ペプチド類の 混合物のいずれかを用いることを決定すればよい。

このように、本発明はより詳細にはそれらの適用に適した稀釈剤、１種以上のそ の様なペプチド類を含有する組成物、より詳細にはヒト或いは動物における治療 及び予防の分野並びに植物病原体防除の分野の両者、及び食物及び飼料コントロ ールの分野における病原体微生物に対する組成物に関するものである。

第一の例において、本発明は溶液、スプレーの形態で局所的に或いは又経口的或 いは非経口的に適用することのできるタイプの組成物に関する。

第二の例において、それらは大面積にわたって分配可能な液体或いは固体組成物 などのそれらの野菜への適用に適した組成物に導入することができる。

第三の例において、それらはそのまま或いはこれらのペプチドの少なくとも１種 を産生するラクトバシルス（Ｌａｃｔｏ　ｂａｃｉｌｌｕｓ）を食物及び飼料の 保存におけるそれらの適用に適した組成物に導入することができる。

本発明は又細胞培養物の形質転換のためのベクター及び本発明の抗菌因子のこれ らの形質転換された細胞培養物による合成にも関する。

本発明による好ましいベクターは本発明の一個或いは数個のペプチドをコード化 する配列を含んでなるＤＮＡ断片を含有するプラスミドであり、該ＤＮＡ断片は プロモータ領域及び発現及び翻訳シグナルをコード化するＤＮＡの制御下におか れ、及び該プラスミドは抗菌ペプチド類の合成の調節のための手段を含有する。

好ましい細胞培養物は、乳酸菌好ましくはラクトバシルスーエスビ−（Ｌａｃｔ ｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）などの細菌株よりなるものである。ラクトバシ ルス・エスピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　）は免疫蜜蜂リンパに 感性でない、更に、これらのラクトバシルス・エスピー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｓｐ、　）から得られた原形質体は生育可能性及び再生の如何なる阻止 も示さない、これらの試験は次のようにして行った：　プロトプラストを０〜５ 　ｍｇ／ｎ＋４２の範囲のりゾチーム濃度を用いて作り、次いでＡｐｉｄ　Ｉａ 　（０〜ｌＯｕ　ｇ７ｍ！２の範囲の濃度）の存在下において１時間インキュベ ートした。細胞なペレ・シト化し、再懸濁し、ＲＭ、ＭＲＳ上で培養した。原形 質体／正常細胞比を推定するために安定化スクロールなしにコントロールをＭＲ Ｓ上で培養した。これは原型質体の再生を防止し、正常細胞の数の演才苓を可能 にした。該原形質体のＡｐｉｄ　Ｉａの存在下における再生能力を評価するため に寒天拡散アッセイを行った。即ち、原形質体をＲＭ、ＭＲＳ培地上に適用し、 ウェルな作りアビダニシン類或（４μｇ／ウェル）を完全に満たした。抑制ゾー ンは認められなかった。　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＮＣＴＣ９００１を用いる陽性コント ロールは明確な阻止帯を示した。

その他の好ましい細胞培養物は、細菌株、好ましくはＥ、　ｃｏｌｉ及びアグロ バクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）よりなるものであり、但し、こ れらのベクターは形質転換細胞がそれらの合成する抗菌ペプチドにより殺されな いようにする調節手段を含有する。

調節手段はある種の温度条件が尊重される場合にのみそのプロモータ領域の制御 下におかれるＤＮＡ断片の発現を可能にする感温プロモータにより構成されてよ い。

これらの感温プロモータに関しては本発明において準用されるサスマン、Ｒ１及 びリープ、Ｍ、　（ＳＵＳＳＭＡＮＮ、Ｒ，ａｎｄ　ＬＩＥＢ、Ｍ、　）　（” 考文献１１）、（参考文献１２）の刊行物を参照することができる。

もう一つの調節手段は、得られる融合タンパク質がその抗菌特性を欠失するよう に或いは少なくとも抗菌ペプチドを形質転換細胞に利用不能とするように抗菌ペ プチドをコード化するＤＮＡ断片をポリペプチドをコード化する第二ＤＮＡ断片 の後に融合化することにある。

