JPH0866190A - 哺乳動物の誘導性プロモーターカスケード系 - Google Patents

哺乳動物の誘導性プロモーターカスケード系

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JPH0866190A
JPH0866190A JP3100244A JP10024491A JPH0866190A JP H0866190 A JPH0866190 A JP H0866190A JP 3100244 A JP3100244 A JP 3100244A JP 10024491 A JP10024491 A JP 10024491A JP H0866190 A JPH0866190 A JP H0866190A
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dna
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ジェン チュング−ハー
Ming-Fan Law
ロウ ミン−ファン
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シルバークラング メルヴィン
George E Mark Iii
イー．マーク ザ サード ジョージ
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は新規哺乳動物誘導性カスケード遺伝
子発現系の開発を目的とする。 【構成】 lac レプレッサータンパク質を発現し、lac
オペレーターをコードするＤＮＡで調節されるＨＩＶト
ランスアクチベーター（ＨＩＶ−ＴＡＴ）をコードする
ＤＮＡ、および外来遺伝子がＴＡＴでトランスに活性化
されるＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの調節下にあるＤＮ
Ａを同時に含む組換哺乳動物細胞系を構築することを特
徴とする。 【効果】 ラクトースオペロンのインデューサーにより
目的遺伝子産物を高度に発現できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】真核細胞における遺伝子発現の制御に関す
る主なメカニズムの１つは、原核細胞と同様に、調節タ
ンパク質のそれが認識する特定ＤＮＡ配列への結合であ
る。調節タンパク質のその特定ＤＮＡ配列への結合は、
遺伝子の転写に関して正又は負の効果（各々活性化又は
抑制）を有することができる。遺伝子転写を調節するタ
ンパク質−ＤＮＡ相互作用に関して最も詳しく研究され
かつ最もよく理解された例の１つは、細菌大腸菌のlac
オペロンからのものに関する。lac オペレーターＤＮＡ
配列へのlac レプレッサータンパク質の結合による遺伝
子発現の抑制は、上流プロモーターからの転写を阻止す
る。抑制の解除はイソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトシ
ド（ＩＰＴＧ）のようなインデューサーの作用でおきる
が、これはlac レプレッサータンパク質とlac オペレー
ターＤＮＡとの相互作用を修正して、ｍＲＮＡ転写をプ
ロモーターから進行させる。
【０００２】lac レプレッサータンパク質はサブユニッ
ト分子量３８キロドルトン（ＫＤ）のホモテトラマーと
して機能し、哺乳動物細胞で組換え発現された。哺乳動
物細胞で発現されたlac レプレッサータンパク質はlac
オペレーターＤＮＡと相互作用して、同細胞内でlac オ
ペレーターを含むクローン化された遺伝子の発現を抑制
できることが示された。クローン化遺伝子発現の抑制解
除は外部培地へのＩＰＴＧ添加で誘導された。これは、
lac レプレッサー／オペレーター系が哺乳動物細胞にお
いて上流プロモーターからのクローン化遺伝子発現を抑
制するように機能できることを立証した。
【０００３】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含めた
レトロウイルスは、長鎖末端反復（ＬＴＲ）として知ら
れるウイルスゲノムのセグメントからウイルス遺伝子の
転写を指示する。ＬＴＲからの転写は、レトロウイルス
遺伝子産物トランスアクチベータータンパク質（ＴＡ
Ｔ）の結合により活性化される。ＴＡＴは約１0.５ｋＤ
のタンパク質であって、ＬＴＲにリンクされたすべての
遺伝子の強いトランスアクチベーターである。したがっ
て、ＴＡＴはＨＩＶ遺伝子発現に関して強い正のフィー
ドバックを示す。ＬＴＲプロモーターの活性化は、培養
により哺乳動物細胞内でクローン化遺伝子を発現させる
目的である程度利用されてきた。
【０００４】組換えＤＮＡ技術の出現は、外来タンパク
質を哺乳動物細胞で産生させることをかかるタンパク質
についてコードする外来ＤＮＡの導入により可能にし
た。外来タンパク質が活性プロモーターから構成的に発
現される哺乳動物発現系が開発された。これは外来遺伝
子の継続的発現をおこす。しばしば外来タンパク質の豊
富な存在は宿主細胞にとって毒性であり、構成的発現の
結果として宿主細胞群は弱体化して死滅するようにな
る。更に毒性タンパク質の豊富な存在は宿主細胞に選択
圧力を加えて、外来ＤＮＡの変異バージョンを有する細
胞群、即ち、大幅に修正されたタンパク質を発現するか
又は外来遺伝子を欠失した細胞群を出現させてしまう。
その結果、商業的に有用なレベルの構成的発現は組換え
細胞群で決して維持されないことになる。
【０００５】この欠点を克服する努力の結果、外来タン
パク質の発現を制御しうる誘導性哺乳動物発現系を開発
した。誘導性発現は特定レギュレーターの存在又は非存
在により制御されるプロモーターを用いることで達成で
きる。例えば、lac レプレッサータンパク質はそれがla
c オペレーターＤＮＡと結合した場合にlac 遺伝子の発
現を阻止する。発現はＩＰＴＧが細胞培地に加えられた
場合に誘導される。lac レプレッサー／オペレーター系
で制御される外来遺伝子もlac 遺伝子と同様にして調節
されるであろう。特にlac レプレッサー存在下におい
て、毒性外来遺伝子産物はＩＰＴＧが細胞に加えられな
いかぎり発現されない。この系は外来タンパク質の毒性
効果なしに細胞を高密度に増殖させうる。そのとき高レ
ベル発現はインデューサーＩＰＴＧを加えて行うことが
できる。
【０００６】外来遺伝子発現を制御するも１つの手段
は、特定アクチベータータンパク質の存在下で更に活性
になるプロモーターの使用である。かかるプロモーター
の制御下における外来遺伝子はアクチベーターの合成誘
導後にのみ高レベルで発現される。このようなプロモー
ター／アクチベーター系の例はＨＩＶ ＬＴＲ／ＴＡＴ
である。ＨＩＶ ＬＴＲからの転写はＴＡＴ及びＬＴＲ
