JPS59169492A - ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法 - Google Patents
ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法Info
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- JPS59169492A JPS59169492A JP58041409A JP4140983A JPS59169492A JP S59169492 A JPS59169492 A JP S59169492A JP 58041409 A JP58041409 A JP 58041409A JP 4140983 A JP4140983 A JP 4140983A JP S59169492 A JPS59169492 A JP S59169492A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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- C07K14/545—IL-1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトの腫瘍化したマクロファージの細胞株と
腫瘍化していないヒトマクロファージとを、細胞融合し
てなる雑種細胞を利用する医学上有用な各種生理活性物
質の産生方法に関する。
腫瘍化していないヒトマクロファージとを、細胞融合し
てなる雑種細胞を利用する医学上有用な各種生理活性物
質の産生方法に関する。
マクロファージは、従来は生体内で生体にとっての異物
を清掃、貧食するスカベンジャーとしてのみ注目されて
いたが、最近、免疫学の進歩に伴い、マクロファージの
免疫応答における重要な役割が明らかになってきた。そ
れに伴い、マクロファージが種々の医学上重要な生理活
性物質を産生することが明らかにされてきた。例えば、
腫瘍細胞障害物質、プロスタグランディンＥ、インター
ロイキン１で総称されるリンパ球活性化因子、コロニー
ステイミュレーテイング因子およびプラスミノーゲンア
クチベータ等はその例である。
を清掃、貧食するスカベンジャーとしてのみ注目されて
いたが、最近、免疫学の進歩に伴い、マクロファージの
免疫応答における重要な役割が明らかになってきた。そ
れに伴い、マクロファージが種々の医学上重要な生理活
性物質を産生することが明らかにされてきた。例えば、
腫瘍細胞障害物質、プロスタグランディンＥ、インター
ロイキン１で総称されるリンパ球活性化因子、コロニー
ステイミュレーテイング因子およびプラスミノーゲンア
クチベータ等はその例である。
インターロイキン１は、リンパ球活性化因子ともいわれ
、分子量１２，０００から１６，０００程度のポリペプ
チドで、マウスおよび人間のマクロファージより産生さ
れることが明らかにされている。そして、１９７７球の
活性化あるいはりウマチの関節腔内の滑液細胞の活性化
等で重要な役割を持つことが明らかにされてきた。これ
らは癌、各種免疫疾患および血栓症の治療等に有望であ
り、期待されるものである。しかし、マクロファージは
、それ自身、分裂増殖する能力を持たず、これらの物質
を実用に供する量だけ得るのは離しい。
、分子量１２，０００から１６，０００程度のポリペプ
チドで、マウスおよび人間のマクロファージより産生さ
れることが明らかにされている。そして、１９７７球の
活性化あるいはりウマチの関節腔内の滑液細胞の活性化
等で重要な役割を持つことが明らかにされてきた。これ
らは癌、各種免疫疾患および血栓症の治療等に有望であ
り、期待されるものである。しかし、マクロファージは
、それ自身、分裂増殖する能力を持たず、これらの物質
を実用に供する量だけ得るのは離しい。
これらの物質を実用に供する量だけ取得するための一つ
の手段は、マクロファージに増殖性を付与することであ
る。一方、癌、免疫疾患および血栓症等の治療に、これ
らの生理活性物質を用いるには、当該物質がヒト由来の
ものであることが必要である。それは、ヒト以外に由来
する物質を人間に投与した場合に生ずると予想される抗
原性全排除するためである。したがって、増殖性を持っ
たヒトのマクロファージを得ることは、各種疾患の治療
薬を得るために極めて重要な意味を持つものである。
の手段は、マクロファージに増殖性を付与することであ
る。一方、癌、免疫疾患および血栓症等の治療に、これ
らの生理活性物質を用いるには、当該物質がヒト由来の
ものであることが必要である。それは、ヒト以外に由来
する物質を人間に投与した場合に生ずると予想される抗
原性全排除するためである。したがって、増殖性を持っ
たヒトのマクロファージを得ることは、各種疾患の治療
薬を得るために極めて重要な意味を持つものである。
ところで、腫瘍化したヒトのマクロファージ細胞株とし
て、腫瘍患者より樹立されたものがあるが、極めて少な
い。例えば、Ｕ−９５７（インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・キャンサー、１７巻、５６５頁−５７７頁
、１９７６年） 、ＴＨＰ−１（インターナショナル・
ジャーナル・オブ・キャンサー、２６巻、１７１頁−１
７６頁、１９８０年）、Ｊ−１１１（ブラッド、１０巻
、１０１［１頁。
て、腫瘍患者より樹立されたものがあるが、極めて少な
い。例えば、Ｕ−９５７（インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・キャンサー、１７巻、５６５頁−５７７頁
、１９７６年） 、ＴＨＰ−１（インターナショナル・
ジャーナル・オブ・キャンサー、２６巻、１７１頁−１
７６頁、１９８０年）、Ｊ−１１１（ブラッド、１０巻
、１０１［１頁。
１９５５年）、ＨＬ−６０（ネイチャー、２７０巻。
３４７頁、１９７７年）、ＫＧ−１（サイエンス。
２００巻、１１５３頁、１９７８年）およびに−５６２
（ブラッド、４５巻、３２１頁−３３４Ｊ、１９７５年
９等が知られている。
（ブラッド、４５巻、３２１頁−３３４Ｊ、１９７５年
９等が知られている。
