JPH02500562A - 組み換えインターロイキン‐１の精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換えインターロイキン−１の精製 本発明は一般にタンパク質化学に関し、より詳細には！生物による高レベル発現 によって産生された組み換えタンパク質を精製する方法に関する。

インターロイキン−１（ＩＬ−・ｌ）は免疫原刺激に応答してマクロファージに より放出されるリンフ才力インである。このポリペプチドは複雑な生理活性スペ クトルに関係している。ＩＬ−１はインターロイキン−２放出の誘発により胸腺 細胞の増殖を誘導し且つ８９７３球の増殖および成熟を刺激し得る主要な免疫刺 激信号である。

さらに、ＩＬ−１はプロスタグランジンの生産、発熱および傷の治癒促進に関係 している。ＩＬ−１に関する文ヒ）ＩＬ−１活性は本明細賽中においてＩＬ−１ αおよびＩＬ−１βと呼ばれる２種類の関連のうすいタンパク質に見出される〔 マーチ（Ｍａｒｃｈ）ら、Ｎａｔｓｒｇ３１５：６４１（１９８５））。　両方 の分子とも通常は分子量約３０，０００ダルトンの大きい前駆物質として合成さ れ、その後タンパク質分解簿素により加水分解されて分子量約１７５００ダルト ンの成熟型となる。

最近、両方のヒトＩＬ−１物質をコードするｅ　Ｄ　Ａ’　Ａがクローン化され 、微生りにより発現された。この成功によって治療用途に足る量のＩＬ−１αお よびＩＬ−１βが生産可能になるはすである。しかしながら、組み換えタンパク 質を高レベルで発現しうる細胞から生理活性のある７Ｆ、変性ＩＬ−１物質を精 製する点で困難に直面した。

これらの困難は、組み換えタンパク質が産生細胞によって不溶性の形Ｋｍ縮され るらしいという観察のせいにされた。

ガブラー（Ｇｓｂｌ＊ｒ）ら、Ｊ、　７ｍ＋ｓｓｓ、　３６　：　２４９２（１ ９８６）はＥ、ｃａｊｊ（犬ｍ７Ｍ　）　Ｋより発現されたＩＬ−１αの太１か な精製法を報告した。しかしながら、この方法は組み換えタンパク質の可溶化を 促進するために変性剤のグアニジン塩酸塩を使用するものであった。

本発明は、微生物細胞の培養物から組み換えＩＬ−１’ｔ＊にするための迅速で 効果的なｅＲ謀介組み洪えタンパク気可溶化法を提供する。

発明の要約 不発明は、 （Ｇｌ　石胞′４ｔｐＢ約１〜５の水５綾衝謀体中に６濁し；ｆｌ＋１　該細胞 を仮象して可溶化ＩＬ−１を含む抽出物を論製し；そして （ｃｌ　該抽出物から可澄化ＩＬ−１を回収することから成る、微生物細胞から 組み換えＩＬ−１を積装する方法を提供する。

生産物の面において、不発明は比芯注約６．０Ｘ１０’単位／り以上およびエン ドトキシン含量１００アタエン１’）キシン／μｔデＩＬ−１α以下である精製 済み組み換えＩＬ−１α、および比活性的１．９Ｘ１０”単位７９以上およびエ ンドトキシン含量約５０ｐタエンドトキシン／μｙ　ｒｌＬ−１β以下である精 製済み組み換えＩＬ−１βを提供する（但し、エンドトキシン含量はカブトガニ 変形細胞溶解物検定により測定した）。

詳細な説明 本発明方法は酸性条件下で微生物細胞から組み換えヒトＩＬ−１物質を抽出する ことを包含する。酸抽出は同時ＫＩＬ−１を可溶化し且つ大半の微生物タンパク 質を沈殿せしめて、酸抽出物の上溝へのＩＬ−１の回収を可能にする。予偏冥験 により、Ｅ、　Ｃ０１ｉでは組み換えＩＬ−１が不溶性の形で発現されることが 明らかＫなった。

一般に、組み換えタンパク質はグアニジンや尿素のようなカオトロピズム剤（ｃ ｈａｏｔｒｏｐｉｃ　ａｇｅｎｔ　）を用いて可溶化することができる。対照的 に、ｒｆｉ、１に、介抽出はタンパク質ン変江させる性質のある抽出用浴剤の使 用が避けられ、初期の抽出工程からその後のイオン交換法へ、浴剤の妨害やタン パク質の変性なしＫｗＩ製を直暴進行させることができる。従って、この方法は 規倶の拡大に理想的に適合し、商業上有意な量の組み換えＩＬ−１αおよびＩＬ −１７を提供する。

本明細薔中で用いる１インターロイキン−１″、１組み換えインターロイキン− １’、”ＩＬ−１”および−デＩＲ−１″は微生物発酵法により生産された組み 換え型のＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを集合的に意゛体するものである。さらに 、この用語は天然槃と共通の生理活性を有する、天然型鴫乳動物ＩＬ−１αおよ びＩＬ−１βと冥質的に同じアミノ酸配列をもつタンパク質を包括するものであ る。アミノ酸配列の冥質的同−注とは、その配列が合成タンパク質と天然型タン パク質の間に不利な機能的相違を生じさせない１個以上のアミノ酸のｉ更（欠失 、付加または置！ｌ！りＫよって異なるか、または天然型アミノ酸と同一である ことを意味している。

好ましくは、デＩＬ−１αの酸妹介抽出工程は、Ｅ約２．０〜３．５、最も好ま しくは、Ｈ約２．６〜３．０の水性緩衝媒体中で実施される。デＩＬ−１βの場 合には、酸抽出工程が好ましくはｊ＃ＦＩ３．５〜４．５、最も好ましくはアＢ 約３，７〜４．１で実施される。本明細書中で用いる１微生物細胞”とはａ′＠ （特に大腸画（ｈｓｃｋｍｒｉｃｋｉαｃｏｌｉ　）　）および酵母（例えばビ ール酵母ｐｉ　（５ａｃｃｋａｒｏ−悔ｙｃａａ　ｃａｒａｖｉａｔａｍ　）　 ）を意味する。本発明方法において、細胞は凍結−解凍サイクル、超音波処理、 機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含めた慣用方法で破壊される。

より完成した方法の面からすると、酸抽出工程は水性島体中でのその後のクロマ トグラフィ一工程と連結される。Ｎ製法のこの部分は好ましくは初期のイオン５ ！換クロマトグラフイ一段階と、そｒＬＶｃｆｆｃ（アフイニテイクロマトグラ フイ一段階を含む。イオン交換段階は、好ましい面において、カチオン交換クロ マトグラフィーとその後のアニオン交換クロマトグラフィーかも成っている。