形質転換細胞外の発現融合タンパク質の精製後、抗菌ペプチドを適当なプロテア ーゼを用いて（融合）タンパク質から回収することができる。

もう一つの調節手段は得られる融合タンパク質が培地内に分泌されるように、抗 菌ペプチドをコード化するＤＮＡ断片を該ペプチドの分泌を行うシグナル配列の 後に融合することにある。

以下にアミノ酸配列が知られているｂｅｅ　６ｂ或いはその他のアビダニシン類 或いはアバニシン類をコード化するＤＮＡ断片を含有する一連のプラスミドの造 築の説明を例示する。

ｂｅｅ　６ｂのアミノ酸配列は知られているのでこのペプチドをコード化するヌ クレオチド配列を設計することが可能である。平行して、遺伝子断片をカセット としてつるために幾つかの制限部位も又導入された。

ｂｅｅ　６ｂコード化領域よりなり、遺伝子を二段階で造築することを可能にす る４個のオリゴヌクレオチドを合成した。用いられたコドンはＥ、　ｃｏｌｉ及 び幾つかの植物遺伝子にみられたコドン使用に基づいた２２本の相補菌株の多対 （１及び２）（３及び４）はそれぞれｂｅｅ　６ｂをコード化する遺伝子のＮ− 及びＣ−末端部分をコード化する。オリゴ１及び２をアニーリングし、及びｐＬ Ｋ　５７のポリリンカー（参考文献１３）におけ・るＡｖａＩ及びＢａｍ　ＨＩ 部位間にクローニングしてプラスミドｐＢＴＯＸ１を製造した（第５図参照）、 オリゴ３及び４をアニーリングし、プラスミドｐＬＫ　５６のポリリンカー（参 考文献１３）におけるＢａｍ　ＨＩ及びＥｃｏ　ＲＩ部位間にクローニングして プラスミドｐＢＴＯＸ２を製造した０両造築物共コード化領域即ちｐＢＴＯＸｌ の断片の末端及びｐＢＴＯＸ２の断片の開始にＳａｃ　ＩＩ部位を保有するので 、この遺伝子は ＣＣＴ、　ＣＣＧ、　ＣＡＣ，ＣＣＧ、　ＣＧＴ、　ＣＴＴ、　ＴＧＡＡＴＴＣ Ｌｅｕ　停止膿ＲＩ （ＧＧＧ　ハ第一７　ミ）　ＩＪＧｌｙをコート化し、ＣＴＴは最終アミノ酸Ｌ ｅｕをコード化する）であり得る。

得られたプラスミドｐＢＴＯＸ３は必要な場合には更に修飾して前記プロモータ 領域及び調節手段を挿入される。

参考文献 １、　ＦＲＩＥＳ Ｃｏｍｐ、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌ、旦、ｆ１９８４）。

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１４、ＫＥＰＰＩ　Ｅ、、ＤＩＭＡＲＣＱ　Ｊ、Ｌ、、ＬＡＭＢＥＲＴ　Ｊ、、 ＺＡＣＨＡＲＹ　Ｄ、。

ＲＥＩＣＨＨＡＲＴ　Ｊ、Ｍ、、ＨＯＦＦＭＡＮＮ　Ｄ、、ＫＥＬＬＥＲＲ。

及びＨＯＦＦＭＡＮＮ　Ｊ、。

Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、Ｓｃ、Ｐａｒｉｓ、ｔ、３０３．５ｅｒｉｅ　ＩＩｌ、ｎ’ ５：１５５−１６０［１９８６１゜ １５、ＤＩＭＡＲｃＱ　Ｊ、Ｌ、、ＫＥＰＰＩ　Ｅ、、ＤＵＮＢＡＲＢ、、ＬＡ ＭＢＥＲＴ　Ｊ、。

ＲＥＩＣＨＨＡＲＴ　Ｊ、Ｍ、ＨＯＦＦＭＡＮＮ　Ｄ、、ＲＡＮＫＩＮＥ　Ｓ、 Ｍ、。

ＦＯＴＨＥＲＧＩＬＬ　Ｊ、Ｅ。

及びＨＯＦＦＬＩＡＮＮ　Ｊ、Ａ。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１７１：１７−２２（１９８８）。

