JPH02500801A - 誘発的に発現された活性化因子タンパク質からの刺激下での組換え遺伝子の発現のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 序論 遺伝的に構築された発現システムの使用による興味ある医薬用タンパク質の製造 が、ひじように興味ある対象であり、そして最近その研究がなされて来た。多く の興味あるタンノマク質は、自然に分泌されるタンパク質であるので、それらは 、生物学的に機能する高分子になる前、時々、種々の翻訳後変性、たとえばグリ コジル化、特定の化学変性及び複雑な折りたたみを受ける。

生体外でのヒト及び他の真核生物の遺伝子の発現への２つの主要アプローチが使 用されて来た：まず第１に、真核生物産生細胞、すなわち最っとも一般的には細 菌、たとえばＥ。

コ！Ｊ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）及び少ない程度の枯草菌が使用されて来た。

これらの細胞系は、比較的多くの単純ポリペプチドの高いレベルでの産生のため に適切であることがわかっているが、しかし他方では、ある限界、たとえばグリ コジル化、等を行なうためにＳ−８架橋を形成するためのそのような産生細胞の 無能力性が示され；さらに、高レベルの発現は、細菌の内部に不溶性粒状物の形 で生成物の蓄積を時々導ひいている。幾分複雑な再生段階が、これらの不溶性粒 状物から活性タン）ｉり質を産生ずるために必要とされ、そしてその最終生成物 は天然の高分子の構造形の混合物である。

第２のアプローチは、真核生物のタンパク質の産生のために原核生物の産生細胞 を使用することであった。そのような細胞タイプの最っとも単純な適用は、多く の従来の発酵実験がすでに存在する酵母の使用であった。酵母における好結果を もたらすタンパク質産生の多くの例、たとえばＨＢ表面抗原サブユニットワクチ ン、インターフェロン、インターロイキン、等が存在する。タンパク質生成物の 分泌のレベルで、及び酵母に対して特異的であり且つ問題のタンパク質のために 天然の産生細胞タイプに存在するタンパク質とは異なる翻訳後の変性反応による 制限が存在する。

これらの目的を考慮して、遺伝子の発現を誘導するために熱シヨツク遺伝子の発 現制御要素の使用が、１９８１年３月に初めてＢｒｏｍｌｅｙ及びνｏｅｌ］ｍ ｙにより提案され、そしてアメリカ特許出願第６２８．５８８号に開示された。

この進展を導ひく理由は、熱シヨツク遺伝子自体が熱処理された細胞にひじょう に高いレベルで発現され、そしてこれらの遺伝子がひじょうに強い発現の調節を 受けること、すなわちそれらは、ストレスを受けた細胞において高い活性を有す るが、しかし細胞増殖の正常な条件下では実質的に不活性であることであった。

従って、合成の高いレベルで対象の遺伝子の発現を誘導するために熱シヨツク遺 伝子の転写及び翻訳調節要素を使用することが可能であるように思われる。この 概念は、後に完全に確認され、そしていくつかの出版物及び特許出願（この後、 参照のこと）の目的になった。

外来性遺伝子（たとえば構造遺伝子）の発現を調節するために、すなわち適切な 原核生物及び真核生物宿主細胞中に組換えＤＮＡ構造体を導入し、そしてその培 養物をストレスにさらすために熱シヨツク配列を使用する技法の進展が、さらに ＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５１に開示されている。本発明者は、新しい熱誘導性 タンパク質発現装置及び外来性調節要素により誘導される遺伝子の発現の時間を 実質的に延長し、且つその遺伝子の効率を実質的に高めることができる方法の説 明を所望する。

発明の要約 この後記載される実験においては、本発明者は、対象の遺伝子の発現がヒト免疫 欠損ウィルス（ＨＩ　Ｖ）のトランス−活性化因子ｔａｒ−ｍタンパク質により 調節される過渡発現アッセイにおいて、熱シヨツクプロモーターの転写制御下で それ自体合成される、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因物質を例示する 。説明されるべきいくつかの理由に関しては、このタイプの発現システムは、対 象の遺伝子の発現が、結合された熱シヨツクプロモーターにより直接調節される 従来のシステムよりも卓越する見込みがある。

これまでに開示された一連の初期の実験（前の文献を参照のこと）においては、 本発明者は、ショウジヨウバエのｈｓｐ　７０遺伝子及びヒ）ｈｓｐ７０遺伝子 からの熱シヨツク調節要素［Ｖｏｅｌｌｍｙなど、　、（１９８５）　ＰＮＡＳ 　８２．４９５９〜４９５３）を種々の試験遺伝子、たとえばＥ、コ！Ｊ　（Ｅ 、ｃｏｌｉ）−β−ガラクトシダーゼ、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、鶏リゾチ ーム及びインフルエンザウィルス赤血球凝集系遺伝子に連結し、そしてこれらの 遺伝子のタンパク質生成物が種々の細胞において熱誘導性になることを示した［ 　Ｌａｗｓｏｎなど、　、（１９８４）　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、１９８．　１１６〜１２４　；　Ｄｒｅａｎｏなど、　 、（１９８６）　Ｇｅｎｅ　４９゜１〜８〕。たとえば、熱ショック−ｈＧＨ遺 伝子構造体の安定して組込まれたコピーを担持する永久マウス細胞系は、他のプ ロモーターシステムを用いて得られたｈＧＨに十分に匹敵するｈＧＨを、ホルモ ンの発現のレベルでの熱誘導性方式において産生ずることが示された。［Ｄｒｅ ａｎｏなど０、（１９８６）Ｇｅｎｅ　４９．　１〜８　；Ｄｒｅａｎｏなど、 　、（１９８７）　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