適当なカチオン７２換クロマトグラフイー基材にはスルホプロピル基またはカル ボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基 が好適である。そのマトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン 、セルロース、またはタンパク質の精製の際に通常用いられる他のイオン交換樹 脂もしくは基材でありうる。デＩＬ−１αおよびｒｌＬ−１βのカチオン交換ク ロマトグラフィーのため［’Ｗに有用な材料はスルホプロピルセファデックスＣ −２５Ｃスウエーデン自ウプサラ、Ｐｋａｒｍａｅｉａ　Ｆｉｎａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ−社）である。

スルホプロピル基を含む基材を使用する場合、ｒｌＬ−１物質ン含む抽出物はク エン酸ナトリウムのような適当な酸衝液中ｐＥ約４．０で加えられる。ｒｌＬ− １物質はイオン又換体によって結合され、そして弱塩基性＃離削（例えば１０　 ｔｐｈＭ　Ｔｒｉａ　−ＥＣ１，ｐＨ８，１）の使用により高度に精製された形 で溶出される。

適当なアニオン交換クロマトグラフィー基材にはジエチルアミノエチル（ＤＥＡ Ｅ）Ｍ’ｉたはジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル（ＱＡＥ） 基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。ＤＥＡＥ基が好適である。その マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、また はタンパク質の精製に通常用いられる他の型であり得る。デＩＬ−１αおよびデ ＩＬ−１βのカチオン交換クロマトグラフィーのために特に有用な材料はＤＥＡ Ｅ−セファセル（Ｐｋａｒ−ｍａ　ｃ　ｉ　ａ社）である。ＤＥＡＥ基を含む基 材を用いる場合、ｒｌＬ−１物質を含有する抽出物は弱塩基性、Ｅで加えられる 。例えば、先のカチオン交換クロマトグラフィ一工程から得られたｒｌＬ”１含 有画分プール（ｐＥ約８．１）は、Ｔデ１ａＪＩｃＬのよう乏適当な緩衝液でＮ 接加えることができる。デＩＬ−１物質はアニオン交換体により結合され、そし て同一緩衝液中の塩勾配の使用により高度［＠＆された形で溶出される。デＩＬ −１αはＤＥＡＥ−セファセルから０．１７〜０．２２ＭのＮａＣＬで溶出され 、デＩＬ−１βは０．０７５〜０．１５５ＭのＮａＣＬで浴出されることが４！ ＋Ｊ明した。従って、デＩＬ−１αおよびｒｌＬ−１βを精製する場合、それぞ れ０→６００　ｔｎＭ　ＮａＣ１および０−４００　ｔｐＪＩＩ　ＮａＣ１の塩 勾配を使用するのが好適である。

そのｆ＆遥な面において、本発明は前記の酸抽出およびイオン交換クロマトグラ フィー法、それに続くアフイニテイクロマトグラフイーを含む方法を提供する。

ＩＬ−１αの場合は、＠基フェニルグリシジルエーテル基（または逼白な基材に エーテル結合ｌたはアミド結合によって結合された側基フェニル残ｔもたらす他 の基）を含むアフイニテイ基材が好適である。この種の基材には例えばフェニル セファロースＣＬ　−４Ｂ　（Ｐｋａｒｍａｅｉａ社）が含まれるが、その他の 不溶性マトリックス（例えばデキストラ／やセルロース誘導体）も使用できるで あろう。

ｒｌＬ−１αは、Ｈ約８．１の適当な駿漬液中約Ｏ，Ｓ　〜０．７Ｍ＜好ましく は約０．６ｊｆ）の硫酸アンモニウムを含む溶液でこの種の基材に加えられ、そ の後次第に減少する硫酸アンモニウムの線状勾配それＷＣｌｆｃ＜無塩緩衝液で 溶出される０デＩＬ−１αは約０．２５〜０．１（ｌの硫酸アンモニウムでフェ ニルセファロースＣＬ　−４Ｂ’ｂ％うｆｆ！出される。

こうして、ＩＬ−１αのための最適な方法は組み換えＩＬ−１αを含む微生物細 胞を、Ｂ約２．０〜３．５の水性酸衝媒体中に懸濁し；紋細胞を破壊して可溶化 ＩＬ−１α！抽出し；可溶化ＩＬ−ｌαを、Ｂ約２．５〜５．０でカチオン交換 基材に加え；カチオン交換基材からＩＬ−１αをｐＨ約７．５〜９．０で浴出し ；該ＩＬ−１αを低い容量オスモル濃度の緩衝液でアニオン交換基グに加え；該 ＩＬ−ｘαを次第に増加する塩濃度の勾配で溶出し；該ＩＬ−１αを、０．５〜 ０．７Ｍ硫酸アンモニウム含有玖衝漬液、側基フェニルグリシジルエーテル基を 含む基材に加え；そして該ＩＬ−１αを次第に減少する硫酸アンそニウム濃度の 勾配で溶出する；ことから成っている。得られた画分は側基スルホプロピル基ン 含む基材による最終クロマトグラフィーエ８により濃縮される。

ＩＬ−１１１に精製するためのｉ＆終アフイニティ工程では、１１１基トリアジ ニル赤色染料リガンド基を含むアフイ二ティ基材が好適である。この種の基材は 側基：をもつものであり、プロジオンレッド（Ｐｒｏｃｉｏ％Ｒａｔ）または１ リアクテイブレツド（ｒｅａｃｔｉｇｇ　ｒｅｄ）’として知られるある種のス ルホン化ナフトリン染料と適当な不溶性基材と’に：Ｍ合させることにより作ら れる。これらの基準を満たす市販材料にはレッドセファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈ ａデ５ｃ４ａ社）、リアクティブレッド−アガロース（米国ミズーリ州セントル イス、Ｓすｔｎａ　Ｃｋ−悔１ｃａ１社）、およびプロジオンレッドアガロース （米国メリーランド州ガイサースバーグ、ＢａｔｈａａｔＬａ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ研究所）が含まｎる。好ましくは、プールしたｒｌＬ−１β含有画分は１０− Ｔｒｉｍ−ＥＣＬのような適当な緩衝液で低いイオン強度（例えば４０惟屑以下 ）Ｋ希釈して染料−リガント基材に加えられる。その後ｒｌＬ−１ｌｌｔ超合さ せた基材は追加の＆漬液で洗い、目的タンパク質な次第に増加する塩濃度の線状 勾配（例えば０→１ＭＮａＣ１）で溶出する。ｒｌＬ−１／はＰＩ　Ｏ，３６− ０，４６ｊ／　ＮａＣＬでプロジオンレッドから溶出される。得られた画分は側 基スルホプロピル基を含む基材による最終クロマトグラフィ一工程で８ｉｍする ことができる。