の相互作用後１００倍以上に高められる。ＴＡＴの発現
を制御することで、ＬＴＲプロモーターからの転写が次
に制御される。したがって、ＨＩＶ ＬＴＲの転写制御
下における外来遺伝子はＴＡＴが存在する場合のみ高レ
ベルで発現される。本発明の目的は誘導可能な方法によ
るクローン化遺伝子の高レベル発現のために哺乳動物誘
導性プロモーターカスケード系を提供することである。
もう１つの目的は、ＨＩＶのトランスアクチベータータ
ンパク質（ＴＡＴ）の制御的発現のために複数lac オペ
レーターを含んだ発現ベクターを提供することである。
もう１つの目的は、細菌lac レプレッサー及びＨＩＶ
ＴＡＴタンパク質を有して同時発現する安定な哺乳動物
細胞系を提供することであるが、その細胞系においてＨ
ＩＶ ＴＡＴの発現はインデューサーの非存在下で強く
抑制される。もう１つの目的は、哺乳動物細胞における
挿入ＤＮＡ配列の誘導性発現のためにＴＡＴ依存性プロ
モーターを含む発現ベクターを提供することである。本
発明のこれら及び他の目的は以下の記載から明らかであ
ろう。
【０００７】プラスミドｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tk
Ｈygが組立てられ、プラスミドｐＣＭＶlac Ｉと共に培
養哺乳動物細胞内に同時導入された。ＴＡＴ発現が構成
的に合成されるlac レプレッサーで抑制され、かつＩＰ
ＴＧで誘導されるクローン系が選択された。発現用組換
え遺伝子はＨＩＶ ＬＴＲプロモーターＣＤ２３を含む
プラスミドに組込まれて分子的にクローン化され、ｐＣ
ＭＶlac Ｉ及びｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygの双
方を有する細胞内に安定的に導入された。ＩＰＴＧで誘
導された場合、ＴＡＴタンパク質は組換え遺伝子の高レ
ベル発現を導くＣＤ２３プロモーターを活性化する。
【０００８】用語の定義 プロモーター −ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、
ＲＮＡ合成の開始を合図するＤＮＡヌクレオチド配列lac オペレーター −lac レプレッサーの結合に特異的
で、lac レプレッサーと結合した場合に隣接プロモータ
ーからのＲＮＡ合成を阻止するＤＮＡヌクレオチド配列Lac レプレッサー −lac オペレーターＤＮＡ配列に結合
し、lac オペレーターと結合した場合に隣接プロモータ
ーからのＲＮＡ合成を阻止するタンパク質転写上制御される −ＲＮＡ合成が特定プロモーターで制
御されるＤＮＡ配列からのＲＮＡ合成転写上リンクした −特定プロモーターの転写制御下にお
けるすぐ近くの位置のＤＮＡ配列インデューサー −構造遺伝子のその転写上リンクしたプ
ロモーターからのＲＮＡ合成を活性化できる物質誘導性プロモーターカスケード −インデューサーの添加
でプロモーターを活性化し、その産物が別のプロモータ
ーを活性化するように連続段階で配列されたプロモータ
ー
【０００９】本発明は遺伝子発現用の哺乳動物誘導性プ
ロモーターカスケード系に関する。更に詳しくは、本発
明はlac オペレーターＤＮＡ配列を介してＴＡＴ遺伝子
の発現を抑制させる細菌lac レプレッサータンパク質の
動物細胞における使用に関する。インデューサーＩＰＴ
Ｇが存在する場合には、lac レプレッサータンパク質は
もはやＴＡＴ遺伝子発現を妨げず、ＴＡＴタンパク質が
合成される。次いでＴＡＴタンパク質はＨＩＶ ＬＴＲ
プロモーターを活性化するが、これはリンクした遺伝子
の発現をおこす。プロモーター活性化のこのカスケード
は、ＨＩＶ ＬＴＲで転写上制御されるあらゆる遺伝子
の高レベル発現をおこす。加えて、本発明は宿主細胞に
とって毒性のタンパク質をコードする遺伝子の動物細胞
内発現にも関する。
【００１０】本発明で利用される宿主細胞系はアフリカ
ミドリザル腎臓由来ＣＶ−１Ｐ細胞系である。ＣＶ−１
Ｐ細胞は組換え遺伝子発現系で使用しやすい生育特性・
特徴を有した繊維芽細胞様細胞系統である。様々な通常
用いられる哺乳動物細胞系が本発明での使用に適してい
ることは，当業者にとって容易に明らかであると理解さ
れる。哺乳動物種に由来した適切な細胞系としては格別
限定されず、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯動物起
源の細胞系がある。更に非哺乳動物種の適切な細胞系と
して格別限定されず、トリ及び他の高等非哺乳動物種の
細胞系がある。
【００１１】ＣＶ−１Ｐ細胞は市販標準細胞培地で増殖
かつ維持される。適切な市販細胞培地は濃度１０％で熱
不活化新生仔牛血清で補充されたダルベッコ改良イーグ
ル最少培地（ＤＭＥ）である。ＤＭＥ及び新生牛血清は
メリーランド州デイザースバーグのギブコ（ＧＩＢＣ
Ｏ）から入手できる。ＣＶ−１Ｐ細胞は典型的には当業
界で標準的な組織培養技術に従い維持される。ボトル、
フラスコ又は培養皿のような適切な組織培養容器にＣＶ
−１Ｐ細胞を接種し、細胞が容器の増殖域を覆うまで細
胞は空気中５〜１０％ CO2の雰囲気下保湿インキュベー
ター内において３７℃でインキュベートされる、細胞を
トリプシン処理で回収し、約１：１０希釈で別の組織培
養容器に接種するか又は細胞を血球計で計測して特定数
の細胞を接種する。
【００１２】本発明の誘導性プロモーターカスケード系
の必須成分は、細菌lac レプレッサータンパク質につい
てコードするＤＮＡを有して発現させる組換え宿主細胞
系である。この組換え宿主細胞系は、各々５′→３′の
順序でｍＲＮＡ転写プロモーター、lac オペレーター及
びＨＩＶ ＴＡＴタンパク質を連続的にコードするＤＮ
Ａも有していなければならない。前記組換え宿主細胞系
を組立てるために、２種の別個の異なるプラスミドがＣ
Ｖ−１Ｐ細胞内に導入された。ｐＣＭＶlac Ｉとして当
業界で知られるプラスミド〔ブラウンら，１９８７年，
セル，第４９巻，第６０３頁（Broun, el al.,（１９８
７）Cell, ４９，pp, ６０３）〕は、細菌lac レプレッ
サー遺伝子に転写上リンクされたサイトメガロウイルス
最初期プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）を含んでいる。ｐ
ＣＭＶlac Ｉの組立て方は既に記載されており、そのプ
ラスミドは変更せずＣＶ−１Ｐ細胞内へ導入した。ＣＭ
Ｖ ＩＥ以外のプロモーターもＣＶ−１Ｐ及び他の細胞
系におけるlac レプレッサー遺伝子の発現に適している
ことは、当業者にとって容易に明らかである。他の適切
なプロモーターとしては格別限定されず、ＳＶ４０初期
プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、マウス乳房