印刷中〕。

しかしながら、選択されたタンパク質の連続した産生は、熱活性化の多数のサイ クルの使用を必要とする。熱シヨツク遺伝子は特定のストレス、たとえば熱に急 速に応答するけれども、これらの遺伝子は、ストレスが除かれるとすぐにそれら の正常な不活性状態に戻る。しかしながら、タンパク質生成物の合成は、完全に 急速には停止しない。合成は、活性転写の期間よりも２４時間はど実際に続くこ とができる（対象の遺伝子のｍＲＮＡの半減期に依存して）。タンパク質産生に 適用される反復熱ショックの詳細のためには、叶ｅａｎｏなど１、（１９８６） 　Ｇｅｎｅ　４９．　１〜８を参照のこと。しかしながら、産生目的のためには 、合成は、より長い期間（たとえば１又はそれ以上の週の間）にわたって維持さ れる必要がある。この結果を達成するためには、産生細胞の培養物が、次の欠点 を有すると思われる定期的な熱処理にゆだねられるべきである：ａ）現在の工業 用装置が適合されず、そして導入される調節されたシステムは高価であるので、 特に大規模な培養に関して、多くのサイクルのために発酵器の温度を定期的に高 めることは技術的に不便であり； ｂ）最大の熱シヨツク誘導が、細胞増殖阻害を引き起こす温度で生じ、そして実 質的にそれよりも高い温度である場合、細胞の死が生じ、すなわち培養物中の細 胞の計数は、適用される熱シヨツクサイクルの数の関数として減少しく収量の減 少をもたらしながら）； Ｃ）はとんどの産生時間の間、細胞は、多くの細胞活性が阻止され（たぶんグリ コジル化及びタンパク質の輸送でさえ）、そして一部減じられたレベルで維持さ れることが予測される熱シヨツク状態にあるであろう。

ＨＩＶの機構及び天然の発現制御の理解における最近の進歩は、ｔａｔ−ｍ（他 の比較しうるタンパク質、たとえばヒトＴ−細胞白血病ウシ）Ｌｔス）ｌＴＬＶ ＝−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ　カら（７）　ｔａｔ　−■及びｔａｔ−ＩＩとは異 なる）として定義される新規のウィルス−コードされたトランス−活性化因子タ ンパク質の説明を導ひいて来た［Ａｒｙａなど、　、（１９８５）　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２２９．６９〜７３　；６９１〜７０１〕。感染された細胞における高レ ベルのウィルス発現は、少なくとも一部、ｔａｔ−ｍに帰する。たとえば、細菌 性クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーセｉｎ伝子を有するＨＩＶウ ィルス（これまでは）ＩＴＬＶ−Ｉ［Ｉ　）により感染されたヒ）Ｔ細胞系にお ける過渡アッセイにおいては、前記遺伝子の発現は、このウィルスの長い末端の 反復配列により向けられる場合、感染されていない細胞の場合と比べて３００倍 以上刺激される。このトランス−活性化因子タンパク質は、長い末端の反復体の 一部、すなわちいわゆるＬＴＲであるウィルスプロモーター［Ｒｏｓｅｎなど、 　、（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３１９゜５５５〜５５９〕の転写部位の開始 近くのＤＮＡ標的配列と、直接的又は間接的に相互作用することが推定される。

ｔａｔ−ｍはまた、転写後レベルでも作用するように思える［　Ｒｏｓｅｎなど ０、（１９８６）前記〕。最近の研究は、ウィルスの複製サイクルにおけるその ｔａｔ−ｍ遺伝子の正確な役割は不明確であるけれども、そのｔａｔ−ｍ遺伝子 は、感染性ＨＩＶピリオンの産生のために必要とされることを示唆した［Ｆｉｓ ｃｈｅｒなど、　、（１９８６）他のヒ）Ｔ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）は 、それら自体のＬＴＲプロモーター配列に対して作用する、トランス−作用性転 写活性化因子を含むことがまた示された。５ｏｄｒｏｓｋｉなど０、（１９８４ ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２５．３８１〜３８５；Ｆｕｊｉｓａｗａなど、　、（ １９８５）ＰＮＡＳ　８２．２２７７〜２２８１　；　５ｅｉｋｉなど、　、（ １９８６）　ＥＭＢＯＪ、　５゜５６１〜５６５　（ＩＩＴＬＶ−Ｉのためには ）及びＧｒｅｅｎｅなど、　、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３２．８７７〜 ８８０（ＨＴＬＶ　−ＩＩのためには）を参照のこと。

類似する観察が、ウシ白血病ウィルス［Ｒｏｓｅｎなど０、（１９８５）［：ｅ ｌｌ　４１．８１３〜８２３］及びビスナウィルス〔Ｈｅ５ｓなど１、（１９８ ５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．４８２〜４８５　］のＬＴＲに対して得られた 。さらに、同じ配列が、ある細胞遺伝子、たとえばインターロイキン−２及びそ の受容体の誘導を担当すると思われるＨＩＶが複製される細胞の他に、ｔａｔ− ｍ−活性化ＬＴＲプロモーターは、種々の細胞、たとえばＢ及びＴ’Ｊンバ球細 胞系（Ｒａｊｉ、　Ｊｕｒｋａｔ、　Ｈｅ−）及びまた）ＩｅＬａ、　ＣＯＳ　 ３Ｔ３．　ＣＨＯ細胞［５ｏｄｒｏｓｋｉなど、　、＜１９８５＞、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　２２９．７４〜７７；　Ｒｏｓｅｎなど、、（１９８６）、Ｎａｔｕｒ ｅ　阻９．５５５〜５５９　；　Ｒｏｓｅｎなど０、（１９８６）、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ　５７．　３７９〜３８４：　Ｆｉｎｂｅｒｇなど、、（１９８６）。

Ｃｅ１ｌ　４６．８０８〜８１７〕において活性的である。

従って、本発明者は、前に記載された熱シヨツク発現システムに追加の最適寸法 を付与するために、ＨＩＶ　ｔａｔ−ｍ遺伝子を用いて、ｔｒａｎｓ−活性化因 子現象を使用した［Ｐ、　Ｂｒｏｍｌｅｙ及びＲ，Ｖｏｅｌｌｍｙ、（１９８３ ）アメリカ特許出願第６２８．５８８号；Ｐ、　Ｂｒｏｍｌｅｙなど、、（１９ ８５）　ＰＣＴ／ＥＰ８６／　００４５１　：　Ｐ、　Ｂｒｏｍｌｅｙなど、　 、（１９８６）ヨーロッパ特許出願第８６／８１０．４５５．５号〕。