こうして、ｒｌＬ−１βのための最適な方法は組み換えＩＬ−１／ｙ２含む微生 ＠細胞を、Ｅ約３．５〜４．５の水性畿衝謀体中に懸濁し；該細胞を破壊して可 溶化ＩＬ−１／を抽出し；可溶化ＩＬ−１βを、Ｈ約２．５〜５．０でカチオン 交換基材に加え；該ＩＬ−１βｆ、Ｈ約７．５〜９．０でカチオン交換基材から 溶出し；該ＩＬ−１７１’Ｉｔ低イオン強度の緩低板オフ強度ン交換基材に加え ；次第に増加する塩濃度の勾配でＩＬ−１βを溶出し；該ＩＬ−１βを側基プロ ジオンレッド染料リガンド基を含む基材に加え：そして次第に増加するＮ　ａｃ 　Ｌ　濃度の勾配でＩＬ−１／を浴出する；ことから成っている。

デＩＬ−１αまたはデＩＬ−１β精製の進行は、ＣＤ−１マウス白米の胸腺細胞 の増殖を誘導する試料の能力を確かめることを含む胸腺細胞有糸分裂誘発検定に より追跡することができる。この検定では、生後１０〜１２Ｍ目のＣＤ−１マウ ス（マサチューセッツ州りイルミントン、Ｃｈａｒｇｅｓ　Ｒ４ｖｅｒ　Ｂｒｅ ｅｄｉｎｇ研究所）から得られた約Ｉ　Ｘ　ｌ　Ｏ＠個の胸腺細胞を、３倍希釈 系列のＩＬ−１含有液体試料の存在下で丸底マイクロプレートウェルにューヨー ク州コーニング、Ｃａｒｖｉｎｇ　Ｆｌａａｔｉａａ社）Ｋｔ＜。ａＳＳ胞は５ ０Ｕ／ｄベニＶリン、５０ｔｘｙ／ｄストレプトマイシン、２常λグルタミン、 ０．２ｍλゲンタマイシン、ｌＯ惰Ｍ　ＥＥＩ’ＥＳ　（Ａ’−２−ヒドロキシ エチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）　！！１ｌｌｉ腋（Ｆｌｉ７ ．４）を４　ｔｎ／ｖ％ヒト血清および１０−１λ２−メルカプトエタノールと 共に含有するイーグル最少必須培地（元ＪＭ）１５０μＬ中で培養する。試料は ５％ＣＯ３／王気の雰囲気下３７℃で７２時間培養する。その後、ｉｔ物ｉ！” Ｂで梯ｉｔしたテミジ：ｙ　（”Ｂ−Ｔｄｒ　）　０．５μＣ−を用いて約４Ｍ ＃間パルス採誕し、次いで多重−目動サンプルハーベスタ−乞用いてガラス値維 フィルターストリップ上に一培ｌＩ物を回収する。この方εの細部についてはギ リス（Ｇｔｌｌｉａ）ら、Ｊ、Ｉ？ｌｌ情％％、１２０：２０２７（１９７８） および木１脣許第４４１１９９２号を参照されたい。

この慣定において、ＩＬ−１の存在下で培養したＣＤ−１均胞のみが用量に依存 した関係で”１ｉ−Ｔｄｔを取り込む。ＩＬ−１の不在下で培養したＣＤ−１Ｍ 胞はバックグラウンドレベルの放射ε標識Ｖ取り込むにすぎない。

ＩＬ−１活性は”Ｅ−Ｔｄｒ取り込みデータの直Ｉｉ１部分からめる。ＩＬ−１ 活注率但は実験室標準と比較して胸腺細胞の最大”Ｅ−Ｔｄｒ取り込みの５０％ ンもたらす試料希釈率の逆数として定められる。

別法として、ＩＬ−１活性はＩＬ−Ｌ−ｔｒＺＩＬ−２非産生細胞株のネズミ腫 瘍細胞株ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５をＩＬ−２生産株へ変換するという発見に基づ いたＩＬ−１変換検定により調べることができる。この検定では、ＬＢＲＭ−３ ３−ＩＡ５細胞（ＡＴＣＣ７ｇ６ＣＲＬ″″８０７９　）を５０μｆ／Ｍｔのマ イトマイシンＣの添加により不活性化して、３７℃で１時間培養する。１００μ ｔの不活性化細胞（５Ｘ１０”細胞／−）は９６−ウェル平底プレート中で試料 の系列希釈物および等容量の分裂促進剤フィトへ１グルチニン（ＰＥＡ、１％） の存在下に培養するｅ１時間ごとに、ＩＬ−１で誘発されたマイトマイシンＣ阻 害ＬＢＲＭ−３３−ＩＡ５Ｂ胞が産生じたＩＬ−２活性の存在を、５０　ｐｔの ＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２Ｂ胞（８Ｘ１０４細胞／、ｊ）の諮加により厘接確 かめる。その後、マイクロウェル培養物はさらに２０時間培養し、続いて０．５ μＣｉの”Ｂ−Ｔｄｒを用いて４時間パルス標識し、こうして得られたパルス標 識培養物を先に詳述したようにチミジン取り込みについて検定する。あらかじめ ＩＬ−１と接触させておいた（これにより不活性化ＬＢＲＭ細胞によるＩＬ−２ 生産が誘発される）ウェルに添加したＣＴＬＬ−２細胞のみが放射性標識を取り 込むであろう。この変換検定は胸腺細胞有糸分裂誘発検定よりも迅速でしかも感 度がよい。

タンパク質の濃度は適当などの方法で測定してもよい。

しかしながら、Ｂｉｏ−デミｄ総タンパク質検定（米国カリフォルニア州すッチ モンド、Ｂｌｎ−デミｄ研究所）が好適である。５ＤＳ−ＰＡＧＥもまた精製の 進行を追跡するたまた他の適当な仮性も使用できる。上記のＩＬ−１検定の使用 に関するこれ以上の細部は、コンロン（（’ｏｓ！ｏｓ）、Ｊ、Ｉ雪ｉ％、１３ １　：１２８０（１９８３）およびクロンノ・イムらの上記文献に開示されてい る。

