JPH02500716A - バチルス・スリンギエンシスｐ‐２毒素の遺伝子、タンパク質および関係する殺虫剤組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

タンパク質および関係する殺虫剤組成物１．０　更隻 本発明は、生物学的殺虫剤として有用であり、モしてＰ−２毒素、またはＰ−２ デルタ−内毒素として知られている、結晶買タンパク質に関する。それはバチル ス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のあ る種の菌株により天然に産生される。さらに詳しくは、本発明は、Ｐ−２デルタ −内毒素の遺伝情報を指定する遺伝子の種々の微生物におけるクローニングおよ び発現、およびＰ−２毒素それ自体組み込んだ関係する新規な殺虫剤組成および Ｐ−２遺伝子で形質転換した微生物に関する。 ２．０　発明の背景 ２．１　商用農薬：　一般的考察 毎年、世界の商業的に重要な農作物は昆虫および他の有害生物（ｐｅｓｔ）の蔓 延で失われている。これらの有害生物による損害は、食物、繊維材料、および種 々の家庭の植物を包含する商業的に重要なすべての分野に広がり、そして経済的 損害は数百万ドルになる。こうして、このような蔓延から作物を保護することは 極めて重大な問題である。 広いスペクトルの農薬（ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）は、作物の保護に最も普通に使用 されているが、これらの薬剤の無差別の使用は植物の自然の防御因子の破壊に導 くことがある。さらに、それらの広いスペクトルの活性のため、化学的農薬は非 標的有機体、例えば、有益な昆虫および破壊的有害生物の寄生体を破壊すること がある。これらは、また、しばしば動物およびヒトに毒性であり、こうして、適 用するとき、環境的危険を持ち出す。 さらに、昆虫および他の有機体は、しばしば、これらの農薬に反復して暴露され るとき、これらに対する抵抗性を発現する。農薬の実用性を減少することに加え て、すくない有害生物の抵抗性系統は、有益な寄生体有機体の減少のために、主 要な蔓延の問題となることがある。 これは広いスペクトルの農薬を使用するとき直面する主要な問題である。要求さ れることは、狭いスペクトルの活性と、その活性を延長した時間にわたって維持 する能力、すなわち、それに対する抵抗が非常により遅いか、あるいはまったく ない、とを兼備しＩ；生物分解性農薬である。 生物農薬（ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）はこれに関して有用であると思われる。 ２．２　生物学的農薬 生物農薬、またバイオラショナル（ｂｉｏｒａｔ　１ｏｎａｌ）と呼ばれている 、は、農作物の昆虫、菌・かび、および雑草の蔓延を抑制するｔ；めに使用され る。このような物質は、バクテリアの成長培地を使用するか、あるいは使用しな いで、蔓延因子に対して毒性の物質（例えば、毒素）を産生ずるバクテリアから なることができる。このようなバクテリアは、係準の適用方法１５より植物へ直 接通用することができ、そして典型的には延長した期間にわたって、作物により 耐えられ、反復適用の必要性を減少する。 有害生物の抑制の生物学的方法の使用は、最初に、菌・かびの病気がカイコにお いて発見された１８９５年において示唆された。しかしながら、乳化病のバクテ リアの二ホンカプトムシバチルス・ボピリアエ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｏｐｉｌ ＋１ａｅ）の胞子を使用してアメコガネ（Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｂｅｅｔｌｅ）を 抑制するために使用した１９４０年まで、最初に生物学的有害生物の抑制は成功 しなかった。１９６０年代後半において、チョウおよびガの幼虫に対して致死的 な毒素を分泌するバクテリアの新しい菌株の発見は、商業的生物農薬のための段 階を設定した。バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎ ｇｉｅｎｓｉｓ）（以後、ｒＢ、ｔ、Ｊと互換的に呼ぶ）と命名するバクテリア は、現在量も広く使用されている生物農薬である。 バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ）は、広く分布した、杆状の、好気性の、胞子形成性微生物である。その胞子形 成サイクルの間、Ｂ、ｔ、はプロトキシン（ｐｒ。 ｔｘｉｎ）またはデルタ−内毒素として知られているタンパク質を形成する。こ れらのプロトモシンは、パラ胞子、結晶質封入体としてまたは胞子殻の一部とし てＢ、ｔ、甲に蓄積される。種々の感受性昆虫、例えば、鱗翅類（Ｌｅｐｄｏｐ ｔｅｒａ）’＜よび双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）の目におけるものに対するＢ、ｔ 、の病原性は、本質的にこのパラ胞子の結晶のためであり、この結晶は胞子形成 の時においてＢ、ｔ、細胞の乾燥重量つ２０％を越えることがある。 パラ胞子の結晶は、摂取後にはじめて昆虫において活性である。例えば、鱗翅類 の昆虫による後、中腸におけるアルカリ性ｐＨおよびタンパク質分解酵素は結晶 を活性化して、毒性成分を放出させる。これらの毒性成分は中腸の細胞を毒し、 昆虫の食物摂取を停止させ、究極的に、昆虫を死亡させる。事実、Ｂ、ｔ−は鱗 翅類の昆虫を取り扱うとき、有効なかつ環境的に安全な昆虫であることが証明さ れた。 Ｂ、ｔ、の異なる系統は血清学的に異なるパラ胞子の結晶を産生することが、報 告された。しかしながら、Ｂ、ｔ、系統の多くにより産生される主要な結晶形態 の１つはＰ−１として知られている形態である。Ｐ−１は約１３０，０００ダル トンの分子量を有し、そして、また、胞子殻の１つ主要な成分であると考えられ る。パラ胞子の結晶のＰ−１の遺伝子および他のタンパク質結晶のほとんどのそ れらは、Ｂ、ｔ、中に変化する大きさの多数の異なるプラスミドの任意の１つ上 に存在することが発見された。 ２．４　デルタ−内毒素のクローニングＢ、ｔ、毒素の遺伝子は、典型的には、 プラスミド上に存在し、そしてそれらの産生物は有効な殺虫剤であることが証明 され、これらの殺虫剤は、結晶の形態であるとき、あるいは胞子形成に関連する とき、容易に分離されるので、きわめて多くの科学的研究、とくに遺伝子の分離 およびクローニングの手順に関する研究の主題であった。 Ｐ−１の遺伝情報を指定する遺伝子は、Ｂ、ｔ、亜種クルスタキ（ｋｕｒｓｔａ ｋｉ）系統ＨＤ−１−Ｄｉｐｅｌから分離され、モしてＥ。 ｃｏｌｉにおいてクローニングおよび発現された［５ｃｈｎｓｆら、米国特許第 ４．４６７．０３６号］。タンパク質産生物のＰ−１は、鱗翅類の昆虫（タバコ のイモムシの幼虫）に対して毒性であることが決定された。Ｐ−１の結晶タンパ ク質の遺伝子のプロモーター領域および解読領域の部分のヌクレオチド配列は、 また、決定されｔ：　［Ｈ，Ｐ、　Ｗｏ　ｎｇら、ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉ。 ｌ　Ｃｈｅｍ、）、Ｖｏ　１．２５８、Ｎ００３、ｐｐ、１９６０−１９６７　 （１９８３）］。この遺伝子の全体のヌクレオチド配列は、また、決定され、そ してそのデルタ−内毒素タンパク質それ自体は形質転換しｔ：Ｅ、ｃｏｌｉ系統 中で発現された［Ｍ、Ｊ、Ａｄａｎｇら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、Ｖｏｌ、３６、 ｐｐ、２９８−３００　（１９８５）およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ　８５１０ １６６５、Ｂ、ｔ、の結晶タンパク質毒素のセグメントについて（１９８５）］ 。 他のデルタ−内毒素の形態の遺伝子は、また、Ｅ、ｃｏｌｉ中でクローニングお よび発現された。Ｂ、ｔ、Ｖａｒ、イスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ）からの力のデルタ−内毒素遺伝子を含有する組み換え体プラスミドは、Ｅ−ｃ ｏｌｉのベクター中に挿入された。２６゜０００ダルトンのポリペプチドは、こ のベクターで形質転換したＥ、ｃｏｌｉにより合成された。このポリペプチドは 、双翅類（Ｄ　ｉ　ｐ　ｔ　ｅ　ｒａ）目における昆虫（力）に致死的であるこ とが示された。［Ｅ、Ｓ。 Ｗａｒｄら、ＦＥＢＳ　Ｖｏｌ、１７５．２、ｐｐ−３７７−３８２，１９８４ ］。この結晶タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子のヌクレオチド配列は、ま た、生ずるタンパク質配列と一緒に決定された［Ｃ。 Ｗａａｌｗｉｊｉｋら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ）、Ｖｏｌ、１３、Ｎｏ、ｐｐ、８２０７−８２１７、（１９８５）］。 １３０ＫＤａの結晶タンパク質をエンコードする他のＢ、ｔ、イスラエレンシス （ｖａｒ、１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）の遺伝子は、クローニングされ、そして巨 大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・スブチリス （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）を形質転換するために使用されｊ；。 巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびバチルス・スブチリ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の両者は、胞子形成の間結晶質封入 体を発現し、この封入体はエデス・ニジブチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔｉ）の 幼虫に対して毒性であることが決定された。［Ｖ、５ｅｋａｒら、遺伝子（Ｇｅ ｎｅ）、Ｖｏｌ、３３、ｐｐ、１５１−１５８（１９８５）］。 他のデルタ−内毒素の結晶質タンパク質は、Ｂ、ｔ、亜種ソフト（Ｓｏｔｔｏ） から誘導された。この結晶質タンパク質の遺伝情報を指定する遺伝子は、ベクタ ー中でクローニングされ、次いで形質転換したＥ。 ｃｏｌｉ中で発現された。この遺伝子は１４４．０００ダルトンのぺ／チド（９ ３４アミノ酸残基）の遺伝情報を指定する。遺伝子のヌクレオチド配列および対 応するタンパク質のアミノ酸配列は、報告された［Ｙ。 Ｓｈ　ｉ　ｂａｎｏら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）、Ｖｏｌ、３４、ｐｐ、２４３−２ ５］　（１９８５）］　。 他の主要なデルタ−内毒素のタンパク質はＢ、ｔ、のいくつかの亜種により産生 されることが、また、認識された［Ｔ、Ｙａｍａｍｏ　ｔ　ｏ。 バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）、Ｖｏｆ、１０３、Ｎ ｏ、ｐｐ、４１４　４２１　（１９８１）；Ｔ、Ｙａｍａｍｏ　ｔ　ｏら、アー チーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ ｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ） 、Ｖｏｗ、２２７、Ｎ００１、ｐｐ、２３３−２４１　（１９８３）］。この］ デルター内毒は、Ｐ−２として同定され、そしてＢ、ｔ、Ｖａｒ、クルスタキ（ ｋｕｒｓｔａｋｉ）（ＨＤ−１）から分離された。このデルタ−内毒素タンパク 質はほぼ６５．０００ダルトンの分子量を有し、そして鱗翅類および双翅類の昆 虫に対して毒性であることが知られている。対照的に、Ｐ−１は鱗翅順目の昆虫 に対して活性である。今日まで、Ｐ−２タンパク質は分離され、そしである種の 昆虫に対するその活性により特徴づけられてきたが、このタンパク質の遺伝情報 を指定する遺伝子およびそのタンパク質配列は確認しにくいままである。この事 実のため、Ｂ、ｔ、以外の有機体中でこの独特に活性のデルタ−内毒素タンパク 質を発現するあ手段を得ることは不可能であった。クローニングしｆ：、　Ｐ　 −２遺伝子の利用可能性は、Ｂ、ｔ、中のＰ−２タンパク質の産生を増大させ、 そして、また、他のデルタ−内毒素を含有しない異種の有機体におけるＰ−２の 合成を可能とする。 ３．０　発明の要約 本発明は、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒ　ｉｎｇ ｉｅｎｓ　ｉ　ｓ）により産生されたＰ−２デルタ−内毒素、このタンパク質の 遺伝情報を指定する遺伝子のＤ　Ｎ　、Ａ配列およびこのタンパク質組み込んだ 新規な殺虫剤および／またはＰ−２遺伝子で形質転換した有機体に関する。さら に詳しくは、本発明は、Ｐ−２デルタ−内毒素の遺伝情報を指定する遺伝子で、 微生物をクローニングおよび形質転換することに関する。本発明は、Ｂ、ｔ、以 外の有機体において、胞子形成の間に天然のＰ−２産生Ｂ、ｔ、有機体により産 生されるより大きい量で、Ｐ−２デルタ−内毒素の発現を可能とすることにおい て有用である。さらに、本発明は、Ｐ−２毒素の遺伝情報を指定する遺伝子で非 胞子形成性微生物を形質転換するとき有用であり、これによりこのデルタ−内毒 素は微生物の増殖の事実上すべての段階の間産生することができ、これにより胞 子形成の段階の間のみに制限されない。 本発明の追加の目的は、分離された遺伝子により産生される均質なＰ−２タンパ ク質を提供することである。このタンパク質は、胞子形成するまたは非胞子形成 の微生物、例えば、巨大面（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）または Ｅ、ｃｏｌｉまたはＢ、ｔ、の異なる系統を、クローニングしたＰ−２遺伝子で 形質転換する方法によって産生ずることができる。この方法は、適当な宿主およ びベクターの選択のおかげで、ｐ−２デルタ−内毒素の高い収率の産生を可能と し、こうしてＰ−２毒素の実質的に均質な、すなわち、天然のＢ、ｔ、宿主中の Ｐ−２毒素とともにあるいはと同時に典型的に産生されるデルタ−内毒素の他の 変異型による汚染がない、調製を誘導することが可能である。Ｐ−２タンパク質 および／または形質転換した宿主は、種々の殺虫剤組成物において利用すること ができる。 本発明の他の目的は、Ｐ−２デルタ−内毒素の遺伝情報を指定するＤＮＡで形質 転換した、自然Ｂ、ｔ、宿主以外の有機体を提供することである。この外来の形 質転換した宿主は、より望ましいおよび／または選択的培養条件下に、Ｐ−２デ ルタ−内毒素の産生を可能とする。 本発明の他の目的は、種々のバチルス・スリンギエンンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）中のＰ−２遺伝子の存在の検出に有用なりＮＡプ ローブを提供することである。このＤＮＡは、また、Ｐ−２タンパク質と共通の 相同性を共有するタンパク質の遺伝情報を指定する関連する遺伝子の可能な存在 についての種々の系統のスクリーニング、およびこれらの関連する遺伝子の分離 を可能とする。本発明の上の実施態様のすべては、以下の本発明の説明において より詳しく説明する。 ４、