腫瘍ウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、モロ
ニー白血病ウイルスＬＴＲ及びヘルペスウイルスチミジ
ンキナーゼプロモーターがある。
【００１３】哺乳動物又は他の高等動物細胞培養で細菌
lac レプレッサータンパク質を発現しうるのであれば、
いかなる組換えＤＮＡ組立体又はプラスミドもｐＣＭＶ
lacＩに代わり本発明での使用に適していると理解され
る。第二のプラスミドは各々５′→３′の順序にＳＶ４
０初期プロモーター、複数のlac オペレーターコードＤ
ＮＡ配列及びＨＩＶ ＴＡＴ遺伝子を含むように組立て
られた。図２は下記の組換えＤＮＡクローニング法につ
いて示している。
【００１４】３′末端でＳＶ４０後期ポリアデニル化シ
グナルコードＤＮＡ（ＳＶ４０後期ボリ（Ａ））とリン
クし、全ＴＡＴタンパク質についてコードするＤＮＡは
プラスミドｐＤ５ＴＡＴから得られた。ｐＤ５ＴＡＴは
当業界で公知のプラスミドであり、その組立て方は詳細
に記載されている〔バークナーら，１９８８年，Ｙ．グ
ルツマン及びＳ．Ｈ．ヒューズ（編集）、分子生物学に
関する現在の情報、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー，ニュ
ーヨーク，第５６−６１頁（Berkner et al., （１９８
８）In Y. Gluzman and S. H. Hughes(ed.) Current Co
mmunications in Molecular Biology, Cold Spring Har
bor Laboratory, Cold Spring Harbor, N Y., pp. ５６
−６１）；アルヤら，サイエンス，１９８５年，第２２
９巻，第６９頁（Arya et al., Science（１９８５）２
２９，pp, ６９）〕。ｐＤ５ＴＡＴはｐＤ５ＴＡＴを１
カ所開裂させる制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩで切断
され、１本の直鎖4.６キロ塩基対（kbp)ＤＮＡ分子を生
じた。ｐＤ５ＴＡＴから既存転写制御要素を除く一方で
完全ＴＡＴコードＤＮＡを保存するため、ＥcoＲＩ直鎖
化ｐＤ５ＴＡＴは制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩで部
分切断された。ＢamＨＩ部分切断ステップは双方のＢam
ＨＩ認識部位でｐＤ５ＴＡＴ ＤＮＡを開裂させずに、
一方のＢamＨＩ部位でのみ開裂させる。その結果、3.２
kbp ＤＮＡ断片は完全ＴＡＴ遺伝子及びＳＶ４０初期ポ
リ（Ａ）シグナルを含んでいる。この3.２kbp 断片はプ
レパラティブアガロースゲル電気泳動で精製され、５′
リン酸は子牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）に
よる処理で除去された。次いでＤＮＡ断片の末端は、Ｅ
coＲＩ及びＢamＨＩ切断に基づく５′突出部（粘着末
端）を補充（ブラント末端化）するためＤＮＡポリメラ
ーゼＩのクレノウ断片で処理された。次いでブラント末
端化ＤＮＡはＨind III 部位を含んだ合成ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドに結合され、ｐＴＡＴを形成する。ｐＴＡ
Ｔは大腸菌による増殖で増幅された。
【００１５】ｐＴＡＴはＨind III で切断され、ｐＳＶ
lac ＯＣＡＴに由来する1.１kbp ＤＮＡ断片に結合され
た。ｐＳＶlac ＯＣＡＴは当業界で公知のプラスミドで
ある（ブラウンら，セル，１９８７年，第４９巻，第６
０３頁）。1.１kbp 断片はＳＶ４０初期プロモーター及
び細菌lac オペレーターＤＮＡ配列を含むが、これはｐ
ＳＶlac ＯＣＡＴをＨind III で切断して形成された。
得られたプラスミドはｐＳＶlac ＯＴＡＴと命名され
た。
【００１６】ｐＳＶlac ＯＴＡＴ（4.３kbp ）はlac オ
ペレーターの単一コピーにリンクされたＳＶ４０初期プ
ロモーターを含んでおり、更にそのオペレーターはＴＡ
Ｔ遺伝子及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルにリンク
している。ｐＳＶlac ＯＴＡＴにおけるＳＶ４０初期プ
ロモーターがＣＶ−１Ｐ細胞及び他の細胞系における発
現に適した他の異なるプロモーターと交換しうること
は、当業者にとって容易に明らかであると理解される。
他の適切なプロモーターとしては格別限定されず、サイ
トメガロウイルス最初期プロモーター、ＳＶ４０後期プ
ロモーター、マウスメタロチオネインプロモーター、マ
ウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴ
Ｒ、モロニー白血病ウイルスＬＴＲ及びヘルペスウイル
スチミジンキナーゼプロモーターがある。ＳＶ４０後期
ポリ（Ａ）シグナルが他の異なるポリ（Ａ）シグナルで
交換しうることも、当業者にとって容易に明らかであ
る。他の適切なポリ（Ａ）シグナルとしては格別限定さ
れず、ＳＶ４０初期ポリ（Ａ）、牛成長ホルモンポリ
（Ａ）、ベータグロビンポリ（Ａ）及びヒトコラーゲン
ポリ（Ａ）がある。
【００１７】ｐＳＶlac ＯＴＡＴを組立てる目的はＴＡ
Ｔタンパク質発現用のプラスミドを提供することであ
る。本発明の誘導性プロモーターカスケード系において
はＴＡＴの構成的発現をさせることが望まれず、その理
由はこれがＨＩＶ ＬＴＲプロモーターの制御下におい
て、毒性になりうるタンパク質の連続発現を起すことが
できるからである。ＴＡＴの発現は組換え宿主細胞で強
く制御されねばならない。本発明によれば、ＴＡＴ発現
はＳＶ４０初期プロモーターとＴＡＴコードＤＮＡの間
におけるlac オペレーターＤＮＡの導入によって制御さ
れる。lac レプレッサータンパク質が存在する場合、レ
プレッサータンパク質はlac オペレーターＤＮＡに結合
して、ＴＡＴ発現を妨げる。遺伝子発現を誘導可能に制
御できかつ当業界で周知である、lac レプレッサー／オ
ペレーター系と同様の方法で機能する他の遺伝メカニズ
ムも存在する。これらの誘導可能な系としては格別限定
されずメタロチオネインプロモーター系及び熱ショック
応答系があるが、これらは本発明のlac レプレッサー／
オペレーター系に代わることができる。
【００１８】lac オペレーターＤＮＡ配列の単一コピー
では下流遺伝子の発現を完全に抑制する上で十分でない
ことが当業界で知られている。これは本発明の目的にと
っては“漏出”系であって、一部のＴＡＴ発現を起させ
て、潜在的に毒性なクローン化遺伝子の発現を妨げる上
で必要なプロモーターカスケードにおける制御をこわし
てしまう。
【００１９】ＴＡＴ発現において強い非漏出制御を保証