これらの腫瘍化した細胞株は、増殖性を持ち、リポポリ
サッカライド、植物レクチンあるいはリンパ球の分泌物
等による刺激により、各種生理活性物質を分泌させるこ
とは可能ではあるが、量的には極めて少なく、細胞株の
種類も高々上記のものに限られ、とても実用には供し得
ない。
サッカライド、植物レクチンあるいはリンパ球の分泌物
等による刺激により、各種生理活性物質を分泌させるこ
とは可能ではあるが、量的には極めて少なく、細胞株の
種類も高々上記のものに限られ、とても実用には供し得
ない。
ヒトのマクロファージに増殖性を持たせる手段としては
、ウィルスあるいは化学発癌剤等で細胞を腫瘍化する方
法、継代培養細胞中から拾い上げる方法、あるいは腫瘍
細胞との細胞融合による方法等が考えられるが、簡単で
、一度技術を確立すれば多種の細胞に応用可能、ウィル
スおよび化学発癌剤等の残留の恐れを除去できる点で、
細胞融合が最適でおる。
、ウィルスあるいは化学発癌剤等で細胞を腫瘍化する方
法、継代培養細胞中から拾い上げる方法、あるいは腫瘍
細胞との細胞融合による方法等が考えられるが、簡単で
、一度技術を確立すれば多種の細胞に応用可能、ウィル
スおよび化学発癌剤等の残留の恐れを除去できる点で、
細胞融合が最適でおる。
しかし、マクロファージの細胞融合の研究は、マウス、
ラット等のブラシ類について、同種細胞同士の融合によ
り巨大細胞が形成されるとの報告はあるが、異種細胞間
の融合、特にそれらの細胞が双方共に、ヒトのマクロフ
ァージ系の細胞である場合の報告はない。
ラット等のブラシ類について、同種細胞同士の融合によ
り巨大細胞が形成されるとの報告はあるが、異種細胞間
の融合、特にそれらの細胞が双方共に、ヒトのマクロフ
ァージ系の細胞である場合の報告はない。
本発明者らは、腫瘍化したヒトのマクロファージ系の細
胞株と、腫瘍化していないヒトマクロファージとの細胞
融合を鋭意検討した結果、融合剤にポリエチレングリコ
ールを用いる従来法に改良を加えることにより、融合方
法の確立に成功し、目的とする生理活性物質全取得する
方法を見い出し、本発明を児成するに至った。
胞株と、腫瘍化していないヒトマクロファージとの細胞
融合を鋭意検討した結果、融合剤にポリエチレングリコ
ールを用いる従来法に改良を加えることにより、融合方
法の確立に成功し、目的とする生理活性物質全取得する
方法を見い出し、本発明を児成するに至った。
すなわち、本発明は、腫瘍化したヒトのマクロファージ
の細胞株と腫瘍化していないヒトのマクロファージとを
、細胞融合してなる雑種細胞を用いて、生理活性物質を
産生ずる方法に関する。
の細胞株と腫瘍化していないヒトのマクロファージとを
、細胞融合してなる雑種細胞を用いて、生理活性物質を
産生ずる方法に関する。
腫瘍化したヒトのマクロファージの細胞株としては、Ｕ
、−９３７、ＴＨＰ−１、Ｊ−１１１、ＨＬ−６０ある
いはに−５６２およびＫＧ−１等公知の細胞株が用いら
れるが、細胞株の安定性および浮遊性による細胞融合操
作の簡便性等の点からは、Ｕ−９３７およびＴＨＰ−１
が好ましい。しかし、両者に限定する必要はない。各々
異なる細胞株との融合によシ得られる雑種細胞は、各々
に異なる特徴を持つからである。
、−９３７、ＴＨＰ−１、Ｊ−１１１、ＨＬ−６０ある
いはに−５６２およびＫＧ−１等公知の細胞株が用いら
れるが、細胞株の安定性および浮遊性による細胞融合操
作の簡便性等の点からは、Ｕ−９３７およびＴＨＰ−１
が好ましい。しかし、両者に限定する必要はない。各々
異なる細胞株との融合によシ得られる雑種細胞は、各々
に異なる特徴を持つからである。
実際にこれらの細胞株を、腫瘍化していないヒトのマク
ロファージ系の細胞と細胞融合させる場合には、腫瘍化
した細胞株をあらかじめ５−ブロモデオキシウリジンに
耐性とし、チミジン・カイネースの欠損した株を選択し
て用いる。これは後述するが、雑種細胞のみを選択的に
増殖させ、分離するためである。
ロファージ系の細胞と細胞融合させる場合には、腫瘍化
した細胞株をあらかじめ５−ブロモデオキシウリジンに
耐性とし、チミジン・カイネースの欠損した株を選択し
て用いる。これは後述するが、雑種細胞のみを選択的に
増殖させ、分離するためである。
腫瘍化していないヒトのマクロファージ系の細胞として
は、肺胞マクロファージ、牌臓マクロファージ、肝臓マ
クロファージ、腹腔マクロファージ、胎盤マクロファー
ジ、末梢血半球および脂腺マクロファージ等が用いられ
るが、マクロファージ系の細胞をよ、体組織に広く分布
しているものであり、これらに限定する必要はない。こ
れらの腫瘍化していないマクロファージは、通常はその
まま細胞融合に用いられるが、後で述べるような、例え
ば、リポポリサッカライド（以下ＬＰＳと略Ｔ ） 、
’ ” ７ カナハ！ＪンＡ１フィトヘマグルチニン、
ボークウィドウマイトジエン、ビタミンＡおよびその誘
導体、ホルボールエステル、ムラミルジペプチド、ＢＣ
Ｇ、プロテオ−７ベブトン、レンチナン、ピシバニール
、ジメチルスルホキシドあるいはリンホカイン等の刺激
剤によシ刺激をした後に１細胞融合に用いても勿論よい
。
は、肺胞マクロファージ、牌臓マクロファージ、肝臓マ
クロファージ、腹腔マクロファージ、胎盤マクロファー
ジ、末梢血半球および脂腺マクロファージ等が用いられ
るが、マクロファージ系の細胞をよ、体組織に広く分布
しているものであり、これらに限定する必要はない。こ
れらの腫瘍化していないマクロファージは、通常はその
まま細胞融合に用いられるが、後で述べるような、例え
ば、リポポリサッカライド（以下ＬＰＳと略Ｔ ） 、
’ ” ７ カナハ！ＪンＡ１フィトヘマグルチニン、
ボークウィドウマイトジエン、ビタミンＡおよびその誘
導体、ホルボールエステル、ムラミルジペプチド、ＢＣ
Ｇ、プロテオ−７ベブトン、レンチナン、ピシバニール
、ジメチルスルホキシドあるいはリンホカイン等の刺激
剤によシ刺激をした後に１細胞融合に用いても勿論よい
。
細胞融合は、腫瘍化したヒトのマクロファージ細胞株と
腫瘍化していないヒトのマクロファージとを、細胞融合
剤の存在下で、常温で混合することにより行う。細胞融
合剤としては、ポリエチレングリコール溶液、不活化セ