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローニングしたＰ−２遺伝子を含有する、組み換え体プラスミドｐ ＥＧ２０１およびｐＥＧ２０４の制限地図である。Ｐ−２遺伝子の転写の位置お よび方向は、大きい矢印で示されている。 第２図は、Ｐ−２遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列および、また、このＤＮＡヌ クレオチド配列により遺伝情報を指定されるｐ−２タンパク質のアミノ酸配列を 示す。 第３図は、３Ａおよび３Ｂから構成されている。３Ａは臭化エチジウム染色した エフハル）　（Ｅｃｋｈａｒｄｔ）ゲルの写真である。Ｂ、ｔ。 の種々の系統中に存在する天然プラスミドを見ることができ、Ｂ、ｔ。 のほとんどはいくつかは天然プラスミドを含有することを示す、３Ｂは、３Ａに 示すプラスミドで放射線的に標識し！；クローニングしたＰ２遺伝子をハイブリ ダイゼーションすることによって作られた、オートラジオダラムの写真である。 ３Ｂが示すように、クローニングしたＰ２遺伝子は、Ｐ２タンパク質を産生ずる ことが知られているＢ、ｔ、の３つの系統（ＨＤＩ−ＩＳＨＤ２６３−１および ＨＤ２７８）においてＩＩＯＭＤａのプラスミドに広範にハイブリダイゼーショ ンした。クローニングしたＰ２遺伝子は、また、３０ＭＤａのＤＮＡバンドにハ イブリダイゼーションした（３Ｂ）。 第４図は、４Ａおよび４Ｂから構成されている。４Ａは、系統ＨＤＩ−１からの Ｈｉｎｄｌ１１消化したＤＮＡを含有する、臭化エチジウム染色したアガロース ゲルの写真である。４Ａが示すように、Ｈｉｎｄｌｌ＋で消化した合計のＢ、ｔ 、ＤＮＡは、数百の異なる大きさの断片に分割することができた。４Ｂは、４Ａ に示すＨｉｎｄｌｌｌ消化した断片で放射線的に標識したクローニングしたＰ２ 遺伝子をハイブリダイゼーションすることによって作られた、オートラジオダラ ムの写真である。 ４Ｃは、８０℃において４Ｂのニトロセルロースフィルターを再洗浄後作った、 オートラジオダラムの写真である。 第５図は、ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルの写真であり、クローニングしたＰ −２遺伝子を収容する巨大面（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の組 み換え体宿主遺伝子が、真性のＰ−２毒素のそれと同様な大きさを有するタンパ ク質を大量に合成することを示す。 第６図は、Ｐ−１毒素およびＰ−２８素のアミノ酸配列の間の相同性の領域を示 す。 ５．０　発明の説明 一般に述べると、本発明は、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉ］！ｕｓ　 Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のＰ−２デルタ−内毒素または毒素の遺伝情報を 指定ｔ２、そして第２図に示すＤＮＡヌクレオチド配列からなるクローニングし た遺伝子を提供する。この遺伝子（これはヌクレオチド鎖がお互いに相補的な塩 基配列を有する、二本鎖ＤＮＡからなる）は、アミノ酸配列が第２図に示されて いる、Ｐ−２毒素のアミノ酸配列を有するタンパク質（または、また、ポリペプ チドとしてここで等しく使用する）の遺伝情報を指定する。クローニングした遺 伝子によりエンコードされるＰ−２毒素は、鱗翅類および双翅類の昆虫に対して 殺虫活性を有する。 Ｐ−２毒素を産生ずる方法は、また、本発明により提供される。この産生方法に おいて、Ｐ−２デルタ−内毒素をクローニングしたベクターまたはプラスミド中 に挿入し、次いでこれを利用して選択した微生物を形質転換する。 ここに記載されているクローニングしたベクターは、一般に、この分野において 知られており、そして商業的に入手可能である。特定のプラスミドは、当業者の 技量の範囲内であり、そしてその人の選択事項である。本発明において適当なプ ラスミドは、例えば、ｐＢＲ３２２、Ｂ。 ｔ、から誘導されたプラスミド、バチルス（Ｂａｃｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）から！導さ れた微生物でありそして、好ましくは、巨大面（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅ ｒｉｕｍ）のようなものである。本発明とともに使用するのに適当な微生物は、 胞子形成性微生物および非胞子形成性微生物の両者、例えば、Ｅ、ｃｏｔ　ｉ、 Ｂ、ｔ、および巨大面（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅπａｔｅｒｉｕｍ）である。利 用する微生物は、また、この分野において知られており、そして一般に入手可能 である。本発明の実施において使用する特定の微生物の選択は、または、個人の 好みの事項である。本発明の好ましい実施態様において、微生物は巨大面（Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。 一般に述べると、Ｐ−２毒素タンパク質は、形質転換した有機体により産生され 、そして次いで第２図に示すアミノ酸配列を有する均質な調製物に精製される。 さらに詳しくは、このタンパク質は、微生物をＰ−２遺伝子で形質転換し、形質 転換した微生物を増殖させ、これによりＰ−２遺伝子により遺伝情報を指定され るタンパク質を微生物中で発現し、そしてタンパク質を有機体から標準のタンパ ク質精製技術により抽出することによって産生ずることができる。まｔ；、タン パク質を形質転換した微生物から分離しないが、この有機体を、発現したＰ−２ 毒素を含めて、殺虫剤組成物として、あるいはその中で利用することは、本発明 の範囲内である。 本発明は、また、Ｂ、ｔ、Ｐ−２毒素および適当な担体からなる、鱗翅類および 双翅類に対して使用するための、新規な殺虫剤（ｉｓｅｃｔｉｃｉｄｅ）を提供 する。Ｐ−２毒素は、有機体中に含有されるが、あるいは胞子の一部として、あ るいは均質なタンパク質調製物であるが、あるいは胞子と培養した形質転換した 有機体との混合物であることができる。Ｐ−２毒素は、また、非胞子形成性微生 物または胞子形成性微生物、例えば、巨大面（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅ ｒｉｕｍ）またはＢ、ｔ、中に含有されることができる。適当な担体は、当業者 に知られているある数の固体または液体のいずれの１つであるすることもできる 。 本発明は、また、Ｐ−２遺伝子を含む組み換え体またはプラスミドおよびこの遺 伝子で形質転換した特定の微生物からなる。さらに、本発明は、また、Ｐ−２デ ルタ−内毒素の遺伝情報を指定する遺伝子のためのオリゴヌクレオチドプローブ を提供する。本発明のこれらの面は、下に詳細に説明し、そして下の実施例にお いて例示する。 ５．１　組み換え体および技術および遺伝子の発現一般に述べると、組み換え体 ＤＮＡ技術は、特定のＤＮＡ配列をＤＮＡベヒクル（プラスミドまたはベクター ）中に挿入して、宿主細胞中で複製することができるキメラＤＮＡ分子を形成す ることを包含する。挿入されるＤＮＡ配列は、典型的には、受容体宿主に対して 外来である、すなわち、挿入されるＤＮＡ配列およびＤＮＡベクターは性質が遺 伝情報を交換しない有機体から誘導されるか、あるいは挿入されるＤＮＡ配列は 完全にまたは部分的に合成的につくることができる。近年、組み換え体ＤＮＡ分 子の構成を可能とするいくつかの一般的方法は開発された。 例えば、米国特許第４．２３７，２２４号（ＣｏｈｅｎおよびＢｏｙｅｒ）は、 制限酵素を使用しそして結合（］　ｉｇａｔ　１ｏｎ）として知られている、こ のようなプラスミドの産生を記載している。次いで、これらの組み換え体プラス ミドを、形質転換により単細胞の有機体中に導入しそして複製する。その中に記 載されている技術の一般的応用の、ｔこめ、米国特許第４，２３７，２２４号は 本発明の明細書中に引用によって加える。 構成のために使用される方法に無関係に、組み換え体ＤＮＡ分子は、宿主細胞と 適合性でなくてはならない、すなわち、宿主細胞中で自律的に複製することがで きなくてはならない。組み換え体ＤＮＡ分子は、また、そのように形質転換した 宿主細胞の選択を組み換え体ＤＮＡ分子により可能とする、マーカー機能ををす べきである。さらに、適切な複製、転写および翻訳のシグナルのすべてがキメラ ＤＮＡ分子上に正しく配置されている場合、外来遺伝子は形質転換した細胞およ びそれらの子孫において発現されるであろう。 これらの異なる遺伝シグナルおよび地理の事象は、遺伝子の発現の多くのレベル 、すなわち、ＤＮＡの転写およびメツセンジャーＲＮＡの翻訳を制御する。ＤＮ Ａの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を命令し、これにより転写を促進するＤ ＮＡ配列である、プロモーターの存在に依存する。 原核細胞中のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の転写は、適切な原核細胞の シグナルの存在に依存する。原核細胞、例えば、Ｂ、ｔ−中のｍＲＮＡの効率よ い転写は、ｍＲＮＡ上のシャイン・ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ　Ｄａ　Ｉｇｒｎｏ ）（ＳＤ）配列と呼ばれるリポソーム結合部位を必要とする。この配列はｍＲＮ Ａの短いヌクレオチド配列であり、タンパク質のアミノ末端メチオニンをエンコ ードする出発コドンの前に位置する。ＳＤ配列は１６５　ＲＮＡ（リポソームの ＲＮＡ）の３′末端に対して相補的であり、そして多分ｍ　ＲＮ　、Ａと二本鎖 となることによってリポソームへのｍＲＮＡ結合を促進して、リポソームの正し い位置決め可能とする［ＲｏｂｅｒｔｓおよびＬａｕｅｒ、１９７９、メソッズ ・インーエンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、旦 ８：４７３］。 特定の遺伝子のクローニングに広く使用される１つの方法は、組み換え体プラス ミドの「ライブラリー」を調製することである。組み換え体プラスミドの各々は 、通常それを収容する細胞に対して抗生物質の抵抗性を与える、プラスミドベク ターと、遺伝子を含有するする有機体である、供与体有機体からのＤＮＡの断片 から構成されている。プラスミドのライブラリーは、プラスミドベクターおよび 供与体有機体からの合計のＤＮＡの両者を、制限酵素で消化し、酵素を不活性化 し、そしてＤＮＡ混合物を結合することによって調製する。この結合したＤＮＡ はプラスミドのライブラリーである。ライブラリー中の組み換え体プラスミドの 少なくとも１つは、問題の遺伝子がその上に存在する供与体有機体からのＤＮＡ の断片を含有する、傾向が強い。プラスミドのライブラリーを、遺伝子を含有し ない宿主有機体の細胞中に形質転換する。宿主細胞は選択的培地上に広げ、これ は通常抗生物質を含有し、この抗生物質は組み換え体プラスミドを含有する、形 質転換した細胞のみをコロニーに増殖できるようにさせる。個々の形質転換した 宿主コロニーは、供与体有機体からの遺伝子の獲得について試験する。宿主コロ ニーにおいて、獲得した遺伝子は組み換え体プラスミド上に支持される。 遺伝子の獲得について試験する最も直接の方法の１つは、遺伝子特異的ハイブリ ダイゼーションプローブ、すなわち、遺伝子に対して相同性であるＤＮＡの断片 を使用することである。相同性ＤＮＡ断片の特徴は、ｔｙｅがハイブリダイゼー ションの間にお互いに％ｍ結合することである。典型的には、放射線標識しｆ− Ｄ　Ｎ　Ａプローブをハイブリダイゼーションの間に使用し、こうして遺伝子へ のグローブの結合を容易に監視することができるようにする。 分子生物学的における最近の進歩は、遺伝子特異的プローブとして合成オリゴヌ クレオチドを使用することである。オリゴヌクレオチドを使用する基準は、すべ ての生物学的系において、ヌクレオチドの特定の配列はアミノ酸の精確な配列を エンコードすることである。逆に、アミノ酸の配列が特定のタンパク質について 知られているとき、そのタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列は、精確 にではないが、推定することができる。実際に、あるタンパク質の部分的アミノ 酸配列、すなわち、問題の遺伝子の産生物、は化学的方法により決定することが できる。 タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロー ブが合成され、このプローブは、変化する程度に、遺伝子に対して相同性である ことができる。精確な相同性は保証することができない。なぜなら、あるタンパ ク質のアミノ酸配列の知識は、そのタンパク質をエンコードする遺伝子のヌクレ オチド配列の精確な知識を事実与えるからである。それにもかかわらず、オリゴ ヌクレオチドプローブと遺伝子との間の相同性が精確でないことがあるが、オリ ゴヌクレオチドグローブを遺伝子に特異的に結合させる、ハイブリダイゼーショ ンの条件は通常発見することができる。 したがって、Ｐ−２遺伝子の分離において、Ｐ−２タンパク質はバチルス・スリ ンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｖａｒ、ｋｕ ｒｓｔａｋｉの供与体系統から精製し、モしてＰ−２タンパク質の部分的アミノ 酸配列が決定された。Ｐ−２遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、Ｐ− ２タンパク質のアミノ酸配列に基づいて合成した。オリゴヌクレオチドを放射線 的に標識し、そしてハイブリダイゼーションの実験において使用して、供与体Ｂ 、ｔ、系統からのＰ−２遺伝子を有する組み換え体プラスミドを収容する、形質 転換した宿主コロニーを同定した。 ５．