エンドトキシン含量は米国メリーランド州つオルカースビル、Ｗｈｉｔｔａｋａ ｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｓｃｔａ社から市販されている商業用キット（定量発色性Ｌ ａＩＱＣＬ−１０００）またはその同等物を用いて有利に検定される。この方法 はエンドトキシンを発色検定するために、カブトガニ変形細胞済解物と合成の発 色性基質を使用するものである。

精製したｒｌＬ−１αおよびＦＩＬ−１βは多重希釈でエンドトキシンの存在に ついて試鋏される。この検定は好ましくは精製完了の直後であって一７０℃で貯 蔵する前に実施される。精製中の細菌汚染の可能性を最小限に抑えるために、滅 菌緩衝液を用いるのが好ましい。

成熟ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βは、ファージλ　ＰＬプロモーターとｃ１８５ ７ｔａ非耐熱性リプレッサーの制御下でＥ、ｅｏＨＫより発現される。ｒｌＬ− １αおよびＦＩＬ−１β生産用の発現プラスミドはグラ２ミドｐＰＬｃ２Ｂ（Ａ ＴＣＣ５３０８２）、プラスミドｐλに２２３−３（スウェーデン国つプサラ、 ＰｈａｒｖｈａｃｉａＦ６％＃　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　社から市販されている） 、並びにＩＬ−１αクローン１０，４（マーチらの上記文献；ＡＴＣＣ３９９９ ７）およびＩＬ−１βクローン！Ｌ−１−１４（ＡＴｃｃ　３９９２５）’ｉｒ ：含むプラスミドから次のようにして構築することができる。

ＩＬ−１αの発現ベクターを構築するために、Ｓ、、ｌｌ３（ヌクレオチド３３ ７−３３９）からＡｌａ″１（ヌクレオチド８１１−８１３）：での７Ｌ−１α 遺伝子の３′部分を発現ベクターアＰＬｃ２８に挿入する。これはＩＯＡクロー ンから４９９塩基対のＡ１％１−Ｎｄａエフラグメントを切り出し、そのフラグ メントに次の合成オリゴヌクレオチを連結することにより達成される。このリン カ−はＩＬ−１α５．．１１１−５．．１１？配列のほかに、４ＪｓＩ７端とＥ ｃｏＲＩ末端、リポソーム結合部位、およびＡ　ＴＧ開鉗コドンを含んでいる。

その後、ｐＰＬｃ２８１：ＥｃｏＲＩとＮｄａＴで完全消化し、得られた大きい 方の７ラグメントをアガロースゲル電気泳動で単離する。次いで、リンカ−５１ ０，４クローンおよびプラスミドフラグメント’ｔ−ｒ４リガーゼによって融合 させ、本明細書で、ＩＬＰαと称する発現プラスミドを作る。、ＩＬＰαの作製 に関するさらに評しい技術は係属中の米国特許出願第７２１７６５号に開示され ており、その内容は参照によりここに引用される。

その後、得られた構築物を用いて標準技法によりＥ。

ｃｏｌｔ△Ｈ１株（ＡＴＣＣ３３７６７；カスチラシ（ＣａａｔａＬｌａｇｉ　 ）ら、Ｍｏ１ｅｃ、　ｇｔｓ、　Ｇａ％ｕｔ、　１１７　：　２１１　）をアン ピシリン耐性へ形質転換する。プラスミド出来のＩＬ−１α遺伝子を発現させる ために、形質転換したΔＥｌ培養培養アンアンビシリンま々いＬ培地中で増殖さ せる。培養物が約０，５のＡｍに到達した時点で、培養温度を約４２℃に上げて 非耐熱性ＰＬプロモーターの抑ｔｉｊ解除を促進する。昇温で１時間後、細胞を 遠心により回収し、ドライアイス／メタノール混合物中で７ラツシユ凍結させる 。細胞抽出物のＩＬ−１α活性は先に述べた胸腺細胞有糸分裂誘発検定またはＩ Ｌ−１変換検定のいずれかで検定することができる。精製法に関する細部は以下 の実施例において脱明する。

ｒｌＬ−１βは本ＢＡ細簀中でアＩＬＰβと称するプラスミドの構築を経て生産 される。このベクターは、ＡＡ２２３−３のＢａｔ％Ｅ　Ｉ／Ｅｃ　ｏＲＩフラ グメントをλＰＬプロモーター含有ｐ　Ｐ　Ｌ　ｃ　２８由来のＳａｓ　３Ａ／ Ｅｃ　ｏ　ＲＩ　７ラグメントと取り換えることにより構築されたｐ　Ｉ　Ｌ　 Ｐ　ｃ（マーチらの上記文献）から組み宜てられる。このプラスミドをＥｇ・Ｒ １とＰａｔ■で完全消化し、その後置も大きいフラグメント′％：（１）ヒトＩ Ｌ−１β遺伝子を含むｐｌＬ−１−１４（ＡＴＣＣ３９９２５）由来の６６９塩 基対のＨｐ　ａｆｌ／Ｐ　ｓ目フラグメント（Ａｌ４田からＣ０ＯＨ末端までが 活性タンパク１Ｋをコードする）および（２）次のＥ　Ｃ（ｌ　ＲＩ／＃ｊｌ　 ａ　Ｉ合成オリゴヌクレオチド：ＭｒｒＣｒｌ；ＧｌｒＡｅＴＡ　ｔｒＧ　ＧＣ Ａα了ＧｒＡ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　Ｃ’ｒＧ　Ａｔ　ＴＧＣＡＣＧ　ＣＩ’ＣＧｌ ｒＣＣＴＡＴＭＩ’　Ｔ、ｔ：　ＣＧｒ　ＧＧＡ　Ｃ１（ｆｆ　７；ｒＧＡＩＣ ＴＴＧ　ＩＧ　ＴＧＣＧＡＧ　ＧＣに連結させる。

その後、プラスミドｐｌＬＰＩＹ用いてＥ−ｃｔｒｌｉ　Ｈ１株またはＰＬ転写 の非耐熱性リプレッサーを含む他の細胞！形質転換する。約０．５０Ａ、へ増殖 させた後、ｒｌＬ−１！遺伝子の発現が先に述べたような熱誘導により得られる 。ｒｌＬ−１β活性は、ｒｌＬ−１αの場合と同様に、上記の胸腺細胞有糸分裂 誘発検定またはＩＬ−１変換検定を用いて同定することができる。