するため、複数コピーのlac オペレーターＤＮＡ配列が
ｐＳＶlac ＯＴＡＴ中ＳＶ４０初期プロモーター及びＴ
ＡＴ遺伝子の間に挿入された。複数のlac オペレーター
ＤＮＡ配列は、lac オペレーターとのlac レプレッサー
相互作用の動的性質のおかげで、いつも１以上のlacレ
プレッサー分子と結合しうる大きな可能性を有してい
る。したがって、複数のlac オペレーターはＴＡＴ抑制
を高める。lac オペレーターの３タンデムコピーを含む
合成６０塩基対ＤＮＡオリゴヌクレオチドはアニーリン
グされて、ｐＳＶlac ＯＴＡＴの唯一のＳalＩ部位に結
合された。ＳalＩ部位はＴＡＴ遺伝子の５′非コード領
域内に存在する。得られたプラスミドはｐＳＶlac ＯＳ
Ｏ３ＴＡＴと命名された。lac オペレーター配列の機能
は、ＴＡＴの抑制に関してＴＡＴ遺伝子のアミノ酸コー
ド部分とそのプロモーターの間におけるその厳密な位置
によっては影響されない。したがって、本発明における
ＳalＩ部位の使用は簡便かつ適切な近位置であることに
基づくのであって、ＴＡＴ抑制に関する必要性に基づく
ものではない。ｐＳＶlac ＯＴＡＴのＳalＩ部位以外の
部位もlac オペレーター配列の導入用に適した部位であ
ることは、当業者にとって容易に明らかである。更に、
利用されるlac オペレーターの数は様々でよく、ｐＳＶ
lac ＯＳＯ３ＴＡＴに相当するプラスミドでは本発明で
有用なｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴと同数のlac オペレー
ター配列を必要としない。
【００２０】次いで優性選択マーカーがｐＳＶlac ＯＳ
Ｏ３ＴＡＴ中にクローニングされた。tkプロモーターを
含むＨygＢR 遺伝子カセットはｐＡＬ２から得たが、こ
れはヘルペスウイルスtkプロモーターの制御下のヒグロ
マイシンＢ耐性遺伝子を含んだ無毒化ｐＢＲ３２２誘導
体である。ＨygＢR 遺伝子カセットを含む他のプラスミ
ド、例えばｐＭＡＭ（カタログNo. ６１００−１）はカ
リフォルニア州パロアルトのクローンテック・ラブス社
（Clonetech Labs, Inc.) から入手できる。本発明で利
用されるプラスミド保有細胞を選択するすべての方法が
自由に交換しうることは、当業者にとって容易に明らか
である。ＢamＨＩによるｐＡＬ２の切断で2.０kbp Ｈyg
ＢR カセットを切り出す。次いでこの2.０kbp ＢamＨＩ
断片はｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴの唯一のＢglII部位に
結合されて、ｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygを形成
した（図３参照）。
【００２１】ＴＡＴタンパク質を誘導可能に発現しうる
安定な細胞系を得るため、ｐＣＭＶlac Ｉ及びｐＳＶla
c ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygがリン酸カルシウム共沈法に
よってＣＶ−１Ｐ細胞内にコトランスフェクトされた。
ＨygＢ含有培地で選択してＨygＢ耐性クローンが出現し
た。哺乳動物細胞内に外来ＤＮＡを導入する他の方法も
本発明での使用に適していることは、当業者にとって容
易に明らかである。これらの方法としては格別限定され
ず、電気ポレーション(electroporation) 、レトロウイ
ルス感染、リポソーム融合、ＤＥＡＥデキストラン及び
マイクロインジェクションがある。ｐＣＭＶlac Ｉ及び
ｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygを各々４８対１のモ
ル比で含む溶液が沈降用に調製された。この比率はプラ
スミドｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygのみを含むＨ
ygＢR クローンの数を減少させるために用いられた。双
方のプラスミドがＣＶ−１Ｐ細胞内に同時に導入される
ことは必要でない。加えて、いずれか特定のプラスミド
モル比が用いられることも必要でない。
【００２２】個々のＨygＢR クローンは、ＴＡＴタンパ
ク質を誘導可能に発現させ、ついでクローン化遺伝子を
発現させうるそれらの能力の評価を行うために増殖させ
た。
【００２３】本発明のプロモーターカスケード系でクロ
ーン化される遺伝子の誘導性発現のために、ＨＩＶ Ｌ
ＴＲプロモーター含有プラスミドが組立てられた。ＨＩ
ＶＬＴＲプロモーターはＴＡＴタンパク質で転写活性化
される。したがって、ＨＩＶ ＬＴＲに転写上リンクし
たクローン化遺伝子はＴＡＴタンパク質の存在下で活性
的に転写される。ＨＩＶ ＬＴＲにリンクしたクローン
化遺伝子だけが異なる種のプラスミドが用いられた。当
業界で公知のプラスミドｐＣＤ２３ＣＡＴ（4.７kbp ）
〔シーケビッツ（Siekevitz)ら，サイエンス，１９８７
年，第２３８巻，第１５７５頁〕はＣＤ２３プロモータ
ーとして知られるＨＩＶ ＬＴＲの一部を含んでいる
（図４参照）。ＣＤ２３はＬＴＲ転写開始部位に関して
ヌクレオチド−１１７〜＋８０のＨＩＶＬＴＲ領域をコ
ードしている。ｐＣＤ２３ＣＡＴはＣＤ２３プロモータ
ーに転写上リンクされたクロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子も含んでいる。Ｃ
ＡＴ活性は容易に測定でき、ＣＡＴ遺伝子発現レベルと
直接相関している。
【００２４】ｐＣＤ２３ＣＡＴは、ＳＶ４０初期ポリ
（Ａ）シグナルと共に1.６kbp ＣＡＴ遺伝子を除去する
一方で、ＣＤ２３プロモーターを含めて残りのプラスミ
ドを完全な形で留めるためにＨind III 及びＢamＨＩで
切断された。3.０kbp ＣＤ２３含有断片はアガロースゲ
ル精製され、ｐＣＨ１１０〔ファルマシア（Pharmacia)
から購入〕をＨind III 及びＢamＨＩによって切断して
得られた、β−ガラクトシダーゼ（ＬacＺ）遺伝子及び
ＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルをコードする3.８kbp
ＤＮＡ断片と結合された。得られたプラスミドはｐＣＤ
２３ＬacＺと命名された（図５参照）。β−ガラクトシ
ダーゼ（b-gal)活性は容易に測定でき、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子発現レベルと直接相関している。
【００２５】吸血コウモリプラスミノーゲンアクチベー
ター（Ｂat−ＰＡ）遺伝子にリンクされたＣＤ２３プロ
モーターを含む第三のプラスミドが組立てられた。Ｈin
d III 及びＢamＨＩで形成されたｐＣＤ２３ＣＡＴの3.