ンダイウィルスなど、種々知られており、特に制限はな
いが、調製が簡便であるポリエチレングリコール溶液が
用いやすい。細胞融合後、融合しなかった腫瘍化してい
ないマクロファージは、徐々に死滅してゆき、雑種細胞
株の獲得に特に支障はないが、融合し々がった腫瘍化し
た細胞株は死滅しないので、それとの分離は工夫を要す
る。
腫瘍化していないヒトのマクロファージとを、細胞融合
剤の存在下で、常温で混合することにより行う。細胞融
合剤としては、ポリエチレングリコール溶液、不活化セ
ンダイウィルスなど、種々知られており、特に制限はな
いが、調製が簡便であるポリエチレングリコール溶液が
用いやすい。細胞融合後、融合しなかった腫瘍化してい
ないマクロファージは、徐々に死滅してゆき、雑種細胞
株の獲得に特に支障はないが、融合し々がった腫瘍化し
た細胞株は死滅しないので、それとの分離は工夫を要す
る。
雑種細胞株と融合しなかった肺癌化した細胞株との分離
は、寒天培地中でのクローニング限界希釈法等を用い、
個々のコロニー間の性状比較にょシ実施可能であるが、
よシ用いやすい分離法として、腫瘍化した細胞株から、
あらかじめアミノプテリンおよびアザセリンの双方ある
いは一方を含む培地中で死滅するような酵素欠損株を選
択し、細胞融合用細胞株として用いる方法がある。アミ
ノプテリンで死滅する酵素欠損株は、アザセリンで死滅
するので、アミノプテリンの場合について以下に述べる
。以下、アミノプテリンについて述べることは、全てア
ザセリンについても適用できる。この方法によれば、細
胞融合後アミノプテリンを含む培地中で培養を行うこと
により、雑種細胞のみを選択的に増殖せしめられる。こ
の酵素欠損株の選択法は、例えばヒポキサンチン・グア
ニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、ＨＧ
ＰＲＴと略記する）の欠損株を獲得する場合は、８−ア
ザグアニンもしくは６−チオグアニンなどの薬剤を含む
培地中で増殖できる細胞株を選択する。またチミジン・
カイネースの欠損株金得る場合は、５−ブロモデオキシ
ウリジンを含む培地中で増殖しうる細胞株を選択する。
は、寒天培地中でのクローニング限界希釈法等を用い、
個々のコロニー間の性状比較にょシ実施可能であるが、
よシ用いやすい分離法として、腫瘍化した細胞株から、
あらかじめアミノプテリンおよびアザセリンの双方ある
いは一方を含む培地中で死滅するような酵素欠損株を選
択し、細胞融合用細胞株として用いる方法がある。アミ
ノプテリンで死滅する酵素欠損株は、アザセリンで死滅
するので、アミノプテリンの場合について以下に述べる
。以下、アミノプテリンについて述べることは、全てア
ザセリンについても適用できる。この方法によれば、細
胞融合後アミノプテリンを含む培地中で培養を行うこと
により、雑種細胞のみを選択的に増殖せしめられる。こ
の酵素欠損株の選択法は、例えばヒポキサンチン・グア
ニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（以下、ＨＧ
ＰＲＴと略記する）の欠損株を獲得する場合は、８−ア
ザグアニンもしくは６−チオグアニンなどの薬剤を含む
培地中で増殖できる細胞株を選択する。またチミジン・
カイネースの欠損株金得る場合は、５−ブロモデオキシ
ウリジンを含む培地中で増殖しうる細胞株を選択する。
これらの方法は、用いようとする細胞株の薬剤感受性に
より必要な薬剤濃度が異なるため、まず、種々の濃度係
剤鯰む培地にて培養を行ない、薬剤非添加時の１／２の
増殖速度を示す薬剤濃度を求め、該濃度の２０〜１００
倍濃度の薬剤濃度まで２〜６ケ月をかけて徐々に薬剤を
増加せしめることにより、酵素欠損細胞株を獲得できる
。該細胞株はアミノプテリンを含む培地中で生存できな
い。以下該細胞株をアミノプテリン感受性細胞株と略す
。
より必要な薬剤濃度が異なるため、まず、種々の濃度係
剤鯰む培地にて培養を行ない、薬剤非添加時の１／２の
増殖速度を示す薬剤濃度を求め、該濃度の２０〜１００
倍濃度の薬剤濃度まで２〜６ケ月をかけて徐々に薬剤を
増加せしめることにより、酵素欠損細胞株を獲得できる
。該細胞株はアミノプテリンを含む培地中で生存できな
い。以下該細胞株をアミノプテリン感受性細胞株と略す
。
獲得された株が真にアミノプテリン感受性細胞株である
ことを確認するために、種々の濃度のアミノプテリンを
含む培地中で１５日間培養を行い、確実に該細胞株が死
滅することを確認し、酵素欠損株を死滅させる薬剤であ
るアミノプテリンの有効濃度を求める。該細胞株の全て
が、培養開始後１５日間で死滅するアミノプテリンの最
小濃度からその１００倍までの濃度を、細胞融合後の選
択培地のアミノプテリン濃度とすることが好ましい。
ことを確認するために、種々の濃度のアミノプテリンを
含む培地中で１５日間培養を行い、確実に該細胞株が死
滅することを確認し、酵素欠損株を死滅させる薬剤であ
るアミノプテリンの有効濃度を求める。該細胞株の全て
が、培養開始後１５日間で死滅するアミノプテリンの最
小濃度からその１００倍までの濃度を、細胞融合後の選
択培地のアミノプテリン濃度とすることが好ましい。
以下、細胞融合の詳細について記載する。
ヒトの腫瘍化していないマクロファージは、ヒトの各臓
器よシ、次のような手順で得られる。
器よシ、次のような手順で得られる。
末梢血単球は、フィコール・コンレイ液の上部に末梢血
を重層せしめ、４００９．３０分の遠心分離を施し、中
間層として得られる末梢血リンパ球分画、腹腔マクロフ
ァージは、腹水貯溜患者よシ得られた腹水を遠心分離に
よシ集めた細胞、肝臓、胸腺、胎盤、肝臓マクロファー
ジは、摘出した組織をよく切りきざみ、ステンレスメツ
シュで固形分を分離し、混入した赤血球ｉｎ、１４Ｍ塩
化アンモニウム溶液にて溶血処理を施し、除去した細胞
を各々細胞培養液に分散させ、あらかじめ牛胎児血清で
表面コーティングしたプラスチックスプレートに撒き、
数時間後に付着した細胞ヲ、トリプシンあるいはエチレ
ンジアミンテトラアセテート処理によシプラスチックス
プレートよシはがして得られる。肺胞マクロファージは
、肺洗浄によシ得られた洗浄液そのものを用いる。
を重層せしめ、４００９．３０分の遠心分離を施し、中