実施例１および２：タンパク質の精製 以下の実施例１および２で述べる一般的Ｍ製方法は細胞ベレットからの初期酸抽 出、そＲｖｃ萩く５Ｐ５（スルホプロピルセファデックス；　Ｐｋａｒｔｐｈａ ｃｉａ社）カラムクロマトグラフィ一工程、およびＤＥＡＥ−セファセル（Ｐｋ ａｒｍａ　ｅ　ｓ　ａ社）カラムからの溶出を包含していた。その後、デＩＬ− １αを含むカラム画分はフェニルセファロースＣＬ　−４Ｂ　（Ｐｈａｒｖｓｇ ａａｉａ社）カラムにかけて最終Ｍ製を行い、一方デＩＬ−１１１’含むカラム 画分はプロジオンレッドアガロース（Ｂｅｔｈａａｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ研究 所）カラムにかけて最終ｗｉ’ｒ行りた。エンドトキシンによる汚染から生産物 を守るために、ＷＩ製プロトコルの全過程を通して滅Ｍ緩衝液を使用した。クロ マトグラフィー画分はＢｉｂ−ゾロｄ総タンパク質検定（米国カリフォルニア州 すッチモンド、Ｂｌｎ−デミｄ研究所）Ｋよりタンパク質濃度について監視し、 精製の進行はクロンハイム（Ｋｒｏ＊ｈｔｉｘ）、Ｊ、Ｅｚｐ、Ｍａｄ、１６１ 　：４９０（１９８５）に記載されるような５ＤＳ−ＰＡＧＥＫより評価した、 カラム画分のＩＬ−１活性は先に述べたＩＬ−１検定により詞ぺた。

初期抽出用緩衝液の、Ｂを変化させる実験にょ９、Ｅ、　ｃｏｌｔ細胞懸濁体か らのｒｌＬ−１αのｐＨ２，８での抽出は有意量の夾雑タンパク質を沈殿させる と同時にデＩＬ−１αの良好な回収を可能にすることが分かった。

ｒｌＬ−１／Ｉｃ関する同様な案訣は、不要タンパク質を沈殿させてｒｌＬ−１ βを可溶化するのにｐＨ３，９が最適であるとと乞示した。従って、この初期抽 出工程の最適ＰＲは発酵槽のバッチごとに変化しうる。この理由のために、小規 模パイロット英数がｉ＆逼ｐＥを決めるために、特に大量の物質が関係する場合 に、用いられる。

ｒｌＬ−１αおよびｒｌＬ−１βは、ｒｌＬ−１αおよびｒｌＬ−１βの高しヘ ル非耐熱性発現プラスミドを保有するＥ、ｃｏｌｉ細胞の増殖および抑制解除に より生産された。細胞は最大通気および淑しい攪拌の条件を用いて１０リツトル のマイクロファーム発酵槽（Ｎｅｗ　Ｂｒ％Ｓ−ｓｗｔｃｋ社）内で増殖させた 。消泡剤（アンチフオームＡ）を使用したｅ培養物は抗生物質を添加した、モッ ト（ｊｆｏｔｔ）ら、Ｐｒｏｇ、Ｎａｔｌ、Ａｃ昏ｔ１．Ｓｅｔ、ＬＩＳＡ　８ ２：８ｇ（１９８５）に記載される超誘導培地（ａ％ｐａｒ　ｉ％ｄ％Ｃ−１ｉ ｅ％ｍａｄｉｓｍ）中３０℃で増殖させ、温度を４２℃に上げることによりＡ、 ＝　０．０５　Ｋ相当する細胞密度で抑制解除し、そして温度の上昇後１６時間 して収穫した。

初メにペリコン・カセット・システム（ＰａＬ１ｉｃｏ％Ｃａ５ｓｅｔｔｅ　５ ｙａｔ情；Ｍｉｌｌｉｐｏｒ−社〕を用いて細胞集団’ｉ’濃縮した。その後、 細胞スラリーを４℃、１１００００Ｘで１０分間遠心し、次いで２．５ｔの培養 物アリ；−トからの細胞ベレットをすみやかに凍結した。

初期酸抽出を行うために、上記のようにして２．５ｔの発酵培地から得られた細 胞ベレットを、５　ｔｎＭ　ＥＤＴＡおよび１ｙｓｎフツ化フエニルメチルスル ホニル（ＰＭＳＦ）を含む３０　ｔｈＭ　Ｔｒｉｍ−ＥＣＬ欣衝液漬液Ｅ８）約 ２０−中に懸濁した。この懸濁体をドライアイス／メタノール浴中で急速に凍結 させ、その後解凍した。次に、５常λＥＤＴＡおよび２５０μｔ／−リンチーム を含むｐＨ２，８（ｒｌＬ−１α）またはＰＨ３，９（ｒｌＬ−ｚβ）の３〇− クエン駿ナトリウム緩衝液２００１１ｔ’ｅこの懸濁体に加えた。得られた酸懸 濁体は３７℃の水浴中で６０分間インキュベートした。インキュベートした後、 その抽出’ｔｍｖドライアイス／メタノール浴中で急速凍結させ、解凍し、そし て４℃、３８０００Ｘ、で４５分間遠心した。その後、上清を注意しながらデカ ントして次のｗＩ製工程において使用した。

ｐＨ２，８でのＥ、ｃｏｌｉ細胞懸濁体からのｒｌＬ−１αの抽出は、７９％の 夾雑タンパク質の沈殿および６２．５％のｒｌＬ−１αの回収をもたらした。得 られた抽出物を、Ｈ４で５ＰＳＣ−２５カラムにかけた。カラムは樹脂へのＩＬ −１活性の非特異的＠＊を減するために、０．１％Ｔｒｉｔｏ％Ｘ−１００（ポ リオキシエチレンエーテル；米国ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ− ％１ｃａ１社）および１０％ウシｂ児血清で予備調整した。初めに、粗抽出物の ＰＨ％：　１．　ＯＮＡ’ａＯＢの添加により約４．ＯＫ上げ、その後、得られ た溶液’ｌ　１０　ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４，０）で予め平衡化してお いた５ＰＳＣ−２５％：含む２０Ｘ２．５ｃｍカラムに入れた。このカラムを３ 倍カラム容量の１０ｍＭ　２−　（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン醗ＣＭＥＳ ）＆衝板（アＢ５．０）で洗い、目的タンパク５ｉｉン１０　ｔｓｈＭ　Ｔｒｉ ｍ　−ＥＣＬ　（ｐＨ８，１）で刀ラムから溶出した。１〇ゴ画分を集め、５Ｄ Ｓ−１’ＡＧＥＫより分析し、その後の精製のために４℃で貯蔵した。ｐＨ８， １の１０ｍＭＴデ１ｓ−Ｂｃｔ緩衝液での溶出は３倍カラム容量での洗浄および ＦＩＬ−１αの溶出の後に、Ｈ上昇をもたらし、４９％の夾雑タンパク５ｉがゲ ルに結合したままであった。