０kbp ＣＤ２３含有断片は1.５kbp Ｈind III 及びＸba
Ｉで形成されたＢat−ＰＡコードＤＮＡ断片とＸbaＩ及
びＢamＨＩで形成されたＳＶ４０初期ポリ（Ａ）シグナ
ルコード0.２５kbp ＤＮＡ断片の双方に結合された。こ
のプラスミドはｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡと命名された（図
６参照）。Ｂat−ＰＡ活性は容易に測定され、Ｂat−Ｐ
Ａ遺伝子発現レベルと直接相関している。
【００２６】増殖させたＨygＢR クローンの各々は、 l
acＩ／ lacＯ系がＴＡＴ発現を機能的に制御するか否か
を調べるためにスクリーニングされた。プラスミドｐＣ
Ｄ２３ＣＡＴ及びｐＣＤ２３ＬacＺが一過性発現アッセ
イに用いられた。各ＨygＢR クローンから約１×１０6
細胞が組織培地の入った３つの６０mm組織培養皿の各々
に接種された。接種時にＩＰＴＧが３つのうち１つの細
胞皿に約２０mMの最終濃度で加えられ、すべてのプレー
トが約２４時間インキュベートされた。一方がＩＰＴＧ
含有で他方がＩＰＴＧ非含有である２つの細胞培養皿は
リン酸カルシウム共沈法によりｐＣＤ２３ＣＡＴ又はｐ
ＣＤ２３ＬacＺでトランスフェクトされた。第三の細胞
皿は擬似トランスフェクトされた（無ＤＮＡ）。次いで
細胞を約４８時間インキュベートし、ＣＡＴアッセイ又
はｂ−gal アッセイを各ヒグロマイシン耐性クローン由
来の細胞の培養皿３つについて行われた。ｐＣＤ２３Ｃ
ＡＴによるトランスフェクト前にＩＰＴＧ存在下でイン
キュベートされた細胞は、lac レプレッサータンパク質
の活性に対するＩＰＴＧの効果に起因したＴＡＴ遺伝子
発現の脱抑制に基づき高レベルのＣＡＴ活性を示した。
ＴＡＴ発現の抑制解除はＣＤ２３プロモーターのトラン
スの活性化をおこし、しかる後ＴＡＴ遺伝子の高レベル
発現をおこした。
【００２７】逆に、ｐＣＤ２３ＣＡＴによるトランスフ
ェクト前にＩＰＴＧ非存在下でインキュベートされた細
胞は非常に低レベルでしかＣＡＴ活性を示さなかった。
これらの細胞では、ＴＡＴの発現はＩＰＴＧ非存在下で
lac オペレーターと結合するlac レプレッサータンパク
質により抑制された。ＴＡＴタンパク質の非存在下では
ＣＤ２３プロモーターはトランス活性化されず、非常に
低レベルのＣＡＴ遺伝子発現及びＣＡＴ活性を示しただ
けであった。擬似トランスフェクト細胞のプレートは、
細胞に内在するバックグラウンドＣＡＴ活性のコントロ
ールとして用いられた。
【００２８】同様の原則がｐＣＤ２３ＬacＺでトランス
フェクトされた細胞にもあてはまる。ＩＰＴＧ存在下ｐ
ＣＤ２３ＬacＺでトランスフェクトされた細胞は高いｂ
−gal 活性を有し、一方ＩＰＴＧ非存在下ｐＣＤ２３Ｌ
acＺでトランスフェクトされた細胞は非常に低いｂ−ga
l 活性を有するだけである。
【００２９】この方法によるＨygＢR クローンのスクリ
ーニングで、ｐＣＭＶlac Ｉからlac レプレッサータン
パク質を発現させ、かつｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tk
Ｈygからのlac オペレーターＤＮＡで調節されるＳＶ４
０初期プロモーターにリンクされたＴＡＴ遺伝子を含ん
だクローンを確認することができる。ＩＰＴＧと共にイ
ンキュベートされた細胞における高ＣＡＴ活性は、ＩＰ
ＴＧ非存在下の細胞及びコントロールトランスフェクト
細胞における低ＣＡＴ活性と一緒になって、ＴＡＴ遺伝
子発現の lacＩ／lac Ｏ調節が機能していることを示
す。一過性ＣＡＴ発現アッセイから、ＩＰＴＧなしで増
殖させた細胞では低レベルのＣＡＴ活性を、及びＩＰＴ
Ｇ存在下では有意に高レベルのＣＡＴ活性を示すＨygＢ
R クローンが確認された。ＨygＢR クローンの１つは１
０mMＩＰＴＧ存在下で約４０倍のＣＡＴ活性増加を示し
た。このＨygＢR クローンはＩＰＴＧなしで低レベルの
ｂ−gal 活性及びＩＰＴＧ存在下で非常に高レベルのｂ
−gal 活性も示した。ｂ−gal 活性はｐＣＤ２３ＬacＺ
によるトランスフェクション後２日目に約２５倍増加し
た。このＨygＢR クローンはＣＩＯＴＡＴと命名された
（ＣＶ−１ＰのＣ； lacＩ／lac ＯのＩＯ；及びＨＩＶ
ＴＡＴのＴＡＴ）。同様のＣＡＴ活性を示す他のクロ
ーンも確認されたが、しかしながらＣＩＯＴＡＴがＩＰ
ＴＧ誘導対非誘導ＣＡＴ及びｂ−gal 発現の比が高いた
め、選択された。
【００３０】誘導ＣＡＴ及びｂ−gal 活性レベルが低い
クローンが本発明での使用に適することが理解される。
高レベルの誘導ＣＡＴ又はｂ−gal 発現のクローンも本
発明での使用に適することも理解される。ＣＩＯＴＡＴ
の選択が、この特定ＨygＢR クローンの特徴が本発明で
の使用適合上必要であることを示すものではない。最低
１０倍のＣＡＴ誘導及び最低１０倍のｂ−gal 誘導があ
れば本発明での使用適合性を示すことを本発明者らは示
唆するものである。
【００３１】ＣＩＯＴＡＴ細胞におけるlac レプレッサ
ータンパク質の発現は細胞溶解物の免疫ブロット分析で
実証された。ＣＩＯＴＡＴ及びＣＶ−１Ｐ細胞溶解物が
調製され、免疫ブロットが実施例７で記載されるように
行われた。lac レプレッサータンパク質に特異的な抗体
は、ＣＶ−１Ｐ細胞溶解物では存在しないＣＩＯＴＡＴ
細胞溶解物における３８kDのタンパク質を同定したが、
これはＣＩＯＴＡＴ細胞におけるlac レプレッサータン
パク質の発現を示す。
【００３２】lac レプレッサータンパク質を産生しかつ
ＩＰＴＧ存在下でＴＡＴ発現を誘導しうるＣＩＯＴＡＴ
細胞のサンプルは１２３０／パークローン・ドライブ，
ロックビル・メリーランド州２０８５２におけるアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクショク（Americna T
ype Culture Collection) の永久培養期間に無制限に利
用可能に寄託され、受理No. ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０４
０５が付された。
【００３３】ＩＰＴＧ以外のエフェクター（インデュー
サー及び抗インデューサー）もlacＩ／lac Ｏ系での使
用に適することは当業者にとって容易に明らかである。
このようなエフェクターの例としては格別限定されず、