その選択された基本アプローチは、熱シヨツクプロモーターによる対象の遺伝子 の発現の直接的な誘導を放棄することであり；代わりに請求の範囲第１項に説明 されているように、対象の遺伝子が旧Ｖ　ＬＴＲプロモーター配列の制御下に置 かれ、次に後者はトランス−活性化因子タンパク質により刺激されるようになる 。トランス−活性化因子タンパク質は、ｔａｔ遺伝子の誘発された発現によりそ の場で産生される。従って、次にこれらの対象の遺伝子のＬＴＲ誘導発現は、特 定のタンパク質産生のために適切に選択された細胞に産生されるｔａｔ−ＩＩＩ タンパク質の量により調節される。好都合には、これらの細胞におけるｔａｔ− ｍレベルは、対象の遺伝子と一緒に細胞中に同時導入されるヒト熱シヨツクプロ モーターの制御下に置かれる組換えｔａｔ−ＩＩＩ遺伝子により調節される。当 然本発明はまた、対象の遺伝子を誘導するために、内因性刺激因子、たとえばｔ ａｔ　−Ｉ及びｔａｔ　−ＩＩにより調節される他のプロモーターの使用も含む 。

この効果的な調節カスケードの利点は、次の通りである：１、熱ショックの後、 ｔａｔ−１１１ｍＲＮＡ及びｔａｔ−ＩＩＩタンパク質が、ＬＴＲプロモーター を過剰刺激すために十分な量で製造される。対象の遺伝子の発現が、ｔａｔ−ｍ が存在する場合にかぎり生じると予測されるので（ひじょうに少量でさえ）、対 象の遺伝子の発現は、熱シヨツク後の延長された期間、すなわちｔａｔ−ＤＩの 最後の分子が細胞の代謝機構において使い尽くされるまで続くであろう。この後 得られた結果は、ｔａｔ−■活性化ＬＴＲプロモーターが、強力なプロモーター システムであることを示す。

ひじょうに影響されやすいＬＴＲプロモーターとｔａｔ−ＩＩＩ発現の強い熱シ ヨツク制御との組合せは、選択された遺伝子のほとんど完全な誘発性発現をいつ でも可能にするように思われ、そして産生が短い期間の単一の熱ショックにより 開始される場合、産生は延長された時間効果的に続くであろう。

ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーターの制御下に置かれ得る対象の遺伝子は多く、そして ウィルス抗原、血液因子、ホルモン、酵素的に活性的なタンパク質、構造タンパ ク質、診断試験等のためのタンパク質、たとえばヒト肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ）　；組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）；ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ ）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；インターロイキン及び臨床的及び医薬的対象の他 の生成物を包含する。

ＨＩＶ−ＬＴＲプロモーター配列（ハイブリッド遺伝子１）及び第２ハイブリツ ド遺伝子（２）（）ランス−活性化因子遺伝子が熱シヨツク配列により誘導され る）の転写制御下に対象の遺伝子を配置することに起因する構造体は、好ましく はプラスミドベクターの形で宿主細胞中に導入される。これらのプラスミドは、 容易なりローン選択のために選択マーカー遺伝子を有する又は有さない、通常知 られているプラスミドに起因する。限定的な例は、この後提供されない。たとえ ばウィルス起源の当業界で既知の他のタイプのキャリヤーがまた、使用され得る 。ハイブリッド遺伝子（１）及び（２）は、１つのベクター又は別々のベクター の部分であり、それによって宿主細胞への導入がトランスフェクション又は同時 トランスフェクションにより行なわれる。本発明は、活性化因子により刺激され た調節配列の制御下でたった１つの対象の遺伝子に限定されない。複数の対象の 遺伝子が、１又はいくつかの（それぞれの遺伝子のために１つ）調節配列の制御 下に含まれ得る。

宿主細胞は、通常の条件下で増殖するそれらの能力、ハイブリッド遺伝子（１） 及び（２）を受け入れるだめのそれらの能力及び必要とされる操作条件下でそれ らの発現を阻止しないそれらの能力のために選択される。実際には、当業界で知 られているほとんどの受容細胞、たとえばＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵 巣細胞）　、ＣＯ３，）ＩｅＬａ、　３Ｔ３細胞、等が適切である。

これらの細胞の増殖は、通常の培養培地により通常の手段を用いてもたらされ； 他方、ヨーロッパ特許出願第８６／８１０、４５５．５号に開示されるような増 殖が腫瘍の形で温血動物にもたらされ得る。

本発明においては、次の変法が可能である：たとえば本発明者及び他人が示すよ うに、ヒ）ｈｓｐ７０プロモーターは、対照温度でひじょうに低い基本レベルの 発現を有し、そして潜在的に増幅可能なシステムを用いる場合でさえ、厳密に言 えば誘発可能である。従って、これは本発明に容易に適用できる。そのような増 幅可能なシステムとして、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰ■）ベクターに基ツかれる システム（ヨーロッパ特許出願第８６８１０４５５．５号）、又は高濃度のメト トレキセートの存在下でジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子の同時増幅により得ら れた多くのｈｓｐ７０−　ｃ−ｍｙｃハイブリッド遺伝子を含むＣＨＯ細胞系を 用いるシステム［Ｗｕｒｍなど、　、（１９８６）　ＰＮＡＳ８３、５４１４〜 ５４１８）を使用することができる。ｔａｔ−ｍＬＴＲ−ハイブリッドシステム は、遺伝子増幅の後、調節され得ることが提案される；たとえばまず、ＬＴＲ由 来のハイブリッド遺伝子を適切な宿主細胞中に導入し、遺伝子増幅をもたらし、 そして最終細胞系に熱シヨツク由来のｔａｔ遺伝子ベクターを導入することがで きる。他の変異細胞においては、転写単位が細胞ＤＮＡ中に組込まれ又はエビソ ーム状態（ＢＰＶ配列を担持するベクターを有する）で維持される。

当然、ｈｓｐプロモーター−ｔａｔ−ｍハイブリッド遺伝子は、異なった分子量 のｈｓｐからの及び異なった起源の真核細胞（ヒト、ショウジヨウバエ、酵母、 植物、等）からの並びに構築されたｈｓｐプロモーター変異細胞からのプロモー ター及び／又は合成プロモーターを利用することができる。