１６、ＰＯＳＴＬＥＴＨＷＡＩＴ　Ｊ、Ｈ，Ｊ、Ｈ，，５ＡＵＬ　Ｓ、Ｈ，及び ＰＯＳＴＬＥＴＨＷＡＩＴ　Ｊ、Ａ。

Ｊ、Ｉｎ５ｅｃｔ　ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｖｏｌ、３４．　ｎ’２：　９ｌ−９６（ １９８８）。

１７．２ＡＳＬＯＦＦ　Ｍ、、ＭＡＲＴＩＮ　Ｂ、、ＣＨＥＮ　Ｈ，Ｃ。

ＰＮＡＳ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ、　８５：９１０−９１３　［１ ９８ｇ）　。

１８、ＫＡＩＳＥＲＥ、Ｔ、及ヒＫＥＺＤＹ　Ｆ、Ｊ。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｃｈｅｍ、１６：５６１− ５８１［１９８７１゜ １９、ＢＯＭＡＮ　Ｈ，Ｇ、及びＨＵＬＴλ（ＡＲＫ　Ｄ。

Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４１：１０３−１２６　（１９８７）２ ０、ＳＡＮＮＡＭＵ　Ｌ、、ＭＩＨＡＲＡ　Ｈ，、ＡＯＹＡＧＩ　Ｈ，、ＫＡＴ ＯＴ、。

ＩＺＵＭＩＹＡ　Ｎ、ＹＡＭＡＳＡＫＩ　Ｎ、。

Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　８６２　：２ １１−２１９ｆ１９８６）。

２１、ＢＡＴＥＮＢＵＲＧ　Ａ、Ｍ、、ＶＡＮ　ＥＳＣＨＪ、Ｈ，。

ＬＥＵＮＩＳＳＥＮ−ＢＬＩＬＥＬＴ Ｊ、、　ＶＥＲＫＬＥＬＩ　Ａ、Ｊ、及Ｕ　ＤＥ　ＫＲＵＩＪＦＦ　Ｂ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２３　ｎ’ｌ：１４８ｌ４８−１５４ｆ１９゜２ ２、ＭＡＲＩＯＮ　Ｄ、、ＺＡＳＬＯＦＦ　Ｍ、及びＢＡＸ　Ａ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２７　ｎ’ｌ：２ｌ−２６（１９８８）−２３、 ＧＨＯＳＨＰ、に、、ＲＥＤＤＹ　Ｖ、Ｂ、、５ＷＩＮＳＣＯＥ　Ｊ、、ＬＥＢ ＯＷＩＴＺ　Ｐ。

及びＷＥＩＳＭＡＮ　Ｓ、Ｍ。

Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１２６＋８１３−８４６　（１９７８）　。

２４．ＧＵＢＬＥＲＵ、及びＨＯＦＦＭＡＭ　Ｂ、Ｊ。

Ｇｅｎｅ　２５：２６３−２６９（１９１１１３）。

２５、ＬＡＮＤ　Ｈ，、ＧＲＥＺ　Ｍ、、ＨＡＩＪＳＥＲＨ，、ＬＩＮＤＥＮＭ ＡＩＥＲＷ、及び５ＣＨＵＥＴＺ　Ｇ。

Ｎｕｃｌ、Ａ：ｉｃ！ｓ　Ｒｅｓ、旦＋　２２５１−２２２６　（１９８１）。

２６、ＬＩＤＨＯＬＭ　Ｄ、Ａ、、ＧＵＤｈＡＵＮＤＳＳＯＮ　Ｇ、Ｈ，、ＸＡ ＮＴＨＯＰＯＬＩＬＯＳ　Ｋ。

Ｇ、及びＢＯＭＡＮ　Ｈ，Ｇ。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２２６＋８−１２（１９８７）。

２７、ＭＡＮＩＡＴＩＳ　Ｔ、、ＦＲＩＴＳＣＨＥ、Ｆ、及びＳＡＭＢＲＯＯＫ 　Ｊ。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、；Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２１゜ ２８．０ＨＴＳＵＫＡ　Ｅ、、ＭＡＴＳＵＫＩ　Ｓ、、ＩＫＥＨＡＲＡ　Ｍｌ、 ＴＡ）；ＡＨＡＳＨＩＹ６．及びＭＡＴＳＵＢＡＲＡ　Ｋ。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６０　：　２６０５−２６０８　ｆ１９８５ １　。