２　バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ ｎｓｉｓ）系統ＨＤ２６３−１からのＰ−２毒素遺伝子のクローニング さらに詳しくは、本発明のＰ−２毒素遺伝子をクローニングするために、親系統 ＨＤＩから直接誘導した単一のコロニー分離物である、系統ＭＤＩ−１の細胞（ Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、、Ｃｏｔｔｏｎ　Ｉｎ５ｅｃｔＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｕｎｉｔｓ テキサス州７８５２０ブラウンスビレ）を０２培地（１％のグルコース、０．２ ％のペプトン、０．５％のＮＺ　アミン　Ａ、０．２％酵母エキス、１５ミリモ ルの（ＮＨ４）２Ｓｏ、、２３ミリモル（’）　Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏイ２７ミリーＥ −ル（７）Ｋ２ＨＰＯ４％　１　ミＩＪモルののＭｇ５ｏ４−７Ｈｚｏ、６００ μｍのＣａＣｌ２．１７．ｃ＋ｍ６’）ＺｎＳ０４−７Ｈ，０，１７μｍのＣｕ ５Ｏａ・５Ｈ２０−２μｍのＦｅ５０．・７Ｈ，Ｏ）中で３０℃においてｔ７２ （時間）まで増殖し、そして胞子および結晶を遠心により収穫した。胞子／結晶 の沈澱物を数回の交換の１モルのＮａＣｌで洗浄し、次いで数回の交換の水で洗 浄した。毒素のタンパク質は、胞子／結晶の調製物を５％のＢ−メルカプトエタ ノール、２％のＮａＤｏｄｅＳＯａ、６０ミリモルのトリス　ｐＨ６，８，１０ ％のグリセロール中で７０℃において７０分間インキュベーションすることによ って可溶化し、そして胞子を遠心により除去した。上澄み液を、ＮａＤｏｄｅＳ Ｏ，を含有するポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した。ゲルをクーマツ シー（Ｃｏ　ｏｍａ　ｓ　ｓ　ｉ　ｅ）ブルー染料で染色し、モしてＰ−２タン パク質を含有するゲルのスライスをカミソリの刃で切断した。均質なＰ−２タン パク質の調製物をゲルのスライスから電気溶離し、そして、アセトンで沈澱させ た後、Ｐ−２タンパク質のＮＨ。 −末端アミノ酸配列は、アプライド・バイオシステムス（ＡＩ）ｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）気相配列決定装置（４７０Ａりで実施した自動化エドマン （Ｅｄｍａｎ）分解により決定し、そして１０４０ダイオードの列の検出装置を もつヘラレット−バラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅ　ｒｄ）ＨＰＬＣに おいてデュポンのゾルパックス（Ｚ。 ｒｂａｘ）ＣＩ８カラムで分析した。均質なＰ−２タンパク質のＮＨ。 末端部分のアミノ酸配列は、次のとおりであると決定された：ＭＥＴ　ＡＳＮ　 ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＬＥＵ　ＡＳＮ　ＳＥＲＧＬＹＡＲＧ　ＴＨＲＴＨＲＩＬＥ　 ＡＳＮ　ＡＳＰ　ＡＬＡ　ＴＹＲＡＳＮ　ＶＡＬ　ＶＡＬ　ＡＬＡ　ＨＩＳ　Ａ ＳＰ　ＰＲＯＰＨＥＳＥＲＧＬＹ ５．３Ｐ−２遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブＰ−２タンパク質のＮＨ，− 末端のアミノ１２３４〜２４をエンコードする６２マーのオリゴヌクレオチドプ ローブを、アプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ）ＤＮＡ配列決定装置（３ｇＯＡ型）で合成した。コドンの同義性（ある種 のアミノ酸は各々いくつかのわずかに異なるコドンによりエンコードされる）た め、合成オリゴヌクレオチドの配列は多分Ｐ−２遺伝子の実際のＮＨ２−末端配 列から異なるであろう。しかしながら、Ｂ、ｔ、ゲノムが６８％のＡ：Ｔであり 、そして精確にクローニングされかつ配列決定されたＢ、ｔ。 遺伝子についてのコドン使用の情報を、Ｐ−２遺伝子の実際の配列と最高に一致 する可能性を有するであろう、オリゴヌクレオチドプローブの設計において使用 した。オリゴヌクレオチドプローブは、Ｐ−２遺伝子のＮＨ，−末端の解読領域 のみに結合するように設計した。Ｐ−２遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロー ブの配列は、次のとおりであった：５’　ＧＴＡ　ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＴＣＡ　Ｇ ＧＡ　ＡＧＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　Ａ ＡＴ　ＧＴＡ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＣＡＴ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＴＴ−３’。 ここにおけるＰ−２遺伝子の本来の分離が可能あることに加えて、このグローブ のＤＮＡプローブは本発明の他の好ましい実施態様からなる。 このＤＮＡプローブは、Ｐ−２遺伝子（または可能ならば関連する遺伝子）が天 然に存在するかどうか、あるいは特定の形質転換した有機体がＰ−２遺伝子を含 むかどうかを決定するための、Ｂ、ｔ、系統のスクリーニングを可能とする。こ の方式において、また、Ｂ、ｔ、のその系統の殺虫活性を推定することが可能で ある。また、本発明の範囲内で、このプローブはより小さいか、あるいはより大 きいプローブからなることができる。このプローブは、任意の数のこの分野にお いて知られている技術（例えば、放射線まｌ；は酵素で標識した）により、後述 するように標識することができる。 ５．４Ｐ−２遺伝子について濃縮したプラスミドライブラリーの構成オリゴヌク レオチドプローブを使用して、Ｐ−２遺伝子の少なくともＮＨ２−末端解読領域 を含有するするＢ、ｔ、ＤＮＡの制限断片の大きさを決定した。この決定のため に、親系統ＨＤ２６３から直接誘導した単一のクローンの分離物であるＨＤ２６ ３−１　（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ、　、Ｃｏｔｔｏｎ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｕｎｉｔ、テキサス州７８５２０ブラウンスビレ）および親系統ＨＤ−１か ら直接誘導した単一のコロニー分離物である、系統ＨＤＩ−１（Ｕ、Ｓ、Ｄ、Ａ 、　、Ｃ。 ｔｔｏｎ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｕｎｉｔ、テキサス州７８５２０ ブラウンスビレ）を、ＤＮＡ源として使用した。これらの系統の両者は、Ｐ−２ 結晶タンパク質を産生ずることが知られていた。Ｐ−２結晶タンパク質を産生じ ないＢ、ｔ、系統ＥＧ２１５８およびＨＤ５６７を、陰性の対照として使用した 。 ＤＮＡを、ＬＢ培地中で３０°Ｃにおいて中央一対数期まで細胞を増殖した後、 種々の供与体系統から分離した。細胞を収穫により収穫し、５０ミリモルのトリ スＭＣＩ　ｐＨ７，８、ｉｏミリモルのＥＤＴＡ、１ｍｇ／ｍＱのリゾチーム中 に再懸濁し、モして３７°Ｃにおいて６０分間インキュベーションした。細胞を ＮａＤｏｄｅＳＯ４の添加により０゜２％の最終濃度に溶菌した。細胞のリゼイ トを２回等しい体積のフェノールで、そして１回等しい体積のクロロホルム／イ ソアミルアルコール（２４／ｌ）で抽出した。ｌ／ｌ　０体積の３モルの酢酸ナ トリウムおよび２体積のＥｔＯＨをリゼイトに添加し、そしてＤＮＡをガラス棒 でスプーリングすることによって抽出した。スプーリングしたＤＮＡを６６％の ＥｔＯＨ中で５分間、モしてジエチルエーテル中で１分間ソーキングした。スプ ーリングしたＤＮＡを空気乾燥し、そして脱イオン水中に再懸濁した。 ハイブリダイゼーション実験は、供与体の各々からの合計のＤＮＡをＨ４ｎｄｌ ｌｌ制限酵素で消化し、消化したＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動し、そし てＤＮＡをアガロースゲルからニトロセルロースノフィルターヘサザンのプロッ ト技術により移すことによって実施した［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．ＢｉＯ］、）、９８：５０３−５１７．１９７８］、 ニトロセルロースのフィルターを３２℃において次の溶液中で１６時間インキュ ベーションした：３ＸＳＳＣ（ｌｘｓｓｃ−０，１５モルのＮａＣＩｌｏ、０１ ５モルのクエン酸ナトリウム）、０．１％のＮ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　ｅ　Ｓ　Ｏ１ ％　２００　／’　ｇ　／ｍＱのヘパリン、１０×デンハルト溶液（１ｘ−０， ０２％のウシ血清アルブミン１０．０２％のフィコール（Ｆ　ｉｃｏ　１１）１ ０．０２％のポリビニル−ピロリドン）、ガンマ−Ｐ３２−ＡＴＰおよびＴ４キ ナーゼで放射線標識したＰ−２遺伝子特異的オリゴヌクレオチドグローブのほぼ ｌｐｇを含有する。ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロースのフィルター を３ＸＳＳＣ，Ｏ，１％のＮａＤｏｄｅＳＯ４で３２℃において１時間洗浄し、 そしてフィルターをＸ線フィルムに露出した。得られる芽−トラジオグラムは、 オリゴヌクレオチドプローブが系統ＨＤ２６３−１からのほぼ９．０および５． ０ｋｂのＤＮＡの２つのＨｉｎｄｌｌｌ断片に特異的にハイブリダイゼーション したことを示した。グローブは系統ＨＤＩ−１からのＤＮＡの明らかに同一の９ ．０および５゜ＯｋｂのＨｉｎｄｌｌＩ断片にハイブリダイゼーションした。プ ローブは、Ｐ−２結晶タンパク質を合成しないＢ、ｔ、の２つの系統、ＥＧ２１ ５８およびＨＤ５６７からのＤＮＡの制限断片にハイブリダイゼーションするこ とができなかった。 ２つのＨｉｎｄｌｌｌ断片、９．０および５．０ｋｂのうちどれが、オリゴヌク レオチドプローブに最も強くハイブリダイゼーションするかを決定することは必 要であった。なぜなら、最も強くハイブリダイゼーションする断片はＰ−２遺伝 子を含有する可能性が最も強いであろうからである。ハイブリダイゼーションの 強度は、プローブがニトロセルロースのフィルター上でＤＮＡ断片に結合して止 まる最高の洗浄温度により測定する。したがって、ニトロセルロースのフィルタ ーは３ｘＳＳＣ。 ０．１％のＮａＤｏｄｅＳＯｍ中で漸進的により高い温度で反復して洗浄し、洗 浄の各々はオートラジオグラフィーにより追跡し、これは温度が放射線プローブ がもはや９．０ｋｂの断片にハイブリダイゼーションしないが、もっばら５．０ ｋｂのバンドヘハイブリダイゼーションするように見える温度（５０℃）に到達 するまで実施した。したがって、Ｐ−２遺伝子の少なくともＮＨ，−末端解読領 域が系統ＨＤ２６３−１およびＭＤＩ−１からの５．０ｋｂのＨ４ｎｄｌ　Ｉ　 Ｉ断片上に存在することを決定した。 Ｐ−２遺伝子が＆縮したプラスミドのライブラリーは、ＨＤ２６３−１の合計の Ｈｉｎｃｌｌｌｌ　″消化し、消化したＤＮＡをアガロースゲル上で電気泳動し 、そしてほぼ４．０〜６．０ｋｂの大きさの範囲のＨｌｎｄｌＩＩ　ＤＮＡ断片 を含有するゲルのスライスを切除することによって構成した。４．０−６．０ｋ ｂの大きさの範囲ＨＤ２６３　１Ｈｉｎｄｌｌｌ断片を、アガロースゲルのスラ イスから電気溶離し、フェノール＋クロロホルムで抽出し、エタノール沈澱し、 そしてプラスミドｐＢＲ３２２（Ｈｉｎｄｌｌｌで消化し、そしてアルカリ性ボ ス７アターゼで処理した）のＨｉｎｄｌ１１部位中に結合しｊ；。アルカリ性ボ スファターゼは、ｐＢＲ３２２＋ＨＤ２６３−１のＤＮＡのＨ４ｎｄｌ１１断片 から成る組み換え体プラスミドが形成する可能性を大きく増加しＩ；。 得られる結合混合物は、撹拌ＨＤ２６３−１からのＰ−２毒素遺伝子について濃 縮された組み換え体プラスミドのライブラリーから成っていた。 Ｐ−２遺伝子が濃縮したプラスミドのライブラリーを、ＣａＣ］、の手順により 、Ｅ、ｃａｄｉ、ＨＢＩＯＩのアンピシリン感受性宿主菌株［ベセスダ・リサー チ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ）、ミゾリー州ベセスダ］中に形質転換した。Ｅ、ｃｏｌ　ｉ、ＨＢＩＯ Ｉ菌株はＰ−２タンパク質を合成せず、Ｌ２二がって、Ｐ−２遺伝子を含有する ことが期待されないであろう。 Ｅ、ｃｏｌｉは、これらの細胞が組み換え体プラスミドで容易に形質転換される ので、宿主菌株として使用した。組み換え体プラスミドを獲得するすべての宿主 細胞は、アンピシリン耐性となるであろう。組み換え体プラスミドへ暴露した後 、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主細胞をアンピンリンを含有する固体培地上へ広げ、そして組 み換え体プラスミドを収容する細胞はコロニーに増殖することができた。アンピ シリン耐性の宿主コロニーの各々はｐＢＲ３２２＋供与体系統ＨＤ２６３−１の ＤＮＡからの独特ＨｉｎｄＩＩＩ断片から構成された組み換え体プラスミドの多 くのコピーを収容するであろうことが、期待された。しかしながら、組み換え体 プラスミド中の供与体系統Ｈｉｎｄｌｌｌ断片は、コロニー毎に異なるであろう 。 はぼ２．０００の個々のアンピシリン耐性コロニーを、ニトロセルロースのフィ ルター上にプロッティングしｔ；。コロニーの複製を、後述するように後に使用 するために取っておいた。コロニー中に含有される組み換え体プラスミドは、コ ロニーをＮａＯＨおよびＮＨ，アセテートで処理することによってニトロセルロ ースのフィルターへ結合させた。得うレルニトロセルロースのフィルターは１列 の組み換え体プラスミドを含有し、それらの各々は他の組み換え体プラスミドか ら物理学的に分離した。ニトロセルロースのフィルターを５０’Ｃにおいて１６ 時間次の溶液中でハイブリダイゼーションした：３ＸＳＳＣ，２００μｇ／ｍｌ ２（１’）ヘパリン、０．１％のＮａＤｏｄｅＳＯい　１ＯＸ７’ンハルト溶液 およびほぼｌｐｇの放射線標識したｐ−２遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプロ ーブ。フィルターを５０℃において１時間３ＸＳＳＣ％０．１％のＮａＤｏｄｅ ＳＯａ中で洗浄し、そしてＸ線フィルムに露出した。得られるオートラジオダラ ムは、オリゴヌクレオチドプローブが組み換え体プラスミドヘニトロセルロース のフィルターの４つの異なる位置にハイブリダイゼーションしていることを示し た。 オートラジオダラムをコロニーのレプリカと整列させることによって、組み換え 体プラスミドがオリゴヌクレオチドプローブと明らかＩこハイブリダイゼーショ ンしている４つのコロニーを同定することができた。 組み換え体プラスミドを４つのコロニーの各々から抽出した。プラスミドをＨｉ ｎｄＩＩＩで消化し、そしてアガロースゲル上で電気泳動した。４つのプラスミ ドの３つは、ｐＢＲ３２２＋ＨＤ２６３−１の明らかに同一の大きさの５．