本発明はまた、細胞系が２種の転写単位のうち１つを発現する場合に適用され； 次にそれは、請求の範囲に定義された目的を達成するために十分になり、すなわ ち対象の遺伝子の工業的な高いレベルでの合成を得るために、欠失転写単位によ りこれらの細胞をトランフエクトすることが十分になる。

本発明の変性された遺伝子を担持するために使用されるベクター上のマーカー配 列（たとえば抗生物質耐性遺伝子）の他に、前記ベクターはまた、菌株の同定の ための腫瘍配列、たとえばＨａｒｖｅｙ　Ｃ−Ｒａ５又はＢ　Ｐ　Ｖも担持する ことができる。

発明の詳細な記載及び例 １）プラスミドの構成。

１、Ｉ　ＨＩＶ−ＬＴＲの制御下でクロラムフェニコールアセチルトランスフェ ラーゼ遺伝を含むｐＬＴＲ−Ｃａｔ　０初期実験においては、試験遺伝子構造体 、すなわちｐＬＴＲ−ｃａｔが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼをコードするＤＮＡフラグメントにＨＩＶ−ＬＴＲ領域を連結することによ って調製された。この遺伝子生成物は、遺伝子発現の急速な制御を可能にする便 利にアッセイされた生成物である。ＨＩＶプロウィルスのゲノムを担持するプラ スミドＨＸＢ２−ｇｐｔ　［Ｆｉｓｈｅｒなど、、（１９８６）、　Ｎａｔｕｒ ｅ　２２０．３６７〜３７１］からのＤＮＡを、旧ｎｄｆｆｌにより消化し、末 端をフィルインし、そしてそのＤＮＡをさらにＲａｍ）Ｉ　Ｉ及びＸｈｏＩによ り消化した。

ウィルスゲノムの３’ＬＴＲ領域からのＸ　ｈｏ　Ｉ　”−ＨｌｎｄＩＩＩ　（ 満たされている）フラグメント　〔座標８４７５〜９１９７．　Ｒａｔｎｅｒな ど０、（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．２７７〜２８４のヌクレオチド 配列を参照のこと〕を、電気泳動的に単離し、そしてプラスミドｐＳＶ２−ｃａ ｔＸＸ　ＤＮＡ（下を参照のこと）の大きなＸｂａＩ（満たされている）／Ｘｈ ｏＩフラグメントに連結した。その混合物を用いて、Ｅ、コリを形質転換し、そ してその後、組換え体を担持する細菌コロニーを単離した。プラスミドＤＮＡを 、多くのこれらの単離体から調製し、そして制限消化法により分析した。

ＬＴＲ−ｃａｔは、正しい組換体に混ざって存在した。プラスミドｐＳＶ２−　 ｃａｔＸＸは、ｐＳＶ２−　ｃａｔの誘導体である［Ｇｒｏｍａｎなど１、（１ ９８２）　ＰＮＡＳ　７９．６７７７〜６７８１１　。それは、ｐＳＶ２−　ｃ ａｔのユニークな旧ｎｄＩＩＩ部位の位置でＸｂａＩ部位及びｐＳＶ２−　ｃａ ｔのＮｄｅ　１部位でＸｈｏＩ部位を有する。

１．２　ヒトｈｓｐ　７０プロモーターの制御下でｔａｔ−ｍ遺伝子を含む）ｉ ｓ−ｔａｔ−ｍ。

ヒ）ｈｓｐ７０プロモーターの制御下でｔａｔ−ＩＩＩを発現することができる 構造体、すなわちＨ５−ｔａｔを、調製した。ｐＨＸＢ３−ｔａｔ　［Ｆｅｉｎ ｂｅｒｇなど、　、（１９８６）　Ｃｅ１ｌ　４６．８０７〜８１７］からのｔ ａｔ−ｍコード配列をＢｓ５）Ｉ　ＩＩにより消化し、末端をフィルインし、そ のＤＮＡをさらにＸｈｏＩにより消化し［Ａｒｙａなど９、（１９８５）　５ｃ ｉｅｎｃｅ　２２９．６９〜７３におけるｔａｔ−ｍの配列を参照のこと〕、そ して長さ約７００ｎｔのｔａｔ−ｍ遺伝子セグメントを単離した。ヒ）　ｈｓｐ ７０β−ガラクトシダーゼ融合遺伝子を含むプラスミド［３２８５［Ｉ　ＤＮＡ 　＜　ｐ　１７からのヌクレオチド−２８５〜ヌクレオチド＋１１３　［Ｒ９Ｖ ｏｅｌ１ｍｙなど、　、（１９８５）　ＰＮＡＳ　７９゜１７７６〜１７８０　 ；　Ｄ８ＢからのフラグメントＸｂａＩ　〜ＸｈｏＩ　、　Ａｍ１ｎなど、　、 （１９８７）　Ｍｏｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、７．１０５５〜１０６２を参照の こと〕）をＸｂａＩにより消化しくｈｓｐ７０　ＲＮＡリーダー領域のｎｔ　１ １３で切断）、末端をフィルインし、そのＤＮＡをさらに５ａｌＩにより消化し くβ−ガラクトシダーゼ遺伝子コード配列の末端で切断）、そしてヒ）ｈｓｐ７ ０プロモーター及びＲＮＡリーダー配列並びに３′　トレイラー及びベクター配 列を含む２つの消化フラグメントのうち大きなフラグメントを単離し、そして上 記ｔａｔ−ｍセグメントに連結した。正しい組換え体を産生じ、そして上記のよ うにして同定した。

１．３　ｐ２８５−ｃａｔ（対照） ｐＤ２８５ＤをＸｂａＩ−ＸｈｏＩにより消化した。５′非転写体の２８５−ｂ ｐ及びヒトｈｓｐ　７０のＲＮＡリーダー配列の１１３−ｂｐを含む３９８−　 ｂｐ（Ｄ得られたフラグメントを、ｐＳＶ２　ｃａｔＸＸ（７）Ｘｈｏ　Ｉ及び ＸｂａＩ部位に挿入し、ｈｓｐ７０−ｃａｔ融合遺伝子を含むｐ２８５　ｃａｔ を得た。