間層として得られる末梢血リンパ球分画、腹腔マクロフ
ァージは、腹水貯溜患者よシ得られた腹水を遠心分離に
よシ集めた細胞、肝臓、胸腺、胎盤、肝臓マクロファー
ジは、摘出した組織をよく切りきざみ、ステンレスメツ
シュで固形分を分離し、混入した赤血球ｉｎ、１４Ｍ塩
化アンモニウム溶液にて溶血処理を施し、除去した細胞
を各々細胞培養液に分散させ、あらかじめ牛胎児血清で
表面コーティングしたプラスチックスプレートに撒き、
数時間後に付着した細胞ヲ、トリプシンあるいはエチレ
ンジアミンテトラアセテート処理によシプラスチックス
プレートよシはがして得られる。肺胞マクロファージは
、肺洗浄によシ得られた洗浄液そのものを用いる。
これらの腫瘍化していないヒトのマクロファージを含む
浮遊液と、アミノプテリン感受性細胞株とを混合し、遠
心分離で牛胎児血清等の蛋白成分を完全に除去する。両
細胞の混合比率は特に制限はな（，１：１の細胞比率か
ら一方の細胞を１００倍程度壕で過剰に加えてもよい。
浮遊液と、アミノプテリン感受性細胞株とを混合し、遠
心分離で牛胎児血清等の蛋白成分を完全に除去する。両
細胞の混合比率は特に制限はな（，１：１の細胞比率か
ら一方の細胞を１００倍程度壕で過剰に加えてもよい。
次に、混合細胞ｋ Ｃ０ｎＡ ％ フィトヘマグルチニ
ン、ボークウィドウマイトジエン等の植物凝集素、ある
いはコラーゲン、フィブロネクチン（ｉ７１ｒｎ！−中
に１〜１０００μｍ含んだ無血清培地中で５〜６０分間
、５％ＣＯ□、６７℃で前処理を行うと、マクロファー
ジの細胞融合の効率が極めて高くなることが見い出され
た。勿論、両細胞を混合する前に、それぞれの細胞を別
々に前処理を行った後に混合し、次の操作に入ってもよ
い。これは、おそら〈細胞の凝集をもたらし、絽胞間の
接触効率を上げ、ひいては融合効率を上げるためと推定
される。
ン、ボークウィドウマイトジエン等の植物凝集素、ある
いはコラーゲン、フィブロネクチン（ｉ７１ｒｎ！−中
に１〜１０００μｍ含んだ無血清培地中で５〜６０分間
、５％ＣＯ□、６７℃で前処理を行うと、マクロファー
ジの細胞融合の効率が極めて高くなることが見い出され
た。勿論、両細胞を混合する前に、それぞれの細胞を別
々に前処理を行った後に混合し、次の操作に入ってもよ
い。これは、おそら〈細胞の凝集をもたらし、絽胞間の
接触効率を上げ、ひいては融合効率を上げるためと推定
される。
続いて、細胞融合促進剤である分子量１５００〜６００
０のポリエチレングリコールを蛋白ＪＸヲ含まない培地
もしくは平衡塩液に溶解し、３５〜５５％としたものを
、細胞１０７個あたり０．１〜１−の割合でゆっくりと
滴下し２〜３分間放置後、蛋白質を含まない培地で洗浄
し、充分にポリエチレングリコールを希釈する。
０のポリエチレングリコールを蛋白ＪＸヲ含まない培地
もしくは平衡塩液に溶解し、３５〜５５％としたものを
、細胞１０７個あたり０．１〜１−の割合でゆっくりと
滴下し２〜３分間放置後、蛋白質を含まない培地で洗浄
し、充分にポリエチレングリコールを希釈する。
続いて、アミノプテリン感受性腫瘍細胞を完全に死滅さ
せる最少〜１００倍濃度Ｏ７ミノプテリン、および融合
細胞の増殖を促進する因子であるヒボキサンチンおよび
チミジンを含む培地（以下、ＨＡＴ培地と略記する）に
細胞を分散せしめ、９６穴マイクロテストプレートに分
注し、炭酸ガス培養器中にて融合細胞の増殖をはかる。
せる最少〜１００倍濃度Ｏ７ミノプテリン、および融合
細胞の増殖を促進する因子であるヒボキサンチンおよび
チミジンを含む培地（以下、ＨＡＴ培地と略記する）に
細胞を分散せしめ、９６穴マイクロテストプレートに分
注し、炭酸ガス培養器中にて融合細胞の増殖をはかる。
なお、ヒポキサンチンおよびチミジンの濃度は細胞障害
を示さない範囲ならば特に制限はないが、それぞれ１０
−４’Ｍおよび１．５×１０−５ Ｍ程度が望捷しい。
を示さない範囲ならば特に制限はないが、それぞれ１０
−４’Ｍおよび１．５×１０−５ Ｍ程度が望捷しい。
かくして、ＨＡＴ培地に増殖してくる細胞を分離し、融
合細胞株であることの確認を行う。これはチミジンカイ
ネース欠損した腫瘍化細胞株が、Ｉ（ＡＴ培地中で突然
変異によシ、チミジンカイネースを保有した細胞に戻っ
てＨＡＴ培地中に増殖してくるケースも考えられるが、
これと区別することにもなる。
合細胞株であることの確認を行う。これはチミジンカイ
ネース欠損した腫瘍化細胞株が、Ｉ（ＡＴ培地中で突然
変異によシ、チミジンカイネースを保有した細胞に戻っ
てＨＡＴ培地中に増殖してくるケースも考えられるが、
これと区別することにもなる。
細胞融合の確認は、染色体数の増加の確認によって行う
。通常、腫瘍化していないヒトのマクロファージの染色
体の数は、ヒト正常２倍体の染色体数である４６本に一
致する。腫瘍化したヒトのマクロファージの染色体数も
４６本である。融合によって得られる細胞は、勿論、４
６本以上となる。しかし、分裂増殖ヲ＜シ返すうちに染
色体が脱落し、減少してくることもあり、必ずしも染色
体数が少ないから融合細胞ではないということはできな
い。一般には、融合細胞は染色体数において分布を持つ
。
。通常、腫瘍化していないヒトのマクロファージの染色
体の数は、ヒト正常２倍体の染色体数である４６本に一
致する。腫瘍化したヒトのマクロファージの染色体数も
４６本である。融合によって得られる細胞は、勿論、４
６本以上となる。しかし、分裂増殖ヲ＜シ返すうちに染
色体が脱落し、減少してくることもあり、必ずしも染色
体数が少ないから融合細胞ではないということはできな
い。一般には、融合細胞は染色体数において分布を持つ
。
染色体数の測定は、細胞約１０６ケを１０−７Ｍコルセ
ミド全含む通常培地中で３０〜６０分処理後、低張塩水
溶液で処理し、酢酸−メタノール（１：３ｖ／ｖ）によ
る固定後、冷却スライドグラス上に滴下し、乾燥、ギム
ザ液による染色後、光学顕微鏡下で行う。
ミド全含む通常培地中で３０〜６０分処理後、低張塩水
溶液で処理し、酢酸−メタノール（１：３ｖ／ｖ）によ
る固定後、冷却スライドグラス上に滴下し、乾燥、ギム
ザ液による染色後、光学顕微鏡下で行う。
融合細胞の産生ずる生理活性物質の検出は、融合細胞全
刺激剤として、ＬＰＳ、コンカナバリンＡ１フイトヘマ