前工程からのＩＬ−１活性含有画分を合わせ、その後１０　ｔｓｈＭ　Ｔｒｉｍ 　−ＢＣＬ　（ｐＥ　８゜ｌ）で予め平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファセルを 含む１５Ｘ２．５ｃｘカラＡ［加えたｃｒｌＬ−１αはｓｐｓカラムからＤＥＡ Ｅカラムの平衡緩衝液中に溶出されたので、ＳＰＳプール（２００〜２５０ｍ） はＮ接ＤＥＡＥｔｙラムｉｃかｋすることかでき、それにより透析による活性損 失を回避した。

ＤＥＡＥカラムは５倍カラム容量の出発緩衝液で洗い、その後合計で２倍カラム 容量の、１０　％＆　Ｔｔｉａ　−ＢＣＬ（ｐＢｓ、ｔ）中の０→６００　ｖｈ Ｍ　ＩＶ８ｃＬの線状勾配で溶出したｅ５−画分を集め、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分 析し、その後のｍ製のため［４℃で貯蔵した。デＩＬ−１αは０、１７−０．２ ２　Ｍ　ｈａＣＬ　でカラムから溶出された。この工程において６６％の夾雑タ ンパク質が除かれた；すなわち２０％が早い時期に塩勾配で溶出され、４６％が ｒｌＬ−１αの溶出後ゲルに結合したままであった。

デＩＬ−１α含有画分をプールしく５０〜６０−）、最終濃度”ｋ　０．５　Ｍ とするのに十分な固体硫酸アンモニウムの添加により処理した。その後、得られ た溶液をｐＢｓ、１７７）１０％ＭＴデ１ｓ−ＥＣＬ＠衝液（０，５μ硫酸アン モニウム含有）で予め平衡化しておいたフェニルセファロースＣＬ−４Ｂを含む ３０ｘ２．５ｍカラムに加えた。このカラムＹ５倍カラム容量の出発緩衝液で況 い、約３倍カラム容量の０，５ＭからＯＭへ次第に減少する硫酸アンモニウムの 縁状勾配で浴出した。最後に、カラムは１０ｍＭ　Ｔｒｉａ　−ＥＣ１（ｐＨ８ ，１）約１００−で溶出した。

ｒｌＬ−１αは約０．２５〜０．１（ｌ硫翫アンそニウムで溶出された。ｌ〇− 画分を集めた。各画分のＰＡＧＥは、フェニルセファロース工程がｒｌＬ−１α を均一に精製したことン示した。デＩＬ−１α含有画分をプールし、クロンハイ ムらの上記文献に記載されるような５ＰＳＣ−２５カラムに再度かけてＩＩＭし た。デＩＬ−１αはｐＨ８，２の１０倶λリン酸緩衝溶液（ＰＥＳ）により溶出 された。

精製したデＩＬ−１αは一７０℃で貯蔵した。この精ｇ　ｒ　Ｉ　Ｌ　−１αは 約６０２ｔエンドトキシン／μｆ　ＩＬ−１（ｌ含ｔｌすぎず、６．５　Ｘ　１ ０”単位／Ｗ）死活ａＶ示した。発酵からｗＩ製までの全体的収率は培養物ＩＬ 当たつ精製デＩＬ−１α１６．８　Ｎ９であった。

Ｅ、ｅｏｌｉ細胞登濁体からのｒｌＬ−１βの、Ｅ３−９での抽出は、６９％の 夾雑タンパク質の沈殿と３７．３％のデＩＬ−１β活性の回収ンもたらした。ｒ ｌＬ−１β含有抽出物は０．１％Ｔｒｉｔｏｓ　Ｘ−１００（ポリオキシエチレ ンエーテル；米国ミズーリ州セントルイス、ＳｉｇｗＬａＣｈｅｍｉｃａ１社） およびｌＯ％ウシ胎児血清で予備処理しておいた５ＰＳＣ−２５カラムにかけた 。タンパク質は先にデＩＬ−１αについて記載した通りにカラムに入れて、溶出 した。このＳＰＳ工程は６８％の夾雑タンパク５ｉ′１を取り除き、同時にデＩ Ｌ−１βの良好な回収をもたらした。

ＳＰＳ工程からのＩＬ−１活性含有画分を合わせ、その後１０　ｍＭ　Ｔｒｉａ 　−ＥＣＬ　（ｐＨ８，１）で予め平衡化しておいたＤＥＡＥ−セファセルを含 む１５Ｘ２．５ｃｍカラムに入れた。デＩＬ−１αについて上述したように１Ｄ ＥＡＥカラムを５倍カラム容量の出発緩衝液で洗い、その後、合計２倍カラム容 量の０→４００　ｇＬＭ　ＮａＣＬの線状勾配で溶出した。デＩＬ−１βは０． ０７５ｍ−〇、　１５５　Ｍ　ＮａＣＬでＤＥＡＥカラムから溶出され、６２％ の夾雑タンパク質が除去された。

ＤＥＡＥカラム工程から得られたｒｌＬ−１１１含有画分は１０　ｗｊ／　Ｔｒ ｉｍ　−ＥＣＬ　＆衝板（ｊ＃８．１）で１：４に希釈してイオン強度Ｙ　４０ 　ｍ　Ｍ以下に低下させ、その後１０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＥＣ１緩衝液（ｐＢ ｓ、１）で予め平衡化しておいたプロジオンレッドアガロース！含む２０×２、 ５　ｅｘカラムに入れた。このカラムｙｔ５倍カラム容量の出発緩衝液で洗い、 その後５倍カラム容量の１０ｍＪ（Ｔｔｉａ−ＥＣＬ鞭衝液漬液Ｈ８，１）中の Ｏ＝　Ｉ　Ｍ　ＮａＣＬの線状勾配で溶出した。１０−の画分を集め、分析し、 そしてデＩＬ−１αにりいて上述した通りに濃縮した。デＩＬ−１βは０．３６ −０．４６　Ｍ　）ＩａＣＬでプロジオンレッドカラムから溶出された。

こうして得られたＮ製デＩＬ−１βは１．９５　Ｘ　１０’単位／■の比活性を 示し、３６アタエンドトキシン／μ２デＩＬ−１／’を含むにすぎなかった。タ ンパク質の全体的収車は培養物ＩＬ当たりＳ製タンパク質約８５．２ダであった 。