２ｋ ｂのＨｉｎｄｌＩＩ断片から成っていた。 プラスミドをアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターヘサザンのプロ ット技術により移した。ニトロセルロースのフィルターを放射線標識したオリゴ ヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションし、そしてＸ線フィルムへ露出 した。得られるオートラジオダラムは、オリゴヌクレオチドグローブが３つの組 み換え体プラスミドの各々において５．２ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉの断片にも っばらハイブリダイゼーションしｔ；ことを示した。これらの組み換え体プラス ミド１つ、ｐＥＧ２０１と表示する、をそれ以上の実験および評価のために選択 した。ＰＥＧ２０１を収容するもとのＥ、ｃｏｌｉコロニーはＥＧ１３０４と表 示した。 クローニングした５、２ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ断片はＰ−２遺伝子の少なくとも ＮＨ２−末端解読領域を含有するようであった。５．２ｋｂの断片上のＰ−２遺 伝子の存在は、Ｐ−２タンパク質のＮＨ，−末端をエンコードするクローニング した５、２ｋｂの断片中のある領域について探索するためにＤＮＡ配列決定を使 用して、評価した。２ｋｂより長いＤＮＡ断片を配列決定することは困難である ので、Ｐ−２遺伝子を含有することが期待される５、２ｋｂの断片内のＤＮＡの より小さい断片を同定することが必要であった。したがって、プラスミドｐＥＧ ２０１を種々の制限酵素で消化し、消化したプラスミドをアガロースゲルを通し て電気泳動し、そしてプラスミド制限断片をゲルからニトロセルロースのフィル ターヘブロツティングした。フィルターと放射線標識したオリゴヌクレオチドプ ローブとのハイブリダイゼーションにより、グローブはＤＮＡの１．３ｋｂの５ ａｕ３Ａ制限断片制限具的にハイブリダイゼーションしたことが示された。した がって、１−３ｋｇの断片はＰ−２遺伝子の少なくともＮＨ，−末端解読領域を 含有することが期待された。 １．３ｋｂの断片をｐＥＧ２０１からＤＮＡ配列決定ｃｅｍｐ１８およびｍｐ１ ９［ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ミゾリー州ベセスダ］中にサブクローニングし た。１．３ｋｂの断片のＤＮＡ配列決定により、それはｐ−２タンパク質のＮＨ ，−末端をエンコードするＤＮＡの領域を含有することを明らかにした。これは 結論的に実証するように、供与体系統ＨＤ２６３−１からのクローニングした５ 、２ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ断片はＰ−２遺伝子を含有した。１．３ｋｂの追加の ＤＮＡ配列決定は、Ａｃｃｌ制限部位がＰ−２遺伝子のＮＨ２−末端のメチオニ ンのコドンから１５０ヌクレオチド上流に位置することを示した。このＡｃｃＴ 部位の位置はマーカーとして働いた。それにより、５．２ｋｂの断片中のＰ−２ 遺伝子の位置は後述するように精確に決定することができプニ。 クローニングした５、２ｋｂの断片上のＰ−２遺伝子の転写の位置および方向は 、５．２ｋｂの断片をＡｃｃｌと種々の制限酵素のとの組み合わせで消化するこ とによって決定した。制限断片をアガロースゲルを通して電気泳動し、そしてニ トロセルロースのフィルター上にプロッティングしＩ；。フィルターを放射線標 識したＰ−２遺伝子特異的オリゴヌクレオチドグローブとハイブリダイゼーショ ンすることにより、より大きい５．２ｋｂの断片上の種々の制限断片の位置およ び方向を決定することができた。この知識から、５．２ｋｂの断片上のＰ−２遺 伝子の転写の位置および方向は第１図に矢印で示すように決定された。第１図は ｐＥＧ２０１の制限地図を示す。箱の区域はプラスミドベクターのＤＮＡを意味 する。ｐＢＲ３２２ベクターは開いた箱の区域で示す。水平の線は系統ＨＤ２６ ３−１からのクローニングしたＢ、ｔ、ＤＮＡを意味する。大きい矢印は、Ｐ− ２遺伝子の解読領域を示す。プラスミドｐＥＧ２０４は下に記載する。ｐ−２遺 伝子の長さは、Ｐ−２タンパク質の推定した大きさく６８ＫＤａ）に基づいてほ ぼ１．９ｋｂであると推定された。 ５．７　クローニングしたｐ−２遺伝子のＤＮＡＮＡ配列２遺伝子のすべてまた は少なくともほとんどは、クローニングした５、２ｋｂの断片内の２．２ｋｂの ＡｃｃＴ−Ｈｉｎｄｌｌ＋断片中にを含有するされると、推定された（第１図） 。したがって、２．２ｋｂのＡｃｃＩ−Ｈ１ｎｄｌｌ＋断片は、配列決定ベクタ ーｍｐ１８およびｍｐ１９中にサブクローニングし、そして２．２ｋｂの断片の 完全な配列をサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシ手順により決定した［Ｓａ ｎｇｅｒｘ　Ｆ、、Ｎ１ｃｋｌｅｎ、Ｓ、およびＣｏｕ　ｌ　ｓｏｎ、Ａ。 Ｒ，（１９７７）プロシーデインダス・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、７４　：　 ５４６３−５４６７３゜期待されるように、２．２ｋｂの断片は、Ｐ−２タンパ ク質のためのＮＨ，−末端コドンで開始する、オープンリーディングフレーム（ タンパク質解読領域）を含有した。本発明のＰ−２遺伝子およびｐ−２タンパク 質の推定のアミノ酸配列を含む、２．２ｋｂの断片のＤＮＡ配列は、第２図に示 されている。第２図は、Ａｃｃｒ部位の最初のヌクレオチドで開始しモしてＨｉ ｎｄｌ１１部位の最後のヌクレオチドで終わる、２．２ｋｂのＡｃｃＩ−Ｈｉｎ ｃｌｌｌＩの完全なりＮＡ配列を示す。ＡｃｃＬ部位はｐ−２遺伝子のＮＨ，− 末端メチオニンのコドンから１５０ヌクレオチド上流に位置する。Ｐ−２遺伝子 配列から推定した、Ｐ−２タンパク質の大きさは、６６．５４７ダルトンであっ た。 ５．８．Ｉ　Ｐ−２遺伝子を含有する自然Ｂ、ｔ、プラスミドの同定クローニン グしたＤＮＡ配列の１つの利点は、それを使用してＤＮＡの特徴づけしない試料 中の関連するＤＮＡ配列を同定することができるということである。Ｐ−２遺伝 子の場合において、今回、クローニングした遺伝子を使用して、Ｂ、ｔ、の系統 中のＰ−２遺伝子の存在を検出することが可能である。Ｂ、ｔ、のほとんどの系 統は、染色体のＤＮＡに加えて多数の天然プラスミドを含有する。これらの系統 の多くについて、染色体上またはプラスミドの１つ上にＰ−２遺伝子が存在する かどうかは知られていない。 クローニングしたＰ−２遺伝子を使用して天然Ｂ、ｔ、宿主系統中のＰ−２遺伝 子の位置を検出することができるかどうかを決定するために、Ｂ、ｔ、系統ＨＤ ２６３−１、ＨＤＩ−１，ＨＤ５６７およびＨＤ２７８をエフハルト（Ｅｃｋｈ ａｒｄｔ）の手順［Ｅｃｋｈａ　ｒｄ　ｔ、”ｒ。 （１９７８）プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）ｌ　：５８４−５８８１により溶菌 し、そしてリゼイトをアガロースゲルを通して電気泳動した。この手順は特定の 系統中に含有されるすべてのプラスミドの大きさにより分離を可能とした。分離 した血漿をアガロースゲルからニトロセルロースのフィルターに、サザンのプロ ット手順により移した。ニトロセルロースのフィルターを放射線標識した２、２ ｋｂのＡｃｃ　ｌ−Ｈ４ｎｄ　ＩＩ　Ｉ　（Ｐ−２遺伝子）断片とハイブリダイ ゼーションした。ニトロセルロースのフィルターのオートラジオグラフィーによ り、Ｐ−２遺伝子の断片は、Ｐ−２産生性の系統ＨＤ２６３−１％ＭＤＩ−１お おびＨＤ２７８中のほぼｌｌＯＭＤａの１つのプラスミドにもっばらハイブリダ イゼーションすることが明らかにされた（第３図）。クローニングしたＰ−２遺 伝子はＰ−２陰性系統ＨＤ５６７中のいずれのプラスミドへもハイブリダイゼー ションしなかった。したがって、この実験が実証するように、クローニングした Ｐ−２遺伝子は直接の方法で使用して、Ｂ、ｔ。 系統中にＰ−２遺伝子を含有する天然プラスミドを同定することができた。クロ ーニングしたＰ−２遺伝子とのＤ　Ｎ　、Ａのハイブリダイゼーションは、Ｂ、 ｔ、中に存在する多くのこのようなプラスミドの中からＰ−２遺伝子を支持する 単一のプラスミドの直接の同定を可能とした。 ５．８．２　Ｐ−２遺伝子を含有するＤＮＡ制限断片の同定Ｂ、ｔ、系統ＨＤ２ ６３−１からのクローニングしたＰ−２遺伝子は、ＤＮＡの５．２ｋｂのＨｉｎ ｄｌＩＩ断片上に含有されていた。クローニングしたＰ−２遺伝子を使用して、 Ｐ−２遺伝子を含有する同様なりＮＡの制限断片をＢ、ｔ、の他の系統から同定 することができるかどうかを決定するために、ある方法を実施した。したがって 、試験系統ＨＤ１−１．ＨＤ２７８、ＨＤ５６７およびもとの供与体系統ＨＤ２ ６３−１からの合計のＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩｍ限酵素で消化し、消化したＤＮ Ａをアガロースゲルを通して電気泳動し、そして消化したＤＮＡをゲルからニト ロセルロースのフィルターへ移した。フィルターを５５℃において放射線標識し た２、２ｋｂのＡｃｃＩ−ＨｉｎｄｌｌｌのＤＮＡ（Ｐ−２遺伝子）断片とハイ ブリダイゼーションしそして、５５℃において洗浄した後、フィルターをＸ線フ ィルムに露出した。 第３図（３Ａ）は臭化エチジウム染色したエフハルト（Ｅｃｋｈａｒｄｔ）ゲル の写真である。Ｂ、ｔ、の種々の系統中に存在する天然プラスミドは見ることが できる。３Ａが示すように、Ｂ、ｔ、のほとんどの系統１まいくつかの天然プラ スミドを含有する。この図面の左の数字は、プラスミドのメガダルトン（ＭＤ＆ ）の大きさを示す。 第３図（３Ｂ）は、放射線標識したクローニングしたｐ−２遺伝子を３八に示す プラスミドとハイブリダイゼーションして作った、オートラジオダラムの写真で ある。３Ｂが示すように、クローニングしたＰ−２遺伝子は、Ｐ−２タンパク質 を産生することが知られているＢ、ｔ、の３つの系統（ＨＤ−１，ＨＤ２６３− １およびＨＤ２７８）において１１０ＭＤａのプラスミドにもっばらハイブリダ イゼーションした。クローニングしたＰ−２遺伝子は、ま？：、３０ＭＤａのＤ ＮＡのバンドにハイブリダイゼーションした（第３図（３Ｂ））。このＤＮＡの バンドは、１１０ＭＤａのプラスミドの破壊から得られたＤＮＡ断片であった。 非常に大きいプラスミド、例えば、１１０ＭＤａのプラスミドは、エフハルト（ Ｅｃｋｈａｒｄｔ）型ゲルを通す電気泳動の間に、より小さい断片にしばしば破 壊する。１１０ＭＤａのプラスミドへのクローニングしたＰ−２遺伝子の特異的 ハイブリダイゼーションは、系統ＨＤ−１，ＨＤ２６３−１およびＨＤ２７８に ついて、１１０ＭＤａのプラスミドのみがＰ−２遺伝子を有することを示す。ク ローニングしたＰ−２遺伝子は、Ｐ−２タンパク質を産生じない系統（ＨＤ５６ ７）からのいずれのプラスミドにもハイブリダイゼーションしなかった。全体的 に、第３図（３Ａおよび３Ｂ）が実証するように、クローニングしたＰ−２遺伝 子は天然Ｂ、ｔ、プラスミド上のＰ−２遺伝子の同定のための特異的プローブと して使用することができる。 第４図（４Ａ）は、系統ＭＤＩ−１（レーン２）、ＨＤ５６７　（レーン３）、 ＨＤ２７８　（レーン４）およびＨＤ２６３　１　（レーン５）からのＨｉｎｄ ｌｌ＋消化したＤ　Ｎ　、Ａを含有する、臭化エチジウム染色したアガロースゲ ルの写真である。第４図（４Ａ）が示すように、Ｈｉｎｃｌｌｌｌで消化した合 計のＢ、ｔ、ＤＮＡは数百の異なる大きさの断片に分割された。１としるすレー ンは、Ｈ４ｎｄｌｌｌで消化したラムダＤＮＡを含をした。これは大きさのマー カーとして働く。左の数字は、ＤＮＡ断片の大きさをキロ塩基（ｋ　ｂ）で示す 。 第４図（４Ｂ）は、放射線標識したクローニングしｆ：、　Ｐ　−２遺伝子を４ Ａに示すＨ４ｎｄｌｌｌ断片とハイブリダイゼーションすることによって作った 、オートラジオダラムの写真である。全体的に、第４図（４Ａおよび４Ｂ）が実 証するように、クローニングしたＰ−２遺伝子はＰ−２遺伝子を含有するＤＮＡ ＴＡ＠断片の同定のだめの特異的プローブとして使用することができる。 オートラジオグラフィーが示すように、期待したように、クローニングしたｐ− ２遺伝子はＨＤ２６３−１からの５．２ｋｂのＨｉｎｄｌＩＩ断片にハイブリダ イゼーションした（第４図（４Ｂ）レーン５）。驚くべきことには、Ｐ−２遺伝 子は、また、系統ＨＤ２６３−１からの９゜０ｋｂ（７）Ｈｉ　ｎｄ　１１１断 片にハイブリダイゼーションした（第４図（４Ｂ）、レーン５）。Ｐ−２遺伝子 は、系統ＨＤ　ｌ　−１における５、２および９．ＯｋｂのＨｉｎｄｌｌＩ断片 に（第４図（４Ｂ）、レーン２）、および系統ＨＤ２７８における５、２および ４．４ｋｂのＨｉｎｄｌｌＩ断片に（第４ｉＥ（４Ｂ）、レーン４）ハイブリダ イゼーションした。 ｐ−２遺伝子は、Ｐ−２陰性系統ＨＤ５６７からのいずれのＨｉｎｄｌＩＩ断片 へもハイブリダイゼーションしなかった（第４図（４Ｂ）、レーン３）。ニトロ セルロースのフィルターを８０℃において再洗浄し、そしてＸ線フィルムに露出 した。得られるオートラジオダラムが示すように、より高い洗浄温度後、標識し たｐ−２遺伝子のプローブの有意により少なくか、５．２ｋｂ断片に比較して、 ９．０および４．４ｋｂの断片に結合した（第４図（４ＣＬ　レーン２．４およ び５）。 上はクローニングしたＰ−２遺伝子のいくつかの好ましい使用を実証する。第１ に、系統ＨＤ２６３−１からのクローニングしｆ−、Ｐ　−２遺伝子は他のＢ、 ｔ、系統からのＰ−２遺伝子を含有するＤＮＡ制限断片を同定するために使用す ることができる。例えば、クローニングしたＰ−２遺伝子は系統ＨＤＩＩからの ２つのＨ４ｎｄＩＩＩ断片にハイブリダイゼーションした。第２に、クローニン グした遺伝子は、特定のＢ。 ｔ、系統中に存在するＰ−２遺伝子の数の決定を可能とする。例えば、系統ＨＤ ２６３−１は、Ｐ−２遺伝子のグローブが系統ＨＤ２６３−１からの２つのＨｉ ｎｄｌｌＩ制限断片にハイブリダイゼーションしたので、２つのＰ−２遺伝子を 含有することが分かった。Ｐ−２遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブが、 また、系統ＨＤ２６３〜１からの９゜０および５．２ｋｂの２つのＨｉｎｄｌｌ ｌ断片にハイブリダイゼーションしたということは、意味があることである。 ９．０ｋｂの断片上のＰ−２遺伝子の精確な性質は、９．０ｋｂの断片が分離さ れ、そしてそのＤＮＡ配列が決定されるまで、知るすることができなかった。こ れはクローニングしたＰ−２遺伝子のための第３の使用に導く。Ｐ−２遺伝子は ９．０ｋｂのＨ４ｎｄｌｌｌ断片に特異的にハイブリダイゼーションしｔ；ので 、クローニングしたＰ−２遺伝子（またはその一部まＩ；は誘導体）はそれゆえ 、この断片の分離のための理想的なプローブである。 