１．４　ｐ１７ｅｎｖ この態様においては、ｔａｔタンパク質及びＨＩＶエンベロープタンパク質をコ ードするＤＮＡ配列を、熱シヨツクプロモーターの制御下に置いた。請求の範囲 第１項の方法を実施した後、転写及び翻訳生成物の細胞内プロセッシングが生じ た証拠であるＬＴＲ誘導性遺伝子の刺激の低下は経験されなかった。ｐＬＥＴ　 ［Ｇｕｙａｄｅｒなど、　、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２６．６６２〜６ ６９］からの３．８　Ｋｂの５ａｃＩフラグメントは、ＨＩＶ配列〔Ｒ及びＵ３ 領域の一部を含むフラグメントを担持する座標ｎｔ３０〜ｎｔ１８５　、続いて ウィルスｇｐ１６０．　ｇｐ１２０及びｇｐ４１　（タンパク質分解性切断によ り与えられる）をコードするｎｔ５２３２〜８４５９）　、及びトランス−活性 化因子配列［Ｗｅｉｎ　Ｈｏｂｓｏｎなど９、（１９８５）　Ｃｅ１１．４０９ １７を参照のこと〕並びに続いて８８表面抗原ターミネータ−を含む。このフラ グメントを、Ｐ１７Ｊ。

［［］ｔｅａｎｏなど、　、（１９８７）　Ｇｅｎｅ　４９．〜８）のユニーク ５ａｃ１部位にヒ）ｈｓｐ７０プロモーターの制御下で挿入した。

１、５　ＨＩＶ−ＬＴＲノ制御下テノヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子。

もう１つの例においては、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ｉｔ伝子を、次のように して）ＩＩＶ−ＬＴＲ配列の制御下に置いたニブラスミドＰ１７ｈＧ）ｌｎｅｏ 　［Ｂｒｏｍｌｅｙなど、　、（１９８５）　ＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５１　 ］が、ｈｓｐ　Ｔｏ配列とｈＧＨ配列との間に位置する部位を５ａｉｌ及びＸｂ ａＩにより消化された。同時に、ｐＬＴＲ−ｃａｔをＸｈｏＩ及びＸｂａＩによ り消化し；　ＬＴＲ配列を含む０、７　Ｋｂのフラグメントを単離し、そして上 記フラグメント中に挿入し、その得られたプラスミドｐ１７ＬＴＲｈＧ）Ｉｎｅ ｏはｈＧＨ遺伝子の後ろにヒ）ｈｓｐ７０及びＬＴＲプロモーターを担持し、そ してｐＳＶ２ｎｅｏ　［５ｏｕｔｈｅｒｎ及びＢｅｒｇ、（１９８２）　Ｊ、Ｍ ｏ１．Ａｐｐｌ。

Ｇｅｎ、　１　、３２７〜３４１〕からのネオマイシン転写単位を含む。

ｈＧＨ発現に関して、トランス−活性化因子タンパク質による刺激下でのｐ１７ ＬＴＲｈＧＨｎｅｏの性能を、直接的な熱シヨツクプロモーター制御下でのその 遺伝子の性能と比較するために、本発明者は対照としてプラスミドＩ）１７ｈＧ Ｈｎｅｏを用いた。

このプラスミドは、ヒ）ｈｓｐ７０遺伝子プロモーターの発現制御下に置かれた ｈＧＨ遺伝子を含み；このプラスミド構造は前に記載された（上記Ｂｏｒｍｌｅ ｙの文献を参照のこと）。

２）遺伝子発現実験 ２．１　）１ｅＬａ細胞におけるＬＴＲ−ｃａｔ発現。

ＬＴＲ−ｃａｔ遺伝子は、ｔａｔ−ｍの存在下で（但し、ｔａｔ　−■の不在下 ではない）、ｃａｔの合成を効果的に指図することが見出された。ｃａｔの存在 及びその濃度は、Ｇｏｒｍａｎなど１、（１９８２）、　ＰＮＡＳ　７９．６７ ７７〜６７８１の技法により確かめれた。

）１ｅＬａ細胞を、２８５−ｃａｔプラスミド構成体、ヒトｈｓｐ７０−ｃａｔ 融合遺伝子（対照）又はＬＴＲ−ｃａｔ及び）Ｉｓ−ｔａｔ−ｍの混合物により 、ＤＥＡＥデキストラン技法に従ってトランスフェクトした。トランスフェクシ ョンの後１日してから、培養物の半分を４２℃での３時間の熱処理にゆだね、残 る培養物を３７℃で維持した。次に、すべての培養物をさらに３７℃でインキュ ベートした。熱処理の後１日又は５日後、細胞を収穫し、抽出物を用意し、モし てｃａｔレベルを決定した［Ｇｏｒｍａｎなど、、（１９８２）、ＰＮＡＳ　７ ９．　６７７７〜６７８１’ｌ。

高レベルのｃａｔ活性が、熱処理後１日で、２８５−ｃａｔを含む細胞に見出さ れた（第１表）。実質的に活性は、熱処理されなかったトランスフェクト細胞に は存在しなかった。熱処理後５日では、ひじょうに低レベル（５倍の低下）のＣ ａｔ活性が、２８５−ｃａｔ含有細胞に見出された。これは、Ｃａｔ産生が熱処 理の後、ひじょうに長い間続かなかったことを示唆する。初日に産生されたｃａ ｔ酵素の多くは、５日後衰退したに違いない。