グルチニン、ボークウィドウスイトジエン、ビタミンＡ
およびその誘導体、ホルボールエステル、ムラミルジペ
プチド、Ｂ ＣＧ ’、プロテオ−スペプトン、レンチ
ナン、ピシバニール、ジメチルスルホキシドあるいはリ
ンホカイン等を含む培養液中で培養して得た培養上清を
用いて行った。
刺激剤として、ＬＰＳ、コンカナバリンＡ１フイトヘマ
グルチニン、ボークウィドウスイトジエン、ビタミンＡ
およびその誘導体、ホルボールエステル、ムラミルジペ
プチド、Ｂ ＣＧ ’、プロテオ−スペプトン、レンチ
ナン、ピシバニール、ジメチルスルホキシドあるいはリ
ンホカイン等を含む培養液中で培養して得た培養上清を
用いて行った。
一つの融合細胞から種々の生理活性物質が産生されるが
、これはまた、刺激の方法によっても変化すると思われ
る。さらに、クローニングの手段によｐ、一つの生理活
性物質を特に多量に生産する株を得ることも可能である
。
、これはまた、刺激の方法によっても変化すると思われ
る。さらに、クローニングの手段によｐ、一つの生理活
性物質を特に多量に生産する株を得ることも可能である
。
腫瘍傷害性物質については、マウスＬｌ胞に対する細胞
嵩性の測定、インターロイキン−１については、マウス
胸腺細胞によるトリチウムラベルしたチミジンの取り込
み速度の測定（ＤＮＡ合成促進効果の測定）によって行
った。
嵩性の測定、インターロイキン−１については、マウス
胸腺細胞によるトリチウムラベルしたチミジンの取り込
み速度の測定（ＤＮＡ合成促進効果の測定）によって行
った。
得られた融合細胞の生理活性物質の産生についての結果
１ 腫瘍傷害物質については、親株を異にするいずれの
融合細胞も、刺激によシ培養液中にマウスＬ細胞傷害を
示す物質を産生じ、七の活性の大きさは、親株の腫瘍化
したヒトのマクロファージ細胞株に比べてはるかに高く
、もう一方の親株である腫瘍化していないヒトのマクロ
ファージと同等あるいはそれよりも高く、かつ増殖性を
持つ融合細胞が得られた。
融合細胞も、刺激によシ培養液中にマウスＬ細胞傷害を
示す物質を産生じ、七の活性の大きさは、親株の腫瘍化
したヒトのマクロファージ細胞株に比べてはるかに高く
、もう一方の親株である腫瘍化していないヒトのマクロ
ファージと同等あるいはそれよりも高く、かつ増殖性を
持つ融合細胞が得られた。
２ インターロイキン１についても、腫瘍！Ｆ動物質場
合と同様、その活性が、腫瘍化したヒトのマクロファー
ジの細胞株よりも高く、腫瘍化していないヒトのマクロ
ファーシト同等あるいはそれ以上で、かつ増殖性を持つ
融合細胞が得られた。
合と同様、その活性が、腫瘍化したヒトのマクロファー
ジの細胞株よりも高く、腫瘍化していないヒトのマクロ
ファーシト同等あるいはそれ以上で、かつ増殖性を持つ
融合細胞が得られた。
以上のように、当該融合細胞は、腫瘍傷害物質およびイ
ンターロイキン１を多量に産生ずることが確認されたが
、当該融合細胞が増殖性であシ、かつ人間の細胞同士の
雑種細胞であることは、ヒト由来のこれらの物質を大量
に取得することが可能であることを示すものである。
ンターロイキン１を多量に産生ずることが確認されたが
、当該融合細胞が増殖性であシ、かつ人間の細胞同士の
雑種細胞であることは、ヒト由来のこれらの物質を大量
に取得することが可能であることを示すものである。
本融合細胞の取得により、従来、癌あるいは各種免疫疾
患等の治療薬として期待はされていたが、大量取得の点
で困難であった実用化の問題は、−挙に解決されること
になシ、人類の福祉、健康を守る上で持つ意義は極めて
大きいと思われる。以下、実施例によって本発明をさら
に具体的に説明する。
患等の治療薬として期待はされていたが、大量取得の点
で困難であった実用化の問題は、−挙に解決されること
になシ、人類の福祉、健康を守る上で持つ意義は極めて
大きいと思われる。以下、実施例によって本発明をさら
に具体的に説明する。
実施例１
採血により得たヒト末梢血５０２＄ｉ、各々５ｒｎｌず
つのフィコール・コンレイ液の入った遠心管に５ｄずつ
分注し、フィコール・コンレイ液の上部に重層させ、４
００９．３０分の遠心操作を施す。
つのフィコール・コンレイ液の入った遠心管に５ｄずつ
分注し、フィコール・コンレイ液の上部に重層させ、４
００９．３０分の遠心操作を施す。
中間層として得られる分画（末梢血リンパ球分画）を集
め、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養
液２０−に懸濁し、径１００冊のプラスチックスシャー
レ２枚に撒き、炭酸ガス培養器中で５％ＣＯ，，３７℃
下で一夜培養する。プラスチックスシャーレには牛脂児
血清約２−を入れ、冷蔵庫中で最低８時間以上放置した
後、牛胎児血清全除去したもの全使用する。このように
してプラスチックスシャーレの表面に付着した細胞ｉ、
０．０２５チドリプシンおよび０．００５％ＥＤＴＡ
全含むＰＢＳ溶液２−を加えて３分間室温に放置後、ラ
バーポリスマンで表面に付着した細胞を集める。得られ
た１、５Ｘ １０７ケの細胞は、はとんどが単球であシ
、トリバンプルーの排出テストにより、その生存率は９
５ケ以上である。
め、１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養
液２０−に懸濁し、径１００冊のプラスチックスシャー
レ２枚に撒き、炭酸ガス培養器中で５％ＣＯ，，３７℃
下で一夜培養する。プラスチックスシャーレには牛脂児
血清約２−を入れ、冷蔵庫中で最低８時間以上放置した
後、牛胎児血清全除去したもの全使用する。このように
してプラスチックスシャーレの表面に付着した細胞ｉ、
０．０２５チドリプシンおよび０．００５％ＥＤＴＡ
全含むＰＢＳ溶液２−を加えて３分間室温に放置後、ラ
バーポリスマンで表面に付着した細胞を集める。得られ
た１、５Ｘ １０７ケの細胞は、はとんどが単球であシ
、トリバンプルーの排出テストにより、その生存率は９
５ケ以上である。
一方、腫瘍化したヒトのマクロファージの細胞株である
Ｕ−９３７のチミジンキナーゼ欠損株（以下Ｕ−９３７