第４に、クローニングしたＰ−２遺伝子はＰ−２遺伝子間の関係の急速な定量的 推定を可能とする。例えば、クローニングしたＰ−２遺伝子は、９．０または４ ．４ｋｂのＨｉｎｄｌｌｌ断片のいずれの上に含有されるＰ−２遺伝子へよりも 、系統ＨＤＩ−１の５．２ｋｂの断片上に含有されるＰ−２遺伝子へ関係づけら れることが推定される。この関係は、９．０または４．４ｋｂの断片のいずれへ よりも、５．２ｋｂの断片への８０°ＣにおけるＰ−２遺伝子のグローブのより 強いハイブリダイゼーションにより直接実証された。 ５．９Ｐ−２毒素の追加の精製 Ｐ−２遺伝子は適当なプラスミド中に挿入し、次いでこのプラスミドを利用して 適当な微生物を形質転換することができる。Ｂ、ｔ、以外の微生物をＰ−２遺伝 子の組み込みにより形質転換することができる、すなわち、一般に述べると、バ チルス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およ びシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）ＪｉＥからの微生物を形質 転換することができることは、明らかに本発明の範囲内である。本発明において 、有機体巨大菌（Ｂａｃｊｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）および大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）を使用することが好ましい。また、Ｂ、ｔ、 の異なる系統を、また、Ｐ−２遺伝子の組み込みにより形質転換することができ ることは、本発明の範囲内である。 そのように形質転換した微生物は、好ましくは、Ｂ、ｔ、の天然系統において産 生されるＰ−２の量をはるかに越える量で産生ずるであろう。 形質転換しｊ；有機体により産出されたＰ−２は、好ましくは、唯一のその有機 体により産生されたデルタ−内毒素である。このようにして、有機体それ自体は 単独であるいは殺虫剤組成の一部として利用することができる。Ｐ−２は好まし くはその有機体により産生される唯一の末端であるので、それはこの分野におい て既知の方法、例えば、レッグラフイン密度勾配により他の細胞物質からＰ−２ を精製するための直接の方法である。 ５．１０　植物中へのＰ−２の形質転換まｔ；、Ｐ−２遺伝子（第２図）を植物 中に直接挿入して、植物それ自体がＰ−２毒素を産生ずるようにすることは、本 発明の範囲内である。 植物の遺伝子操作は、Ｐ−２遺伝子を含有する所望のＤＮＡを、種々の形態およ び由来のＤＮＡ分子を使用して、植物の組織または細胞中に導入することによっ て達成することができる。これらはつぎのものを包含するが、これらに限定され ない：天然に産出する植物のベクター、例エバ、アグロバクテリウム・ツメファ シェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのＴ１ プラスミドまたは植物の病原体、例えば、ＤＮＡウィルス、例えば、カリフラ７ アーのモザイク病ウィルス（ＣａＭＶ）またはゲミニウイルス（Ｇｅｍｉｎ　ｉ ｖ　ｉ　ｒｕｓｅ）、ＲＮＡウィルス、およびピロイド（ｖｉｒｏｉｄ）から誘 導されたＤＮＡ分子；不安定な植物ゲノム成分、例えば、細胞器官における染色 体外ＤＮＡ要素（例えば、葉緑体またはミトコンドリア）、または核的にエンコ ードされた制御要素から誘導されｌ：　Ｄ　Ｎ　Ａ分子；安定なゲノム成分（例 えば、Ｄ　Ｎ　Ａを導入して、細胞器官または核のゲノム中に組み込み、そして 複製させ、すなわち、自律的に複製させ、細胞分割および植物の性的再生の間に 通常分離させ、そして植物の連続する世代において遺伝させることができる、複 製の起源および他のＤＮＡ配列）からのＤＮＡ分子。 Ｐ−２遺伝子を含有するＤＮＡは、植物の細胞または組織中に、感染性プラスミ ド、例えば、Ｔｉ１ウイルスまｊ；は微生物、例えば、アグロバクテリウム・ツ メファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リ ポソームの使用、機械的方法よるマイクロ注入および染色体または染色体断片の 使用により、直接供給することができる。 ５．１１Ｐ−２タンパク質を組み込んだ産生物および配合物Ｐ−２デルター内毒 素は、鱗翅類および双翅類の昆虫に対する活性をもつ、効力のある殺虫剤化合物 である。したがって、Ｐ−２タンパク質の毒素を殺虫剤（活性成分）として、単 独で、好ましくは均質または純粋な形態で、および第２図のアミノ酸配列を有す るものを、あるいはクローニングしたＰ　−’　２遺伝子を発現する形質転換し た微生物内にを含めてまたはそれと関連して、あるいはＰ−２を胞子または他の 方法含有するＢ、ｔ、または他の形質転換した胞子形成性微生物の混合物で、利 用することは、本発明の範囲内である。Ｐ−２を含有する本発明の組成物は、殺 虫剤的に有効量で適用され、この量は因子、例えば、抑制すべき特定の鱗翅類ま たは双翅類の昆虫、処置すべき特定の植物、および殺虫剤的に活性な組成物を適 用する方法に依存して変化するであろう。好ましい殺虫剤配合物は、Ｐ−２を単 独でまたは形質転換した微生物中に組み込むか、あるいはそれと関連させて、所 望の担体と混合することによってつくられる。配合物はダストとして、あるいは 油（植物性油または鉱油）中の懸濁液、湿潤性粉末として、あるいは農業上の応 用に適当な任意の他の物質中で、適当な担体アジュバントを使用して、投与する ことができる。適当な担体は、固体または液体であり、そして配合技術において 通常使用する物質、例えば、天然または再生の鉱物物質、溶媒、分散剤、湿潤剤 、粘着付与剤、結合剤または肥料であることができる。 固体まｊ；は液体のアジュバントを含有する配合物は、既知の方法において、例 えば、活性成分を増量剤、例えば、溶媒、固体の担体、およびある場合において 表面活性化合物（界面活性剤）と均質に混合および／または粉砕することによっ て調製する。 適当な液状担体は、植物性油、例えば、ヤシ油、鉱油または水である。 例えば、ダストおよび分散性粉末のために使用する固体の担体は、通常天然の鉱 物繊維、例えば、方解石、タルク、カオリン、アタパルジャイトである。物理学 的性質を改良するために、まＩ；、高度に分散性のケイ酸または高度に吸収性の ポリマーを添加することができる。適当な造粒した吸着性担体は、軽石、破壊し た煉瓦、海泡石、およびベントナイトである。適当な非収着性担体は、シリケー トまたは砂のような物質である。さらに、きわめて多数の予備造粒した物質まＩ ；は無機または有機の混合物、例えば、ことにドロマイトまＩ；は粉砕した植物 残留物を使用することができる。 適当なアニオン性界面活性剤は、水溶性石鹸および水溶性合成表面活性剤である ことができる。 適当な万両は、高級脂肪酸（Ｃ＋ａ　Ｃ＋＋）のアルカリ金属塩類、アルカリ土 類金属類または非置換アンモニウム塩類、例えば、オレイン酸またはステアリン 酸のナトリウム塩またはカリウム塩、あるいは天然の脂肪酸混合物、ヤシ油また はタロウ油から得ることができる混合物である。 さらに適当な界面活性剤は、また、脂肪酸メチルタウリン塩ならびに変性したま たは未変性のリン脂質である。 しかしながら、より頻繁に、いわゆる合成界面活性剤、ことに脂肪族スルホネー ト、脂肪族サルフェート、スルホン化ベンズイミダゾールの誘導体またはアルキ ルアリールスルホネートを使用する。 脂肪族スルホネートまたはサルフェートは、通常、アルカリ金属塩、アルカリ土 類塩まｔ；は非置換アンモニウム塩の形態であり、そして一般にＣ，−Ｃ２□ア ルキル、例えば、脂肪酸から得られｔ；、ドデシルサルフェートのナトリウムま たはカルシウム塩、あるいは脂肪族アルコールサルフェートの混合物のナトリウ ムまＩ；はカルシウム塩を含有する。これらの化合物は、また、脂肪族アルコー ル／エチレンオキシド付加物のスルホン酸エステルおよびスルホン酸の塩類から なる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好ましくは、２つのスルホン酸 基および約８〜２２個の炭素原子を含有する１つの脂肪酸残基を含有する。アル キルアリールスルホネートの例は、次のとおりであるニドデシルベンゼンスルホ ン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸、またはす７タレンスルホン酸／ホルムア ルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウムまたはトリエタノールアンの塩類 。また、対応するホスフェート、例えば、ｐ−ノニルフェノールと４〜１４モル のエチレンオキシドとの付加物のリン酸エステルの塩類は適当である。 非イオン性界面活性剤は、好ましくは、次のとおりである：ポリグリコールエー テル誘導体ま５−は脂肪族またはシクロ脂肪族のアルコールまたは飽和または不 飽和の脂肪酸およびアルキルフェノール、３〜１０個のグリコールエーテル基お よび（脂肪族）炭化水素部分中に８〜２０個の炭素原子およびアルキルフェノー ルのアルキル部分中に６〜１８個の炭素原子を含有する前記誘導体。 他の非イオン性界面活性剤は、ポリエチレンオキシドとアルキルプロピレングリ コールとの水溶性付加物であり、エチレンジアミノポリプロピレングリコールお よびアルキルプロピレングリコールはアルキル鎖中に１−１０個の炭素原子を含 有し前記付加物は２０〜２５０のエチレングリコールエーテル基および１０〜１ ００個のプロピレングリコールエーテル基を含有する。 非イオン性界面活性剤の代表的例は、ノニルフェニルポリエトキシエタノール、 ヒマシ油、グリコールエーテル、プロピレン／ポリエチレンオキシド付加物、ト リブチルフエノキシポリエオトキシエタノール、エチレングリコールおよびオク チルフェノキシポリエトキシエタノールである。ポリオキシエチレンソルビタン の脂肪酸エステル、例えば、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエートは、 また、適当な非イオン性界面活性剤である。 カチオン性界面活性剤は、好ましくは、第四アンモニウム塩であり、これは、窒 素上の置換基として、少なくとも１つのＣ＠　Ｃ２２，アルキル基および、それ 以上の置換基として、低級非置換もしくはハロゲン化アルキルベンジル、または ヒドロキシル価低級アルキル基を含有する。塩は、好ましくは、ハライド、メチ ルすＪレフニーチま！こはエチルサルレフニート、例えば、ステアリルトリメチ ルアンモニウムクロライドの形態である。 ５．１２　コンセンサスデルタ−内毒素タンパク質の相同性コンピューターのサ ーチを実施して、Ｐ−２遺伝子が配列が発表されている他の遺伝子のいずれかに 対して相同性であるがどうかを決定した。 ＤＮＡ配列の相同性は、Ｐ−２遺伝子および他の遺伝子の間で発見されなかった 。しかしながら、驚くべきことには、ある程度の相同性はＰ−２およびＰ−１の タンパク質の間に存在することが発見された。第６図は、Ｐ−１およびＰ−２の タンパク質が約１００アミノ酸のストレッチにわたって３７％の相同性の領域を 共有することを示す。 そうでなければ非相同性のタンパク質内に発見される保存されたアミノ酸の配列 は、タンパク質のための重要なドメインをしばしばシグナルする。第６図に示さ れた保存されたアミノ酸は、ｐ−１およびＰ−２タンパク質の鱗翅類殺幼虫活性 の起因である「活性部位」を構成する。したがって、このタンパク質は、アミノ 酸の組成に影響を及ぼすか、あるいはそれを変化させて、毒性の生ずる変化をよ り特異的に標的するための、部位特異的突然変異誘発実験において実用性を有す る。 この１００アミノ酸のストレッチの重要性は、これらのアミノ酸をエンコードす るＤＮＡの３００ｂｐの断片をサブクローニングすることによって決定すること ができる。この手順は、また、Ｂ、ｔ、、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａ ｔｅｒｉｕｍ）またはＥ、ｃｏｌｉにおいてこのタンパク質を産生ずるための手 段を生ずる。サブクローニングは、部位特異的生体外突然変異誘発を使用して、 この１００アミノ酸タンパク質の遺伝情報を指定するＤＮＡの３００ｂｐ断片を 収容する制限部位をつくることによって達成することができる。次いで、これら の制＠部位を使用して、ＤＮＡ断片を精確に切断することができる。次いで、Ｄ ＮＡ断片を、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）または他の適当なベクター上のプロ モーターまたはリポソーム結合部位から下流に挿入することができるであろう。 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベクターは、それがＰ−２遺伝子それ自体のプロ モーターおよびリポソーム結合部位を含有するように、遺伝子操作することがで きるであろう。次いで、生ずる組み換え体プラスミドを適当なバチルス（Ｂａｃ 　ｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）系統（またはここに記載する他の適当な有機体）中に形質転 換することができ、そして組み換え体系状の殺幼虫活性を測定することができる であろう。形質転換した有機体は、また、このタンパク質を産生ずる手段硫酸ア ンモニウム働くであろう。混合物の形質転換した有機体またはタンパク質それ自 体まｔ；は両者は、Ｐ−２毒素タンパク質と同一の方法で殺虫剤組成物において 利用することができる。 組み換え体プラスミドから合成される１００アミノ酸のポリペプチドはバチルス （Ｂａｃ　ｉ　ｌ　Ｉｕ　ｓ）内のプロテアーゼにより分解することがあり得る 。この潜在的問題を回避するために、バチルス（ＢａｃｉｌＩｎｓ）のプロテア ーゼ陰性系統は、ウォング（Ｗｏｎｇ）ら［Ｗｏｎｇ、Ｓ、　、Ｋａｗａｍｕ　 ｒａ、Ｆ、およびＤｏｔ、Ｒ，，１９８６、ジャーナル・オブ・バタテリオロジ −（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１６８：１００５−１００９］により記載 されているものように発現に使用することができるであろう。 ６．０　実施例 形質転換したまたは非形質転換の巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉ ｕｍ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の殺虫活性は、昆虫 に供給した試験飼料中に種々の量のこれらの微生物を含めることによって決定し た。飼料供給後、昆虫の死亡率を測定した。 詳しくは、これは微生物を固体の寒天基本培地上で３０°Ｃにおいて２日間定常 期まで増殖することを包含した。プラスミドを収容するＥ−ｃ。 