１日目、ＬＴＲ−ｃａｔ及び１３−ｔａｔ−ｍプラスミドの両者を受けた熱シヨ ツク細胞におけるｃａｔレベルはひじょうに高く、２８５−ｃａｔ−含有細胞に おいて達したレベルを相当に越えた。熱処理されなかった比較細胞は何も含まな かった。一層重要なことには、５日後、細胞は１日後に記録されたｃａｔ活性の ８０％をなお有した。従って、実際の工業用目的のためには、刺激されたＬ　Ｔ 　Ｒプロモーターの効力は、ヒト熱シヨツクプロモーターのみよりも一層強く； 従って２種の構成体の組合せは、完全に誘発性であるけれども、強力な遺伝子発 現システムを提供する。ｃａｔ産生が、熱調節されたｔａｔ−ＴＩＩ）ランス− 活性化因子遺伝子からの生成物の影ｖＴにある細胞における合成は、たった１回 の初めの誘発性熱処理の後、数日間続く。

第１表、トランスフェクトされたＨＥＬＡ細胞におけるＣａｔ、活性。

プラスミド　誘発　ショック後の日数 ２８５−ｃａｔ　なし　５９８ ＨＳ　１４８５７ ＬＴＲ−ｃａｔ　／Ｈ３−ｔａｔ−ＩＩＩ　なし　６３２　２４４３ＨＳ　２３ １７５６　１８６４２７ Ｍｏｃｋ　Ｃｏ／　ＨＳ　３７０　３２５２．２　ＣＯ３及びＷｉｓｈ細胞にお けるＬＴＲ−ｃａｔの発現。

ＣＯ８及びＷｉｓｈ細胞を、ＬＴＲ−ｃａｔ遺伝子のみ、又はｐＨ８−ｔａｔ（ Ｏ３−ｔａｔ−ｍハイブリッド遺伝子を担持する）又はｐ１７ｅｎｖ　（Ｏ３− ｇｐ１６０ハイブリッド遺伝子を担持する）のいづれかと混合してＬＴＲ−ｃａ ｔ遺伝子を含む構造体を用いて、ＤＥＡＥデキストラン又は塩化カルシウム技法 によりトランスフェクトせしめた。２４時間後、プラスミド混合物によりトラン スフェクトされた細胞を４３℃で数時間熱処理し、そして３７℃で一層インキユ ベーションし、残るトランスフェクトされた培養物を３７℃で維持した。細胞抽 出及びｃａｔアッセイを、上記のようにして行なった。

第２表は、ＣｏＳ細胞を用いての６種の実験及びＷｉｓｈ細胞を用いての４種の 実験においては、低レベルのｃａｔ活性がｐＬＴＲ−ｃａｔ　）ランスフェクト 細胞に見出され、ところが同時トランスフェクトされた熱処理細胞においては、 高レベルのｃａｔ活性が存在したことを示す。ｐ１７ｅｎｖによる活性化の平均 割合は、それぞれＣＯ８及びＷｉｓｈ細胞において４８及び８．５である。活性 化のレベルは、ｐＨ５−ｔａｔ又はｐ１７ｅｎｖを用いる場合、実質的に同じで あることが注目されるべきである。

これらの結果は、ＬＴＲ−ｔａｔにより調節されたプロモーターシステムの強さ の他に、ｔａｔ活性化が、ハイブリッド遺伝子（この生成物は、トランス−活性 化因子自体を与えるためにプロセッシングを受ける）により得られることを示す 。

第２表 トランスフェクトされたＣＯ８（Ａ）及びＷｉｓｔｌ細胞（Ｂ）におけるｃａｔ のレベルの比較。

ｐＬＴＲ−ｃａｔ　２１５　１０６４　３３８２　２５９　４２０　８２８５ｐ ＬＴＲ−ｃａｔ　２７９５　９００３５　１１１０１６　３４９１３　７４３　 １６８８２５＋　ｐ１７ｅｎｖ ｐＬＴＲ−ｃａｔ　２１７３７　３１７３７　１７０１０４＋ｐｕｓ−ｔａｔ ｐＬＴＲ−ｃａｔ　２８１　１９９　６７８　２３９ｐＬＴＲ−ｃａｔ　９８４ 　６１３　８４０８　３５４８＋ｐ１７ｅｎｖ ２．３　ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の発現。

ｃａｔ遺伝子についての前記例に開示されている方法に類似する方法で、ｈＧＨ 遺伝子を含むプラスミドの発現を分析した。これらの発現実験においては、ＣＯ Ｓモンキー細胞が、ｈＧＨの過渡発現がこれらの細胞において有効であることを 示す実験のために選択された。２種のグループの実験を行なった。第１グループ （第３表）においては、培養細胞〔１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）により補充さ れたＤｕｌｂｅｃｃｏ培地１０ｍ１を含む１００ｍｍの直径の皿当り４．１０６ 個）を、ＤＥＡＥデキストラン方法を用いてトランスフェクトせしめた。２日後 、試験細胞を４３℃で２時間加熱した。（対照は３７℃で維持された）。次に、 産生されたｈＧＨＯ量を、５日間（１，３及び５日後）にわたって確かめた。測 定は、５ｅｎｓｉｂｅａｄ　ＥＩＡ。

Ｔｅｒｕｍｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、により供給されるＥＬＩＳＡキット を用いて行なわれた。培地は、それぞれのサンプリングの後、交換された。１回 の実験は、プラスミドｐ５２２ｄｈｆｒ、すなわちＰＣＴ／ＥＰ８６１００４５ １に開示されるβ−ガラクトシダーゼ含有プラスミドを含む。

第３表：トランスフェクトされた細胞によるｈＧＨの分泌。

熱シヨツク後の日数 ｐ１７ｈＧＨｎｅｏ　＋２０　なし　Ｏ＜５　＜５）Ｉｓ−ｔａｔ−ＩＩＩ　４ 　Ｏ３＜５　＜５　＜５ｐ１７ＬＴＲｈＧＨｎｅｏ　２０　なし　１４　４０　 ２１Ｈ３３０７０４５ ｐ１７ＬＴＲｈＧＨｎｅｏ＋２０　なし　３６　７０　５２Ｈ３−ｔａｔ−ｍ　 ４　Ｏ３１００１６５１００ｐ５２２ｄｈｆｒ　２０　Ｏ３＜１　＜１　＜１他 のグループの実験においては（第４表）、細１０６個又はそれ以下の細胞を、１ ０％ＰＣ３により補充されたＤｕｌｂｅｃｃ。