（ＴＫ−）） ３ Ｘ １０７ケを単球と混ぜ、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０にＭ濁し、遠心により細胞を洗浄し、蛋白
成分全除去する。これを数回くり返した後、３ｍｌＲＰ
ＭＩ−１６４０３−に懸濁し、０．１１℃ｇヒトのフィ
ブロネクチンを加え、３０分間、炭酸ガス培養器中に放
置する。遠心によりＲＰＭＩ−１６４０で洗浄後、ペレ
ット状にした細胞に分子量２０００のポリエチレングリ
コールの４０％ハンクス溶液を力υえて融合し、ＨＡＴ
培養液６Ｄ１ｄに分散させ、９６穴プレ一ト３枚に撒き
、炭酸ガス培養器中で５％ＣＯ２，３７℃に維持した。
Ｕ−９３７のチミジンキナーゼ欠損株（以下Ｕ−９３７
（ＴＫ−）） ３ Ｘ １０７ケを単球と混ぜ、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０にＭ濁し、遠心により細胞を洗浄し、蛋白
成分全除去する。これを数回くり返した後、３ｍｌＲＰ
ＭＩ−１６４０３−に懸濁し、０．１１℃ｇヒトのフィ
ブロネクチンを加え、３０分間、炭酸ガス培養器中に放
置する。遠心によりＲＰＭＩ−１６４０で洗浄後、ペレ
ット状にした細胞に分子量２０００のポリエチレングリ
コールの４０％ハンクス溶液を力υえて融合し、ＨＡＴ
培養液６Ｄ１ｄに分散させ、９６穴プレ一ト３枚に撒き
、炭酸ガス培養器中で５％ＣＯ２，３７℃に維持した。
２５日経過後、増殖のみられる穴が出現したが、これは
染色体数の検査よシ融合細胞であることが確認された。
染色体数の検査よシ融合細胞であることが確認された。
染色体数の検査は、明細書中に述べた方法を用いた。結
果全表１に示す。
果全表１に示す。
表 １
実施例２
実施例１において得られた融合細胞による腫瘍傷害物質
の生産について検討した。
の生産について検討した。
方法は、各融合細胞およびコントロールとして融合の親
株であるＵ−９ｘ７（ＴＫ−１単球を各々１０６ケを、
２４大のプラスチックスシャーレで牛胎児血清７５チを
含むＲＰＭＩ−１６４０培養液１−に懸濁し、ＬＰＳを
１０μ２／−となるように加え、５チＣＯ２，６７℃で
培養し、ＬＰＳ添加添加２聞を検討した。
株であるＵ−９ｘ７（ＴＫ−１単球を各々１０６ケを、
２４大のプラスチックスシャーレで牛胎児血清７５チを
含むＲＰＭＩ−１６４０培養液１−に懸濁し、ＬＰＳを
１０μ２／−となるように加え、５チＣＯ２，６７℃で
培養し、ＬＰＳ添加添加２聞を検討した。
マウスＬ細胞に対する細胞毒性効果は、９６穴のプラス
チックスプレートの各穴に、培養上清液をそのまま、２
倍、４倍、８゛倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍
に１％牛脂児血清を含むＭＥＭ培養液で希釈し、１０ｏ
μｔずつ撒く。次に、マウスＬ細胞１０５ケを１−の１
チ牛脂児血清を含むＭＥＭ培養液で希釈した液を、ｉｏ
ｏμｔずっ各皿に加え、５７℃、５％Ｃｏ，下で２日間
培養する。次に、２０μｔの２５チグルタルデヒドを加
え、室温［１５分放置し、細胞を固定後、水で４回洗浄
し、５０’Ｃで１０分乾燥させる。次に、２チエタノー
ルに溶解した０．２％のクリスタルバイオレッ）１００
μｔを加え、１５分間室温に放置後、水で４回洗浄し、
５０℃で１０分乾燥させる。次に、０ 、１ Ｍ Ｎａ
，ＨＰＯ。
チックスプレートの各穴に、培養上清液をそのまま、２
倍、４倍、８゛倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍
に１％牛脂児血清を含むＭＥＭ培養液で希釈し、１０ｏ
μｔずつ撒く。次に、マウスＬ細胞１０５ケを１−の１
チ牛脂児血清を含むＭＥＭ培養液で希釈した液を、ｉｏ
ｏμｔずっ各皿に加え、５７℃、５％Ｃｏ，下で２日間
培養する。次に、２０μｔの２５チグルタルデヒドを加
え、室温［１５分放置し、細胞を固定後、水で４回洗浄
し、５０’Ｃで１０分乾燥させる。次に、２チエタノー
ルに溶解した０．２％のクリスタルバイオレッ）１００
μｔを加え、１５分間室温に放置後、水で４回洗浄し、
５０℃で１０分乾燥させる。次に、０ 、１ Ｍ Ｎａ
，ＨＰＯ。
とエタノールの容積比で１：１の混合液２００μｔを加
え、室温で３分間振った後、６１Ｄｎｍの吸光度を測定
することにょシみる。結果をまとめて表２に示す。ただ
し、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３は末梢血単球とＵ−９ ５
７ （ＴＫ−）の融合細胞のコロニーを示す。
え、室温で３分間振った後、６１Ｄｎｍの吸光度を測定
することにょシみる。結果をまとめて表２に示す。ただ
し、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３は末梢血単球とＵ−９ ５
７ （ＴＫ−）の融合細胞のコロニーを示す。
表 ２
実施例３
腫瘍化したヒトのマクロファージ細胞株として、チミジ
ンキナーゼの欠損したＴＨＰ−１株（以下、ＴＨＰ−１
（ＴＫ−）と略記）を用い、実施例１の場合と同様の方
法で、末梢血単球と細胞融合を試みたところ、２８８大
中１０株の融合細胞を得た。
ンキナーゼの欠損したＴＨＰ−１株（以下、ＴＨＰ−１
（ＴＫ−）と略記）を用い、実施例１の場合と同様の方
法で、末梢血単球と細胞融合を試みたところ、２８８大
中１０株の融合細胞を得た。
融合細胞につき、腫瘍傷害物質の産生を実施例２と同じ
方法で検討した。結果を表３に示す。ただし、Ｂ−１、
Ｂ−２は末梢血単球とＴＨＰ−１（ＴＫ−）の融合細胞
のコロニーを示す。
方法で検討した。結果を表３に示す。ただし、Ｂ−１、
Ｂ−２は末梢血単球とＴＨＰ−１（ＴＫ−）の融合細胞
のコロニーを示す。
表 ３
実施例４
ヒト肺の洗浄よシ得られた洗浄液５ｏ−より、遠心によ
多細胞を集め、１．０×１０７ケの肺胞マクロファージ
を得る。トリバンプルーの排出テストにより、生存率は
９５％であった。
多細胞を集め、１．０×１０７ケの肺胞マクロファージ
を得る。トリバンプルーの排出テストにより、生存率は
９５％であった。
ヒト肺胞マクロファージ１．Ｄ Ｘ １ ０’ケとＵ−
９ ３ ７（ＴＫ−）、！ｌ ｘ ｉ ｏフケを混ぜ、
ＲＰＭＩ−１６４０ＫＭ濁し、遠心によ多細胞を洗浄し
、蛋白成分を除去する。