メチルｂ−Ｄ−ガラクトシド、メチル１−チオ−ｂ−Ｄ
−ガラクトシド、ｎ−プロピル１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラ
クトシド、イソプロピルｂ−Ｄ−ガラクトシド、ｎ−ブ
チルｂ−Ｄ−ガラクトシド、ｎ−ブチル１−チオ−ｂ−
Ｄ−ガラクトシド、ベンジルｂ−Ｄ−ガラクトシド、ベ
ンジル１−チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトシド、２−フェニル
エチルｂ−Ｄ−ガラクトシド、２−フェニルエチル１−
チオ−ｂ−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−アミノフェニルｂ−
Ｄ−ガラクトシド、ｐ−アミノフェニル１−チオ−ｂ−
Ｄ−ガラクトシド、Ｏ−ニトロフェニル１−チオ−ｂ−
Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニトロフェニル１−チオ−ｂ−
Ｄ−ガラクトシド、Ｄ−フコース、ガラクトース、６−
フルオロ−６−デオキシ−Ｄ−ガラクトース、メリビオ
ース及びチオアロラクトースがある。
【００３４】ＣＡＴ活性及びｂ−gal 活性は、一過性Ｃ
ＡＴ及びｂ−gal 発現アッセイにおいてＣＩＯＴＡＴ細
胞でＴＡＴ遺伝子発現を調節する機能性 lacＩ／lac Ｏ
系の存在を実証した。他の遺伝子もＣＩＯＴＡＴ細胞で
の一過性遺伝子発現のためにｐＣＤ２３ＣＡＴにおいて
ＣＡＴ遺伝子に代えてよい。しかしながら、クローン化
される遺伝子の商業的発現のためには永続的に安定な細
胞系を確立することが更に望まれる。永続的に安定な細
胞系は多量の組換えタンパク質を得る上で操作を更に規
模拡大しやすくかつ培養で更に容易に操作しうるが、そ
の理由はそれらがクローン化遺伝子を発現させるために
新たなラウンド毎にＤＮＡトランスフェクションを要し
ないからである。
【００３５】クローン化遺伝子を誘導可能に発現させう
る永続的安定細胞系はＣＩＯＴＡＴ細胞を用いて確立さ
れた。ＣＩＯＴＡＴ細胞はｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡ及びｐ
ＲＳＶＮeoでコトランスフェクトされた。優性選択マー
カーのネオマイシン耐性遺伝子はｐＲＳＶＮeoに存在す
るが、そのプラスミドは当業界で公知であり、ＡＴＣＣ
３７１９８としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションから入手できる。ｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡ及び
ｐＲＳＶＮeoの双方はリン酸カルシウム共沈トランスフ
ェクション法でＣＩＯＴＡＴ細胞内に同時導入された。
各モル比１０対１のｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡ及びｐＲＳＶ
Ｎeoがトランスフェクションに用いられた。異なるモル
比の２プラスミドでも個別細胞内に双方のプラスミドを
うまくトランスフェクトしうることは、当業者にとって
容易に明らかである。１０対１の比率は、発現されるク
ローン化遺伝子を含むプラスミドとは独立のプラスミド
に存在する選択マーカーを導入する目的にとって当業界
では標準的である。
【００３６】ネオマイシン耐性遺伝子又はいずれか他の
選択マーカーがｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡ又はいずれかのＣ
Ｄ２３プロモーター含有プラスミドに直接挿入されうる
ことも当業者にとって容易に明らかである。トランスフ
ェクション後、ネオマイシン誘導体Ｇ４１８が約２００
mg／mlで培地に加えられた。出現したＧ４１８耐性クロ
ーンはＢat−ＰＡを誘導発現しうるクローンに関してス
クリーニングするため単離し増殖させた。
【００３７】各Ｇ４１８耐性クローンに関して約２×１
０5 細胞が６ウェル組織培養皿（３５mm径ウェル）のう
ち５ウェルに接種された。次いでＩＰＴＧが0.１、1.５
及び４０mMの濃度で４ウェルの培地に加えられたが、５
番目のウェルにはＩＰＴＧが加えられない。培地サンプ
ルはインキュベート開始後２、３、４及び６日目に各ウ
ェルから取り出された。Ｂat−ＰＡは分泌タンパク質で
あるため、培地は市販〔アメリカン・ジアグノスチカ社
（American Diagnostica, Inc.）〕分光スペクトル測定
プラスミノーゲンアクチベーターアッセイを用いてＢat
−ＰＡ活性に関し直接調べられた。
【００３８】Ｂat−ＰＡを誘導発現して培地中に分泌す
るＧ４１８耐性クローンが確認された。最大Ｂat−ＰＡ
誘導（約１００倍）は約１〜５mM、好ましくは約１mMの
ＩＰＴＧを用いて約６日間のＩＰＴＧ誘導した場合に認
められた。このＧ４１８耐性クローンはＣＩＯＴＡＴ−
Ｂat−ＰＡと命名された。細胞系ＣＩＯＴＡＴ−Ｂat−
ＰＡのサンプルは１２３０１バークローン・ドライブ，
ロックビル，メリーランド州２０８５２におけるアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクションの永久培養機
関に無制限に利用可能に寄託され、受理No. ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１０４０４が付された。
【００３９】本発明で用いられるプラスミドは、哺乳動
物細胞内への導入され最終的に宿主細胞ＤＮＡに組込ま
れる。安定細胞系ＣＩＯＴＡＴ及びＣＩＯＴＡＴ−Ｂat
−ＰＡはｐＣＭＶlac Ｉ、ｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−
tkＨyg（ＣＩＯＴＡＴ細胞）及びｐＣＤ２３−Ｂat−Ｐ
Ａ（ＣＩＯＴＡＴ−Ｂat−ＰＡ細胞）の組込まれたコピ
ーを含んでいる。他のプラスミドもlac レプレッサー発
現（ｐＣＭＶlac Ｉと類似）、lac オペレーター調節Ｔ
ＡＴ発現（ｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygと類似）
及びいずれかのクローン化遺伝子発現（ｐＣＤ２３−Ｂ
at−ＰＡと類似）に関するベクターとして適することは
当業者にとって容易に明らかである。これらの他の適切
なプラスミドベクターは染色体外で複製しうるタイプ