ｌ玉について、培地は４０μｇ／ｍＱのアンピシリンを含有するＬＥであった。 プラスミドを収容する巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）につ いて、培地は１０μｇ／ｍＱのテトラサイクリンを含有するＤＳであった。微生 物を固体媒質からスパチュラで引っ掻くことによって収穫しｔ；。湿って重量の 収穫したバクテリアを決定し、そしてバクテリアの細胞を脱イオン水中に既知の 濃度に再懸濁した。懸濁したバクテリア細胞の系統的希釈を行い、そして希釈の 各々の２００ｍｆｆを飼料供給カップ中の３ｍｆｆの固体寒天基準人工飼料に局 所的に適用した。 飼料の上部の表面積を６００ｍｍ”であった。ヘリオチス（Ｈｅｌｉ。 ｔｈｉｓ）の場合において、飼料は大豆粉末を含有し、そしてリマントリア・デ ィスパー（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ　ｄｉｓｐａｒ）について、飼料は麦芽を含有し た。１匹の新生児の幼虫を飼料カップの各々中に配置し、そして死亡率のスコア を７日後つけた。 ＬＣ５０値（幼虫の５０％を殺すために要するバクテリア細胞の重量）を、昆虫 の死亡率のプロビット分析から計算した［Ｒ，Ｊ、Ｄａｕｍ、、プロビット分析 のための２つのコンピュータープログラムの改訂（ＡＲｅｖｉｓｉｏ　ｏｆ　Ｔ ｗｏ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｐｒｏｇｒａｍｓｆｏｒ　Ｐｒｏｂｉｔ　Ａｎａｌｙ ｓｉｓ）ｏＢｕｌｌｅｔｉｎ　。 ｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｏｃ、ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ、Ｖ ｏｌ、１６　（１）、ｐｐ、１−１５１゜ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏ ｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫に標準の飼料を与え、この飼料は種々のプ ラスミドを収容しかつＰ−２遺伝子を有するか、あるいはもたないことが知られ ているＥ、ｃ。 】ｉを添加した。飼料上で７日後、幼虫を成長および生存能力についてスコアを つけ、結果を下表■に報告する。これらの結果から明らかなように、クローニン グしたＰ−２遺伝子は、事実、Ｅ、ｃｏｌｉ、非胞子形成性バクテリアにおいて 発現され、そしてこのクローニングした遺伝子の発現の産生物は、Ｐ−２遺伝子 が存在しないＥ、ｃｏｌｉよりも、ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉ ｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）幼虫に対して、形質転換したＥ、ｃｏｌｉを有意に毒 性とする。 啓上 系統ＥＧ１３０３ （ｐＢＲ３２２、Ｐ−２遺伝子すＬ）　ｌ　Ｏｍｇ／　カップ　２／２゜系統Ｅ Ｇ１３０４ （ｐＥＧ２０１％Ｐ−２遺伝子の存在）ｌｏｍｇ／カップ　２０／２０６．２　 実施例２−巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）中へのＰ−２遺 伝子の形質転換 プラスミドｐＥＧ２０１　（Ｐ−２遺伝子を含有する）は、グラム陰性菌株Ｅ、 ｃｏｌｉにおいてのみ複製するであろう。ｐ−２遺伝子はｐＥＧ２０１を収容す るＥ、ｃｏｌｉ菌株ＥＧ１３０４において発現されたが、低いレベルのみであっ た（参照、バイオアッセイのデータ、表■）。 この実施例の目的は、クローニングレ；Ｐ−２遺伝子が他のバチルス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ）菌株においてより高いレベルで発現されるかどうかを決定することで あった。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株におけるクローニングしたＰ−２遺 伝子の発現について試験するために、まずＰ−２遺伝子を含有しかつバチルス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において複製することができる組み換え体プラスミドを構成 することが、必要である。Ｐ−２遺伝子を含有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ）　−Ｅ、ｃｏｌｉ　ｒシャトルベクター」を構成した。用語「シャトルベクタ ー」は、プラスミドがバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびＥ−ｃｏｌｉの両者 中で複製することができることを示す。Ｅ、ｃｏｌｉ−バチルス（Ｂａｃｉｌｌ ＵＳ）のシャトルベクターを、バチルス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉｕ　ｓ）プラスミ ドｐＢｃ１６　（テトラサイクリン耐性）をＳｐｈ　１で消化し、消化したプラ スミドをｐＥＧ２０１（アンピシリン耐性）のＳｐｈ　１部位中に結合し、そし てＥ、ｃｏｌｉをアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性に形質転換すること によって構成した。 １つのｔｅｔおよびａｍｐ耐性のＥ、ｃｏｌｉ形質転換体は、ｐＥＧ２０１のＳ ｐｈ　１部位中に挿入されたｐＢｃ１６から構成されたプラスミド（ｐＥＧ２０ ４と表示する）を収容した（第１図）。第１図は、プラスミドｐＥＧ２０４の制 限地図を示す。ボックスの領域はプラスミドベクターＤＮＡを意味する。開いた ボックスはｐＢＲ３２２ＤＮＡ（Ｅ、ｃｏｌｉの複製）であり、そして交差ハツ チングしたボックスはｐＢＣ１６ＤＮＡ（バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の複製 ）である。 水平線はＨＤ２６３−１からのクローニングしたＤＮＡである。大きい矢印はＰ −２遺伝子の解読領域を意味する。ｐＥＧ２０４を巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　 ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）（ＡＴＣＣ受託番号ＶＴ１６６０）中に形質転換し、そ してｐＥＧ２０４を収容する１つのテトラサイクリン耐性形質転換体（菌株ＥＧ １３１２と表示する）をそれ以上の研究ために選択した。 この実施例は、クローニングしたＰ−２遺伝子が組み換え体巨大菌（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）菌株ＥＧ１３１２　（ｐＥＧ２０４）中で発現 されＩ；どうかを決定した。遺伝子の発現はＮａＤｏｄｅＳ０４／ポリアクリル アミドゲルの電気泳動の技術により測定した。一般に、この技術は細胞リゼイト の調製％　ＮａＤｏｄｅＳＯａ／ポリアクリルアミドゲルを通す細胞リゼイトの 電気泳動およびタンパク質を可視化するための染色を包含した。 詳しくは、この技術は次のようにして実施した二巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍ ｅｇａｔｅｒｉｕｍ）細胞をｌｏμｇ／ｍｆｆのテトラサイクリンを含有するＤ Ｓ平板上で３０℃において４８時間成長させた。バチルス・スリンギエンシス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）系統は、ＤＳ平板がテトラサ イクリンを含有しない以外、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ）と同様に増殖させた。この期間後、はとんどのすべての細胞は、増殖の定常期 に入った。細胞をスパチュラで収穫し、そして脱イオン水中に懸濁しｔ；。細胞 の懸濁の一部を１＝２体積：体積で予備加熱した（７０℃）のゲル装入緩衝液（ ５％のベーターメルカプトエタノール、２％のＮａＤｏｄｅＳＯい　６゜ミリモ ルのトリスｐＨ６，８，１０％のグリセロール）と混合し、そして７０°Ｃにお いて７分間インキュベーションした。懸濁液を簡単に遠心し、遠心後、上澄み液 を直ちにＮａＤｏｄｅＳＯ，／ポリアクリルアミドゲル上に装入し、そして上澄 み液中のタンパク質をラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）［ジャーナル・オブ・モレキ ュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、８０　：　５７６−５９９ 　（１９７３）］に従いゲル電気泳動により分割した。ゲル中のタンパク質をゲ ルをクーマツシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）染料で染色することによって可視化し た。 第５図はこの分析の結果を示す。第５図は、前述したように調製したＮａＤｏｄ ｅＳＯ，／ポリアクリルアミドゲルの写真である。第５図におけるレーンで標識 した５ＴＮＤは、タンパク質分子量の標準を含有した。ゲルの右への数字はタン パク質の大きさをキロダルトン（ｋＤａ）で示す。レーン標識したＭＤＩ−１は そのＢ、ｔ、系統の抽出物を含有した。Ｐ−２タンパク質に相当するタンパク質 のバンドは、矢印により示す。レーン標識したＰ−２は、精製したＰ−２タンパ ク質の一部を含有した。Ｐ−２タンパク員は、前述したように精製した。 第５図におけるレーン標識したＥＧ１３１］およびＥＧ１３１２は、それぞれ、 ｐＢｃ１６およびｐＥＧ２０４　（Ｐ２）を収容する、これらの巨大歯（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）系統の抽出物を含有した。レーンＥＧ１３ １１およびＥＧ１３１２を比較すると示されるように、系統ＥＧ１３１２　（ｐ ＥＧ２０４）は、大きさがＰ−２タンパク質のそれに相当する主要なタンパク質 を含有した。このタンパク質は系統ＥＧ１３１１　（ｐＢｃ１６）中に存在しな かった。これが実証するように、クローニングしたＰ−２遺伝子を収容する巨大 歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）は、高いレベルのＰ−２タンパ ク質を合成した。さらに、光学顕微鏡で見たとき、系統ＥＧ１３１２の細胞は結 晶毒素に特徴的な相−鮮明なタンパク質の封入体を含有するように思われた 実施した標準の毒性は、系統巨大面（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ）ＥＧ１３１２が、ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓ ｃｅｎｓ）（Ｈ，ｖ、）の幼虫またはりマンドリア・ディスパー（Ｌｙｍａｎｔ ｒｊａ　ｄｉｓｐａｒ）（Ｌ、ｖ、）の幼虫に供給したとき、１．４μｇのバク テリア細胞／昆虫飼料カップのＬＤ５０（幼虫の５０％の死亡）を有した。対照 的に、Ｐ−２遺伝子をもたないプラスミドベクターｐＢＣ１６を収容する巨大歯 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の対照系統は、Ｈ，ｖ、またはり 、ｖ、の幼虫をｌＯμｇのバクテリア細胞／飼料カップの投与量で殺すことがで きなかった。 巨大歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）系統ＥＧ１３１２　（ｐＥ Ｇ２０４−Ｐ−２）を、また、エデス・ニジブチ（Ａｅｄｅｓａｅｇｙｐｔｉ） に対する毒性について試験した。細胞の懸濁液は、系統ＥＧ１３１１　（ｐＢｃ １６−陰性対照）およびＥＧ１３１２をｌＯμｇ／ｍＱのテトラサイクリンを含 有する固体のＤＳ培地上で３０°Ｃにおいて４８時間増殖することによって調製 した。細胞をスパチュラで収穫し、そして細胞を脱イオン水中に再懸濁した。細 胞懸濁液の系統的希釈を行った。エデス・ニジブチ（Ａｅｄｅｓ　ａｅｇｙｐｔ 　ｉ）の２０匹の幼虫（第三または第四齢期）を１００ｍ１２の細胞懸濁液中に 入れ、そして死亡率のスコアを４８時間後につけた。結果（下）が示すように、 系統ＥＧ　ｌ　３１２　（Ｐ−２）は力の幼虫に対して毒性である。対照的に、 ベクタープラスミドｐＢＣ１６単独を含有する巨大歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅ ｇａｔｅｒｉｕｍ）（系統ＥＧ１３１１）は力の幼虫に対して毒性でなかった。 嚢ｌ 投与量−ｍｇ細胞／ｍｆｆ　Ａ　、ａｅｇｙｐｔｉの幼虫＃死亡７含計 ＥＧ１３１１（ｐＢｃ１６対照）　−０−８ｍｇ／ｍｌｌ　Ｏ／　２０ＥＧ１３ １２（ｐＥＧ２０４−Ｐ２） ０．８ｍｇ／ｍＱ　Ｉ　Ｏ／２０ −０．４ｍｇ／ｍ（２１２／２０ −０．２ｍｇ／ｍＱ１０／　２０ −　Ｏ、１ｍｇ／ｍ（１９／　２０ ＥＧ１３１１（対照）　０．９ｍｇ／ｉＱ　Ｏ／２０ＥＧ１３１２（ｐＥＧ２０ ４−Ｐ２） −Ｏ−９ｍｇ／ｍ（１１６／２０ −０．８ＩＩＩｇ／ｍＱｌ　６／２０ −〇、４ｍｇ／ｍ（２１５／２０ −０．２ｍｇ／ｍ（２１２／２０ −０．Ｉｎ＋ｇ／ｍｆｆ　１２／２０ ７．０　微生物の受託 広範な種類の胞子形成性微生物および非胞子形成性微生物の両者を前述したよう にＰ−２で形質転換することができることは、本発明の範囲内である。ここで教 示するように操作することができる微生物の礼あ、バチルス（Ｂａｃｉ　Ｉ　１ ｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ）およびシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏ ｂａｃｔｅｒｉａ）からのものである。 巨大歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）は本発明において使用するのに好ましい。さらに、本 発明ｔこおける使用のまた好ましくかつ列挙したプラスミドを有する次のバチル ス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、巨 大歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）および大腸菌（Ｅ、ｃｏ　１ 　ｉ）は、農業研究培養物収集所（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ）（イリノイ州ベオリ ア）に受託され、そして列挙した受け入れ番号を割り当てられた：ＨＤ　１−１ 　いくつかの天然産出するＢ−１８２０１ＨＤ２６３−１ Ｂ−１８２０２ ＥＧ１３１２　ｐＥＧ２０４ ＥＧＩ　３０４　ｐＥＧ２０１ Ｂ−１８２０４ 本発明は受託された微生物によりその範囲は限定されない。