９ ３ ７（ＴＫ−）、！ｌ ｘ ｉ ｏフケを混ぜ、
ＲＰＭＩ−１６４０ＫＭ濁し、遠心によ多細胞を洗浄し
、蛋白成分を除去する。
以下、実施例１で述べたのと同じ方法で、細胞融合を行
った。融合細胞株は、２５０大中３穴に得られた。この
融合細胞株は、５０本以上の染色体を持つ細胞が全体の
３０〜４２チを占めた。
った。融合細胞株は、２５０大中３穴に得られた。この
融合細胞株は、５０本以上の染色体を持つ細胞が全体の
３０〜４２チを占めた。
また、癌性腹膜炎患者よシ得られた腹水５００ゴを遠心
にかけて細胞を集め、ＯｙｚＭｍ化アンモニウム溶液に
て赤血球の溶血を行った後、１０チの牛胎児血清を含む
ＲＰＭＩ−１６４０培養液２０ぜに懸濁後、実施例１で
述べたのと同様な方法で、プラスチックスシャーレに付
着した腹腔マクロファージ８×１０・６ケを得た。Ｕ−
９３７（ＴＫ勺２ Ｘ １０７ケと混ぜた後、実施例１
による方法で細胞融合全行い、２００穴中５穴の融合細
胞を得た。融合細胞のうち５０本以上の染色体を持つ細
胞は、全体の３８〜５５％であった。Ｕ−９３７（Ｔ
Ｋ−）と肺胞マクロファージの融合細胞およびＴＪ−９
３７ＴＫ−と腹腔マクロファージの融合細胞とを、実施
例２で述べた方法にて、ＬＰＳによる刺激を行った後の
培養上清を用いて、そのインターロイキン１の活性の測
定を行った。同時に、実施例２で得られた単球とＵ−９
３７（ＴＫ−）の融合細胞Ａ−１のＬＰＳ刺激培養上清
のインターロイキン１の活性も測定した。
にかけて細胞を集め、ＯｙｚＭｍ化アンモニウム溶液に
て赤血球の溶血を行った後、１０チの牛胎児血清を含む
ＲＰＭＩ−１６４０培養液２０ぜに懸濁後、実施例１で
述べたのと同様な方法で、プラスチックスシャーレに付
着した腹腔マクロファージ８×１０・６ケを得た。Ｕ−
９３７（ＴＫ勺２ Ｘ １０７ケと混ぜた後、実施例１
による方法で細胞融合全行い、２００穴中５穴の融合細
胞を得た。融合細胞のうち５０本以上の染色体を持つ細
胞は、全体の３８〜５５％であった。Ｕ−９３７（Ｔ
Ｋ−）と肺胞マクロファージの融合細胞およびＴＪ−９
３７ＴＫ−と腹腔マクロファージの融合細胞とを、実施
例２で述べた方法にて、ＬＰＳによる刺激を行った後の
培養上清を用いて、そのインターロイキン１の活性の測
定を行った。同時に、実施例２で得られた単球とＵ−９
３７（ＴＫ−）の融合細胞Ａ−１のＬＰＳ刺激培養上清
のインターロイキン１の活性も測定した。
インターロイキン１の活性測定は、マウスの胸腺細胞に
よるトリチウムラベルしたチミジンの取ケ全ＬＰ６１０
μ２を含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地１−中で２４
時間、ｃｏ２インキュベーター中で培養した後、培養上
清を集め、６週令Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスから採取し
た胸腺細胞５ Ｘ １０６ケを含む５チヒト血清含有Ｍ
ＥＭ培地１−中に添加し、ｃｏ２インキュベーター中で
培養し、４８時間後に１マイクロキユーリーのトリチウ
ムラベルしたチミジンを加え、培養を続け、７２時間後
に培養上清の放射活性をみることによって測定した。た
だし、共存刺激物質として、ＭＦＪＭ培地中にコンカナ
バリンＡ（（最終濃度で５μｍ／−となるように共存さ
せた場合と、共存させない場合の双方について行った。
よるトリチウムラベルしたチミジンの取ケ全ＬＰ６１０
μ２を含む無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地１−中で２４
時間、ｃｏ２インキュベーター中で培養した後、培養上
清を集め、６週令Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウスから採取し
た胸腺細胞５ Ｘ １０６ケを含む５チヒト血清含有Ｍ
ＥＭ培地１−中に添加し、ｃｏ２インキュベーター中で
培養し、４８時間後に１マイクロキユーリーのトリチウ
ムラベルしたチミジンを加え、培養を続け、７２時間後
に培養上清の放射活性をみることによって測定した。た
だし、共存刺激物質として、ＭＦＪＭ培地中にコンカナ
バリンＡ（（最終濃度で５μｍ／−となるように共存さ
せた場合と、共存させない場合の双方について行った。
同様な測定により、ヒトの末梢血単球、肺胞マクロファ
ージ、腹腔マクロファージおよびＵ−９３７（Ｔ Ｋ”
’）についても、インターロイキン１の活性を測定した
ので、結果を表４に示す。
ージ、腹腔マクロファージおよびＵ−９３７（Ｔ Ｋ”
’）についても、インターロイキン１の活性を測定した
ので、結果を表４に示す。
表 ４
実施例５
各種患者の術後に得られた肝臓、肝臓、胸腺および胎盤
各５１より、ハンクス氏液で洗浄後、はさみで細かく切
シきざみ（ステンレスメツシュで濾過後、遠心にて細胞
を集め、０．１４Ｍ塩化アンモニウム溶液にて溶血処理
を施した後、さらにＲＰＭＩ−１６４０溶液で、遠心操
作にょシ洗浄をくシ返し、集めた細胞を、あらかじめ牛
胎児血清で表面コーティングしたプラスチックスプレー
トに撒き、３時間後に、付着した細胞に、０．０２５％
トリプシンおよびｏ、Ｏ０５チＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶
液を加えて、３分間室温に放置後、ラバーポリスマンで
表面に付着した細胞を集めた。得られた各１ａ胞Ｖｃツ
イ−ｃ １ｘ １ｏ７ケとＵ−９３７（ＴＫ−）３ Ｘ
１０７ケとを混ぜた後、実施例１で述べたフィブロネ
クチンのかわシにヒトコラーゲン０．１ηによる前処理
後、実施例１で述べたのと同様な方法で細胞融合全行っ
た。
各５１より、ハンクス氏液で洗浄後、はさみで細かく切
シきざみ（ステンレスメツシュで濾過後、遠心にて細胞
を集め、０．１４Ｍ塩化アンモニウム溶液にて溶血処理
を施した後、さらにＲＰＭＩ−１６４０溶液で、遠心操
作にょシ洗浄をくシ返し、集めた細胞を、あらかじめ牛
胎児血清で表面コーティングしたプラスチックスプレー
トに撒き、３時間後に、付着した細胞に、０．０２５％
トリプシンおよびｏ、Ｏ０５チＥＤＴＡを含むＰＢＳ溶
液を加えて、３分間室温に放置後、ラバーポリスマンで
表面に付着した細胞を集めた。得られた各１ａ胞Ｖｃツ