（エピゾーム）でもよく、それらとしては格別限定され
ず牛パピローマウイルスをベースとするベクター、アデ
ノウイルスをベースとするベクター及びヘルペスウイル
スをベースとするベクターがある。遺伝子増幅のために
選択でき増幅性ＤＮＡ配列として作用するマーカー遺伝
子を、本発明に用いられるいかなる。プラスミド及び本
発明で用いられるものに代わりうるいかなるプラスミド
ベクターにも挿入できることも当業者にとって容易に明
らかである。本発明の誘導性プロモーターカスケードで
の使用上プラスミドに挿入してよい増幅性ＤＮＡ配列と
しては格別限定されず、ジヒドロ葉酸レダクターゼＤＮ
Ａ、多剤耐性ＤＮＡ及びグルタミンシンテターゼＤＮＡ
がある。
【００４０】明細書のここまでは説明目的で示される実
施例と共に本発明の原理を開示しているが、本発明の実
施にここで記載された操作及びプロトコールのすべての
通常のバリエーション、改変、修正、欠失又は付加を特
許請求の範囲及びその相当範囲内に属するとして包むこ
とが理解されるであろう。下記実施例は本発明について
説明するが、しかしながら本発明をそれに限定するもの
ではない。下記実施例で記載される各参考文献の開示
は、参考のため本明細書に組込まれる。
【００４１】実施例１ＬacＩプラスミド ：プラスミドｐＣＭＶlac Ｉは当業界
で公知であり（ブラウンら，セル，第４９巻，第６０３
頁，１９８７年）、その組立て方は以下のように記載さ
れる。全lac Ｉq コード配列を含むＰstＩで形成される
ＤＮＡ断片〔カロスら，モレキュラー・アンド・ゼネラ
ル・ジェネティクス，第１８３巻，第５５９頁，１９８
１年（Calos et al., Mol. Gen. Genet., １８３：５５
９（１９８１））〕をｐＢＲ３２２のＰstＩ部位に結合
させた。クローン化される lacＩ遺伝子の開始コドンを
合成オリゴヌクレオチドとの交換でＧＴＧからＡＴＧに
修正した。得られたＤＮＡは、ｂ−ラクタマーゼプロモ
ーターとリンクされた場合に、 lacＩ- 大腸菌を lacＩ
+ に変換することが示された。哺乳動物細胞における l
acＩの発現のために、プラスミドｐＣＭＶlac Ｉを組立
てた。このプラスミドはサルＣＭＶコルバーン（Colbur
n)株〔ジャングら，モレキュラー・セル・バイオロジ
ー，第２２１４頁，１９８４年（Jeang et al., Mol. C
ell. Biol., ２２１４（１９８４））〕からの最初期遺
伝子（ＩＥ９４）プロモーター配列、完全 lacＩコード
配列（ＡＴＧコドン修正）含有1.１kbp ＤＮＡ断片及び
下流にポリ（Ａ）シグナルを含んでいる。
【００４２】実施例２ ＳＶ４０初期プロモーター及びlac オペレーター配列を
含むＴＡＴプラスミドの組立て lac オペレーター配列を含むＴＡＴ発現プラスミドｐＳ
Ｖlac ＯＴＡＴは下記のように組立てた。アデノウイル
ス５ori 、ＳＶ４０エンハンサー、アデノウイルス２主
後期プロモーター／３分節系リーダー、ＴＡＴｃＤＮＡ
〔アルヤ（Arya) ら，サイエンス，第２２９巻，第６９
頁，１９８５年〕及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナル
を含んだプラスミドｐＤ５ＴＡＴ〔バークナーら，第５
６−６１頁，１９８８年，Ｙ．グルツマン及びＳ．Ｈ．
ヒューズ（編集）、分子生物学に関する現在の情報、コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コール
ド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク〕を制限エン
ドヌクレアーゼＥcoＲＩで完全に切断し、しかる後制限
エンドヌクレアーゼＢamＨＩで部分切断して、すべての
調節配列（全部で約1.４kbp ）を除去する一方でＴＡＴ
ｃＤＮＡ配列及びＳＶ４０後期ポリ（Ａ）シグナルを
残した。得られた3.２kbp 直鎖化ＤＮＡ断片をＣＩＡＰ
で処理して、５′末端を脱リン酸化した。次いで末端を
４種全部のｄＮＴＰ存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのク
レノウ断片で処理してブラント末端化した。リン酸化Ｈ
ind III オリゴヌクレオチドリンカー（ＣＣＡＡＧＣＴ
ＴＧＧ）をアニーリングし、しかる後脱リン酸化ブラン
ト末端断片に結合させた。得られたプラスミド（ｐＴＡ
Ｔ）を用い、大量のｐＴＡＴを製造するため大腸菌を形
質転換した。ｐＳＶlac ＯＣＡＴ（ブラウンら，セル，
第４９巻，第６０３頁，１９８７年）をＨind III で切
断して、1.１kbp ＳＶ４０初期プロモーター／lac オペ
レーター含有ＤＮＡ断片を取出し、リンカーで形成され
たｐＴＡＴの唯一のＨind III 部位に挿入して、プラス
ミドｐＳＶlac ＯＴＡＴを形成させた。
【００４３】ＸhoＩ相補末端と共にlac オペレーター配
列の３タンデムコピーを含む６０塩基対ＤＮＡオリゴヌ
クレオチド： TCGAG(ATTGTGAGCGCTCACAAT)3C を合成し、アニーリングし、ｐＳＶlac ＯＴＡＴの
（５′非翻訳ＴＡＴ配列における）唯一のＳalＩ部位に
挿入して、プラスミドｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴを形成
させた（図２参照）。
【００４４】選択マーカー含有ｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡ
Ｔプラスミドを組立てるため、tkプロモーター駆動Ｈyg
ＢR 遺伝子を下記のようにｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴの
唯一のＥcoＲＩ部位に挿入した。プラスミドｐＳＶlac
ＯＳＯ３ＴＡＴをＥcoＲＩで直鎖化し、クレノウ断片で
処理してＥcoＲＩ形成末端を埋め、ブラント末端を形成
させた。次いでブラント末端化ＤＮＡをＣＩＡＰの処理
で脱リン酸化した。次いでリン酸化ＢglIIリンカー（Ｃ
ＡＧＡＴＣＴＧ）をブラント末端化ＤＮＡに結合させ
た。得られたＤＮＡは、次ステップ用に唯一のＢglII部
位を含んだ十分量のＴＡＴプラスミドを得る目的で大腸
菌を形質転換するために用いた。
【００４５】2.０kbp tkプロモーター駆動ＨygＢR 遺伝
子カセットをプラスミドｐＡＬ２をＢamＨＩで切断して