なぜなら、受託され た実施態様は本発明の範囲の１つの面の単一の例示として意図されているからで ある。事ノ、ここに示しかつ説明されているものに加えて種々の変更は、以上の 説明および添付図面から当業者とって明らかとなるであろう。 ３Ａ　３Ｂ 〜−〜＋　Ｎ−〜−〜− α、ＣＬ　ＣＬＣＬ　ＣＬ（Ｌ　０ＬＣＬ　（Ｌ（Ｌゝ細 トＣ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成１年１０月１６ ８ 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１１３２ ２、発明の名称 バチルス・スリンギエンシスＰ−２毒素の遺伝子、タンパク質および関係する殺 虫剤組成物３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国ペンシルベニア州ラングホーン・ギヤポットブールバー ドウェスト２００５名称　エコジエン・インコーホレーテッド４、代理人　〒１ ０７ 電話　５８５−２２５６ ５、補正音の提出年月日 １９８９年７月８日 ６、添付書類の目録 （１）　補正音の写しく翻訳文）　１通さらに、本発明における使用のまた好ま しくかつ列挙したプラスミドを有する次のバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒ＋ｎｇ＋ｅｎｓｉｓ）、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅ ｇａｔｅｒｉｕｍ）および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）は、農業研究培養物収集所（ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１ｔｅｃ ｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ）（イリノイ州ペオリア）に寄託され、そして列挙した受 け入れ番号を割り当てられた：ＨＤ　１−１　イ＜ツカノ天然産出する　Ｂ−１ ８２０１８Ｄ２６３−１　／Ｉ　Ｂ−１８２０２ＥＧＩ　３１２　ｐＥＧ２０４ 　Ｂ−１８２０３本発明は寄託された微生物によりその範囲は限定されない。な ぜなら、受託されｌ；実施態様は本発明の範囲の１つの面の単一の例示として意 図されているからである。事実、ここに示しかつ説明されているものに加えて種 々の変更は、以上の説明および添付図面から当業者とって明らかとなるであろう 。 請求の範囲 １、第２図のＤＮＡ配列を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｐ−２毒素の精製され且つ分離された遺伝子 。 ２、遺伝子は第２図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子である、請求の 範囲第１項記載の遺伝子。 ３、前記タンパク質は殺虫活性を有する、請求の範囲第２項記載の遺伝子。 ４、前記殺虫活性は鱗翅類および双翅類から成る目から選択される昆虫に対して 有効である、請求の範囲第３項記載の遺伝子。 ５、前記ＤＮＡ配列は組み換え体プラスミド中に挿入されている、請求の範囲第 １項記載の遺伝子。 ６、前記プラスミドは前記ＤＮＡ配列の挿入後の微生物の少なくとも２つの異な る種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第５項記載の遺伝子。 ７、前記プラスミドは、前記ＤＮＡ配列の挿入後の微生物の同一種の少なくとも ２つの異なる亜種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第５項記載の遺 伝子。 ８、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、 請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ９、前記ＤＮＡ配列は外来プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、請求 の範囲第１）ｌＪ記載の遺伝子。 １０、工程： ａ）Ｐ−２毒素の遺伝子をプラスミド中に挿入し、前記遺伝子は第２図のＤＮＡ 配列を有し、 ｂ）微生物を工程ａ）のプラスミドで形質転換し、そしてＣ）工程ｂ）の形質転 換した微生物を増殖させ、これにより前記Ｐ−２毒素を前記微生物において発現 させる、からなる、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒ ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｐ−２毒素を産生ずる方法。 １１、前記遺伝子は第２図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝情報を特徴 する請求の範囲第１０”Ｊ記載の方法。 １２、前記プラスミドは、前記Ｐ−２遺伝子の挿入後の微生物の少なくとも２つ の異なる種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第１Ｏ項記載の遺伝子 。 １３、前記プラスミドは、前記Ｐ−２遺伝子の挿入後の微生物の同一種の少なく とも２つの異なる亜種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第１Ｏ項記 載の方法。 １４、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている 、請求の範囲第１Ｏ項記載の方法。 １５、前記ＤＮＡ配列は外米プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、請 求の範囲第１０”Ｊ記載の遺伝子。 １６、前記微生物は非胞子形成性微生物である、請求の範囲第１０項記載の遺伝 子。 １７、前記微生物は胞子形成性微生物である、請求の範囲第１０項記載の方法。 １８、Ｐ−２毒素は前記微生物の非胞子形成増殖相の間に発現される、請求の範 囲第１６項記載の方法。 １９、前記Ｐ−２毒素は前記微生物の溶菌により微生物から抽出される、請求の 範囲第１Ｏ項記載のタンパク質。 ２０、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する組み換え体ベクター。 ２１、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する非胞子形成性組み換え体微 生物。 ２２、前記微生物はＥ−ｃｏｌｉである、請求の範囲第２１項記載の非胞子形成 性微生物。 ２３、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する胞子形成性組み換え体微生 物。 ２４、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有し、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシアノバクテリア（Ｃｙ ａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）から成る群より選択される組み換え体微生物。 ２５、ＮＲＲＬにより受託されそして受け入れ番号Ｂ−１８２０４を割り当てら れ！二大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）バクテリア、またはその突 然変異体、または組み換え体、または遺伝子操作した誘導体。 ２６、ＮＲＲＬにより寄託されそして受け入れ番号Ｂ−１８２０３を割り当てら れＩ；巨犬菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）バクテリア、または その突然変異体、または組み換え体、または遺伝子操作した誘導体。 ２７、前記ＤＮＡまたはその部分または誘導体はＰ−２ハイブリダイゼーシヨン プローブとして使用するために標識されている、第２区のＤＮＡ配列。 ２８、前記ＤＮＡまたはその部分または誘導体は放射性標識で標識されている、 請求の範囲第２７項記載のＤ　Ｎ　Ａ配列。 ２９、第２図のＤＮＡ配列で形質転換された植物。 ３０、植物はＰ−２毒素を産生ずる、請求の範囲第２９項記載の植物。 手続補正書 平成１年１１月１８日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８８１０１１３２ ２、発明の名称 バチルス・スリンギエンシスＰ−２毒素の遺伝子、タンパク質および関係する殺 虫剤組成物′３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　エコジエン・インコーホレーテッド４、代理人　〒１０７ 住所　東京都港区赤坂１丁目９番１５号５、補正命令の日付　なし ６、補正の対象 「請求の範囲」の欄および「明細書」の欄７、補正の内容 別紙記載の通り （１）　「請求の範囲」の欄を別紙の通り訂正する。 （２）明細書の第５１頁５行以降に下記文章を追加する。 ｒ本発明の主なる特徴および態様は以下のとおりである。 １１第２図のＤＮＡ配列を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ　ｉ　５）Ｐ−２毒素の精製され且つ分離された遺 伝子。 ２、遺伝子は第２図のアミノ、酸配列を有するタンパク質の遺伝子である、第１ 項記載の遺伝子。 ３、前記タンパク質は殺虫活性を有する、第２項記載の遺伝子。 ４、前記殺虫活性は鱗翅類および双翅類から成る目から選択される昆虫に対して 有効である、第３項記載の遺伝子。 ５、前記ＤＮＡ配列は組み換え体プラスミド中に挿入されている、第１項記載の 遺伝子。 ６、前記プラスミドは前記ＤＮＡ配列の挿入後の微生物の少なくとも２つの異な る種からのＤＮＡから構成されている、第５項記載の遺伝子。 ７、前記プラスミドは、前記ＤＮＡ配列の挿入後の微生物の同一種の少なくとも ２つの異なる亜種からのＤＮＡから構成されている、第５項記載の遺伝子。 ８、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、 第１項記載の遺伝子。 ９、前記ＤＮＡ配列は外来プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、第１ 項記載の遺伝子。 ｌＯ１工程： ａ）Ｐ−２毒素の遺伝子をプラスミド中に挿入し、前記遺伝子は第２図のＤＮＡ 配列を有し、ｂ）微生物を工程ａ）のプラスミドで形質転換し、そして Ｃ）工程ｂ）の形質転換した微生物を増殖させ、これにより前記Ｐ−２毒素を前 記微生物において発現させる、 からなる、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）Ｐ　−２毒素を産生ずる方法。 １１、前記遺伝子は第２図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝情報を指定 する、第１０項記載の方法。 １２、前記プラスミドは、前記Ｐ−２遺伝子の挿入後の微生物の少なくとも２つ の異なる種からのＤＮＡから構成されている、第１Ｏ項記載の遺伝子。 １３、前記プラスミドは、前記Ｐ−２遺伝子の挿入後の微生物の同一種の少なく とも２つの異なる亜種からのＤＮＡから構成されている、第１０項記載の方法。 １４、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている 、第１０項記載の方法。 １５、前記ＤＮＡ配列は外来プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、第 １Ｏ項記載の遺伝子。 １６、前記微生物は非胞子形成性微生物である、第１０項記載の遺伝子。 １７、前記微生物は胞子形成性微生物である、第１Ｏ項記載の方法。 １８、Ｐ−２毒素は前記微生物の非胞子形成増殖相の間に発現される、第１６項 記載の方法。 １９、前記Ｐ−２毒素は前記微生物の溶菌により微生物から抽出される、第１Ｏ 項記載のタンパク質。 ２０、第１項記載のＤＮＡ配列を含有する組み換え体ベクター。 ２１第１項記載のＤＮＡ配列を含有する非胞子形成性組み換え体微生物。 ２２、前記微生物はＥ、ｃｏｌｉである、第２１項記載の非胞子形成性微生物。 ２３、第１項記載のＤＮＡ配列を含有する胞子形成性組み換え体微生物。 ２４、第１項記載のＤＮＡ配列を含有し、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシ ェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）およびシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａ ｃｔｅｒｉａ）から成る群より選択される組み換え体微生物。 ２５、ＮＲＲＬにより受託されそして受け入れ番号Ｂ−１８２０４を割り当てら れた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）バクテリア、またはその突然 変異体、または組み換え体、または遺伝子操作した誘導体。 ２６、ＮＲＲＬにより寄託されそして受け入れ番号Ｂ−１８２０３を割り当てら れた巨大面（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）バクテリア、またはそ の突然変異体、または組み換え体、または遺伝子操作した誘導体。 ２７、前記ＤＮＡまたはその部分または誘導体はＰ−２ハイブリダイゼーシヨン プローブとして使用するために標識されている、第２図のＤＮＡ配列。 ２８、前記ＤＮＡまたはその部分または誘導体は放射性標識で標識されている、 第２７項記載のＤＮＡ配列。 ２９、第２図のＤＮＡ配列で形質転換された植物。 ３０、植物はＰ−２毒素を産生ずる、第２９項記載の植物。」 「１１第２図のＤＮＡ配列を有するバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ　１ｓ）Ｐ−２毒】の精製され且つ分離された遺 伝子。 ２、遺伝子は第２図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝子である、請求の 範囲第１項記載の遺伝子。 ３、前記タンパク質は殺虫活性を有する、請求の範囲第２項記載の遺伝子。 ４、前記殺虫活性は鱗翅類および双翅類から成る目から選択される昆虫に対して 有効である、請求の範囲第３項記載の遺伝子。 ５、工程： ａ）請求の範囲第１項記載のＰ−２毒素の遺伝子をプラスミド中に挿入し、前記 遺伝子は第２図のＤＮＡ配列を有し。 