イ−ｃ １ｘ １ｏ７ケとＵ−９３７（ＴＫ−）３ Ｘ
１０７ケとを混ぜた後、実施例１で述べたフィブロネ
クチンのかわシにヒトコラーゲン０．１ηによる前処理
後、実施例１で述べたのと同様な方法で細胞融合全行っ
た。
得られた各融合細胞について、実施例２で述べたのと同
様な方法でマウスＬ細胞に対する細胞拷性効果を、実施
例４で述べたのと同様な方法でインターロイキン１の活
性を測定した。結果を表５に示す。
様な方法でマウスＬ細胞に対する細胞拷性効果を、実施
例４で述べたのと同様な方法でインターロイキン１の活
性を測定した。結果を表５に示す。
表 ５
なお、Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｃ
ｅ１ｌ ＬｉｎｅＵ−９３７（ＴＫ−）およびＭｏｎｏ
ｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｃｅ１ｌＬｉｎｅ Ｔ
ＨＰ −１（ＴＫ−）を工業技術院微生物工業技術研究
所へ寄託申請したが、受託できる微生物の範囲外である
との理由で受託を拒否された。
ｅ１ｌ ＬｉｎｅＵ−９３７（ＴＫ−）およびＭｏｎｏ
ｃｙｔｉｃ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｃｅ１ｌＬｉｎｅ Ｔ
ＨＰ −１（ＴＫ−）を工業技術院微生物工業技術研究
所へ寄託申請したが、受託できる微生物の範囲外である
との理由で受託を拒否された。
Claims (5)
- （１） ヒトの腫瘍化したマクロファージの細胞株と
腫瘍化していないヒトのマクロファージとを、細胞融合
して全る雑種細胞を用いることを特徴とする生理活性物
質の産生方法。 - （２） ヒトの腫瘍化したマクロファージの細胞株が
、チミジンカイネースを欠損し、アミノプテリンおよび
アザセリンの双方あるいは一方を含む培地中で生育しな
いヒトの腫瘍化したマクロファージの細胞株およびそれ
から誘導された細胞株である特許請求の範囲第１項記載
の生理活性物質の産生方法。 - （３） ヒトの腫瘍化したマクロファージの細胞株が
、Ｕ−９３７のチミジンカイネース欠損株およびＴＨＰ
−１のチミジンカイネース欠損株のいずれかである特許
請求の範囲第１項記載の生理活性物質の産生方法。 - （４）腫瘍化していないヒトのマクロファージが、肺胞
マクロファージ、牌臓マクロファージ、末梢血単球、腹
腔マクロファージ、肝臓マクロファージ、胎盤マクロフ
ァージおよび胸腺マクロファージのいずれかである特許
請求の範囲第１項記載の生理活性物質の産生方法。 - （５）生理活性物質が、腫瘍傷害物質あるいはインター
ロイキン１である特許請求の範囲第１項記載の生理活性
物質の産生方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58041409A JPS59169492A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法 |
| EP84102688A EP0118917B1 (en) | 1983-03-15 | 1984-03-12 | Method for production of biologically active substances |
| DE8484102688T DE3484909D1 (de) | 1983-03-15 | 1984-03-12 | Verfahren zur herstellung von biologisch aktiven stoffen. |
| HU841012A HU191397B (en) | 1983-03-15 | 1984-03-14 | Process for preparing biologically active substances by means of the cultivation of hybride cell lines |
| US06/589,832 US4711842A (en) | 1983-03-15 | 1984-03-15 | Method for production of biologically active substances |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58041409A JPS59169492A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59169492A true JPS59169492A (ja) | 1984-09-25 |
Family
ID=12607555
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58041409A Pending JPS59169492A (ja) | 1983-03-15 | 1983-03-15 | ヒト融合細胞からの生理活性物質の産生方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4711842A (ja) |
| EP (1) | EP0118917B1 (ja) |
| JP (1) | JPS59169492A (ja) |
| DE (1) | DE3484909D1 (ja) |
| HU (1) | HU191397B (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4879226A (en) * | 1984-04-06 | 1989-11-07 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Novel human physiologically active polypeptide |
| NL8401221A (nl) * | 1984-04-16 | 1985-11-18 | Innovi Nv | Analytische toepassing van fagocyt-cellijnen. |
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