培地５０ｍ１を含む６０ｍｍ皿上でインキュベートせしめた。トランスフェクシ ョンをＤＥＡＥデキストラン方法を用いて行ない、そして実験の残りは、第１グ ループの実験に示されるようにして行なわれた。トランスフェクションの後、３ 日目、細胞を７５ｃｍ２フラスコ中に分散した。実験が２又はそれ以上のくり返 しから成る場合、ｈＧＨを測定する前、アリコートがプールされた。

第４表 熱シヨツク後の日数 Ｐ１７ｈＧＨｎｅｏ　５　２　なし　０　２　０Ｈ３２１０ ｐ１７ｈＧＨｎｅｏ　＋　５　２　なし　０　３　０ＨＳ−ｔａｔ−ｍ　５　３ 　Ｏ３３１０ｐ１７ＬＴＲｈＧＨｎｅｏ　５　２　なし　７１４８３　Ｏ３８２ ５１０ ｐ１７ＬＴＲｈＧＨｎｅｏ＋　５　２　なし　８３３９ＨＳ−ｔａｔ−ｍ　１　 ３　Ｏ３３５６４１５ｐ１７ＬＴＲｈＧＨｎｅｏ＋　５　２　なし　１２　５４ 　１３ＨＳ−ｔａｔ−ｍ　５　３　Ｏ３２５６４１３ｐ５２２ｄｈｆｒ　５　２ 　Ｏ３ＯＯ＜２第３及び４表からの結果は、十分に予測どおりである。

ｈＧＨの合成及び成長培地中への分泌は、熱ショックの後、ｐ５２２ｄｈｆｒに 関しては実質的にゼロであることが見うけられる。

熱ショックの不在下で、Ｐ１７ｈＧＨｎｅｏの応答はまた、熱ショックの後とる に足らないけれども、負である。ｐ１７ＬＴＲｈＧＨｎｅｏによりトランスフェ クトされた細胞は、熱誘発なしに有効なレベルでｈＧＨを産生じ、そしてこの産 生は、トランスフェクションの後、３及び５日目まで継続することが見うけられ る。

発現レベルの有意な上昇が、細胞が１回の熱ショックにゆだねられる場合に得ら れ、そしてこの上昇は、それぞれアッセイされた期間の後、明らかである。プラ スミドＰ１７ＬＴＲｈＧＨｎｅ。

及びＯ３−ｔａｔ−ｍが５＝１の重量比でＣＯ８細胞中にトランスフェクトされ る場合、対照温度でのｈＧＨ発現レベルは、ｈＧＨ含有プラスミドが単独で使用 される場合に得られるレベルに匹敵する。両プラスミドによりトランスフェクト された細胞の１回の熱ショックの後、ｈＧＨ発現の有意な上昇が観察され、そし てこの上昇は実験の５日目まで維持される。

本発明者は、ｃａｔ遺伝子を用いて得られる初期結果が、この遺伝子が真核生物 の分泌可能なタンパク質、すなわちｈＧＨのための遺伝子と交換される場合にひ じょうに再現されることを上記実験から結論づける。これらの２種の遺伝子によ る結果の間の有意な差は、ｃａｔ発現のための）ＩｅＬａ細胞及びｈＧＨ発現の ためのＣＯ８細胞の使用から推定される。

ＣＯ８細胞はｈＧＨ発現のために選択され、そしてこれは、Ｓν４０ウィルスに 起因する複製の起点を担持するプラスミドベクターがこれらの細胞中でひじょう に増幅され得る事実による［Ｇｌｕｚｍａｎ　Ｙ、、　（１９８２）、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、　ＮＹ　 ）。過渡発現のための細胞のこの選択は、ｃａｔ及びｈＧＨ産生をアッセイする ために使用される試験の感受性の差異により必要とされる。ｃａｔと比べて、対 照レベル以上の熱ショックでのｈＧＨの産生レベルのかなりの低い差異は、たぶ ん、幾分かはｈＧＨを含むプラスミドの増幅の結果、及び個々のＣＯ８細胞によ り効果的に取られるそれぞれのプラスミドの割合に基づく結果である。本発明者 は、それぞれ異なった割合の同時トランスフェクトプラスミドが使用される場合 、ＣＯ８細胞におけるｈＧＨ産生の割合の変化を観察した。

この点を探究するための初期試みは、第４表の結果により確認される。この独立 した一連の実験においては、ＣＯＳモンキー細胞におけるｈＧＨの発現のために 得られた結果は、第３表に見られる結果にひじょうに類似する。ＣＯ８細胞にお けるくり返しの過渡発現アッセイの実験条件による定量的差異が存在するが、し かし定量点の見解から、ｔａｔ−ｍの熱シヨツク発現の効果は、この遺伝子がＬ ＴＲの制御下に置かれる場合、ｈＧＨの産生を明らかに高める。ＬＴＲ（ｐ１７ ＬＴＲｈＧＨｎｅｏ）の単なる制御下でのｈＧＨの比較的重要な発現は、ＣＯ８ 細胞中に生じる少なくともプラスミド増幅の条件下でこのプロモーターの基礎レ ベルを示すことができる。

このプラスミドが、２種の重量比のＨ３−ｔａｔ−ｍ　（１二１及び５：１）に より及び熱ショックの不在下で同時トランスフェクトされる場合の高いレベルの ｈＧＨ産生は、たぶんＨ３−ｔａｔ−ｍにおける熱シヨツク制御のわずかな漏れ の結果である。再びこの結果は、プラスミド増幅による過大視であり、そして明 らかにひじょうに低い最のｔａｔ　−Ｉ［Ｉ生成物がＬＴＲ活性に対して相当な 効果を有すると思われることが注目されるべきである。１ｌｅＬａ細胞における ｃａｔの発現のために観察される相当に強い制御は、このＣＯ８細胞結果の説明 を支持するよう思われる。それにもかかわらず、第１〜４表のデータのセットの それぞれに明らかな証拠が存在する。すなわち本発明に記載される発現システム は、熱シヨツクプロモーターのみの使用よりも両者においてが相当に強力である ことが示される。さらに、初期の熱ショックの後、数日間の連続した発現の実際 の利点は、細胞がそれらの正常な増殖温度に戻された後、多くの真核生物のタン パク質の産生の商業的規模においてひじように重要なものであろう。