２９、ＯＫＡＹＡＭＡ　Ｈ，及びＢＥＲＧ　Ｐ。

Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、２：１６１−１７０ｆ１９８２１゜３０、ＡＮＤ ＯＫ、及びＮＡＴＯＲＩ　Ｓ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２７　：１７１５−１７２１（１９８８１３１、Ｒ ＯＩＴＴ　１．、ＢＲＯ３ＴＯＦＦ　Ｊ、及びＭＡＬＥ　Ｄ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｇｏｗｅｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ。

ロンドン／ニューヨーク（１９８５１。

ＦＩＧ、３Ｃ ＦＩＧ、３０ ＦＩ［３，ＡＡ ＦＩＧ、ＡＢ Δ６３０ｎｍ ＦＩ６．４Ｃ ＦＩＧ、４Ｄ 国際調査報告 １Ｉ１１ｅ＋ｖｎ＋１（−炉１−１１＾１り・−−（ダ自１！か昭１９１−−歯 ＰＣＴ／ＥＰ８Ｂ１００５７５国際調査報告 εＰ　８８００５７５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．免疫蜜蜂の血リンパから単離可能である静菌或いは殺菌特性或いはその両者 を有する熱安定性ペプチド類を含有する組成物であって、そのペプチド類がリゾ チーム類、セクロピン類、ジプチリシン類、マガイニン類及び熱安定性リゾチー ム同族体から区別され、且つそれらを実質的に含まないことを特徴とする組成物 。 ２．精製され及び非免疫蜜蜂の血リンパ中には存在しないペプチド類により主と して形成される請求項１に記載の組成物であって、その組成物が予め１００℃に おいて５分間然的に処理された免疫蜜蜂の血リンパから出発して、該血リンパを トリフルオロ酢酸（極性溶媒）の０．１％（容量）の溶液中において稀釈し、得 られた溶液をＣ４−脂肪族、Ｃ１８−脂肪族、或いはジフェニルリガンドを共有 的に結合して有するシリカの球状ビーズにより形成される非極性静止（固定）相 互に吸収し、静止相互に吸収されたペプチド類を該０．１％のトリフルオロ酢酸 の溶液よりなる溶媒中のアセトニトリルの溶液を用いる溶出により脱着すること により得ることができ、該アセトニトリル濃度が一個或いは数個の活性ペプチド 類の脱着を引起こすような値に調整され、その値が約５〜約４０容量％の範囲内 にあることを特徴とする組成物。 ３．非免疫蜜蜂の血リンパ中に存在するペプチド類を実質的に含まない請求項２ に記載の精製組成物。 ４．該方法により得ることが可能であり、且つ該脱着工程がその上にペプチド類 を吸収してなる該ビーズを当初５％未満であるアセトニトリル濃度から出発する 該０．１％のトリフルオロ酢酸溶液よりなる溶媒中のアセトニトリル溶液の次第 に増大する濃度勾配により濯ぎ、及び該アセトニトリル濃度が約５〜約４０容量 ％の該値に到達する時点で脱着されたペプチド類を集める請求項２に記載の精製 組成物。 ５．該アセトニトリル濃度が約２４．５％の値に到達する時点で、該方法により 得ることの可能なペプチド類により実質的に形成されている請求項４に記載の精 製組成物。 ６．該アセトニトリル濃度が約２５．６％の値に到達する時点で、該方法により 得ることの可能なペプチド類により実質的に形成されている請求項４に記載の精 製組成物。 ７．該アセトニトリル濃度が約３３．６％の値に到達する時点で、該方法により 得ることの可能なペプチド類により実質的に形成されている請求項４に記載の精 製組成物。 ８．該アセトニトリル濃度が約３４％のアセトニトリルの値に到達する時点で、 該方法により得ることの可能なペプチド類により実質的に形成されている請求項 ４に記載の精製組成物。 ９．該アセトニトリル濃度が約３３．８％の値に到達する時点で、該方法により 得ることの可能なペプチド類により実質的に形成されている請求項４に記載の精 製組成物。 １０．下記一般式で表わされるペプチド（アビダエシン）： 【配列があります】 （式中、 Ｘはバリル又はイソロイシル残基及び Ｚはロイシル又はイソロイシル残基である）或いは該アピダエシンの殺菌或いは 静菌特性或いはその両者をなお有する該ペプチドの部分。 １１．１０〜２０個の残基及び請求項１０のアミノ酸配列の全部或いは一部、及 び該アピダエシンの殺菌或いは静菌特性或いはその両者を有するペプチドにおい て、任意に該アミノ酸配列或いはその一部を伴う他のアミノ酸残基が実質的に該 特性を妨害しないことを特徴とするペプチド。 １２．下記一般式よりなるペプチドの群から選ばれる請求項１０に記載のペプチ ド： 【配列があります】及び 【配列があります】 及び該アピダエシンの殺菌或いは静菌特性或いはその両者をなお有する任意の該 ペプチド類の部分。 １３．免疫蜜蜂の血リンパから単離可能であるペプチドの静菌或いは殺菌特性或 いはその両者を有する約８０個〜約１００個のアミノ酸残基よりなるペプチド（ ヒメノプタエシン）であって、該ヒメノプタエシンが、一次の逐次配列及び残基 よりなる中心領域：（１）【配列があります】 （２）【配列があります】及び ３）【配列があります】 （Ｘはグリシン又はリジン残基、 Ｙはプロリン又はグリシン残基、 Ｚはアルギニン又はアスパラギン酸残基であり、及び該配列（１）、（２）及び （３）は単一アミノ酸残基によりそれぞれ相互に分離されている）一次の配列を 含むＮ−末端部分： 【配列があります】 及び 一次の配列を含むＣ−末端部分： 【配列があります】 を含むものであるか、或いは該免疫蜜蜂ペプチドの殺菌或いは静菌特性をなお有 する該ヒメノプタエシンの部分であって、該アミノ酸配列或いはその部分に任意 に付随するその他のアミノ酸残基が実質的に該特性を妨害しないことを特徴とす るペプチド。 １４．約３０個〜約４０個のアミノ酸及び免疫蜜蜂の血リンパから単離可能なペ プチドの静菌或いは殺菌特性を有するペプチド（アパエシン）であって、該アバ エシンが次の配列を含有し： 【配列があります】 該アミノ酸配列或いはその部分に任意に付随するアミノ酸残基が実質的に該特性 を妨害しないことを特徴とするペプチド。 １５．下記一般式で表わされるペプチド：【配列があります】 １６．５０個〜６０個のアミノ酸残基及び免疫蜜蜂の血リンパから単離可能なペ プチドの殺菌或いは静菌特性を有するペプチド（ヒメナエシン）であって、該ヒ メナエシンが次の逐次配列及び残基： （４）【配列があります】 （５）【配列があります】 （６）【配列があります】 （７）【配列があります】 （８）【配列があります】 （９）【配列があります】 （１０）【配列があります】 （ここで、該配列及び残基（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）及 び（１０）は単一アミノ酸残基によりそれぞれ相互に分離されている）を含み、 かつＣ−末端領域が次のアミノ酸配列： （１１）【配列があります】 （１２）【配列があります】 （１３）【配列があります】 よりなるものであるか、或いは該ヒメナエシンの殺菌或いは静菌特性或いはその 両者をなお有する該ペプチドの部分。 １７．ヒト或いは動物における治療及び予防分野における用途のための請求項１ 〜１６のいずれか１項に記載のペプチド組成物。 １８．植物病原体防除の分野における用途のための請求項１〜１６のいずれか１ 項に記載の組成物。 １９．飼料及び食物コントロールの分野における用途のための請求項１〜１６の いずれか１項に記載の組成物。 ２０．請求項１０〜１６項のいずれかに記載のペプチドをコード化するヌクレオ チド配列。 ２１．請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のペプチドをコード化するＤＮＡ 断片よりなり、該ＤＮＡ断片がプロモーター領域及び発現及び翻訳シグナルをコ ード化するＤＮＡ配列の制御下におかれることを特徴とする細胞培養物、好まし くは細菌の形質転換のためのベクター、好ましくはプラスミド。 ２２．該細胞培養物内に該ＤＭ断片の発現の調節のための手段を含んでなる請求 項２１に記載のペクター。 ２３．請求項２１に記載のペクターにより形質転換される細胞培養物、好ましく は細菌株。