上記精製法の結果を以下のｇｌ［ｉ約する。

表に組み換えＩＬ−１αおよびＩＬ−１１１の精製総タンパク質　総活性　収率 　比活性 、１５胞懸濁体　４５７６　８．ＯＺｏｏ　１．７Ｐ＋胞抽出物　９６８　５． ０　６２５　５．ｌ５ＰＳ　ブール　４９３　５．０　６２５　５．１細胞懸濁 体　１０１１６　１９．３　Ｚｏｏ　１．９Ｉ８胞抽出物　３０９６　７．２　 ３７．３　２．３ＳＰＳ　ブール　９７８　１３．２　６８，７　１３．５補正 書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　元年　１月、４日 １６特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０２１４０ ２、発明の名称 組み換えインターロイキン−１の精製 ３、特許８臥 住　所　アメリカ合衆国ワシントン用９８１０１．　シアトル。

ユニバーシティ・ストリート　５１ 名　称　イミュネックス・コーポレーション４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２、特許 請求の範囲 １、　ｃａ＞微生物細胞を、Ｅ約１〜５の水ａ緩衝媒体中に懸濁し； （ｂｌ　該細胞を破壊して可溶化ＩＬ−ｚを含む抽出物をｇｉｂ製し；そして （ｃｌ　該抽出物から可溶化ＩＬ−１を回収することから成る微生物細胞からの 組み換えＩＬ−１ＯＮ製法。

２、組み換えＩＬ、−１はＩＬ−１αである、請求項１記載の方法。

３、細胞ン、Ｅ約２．０〜３．５の水ａｆｔ衝媒体中に６渇する、請求項２記載 の方法。

４、細胞をアＢ約２．６〜３．０の水性表体中体中ＶＣ８濁する、請求項３記載 の方法。

５、組み換えＩＬ−１はＩＬ−１ｌｆである、請求項１記載の方法。

６、細胞をアＢ約３．５〜４．５の水性Ｍｋ衝体中中にぞ濁する、請求項５記載 の方法。

７、ｍ胞をｐＨ約３．７〜４．１の水性緩衝法体中に懸濁する、請求項６記載の 方法。

８、可溶化ＩＬ−１ｙｉ！′水狂媒体を用いるイオン交換萱たを；アフイニテイ クロマトグラフィーにより該抽出物から回収する、請求項１記載の方法。

（ｄｉ　ｆｇｌ　Ｌ　−Ｉ　ＣＬＩ：ｐＨＦ１７．５〜９．０でカチオン交換基 材から溶出し； （−）該ＩＬ−１αを低い容量オスモル濃度のＩＩｋ衝液漬液ニオン交換基材に 加え； （１）該ＩＬ−１αを次第に増加する塩濃度の勾配で溶出し； （ｇｌ　該ＩＬ−１αを０，５〜０，７Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液で側基フ ェニルグリシジルエーテル基ヲ含む基材に加え；そして （ｋｌ　該ＩＬ−１αン次第に減少する硫酸アンモニウム濃度の勾配で溶出する ことから成る請求項１４紀載の方法。

１６、〔削除〕 １７、組み換えＩＬ−１はＩＬ−１βである、請求項１２記載の方法。

込、イオン交換クロマトグラフィーの後に、ＩＬ−１βを側基トリアジニル赤色 染料リガンド基を含む基材に加え、次第に増加する塩濃度の勾配でＩＬ−１βを 浴出することから成る染料−リガンドアフイニテイクロマトグラフイ一工程を含 む、請求項１７記載の方法。

四、（ａ）　ＰＨ約３．５〜４．５の水注緩ｇＪ媒体中に、組み洪えＩＬ−１７ を含む微生物ｍ！８ビ懸濁し：（＆）　該細胞を破壊して可溶化ＩＬ−１βＹＭ 出し；（ｃｌ　可溶化ＩＬ−１β−Ｊｊ（ｐＨ約２．５〜５．０でカチオン交換 基材に加え； （ｉ（ｌ　カチオン交換基材から、Ｅ約７．５〜９．０でＩＬ−１βを溶出し； （＃）該ＩＬ−１ｌｌを低い容量オスモル濃度の緩衝液でアニオン交換基材に加 え； （１）該ＩＬ−１βを次第に増加する塩濃度の勾配で溶出し、 （ｇｌ　側基トリアジニル赤色染料リガンド基を含む基材に該ＩＬ−１βを加え ；そして （ｈ）ＮＩＬ−ｘ、Ｉｗ次ＭＫ増加するＮａＣＬ　９度の勾配で溶出する ことから成る請求項１８記載の方法。

加、アフイニテイクロマトグラフイー基材はプロジオンレッド染料リガンド基を 含む、請求項２１記載の方法。

２１、〔削除〕 本￥細書中で用いる°微生物細胞”とは細菌（特に大腸３１　（ｈｓｃｈａｒｉ ｃｈｉａ　ｔｏｌｉ　）　）および酵母（例えはビール酵母ｙ５　（Ｓａｃｃｈ ａｒｏｍｙｃａａ　ｃｍデａｖｉａｉａａ　）　）’を意味する。不発明方法に おいて、細胞は凍結−解凍サイクル、超音民処理、機械的破壊、または細胞溶解 剤の使用乞含めた慣用方法で破壊される。

より児辰した方法の面からすると、酸抽出工程は水性課体甲でのその後のクロマ トグラフィ一工程と連結される。精製法のこの部分は好ましくは初期のイオン交 換クロマトグラフィ一段階と、それに秩くアフイニテイクロマトグラフイ一段階 を含む。イオン交換段階は、好ましい面において、カチオン交換クロマトグラフ ィーとその後のアニオン交換クロマトグラフィーから成っている。

適当なカチオン交換クロマトグラフィー基材にはスルホプロピル基またはカルボ キシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が 好適である。そのマトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、 セルロース、またはタンパク質の精製の際に通常用いられる他のイオン交換１１ 脂もしくは基材でありうる。ＦＩＬ−１αおよびＦＩＬ−１ｌｌのカチオン交換 クロマトグラフィーのために特に有用な材料はスルホプロピルセファデックスＣ −２５（スウェーデン１ｍウプサラ、Ｆ＆＠ｒｖｐｈａｃｉａ　Ｆｉｓｍ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ社）である。スルホプロピル基を含む基材を使用する場合、デＩ Ｌ−１物質を含む抽出物はクエン酸ナトリウムのような適当な緩衝液中、Ｅ約４ ．０で加えられる。ｒｌＬ−１物質はイオン交換体によって結合され、そして弱 塩基性溶離剤（例えば１０　ｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＬ、　ｐＨ８，１）の使用 により高度ＫＷｊｌＪｔされた形で溶出される、適当なアニオン交換クロマトグ ラフィー基材にはジニチルアミノエチル（Ｌ）ＥＡＥ）基またはジエチル−（２ −ヒドロキシプロピル）アミンエチル（ＱＡＥ）　基を含む種々の不溶性マトリ ックスが含まれる。ＤＥＡＥ基が好適である。そのマトリックスはアクリルアミ ド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質の精ｊｌｌｉに 通常用いられる他の型であり得る。ｒｌＬ−１αおよびｒｌＬ−１βのアニオン 交換クロマトグラフィーのために特に有用な材料はＤＥＡＥ−セファセル（ＰＬ ｔｚｒ惰ａｅｉａ社）である。