国際調査報告 １ＩＩｌ−Ｐ１１＃””１１ｊｌ”ｋ”””嘩−ＰＣＴ／ＥＰ８８１００６４０ 国際調査報告　゛

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．内因性活性化因子により調節されるプロモーターの発現制御下に置かれた対 象の遺伝子によりコードされるタンパク質を産生するための方法であって： １）第１のハイブリッド遺伝子（１）を合成し、活性化因子タンパク質により刺 激され得るプロモーター配列の転写制御下に前記対象の遺伝子を組み入れ； ２）第２のハイブリッド遺伝子（２）を合成し、真核生物の誘発性プロモーター の制御下に前記活性化因子タンパク質を発現するための遺伝子を組み入れ； ３）前記第１及び第２のハイブリッド遺伝子をその中で発現するための適切な真 核生物宿主細胞系を選択し；４）前記第１及び第２のハイブリッド遺伝子を前記 宿主細胞中に導入し、それらを選択及び増殖にゆだね、そして増殖された細胞に ストレスをかけ、それによって活性化因子タンパク質を、前記第１の遺伝子の発 現を刺激するために前記第２の遺伝子により産生することを含んで成り、前記ス トレスを連続的に産生する前記活性化因子の量が、前記第２の遺伝子が正常に戻 された後の時間よりも相当に長い期間、前記対象のタンパク質の産生を促進する のに十分であることを特徴とする方法。
2. ２．前記第１の遺伝子におけるプロモーターがレトロウイルスの長い末端反復（ ＬＴＲ）配列であり、そして前記活性化因子タンパク質がトランス−活性化因子 タンパク質であり、両者はＨＩＶに由来し、そして前記第２の遺伝子における誘 発性プロモーターが真核生物の熱ショックプロモーターである請求の範囲第１項 記載の方法。
3. ３．前記ハイブリッド遺伝子（２）の熱ショック制御されたＤＮＡがＨＩＶエン ベロープ配列（中でも糖タンパク質配列）を含み、この発現生成物は、トランス −活性化因子タンパク質を与えるために細胞内プロセッシングを受ける請求の範 囲第２項記載の方法。
4. ４．前記ハイブリッド遺伝子が、トランスフェクション及び／又は感染により前 記宿主細胞中に導入されるＤＮＡトランスファーベクターにより運はれる請求の 範囲第２又は３項記載の方法。
5. ５．前記ＤＮＡベクターがプラスミド、コスミド又はウィルスＤＮＡである請求 の範囲第４項記載の方法。
6. ６．前記ハイブリッド遺伝子（１）及び（２）が、２種の独立した又はたった１ 種のトランスファーベクターにより運ばれる請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．前記ハイブリッド遺伝子（１）が、クロラムフェニコールトランスフェラー ゼ、すなわちｃａｔをコードするＤＮＡフラグメントに約０．７Ｘｂの　ＨＩＶ −ＬＴＲ領域を連結することによって調製されたプラスミドｐＬＴＲ−ｃａｔに 属し、そして前記ハイブリッド遺伝子（２）が、ヒトｈｓｐ７０遺伝子プロモー ター及びＲＮＡリーダー配列に連結されたＨＩＶプロウイルスのゲノムを担持す るプラスミドのｔａｔ−ＩＩＩ遺伝子から調製されたプラスミドＨＳ−ｔａｔ− ＩＩＩに属する請求の範囲第４項記載の方法。
8. ８．前記ハイブリッド遺伝子（１）を担持するプラスミド、ｐ１７ＬＴＲｈＧＨ ｎｅｏが、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子に関連する約０．７ＫｂのＨＩＶ −ＬＴＲ領域を含み、そして前記ハイブリッド遺伝子（２）がＨＳ−ｔａｔ−Ｉ ＩＩプラスミドに属する請求の範囲第４項記載の方法。
9. ９．前記宿主細胞が、培養培地中における生体外培養により、又は温血動物中に おける生体内培養により増殖される請求の範囲第２又は３項記載の方法。
10. １０．適切に選択された宿主細胞中での対象のタンパク質の発現のためのＤＮＡ システムであって、（１）トランス−活性化因子タンパク質によりそれ自体刺激 された、ＨＩＶからの長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター配列の制御下で前記 タンパク質をコードする１又は複数の遺伝子から成る遺伝子的に構築された第１ 構造体、及び（２）真核生物起源の連結された熱ショックプロモーターの運転作 用下でこのトランスー活性化因子タンパク質のその場での発現のための遺伝子か ら成る第２構造体〔ここで両構造体（１）及び（２）は前記宿主細胞に導入され る〕を含んで成るＤＮＡシステム。
11. １１．前記両者（１）及び（２）が、１種の単一ＤＮＡベクター上に担持される 単一の組換えＤＮＡ構造体に属する請求の範囲第１０項記載のＤＮＡシステム。
12. １２．前記構造体（１）及び（２）が、２種の別々のトランスファーベクターの ２種の独立したＤＮＡ構造体に属する請求の範囲第１０項記載のＤＮＡシステム 。
13. １３．前記トランスファーベクターが、プラスミド、コスミド又はウィルス配列 である請求の範囲第１１又は１２項記載のＤＮＡシステム。
14. １４．前記トランスファーベクターが、クローニングの間、菌株の同定のために 腫瘍又は抗生物質耐性配列を担持する請求の範囲第１３項記載のＤＮＡシステム 。
15. １５．遺伝子増幅のための配列、たとえばメトトレキセートの存在下で作用する ジヒドロキシフォレート遺伝子をさらに含んで成る請求の範囲第１０項記載のＤ ＮＡシステム。
16. １６．前記ＤＮＡベクターがさらに、エピソーム複製配列を担持する請求の範囲 第１１〜１５項記載のＤＮＡシステム。
17. １７．前記トランス−活性化因子遺伝子を、ｔａｔ−Ｉ、ｔａｔ−ＩＩ及びｔａ ｔ−ＩＩＩから選択する請求の範囲第１０項記載のＤＮＡシステム。