ｂ）微生物を工程ａ）のプラスミドで形質転換し、そして Ｃ）工程ｂ）の形質転換した微生物を増殖させ、これにより前記Ｐ−２毒素を前 記微生物において発現させる、 からなる、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｔｈｕｒｉｎｇｉ ｅｎｓｉｓ）Ｐ−２毒素を産生ずる方法。 ６、前記遺伝子は第２図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝情報を特徴す る請求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記Ｐ−２毒素は前記微生物の溶菌により微生物から抽出される、請求の範 囲第５項記載の方法。 ８、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する組み換え体ベクター。 ９、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する非胞子形成性または胞子形成 性組み換え体微生物。 ＩＯ１請求の範囲第１項記載の遺伝子を含む、ＮＲＲＬにより受託されそして受 け入れ番号Ｂ−１８２０４を割り当てられた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　 ｃｏｌｉ）バクテリア、またはその突然変異体、または組み換え体、または遺伝 子操作した誘導体。 １１、請求の範囲第１項記載の遺伝子を含む、ＮＲＲＬにより寄託されそして受 け入れ番号Ｂ−１８２０３を割り当てられた巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇ ａｔｅｒｉｕｍ）バクテリア、またはその突然変異体、または組み換え体、また は遺伝子操作した誘導体。 １２、前記ＤＮＡまたはその部分または誘導体はＰ−２ハイブリダイゼーシヨン グローブとして使用するために標識されている、請求の範囲第１項記載の遺伝子 のＤＮＡ配列。 １３、請求の範囲第１項記載の遺伝子のＤＮＡ配列またはその部分または誘導体 で形質転換された植物。 １４、該植物は、Ｐ−２毒素を産生ずる、請求の範囲第１４項記載の植物。」 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、第２図のＤＮＡ配列またはその任意の部分または誘導体を有するバチルス・ スリンギエンシス（Ｂａｃｉ１１ｕｓＴｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｐ−２毒素 の遺伝子。 ２、遺伝子は第２図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝情報を指定する、 請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ３、前記タンパク質は殺虫活性を有する、請求の範囲第２項記載の遺伝子。 ４、前記殺虫活性は鱗翅類および双翅類から成る族から選択される昆虫に対して 有効である、請求の範囲第３項記載の遺伝子。 ５、前記ＤＮＡ配列は組み換え体プラスミド中に挿入されている、請求の範囲第 １項記載の遺伝子。 ６、前記プラスミドは前記ＤＮＡ配列の挿入後の微生物の少なくとも２つの異な る種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第５項記載の遺伝子。 ７、前記プラスミドは、前記ＤＮＡ配列の挿入後の微生物の同一種の少なくとも ２つの異なる亜種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第５項記載の遺 伝子。 ８、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、 請求の範囲第１項記載の遺伝子。 ９、前記ＤＮＡ配列は外来プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、請求 の範囲第１項記載の遺伝子。 １０、第２図のアミノ酸配列またはその任意の部分または誘導体を有するタンパ ク質。 １１、前記タンパク質は殺虫活性を有する、請求の範囲第１０項記載の遺伝子。 １２、前記殺虫活性は鱗翅類および双翅類から成る族から選択される昆虫に対し て有効である、請求の範囲第３項記載の遺伝子。 １３、前記タンパク質は、工程： ａ）微生物を第２図の遺伝子で形質転換し、ｂ）前記形質転換した微生物を増殖 し、これにより工程ａ）の前記遺伝子によりエンコードされるタンパク質を前記 歓生物中で発現し、そして ｃ）工程ｂ）において発現した前記タンパク質を前記有機体から抽出および分離 する、 からなる方法により産生される、請求の範囲第１０項記載のタンパク質。 １４、工程ａ）の前記遺伝子はプラスミド上に位置する、請求の範囲第１３項記 載のタンパク質。 １５、前記プラスミドは、前記遺伝子を含むとき、微生物の少なくとも２つの異 なる笹からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第１４項記載のタンパク質 。 １６、前記プラスミドは、前記遺伝子を含むとき、微生物の少なくとも２つの異 なる亜種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第１４項記載のタンパク 質。 １７、前記タンパク質は非胞子形成性微生物中で発現される、請求の範囲第１３ 項記数のタンパク質。 １８、遺伝子はその自然プロモーターにより制御される、請求の範囲第１５およ び１６項記載のタンパク賞。 １９、遺伝子は外来プロモーターにより制御される、請求の範囲第１５および１ ６項記載のタンパク質。 ２０、前記タンパク質は胞子形成性微生物中で発現される、請求の範囲第１９項 記載のタンパク質。 ２１、タンパク質は前記微生物の非胞子形成増殖相の間に発現される、請求の範 囲第１８項記載のタンパク質。 ２２、前記タンパク質は工程ｃ）において前記微生物の溶菌により抽出される、 請求の範囲第１３項記載のタンパク質。 ２３、前記タンパク質は実質的に純粋な形態である、請求の範囲第１０項記載の タンパク質。 ２４、工程： ａ）第２図のＤＮＡ配列を有する前記Ｐ−２毒素の遺伝子をプラスミド中に挿入 し、 ｂ）微生物を工程ａ）のプラスミドで形質転換し、そしてｃ）工程ｂ）の形質転 換した微生物を増殖させ、これにより前記Ｐ−２毒素を前記微生物において発現 させる、からなる、バチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）Ｐ−２毒素を産生する方法。 ２５、前記遺伝子は第２図のアミノ酸配列を有するタンパク質の遺伝情報を指定 する、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２６、前記プラスミドは、前記Ｐ−２遺伝子の挿入後の微生物の少なくとも２つ の異なる種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第２４項記載の遺伝子 。 ２７、前記プラスミドは、前記Ｐ−２遺伝子の挿入後の微生物の同一種の少なく とも２つの異なる亜種からのＤＮＡから構成されている、請求の範囲第２４項記 載の方法。 ２８、前記ＤＮＡ配列はその自然プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている 、請求の範囲第２４項記載の方法。 ２９、前記ＤＮＡ配列は外来プロモーターＤＮＡ配列中に組み込まれている、請 求の範囲第２４項記載の遺伝子。 ３０、前記微生物は非胞子形成性微生物である、請求の範囲第２４項記載の遺伝 子。 ３１、前記微生物は胞子形成性微生物である、請求の範囲第２１項記載の方法。 ３２、Ｐ−２毒素は前記微生物の非胞子形成増殖相の間に発現される、請求の範 囲第３０項記載の方法。 ３３、前記Ｐ−２毒素は前記微生物の溶菌により微生物から抽出される、請求の 範囲第２４項記載のタンパク質。 ３４、バチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ ｉｓ）Ｐ−２毒素および適当な担体の混合物からなる、鱗翅類（Ｌｅｐｄｏｐｔ ｅｒａ）に対する使用に適当な殺虫剤。 ３５、Ｐ−２毒素はバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒＩ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子に関連する、請求の範囲第３４項記載の殺虫剤。 ３６、Ｐ−２毒素は均質なタンパク質調製物である、請求の範囲第３４項記載の 殺虫剤。 ３７、Ｐ−２毒素はバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子および培養したバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓＴｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）有機体の混合物中に含有されている、請 求の範囲第３４項記載の殺虫剤。 ３８、Ｐ−２毒素は非胞子形成性微生物に関連する、請求の範囲第３４項記載の 殺虫剤。 ３９、Ｐ−２毒素は胞子形成性微生物に関連する、請求の範囲第３４項記載の殺 虫剤。 ４０、担体は液状担体である、請求の範囲第３４項記載の殺虫剤。 ４１、液状担体は１または２以上の界面活性剤を含有する、請求の範囲第４０項 記載の殺虫剤。 ４２、担体は固体の担体である、請求の範囲第３４項記載の殺虫剤。 ４３、固体の担体は、方解石、タルク、カオリン、アタバルジャイト、シリケー ト、砂、ドロマイトおよび粉砕した植物残留物から成る群より選択される、請求 の範囲第４３項記載の殺虫剤。 ４４、固体の担体は造粒した吸着性担体である、請求の範囲第４３項記載の殺虫 剤。 ４５、造粒した吸着性担体は、軽石、破壊した煉瓦、海泡石、およびベントナイ トから成る群より選択される、請求の範囲第４５項記載の殺虫剤。 ４６、バチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉｎｇｉｏｎｓ ｉｓ）Ｐ−２毒素の混合物からなる双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａ）に対して使用する ために適当な殺虫剤。 ４７、Ｐ−２毒素は非胞子形成性微生物に関連する、請求の範囲第４６項記載の 殺虫剤。 ４８、Ｐ−２毒素は胞子形成性徴生物に関連する、請求の範囲第４６項記載の殺 虫剤。 ４９、担体は液状担体である、請求の範囲第４６項記載の殺虫剤。 ５０、液状担体は、水、植物性油、および鉱油から成る群より選択される、請求 の範囲第４９項記載の殺虫剤。 ５１、液状担体は１または２以上の界面活性剤を含有する、請求の範囲第４９項 記載の殺虫剤。 ５２、担体は固体の担体である、請求の範囲第４６項記載の殺虫剤。 ５３、固体の担体は、方解石、タルク、カオリン、アタバルジャイト、シリケー ト、砂、ドロマイトおよび粉砕した植物残留物から成る群より選択される、請求 の範囲第５２項記載の殺虫剤。 ５４、固体の担体は造粒した吸着性担体である、請求の範囲第５２項記載の殺虫 剤。 ５５、造粒した吸着性担体は、軽石、破壊した煉瓦、海泡石、およびベントナイ トから成る群より選択される、請求の範囲第５４項記載の殺虫剤。 ５６、Ｐ−２毒素はバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉ５ｓ）胞子に関連する、請求の範囲第４６項記載の殺虫剤。 ５７、Ｐ−２毒素は均質なタンパク質調製物である、請求の範囲第４６項記載の 殺虫剤。 ５８、Ｐ−２毒素はバチルス・スリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉ ｎｇｉｅｎｓｉｓ）胞子および培養したバチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓＴｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）有機体の混合物中に含有されている、請 求の範囲第４６項記載の殺虫剤。 ５９、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する組み換え体ベクター。 ６０、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する非胞子形成性微生物。 ６１、前記微生物はＥ．ｃｏｌｉである、請求の範囲第６０項記載の非胞子形成 性微生物。 ６２、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する胞子形成性微生物。 ６３、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ）およびシアノバクテリア（Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）から成る群より選択 される、請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列を含有する微生物。 ６４、ＮＲＲＬにより受託されそして受け入れ番号Ｂ−１８２０４を割り当てら れた大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）バクテリア、またはその突然変 異体、または組み換え体、または遺伝子操作した誘導体。 ６５、ＮＲＲＬに寄託されそして受け入れ番号Ｂ−１８２０３を割り当てられた 巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）バクテリア、またはその突然 変異体、または組み換え体、または遺伝子操作した誘導体。 ６６、配列： ５′【配列があります】′、または その誘導体、 からなる、Ｐ−２デルタ−内毒素の遺伝情報を指定するオリゴヌクレオチドのプ ローブ。 ６７、前記プローブは標識されている、請求の範囲第６６項記載のオリゴヌクレ オチドのプローブ。 ６８、前記プローブは放射性標識で標識されている、請求の範囲第６７項記載の オリゴヌクレオチドのプローブ。 ６９、前記ＤＮＡまたはその部分または誘導体は標識されている、第２図のＤＮ Ａ配列。 ７０、前記ＤＮＡまたはその部分または誘導体は放射性標識で標識されている、 請求の範囲第６９項記載のＤＮＡ配列。 ７１、第２図のＤＮＡ配列で形質転換された植物。 ７２、植物はＰ−２毒素を産生する、請求の範囲第７１項記載の植物。 ７３、第６図におけるようなＰ−２の断片のアミノ酸配列を有するタンパク質。 ７４、第６図に示すようなＰ−１の断片のアミノ酸配列を有するタンパク質。 ７５、アミノ酸は、組成および配列において、第６図においてＰ−１とＰ−２と の間で共有されていると示されるものから少なくともなる、約１００アミノ蕨を 有するタンパク質。