国際調査報告 １＊＋ｙｘ−電−１１１１１Ａｈａ’＜ａ電馴”ｈａＰＣ′ｘ／ＵＳａ７１０２ ：４０

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）微生物細胞をｐＨ約１〜５の水性緩衝媒体中に懸濁し； （ｂ）該細胞を破壊して可溶化ＩＬ−１を含む抽出物を調製し；そして （ｃ）該抽出物から可溶化ＩＬ−１を回収することから成る微生物細胞からの組 み換えＩＬ−１の精製法。
2. ２．組み換えＩＬ−１はＩＬ−１ａである、請求項１記載の方法。
3. ３．細胞をｐＨ約２．０〜３．５の水性緩衝媒体中に懸濁する、請求項２記載の 方法。
4. ４．細胞をｐＨ約２．６〜３．０の水性緩衝媒体中に懸濁する、請求項３記載の 方法。
5. ５．組み換えＩＬ−１はＩＬ−１βである、請求項１記載の方法。
6. ６．細胞をｐＨ約３．５〜４．５の水性緩衝媒体中に懸濁する、請求項５記載の 方法。
7. ７．細胞をｐＨ約３．７〜４．１の水性緩衝媒体中に懸濁する、請求項６記載の 方法。
8. ８．可溶化ＩＬ−１を水性媒体を用いるクロマトグラフイーにより該抽出物から 回収する、請求項１記載の方法。
9. ９．クロマトグラフイーはイオン交換クロマトグラフイーを含む、請求項８記載 の方法。
10. １０．クロマトグラフイーはアフイニテイクロマトグラフイーを含む、請求項９ 記載の方法。
11. １１．イオン交換クロマトグラフイーは酸性条件下でＩＬ−１をカチオン交換基 材に加え、その後弱塩基性条件下で溶出することから成るカチオン交換工程を含 む、請求項１０記載の方法。
12. １２．カチオン交換工程後に、容量オスモル濃度の低い緩衝液でＩＬ−１をアニ オン交換基材に加え、続いて次第に増加する塩濃度の勾配で溶出することから成 るアニオン交換工程を含む、請求項１１記載の方法。
13. １３．組み換えＩＬ−１はＩＬ−１αである、請求項１２記載の方法。
14. １４．イオン交換クロマトグラフイーの後に、０．４〜０．６Ｍ硫酸アンモニウ ム含有緩衝液でＩＬ−１αを側基フエニルグリシジルエーテル基を含む基材に加 え、次第に減少する硫酸アンモニウム濃度の勾配で溶出することから成るアフイ ニテイクロマトグラフイー工程を含む、請求項１３記載の方法。
15. １５．（ａ）ｐＨ約２．０〜３．５の水性緩衝媒体中に、組み換えＩＬ−１αを 含む微生物細胞を懸濁し；（ｂ）該細胞を破壊して可溶化ＩＬ−１αを抽出し； （ｃ）可溶化ＩＬ−１αをｐＨ約２．５〜５．０においてカチオン交換基材に加 え； （ｄ）該ＩＬ−１αをｐＨ約７．５〜９．０でカチオン交換基材から溶出し； （ｅ）該ＩＬ−１αを低い容量オスモル濃度の緩衝液でアニオン交換基材に加え ； （ｆ）該ＩＬ−１αを次第に増加する塩濃度の勾配で溶出し； （ｇ）該ＩＬ−１αを０．５〜０．７Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液で側基フェ ニルグリシジルエーテル基を含む基材に加え；そして （ｈ）該ＩＬ−１αを次第に減少する硫酸アンモニウム濃度の勾配で溶出する ことから成る請求項１４記載の方法。
16. １６．６．０×１０８単位／ｍｇ以上の比活性およびカブトガニ変形細胞溶解物 検定で測定して１００ｐｇエンドトキシン／μｑｒＩＬ−１α以下のエンドトキ シン含量を有する精製された組み換えＩＬ−１α。
17. １７．組み換えＩＬ−１はＩＬ−１βである、請求項１２記載の方法。
18. １８．イオン交換クロマトグラフイーの後に、ＩＬ−１βを側基トリアジニル赤 色染料リガンド基を含む基材に加え、次第に増加する塩濃度の勾配でＩＬ−１β を溶出することから成る染料−リガンドアブイエティクロマトグラフィー工程を 含む、請求項１７記載の方法。
19. １９．（ａ）ｐＨ約３．５〜４．５の水性緩衝煤体中に、組み換えＩＬ−１βを 含む微生物細胞を懸濁し；（ｂ）該細胞を破壊して可溶化ＩＬ−１βを抽出し； （ｃ）可溶化ＩＬ−１βをｐＨ約２．５〜５．０でカチオン交換基材に加え； （ｄ）カチオン交換基材からｐＨ約７．５〜９．０でＩＬ−１βを溶出し； （ｅ）該ＩＬ−１βを低い容量オスモル濃度の緩衝液でアニオン交換基材に加え ； （ｆ）該ＩＬ−１βを次第に増加する塩濃度の勾配で溶出し； （ｇ）側基トリアジニル赤色染料リガンド基を含む基材に該ＩＬ−１βを加え； そして （ｈ）該ＩＬ−１βを次第に増加するＮａＣＬ濃度の勾配で溶出する ことから成る請求項１８記載の方法。
20. ２０．アフイニテイクロマトグラフイー基材はプロシオンレツド染料リガンド基 を含む、請求項２１記載の方法。
21. ２１．１．９０×１０８単位／ｍｇ以上の比活性およびカブトガニ変形細胞溶解 物検定で測定して５０ｐｇエンドトキシン／ｕｇｒＩＬ−１β以下のエンドトキ シン含量を有する精製された組み換えＩＬ−１β。