得たが、ｐＡＬ２はヘルペスウイルスtkプロモーターの
制御下でヒグロマイシンＢ耐性遺伝子を含んだ無毒化ｐ
ＢＲ３２２誘導体である。次いで唯一のＢglII部位を含
むＴＡＴプラスミドをＢglIIで切断し、ＢamＨＩで形成
されたＨygＢR 遺伝子カセットと結合させた。ｐＳＶla
c ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygと命名された最終組立て体
（図３）は、誘導性プロモーターカスケード系用に安定
な細胞系を得るためｐＣＭＶlac Ｉとの同時トランスフ
ェクションに用いた。
【００４６】実施例３ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター駆動リポーター遺伝子： Ｈ
ＩＶ ＬＴＲ（又はＣＤ２３）プロモーター駆動リポー
ター遺伝子を下記のように組立てた。公知のプラスミド
ｐＣＤ２３ＣＡＴ（4.６７kbp ）（シーケビッツら，サ
イエンス，第２３８巻，第１５７５頁，１９８７年）は
ＣＤ２３プロモーターで駆動されるクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子カセッ
トである（図４参照）。ＣＤ２３プロモーターはＨＩＶ
ＬＴＲの端切除バージョンであって、ＨＩＶ ＬＴＲ
転写開始部位に関してヌクレオチド−１１７〜＋８０で
コードされている。ｐＣＤ２３をＨind III 及びＢamＨ
Ｉの双方で完全に切断し、ＣＡＴ遺伝子及びポリ（Ａ）
シグナルを除いた。得られたＣＤ２３プロモーター含有
プラスミド（3.０kbp ）は他のリポーター遺伝子の挿入
のために用いた。3.８kbp ＬacＺ発現カセット断片をＨ
ind III 及びＢamＨＩ切断でプラスミドｐＣＨ１１０
（ファルマシアから購入）から切り出し、ゲル精製し
た。 lacＺ遺伝子カセットをＨind III 及びＢamＨＩ切
断ＣＤ２３プロモーター含有プラスミドに結合させて、
プラスミドｐＣＤ２３ＬacＺを形成した（図５参照）。
プラスミドｐＳＺ８９−１１０−３〔ｐＳＺ８９−１１
０の全記載に関するデュオング（Duong)らの欧州特許出
願第 352,119号明細書及び図１０参照〕由来の吸血コウ
モリプラスミノーゲンアクチベーター遺伝子（Ｂat−Ｐ
Ａ）〔ガーデルら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー，第２６４巻，第１７９４７頁，１９８
９年（Gardell et al., J. Biol. Chem,２６４，pp. １
７９４７（１９８９））〕を含んだもう１つのＣＤ２３
プロモータープラスミドを組立てた。1.５kbp Ｂat−Ｐ
Ａ遺伝子はＨind III 及びＸbaＩ制限酵素によりｐＳＺ
８９−１１０−３を切断して得た。ＳＶ４０初期ポリ
（Ａ）シグナル（0.２５kbp）はＢamＨＩ及びＸbaＩ切
断によりプラスミドｐＲ１３５〔ローザー（Rouzer）
ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー，第２６３巻，第１０１３５頁，１９８８年〕から得
た。Ｂat−ＰＡ及びＳＶ４０初期ポリ（Ａ）についてコ
ードする２つのＤＮＡ断片を双方ともＨind III 及びＢ
amＨＩで切断したＣＤ２３プロモーター含有プラスミド
に結合して、組立て体ｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡを形成させ
た（図６参照）。
【００４７】実施例４細胞培養 確立されたアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１Ｐ、
そのＨygＢR 誘導体（プラスミドｐＣＭＶlac Ｉ及びｐ
ＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygを含んだＣＶ−１Ｐク
ローンＣＩＯＴＡＴ）及びそのＨygＢ／Ｇ４１８耐性誘
導体（プラスミドｐＣＭＶlac Ｉ、ｐＳＶlac ＯＳＯ３
ＴＡＴ−tkＨyg及びｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡを含んだＣＶ
−１ＰクローンＣＩＯＴＡＴ−Ｂat−ＰＡ）を１０％熱
不活化新生仔牛血清（ギブコ）を加えたダルベッコ改良
イーグル最少培地（ＤＭＥ，ギブコ）の入ったプラスチ
ック組織培養皿（１００mm径）で増殖させた。抗生物質
Ｇ４１８（ギブコ）を所定の培地に４００μg ／mlで加
えた。ヒグロマイシンＢ〔カルビオケム（Calbiochem)
〕も所定培地に２００μg ／mlで加えた。細胞を１０
％ CO2含有湿雰囲気下３７℃で培養した。高レベル遺伝
子発現用プロモーターカスケードの誘導のため、１Ｍイ
ソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトシド〔ＩＰＴＧ、プロ
メガ（Promega)〕のストック溶液をＰＢＳ（ギブコ）で
調製し，分割して細胞培地に加え、所要の適切な最終濃
度とした。
【００４８】実施例５ＤＮＡトランスフェクション ＣＶ−１Ｐ細胞及びlac レプレッサー産生細胞（ＣＩＯ
ＴＡＴ）〔フィッジ（Figge)ら，セル，第５２巻，第７
１３頁，１９８８年〕を１０％新生仔牛血清（ＮＣＳ）
添加ＤＭＥ及び２００mg／mlＧ４１８含有培地で各々増
殖させた。トランスフェクト前日に、１×１０6 細胞／
６０mm皿（約６０〜８０％集密率）で加えた。ＩＰＴＧ
は予備インキュベートするため添加時に所要培地に加え
た。スーパーコイルプラスミドＤＮＡをリン酸カルシウ
共沈法でＣＶ−１Ｐ又はＣＩＯＣＡＴ細胞に導入した
〔ウィグラーら，プロシーディング・オブ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第７６巻，第
１３７３頁，１９７９年（Wigler et al., Proc. Nat'l
Acad. Sci. USA,７６：１３７３（１９７９））〕。次
いでＤＮＡ／CaCl2 溶液0.４mlを２×ＨＢＳ（pH7.０５
のＨＥＰＥＳ緩衝液）0.４mlに滴下した。室温で２０〜
３０分間の沈降後、沈降物0.８mlを６０mmプレート内の
細胞に加え、プレートを３７℃で４時間インキュベート
した。培地を除去し、１×ＨＢＳ中１５％グリセロール
を用いて細胞に３分間グリセロールショックを与えた。
一過性発現アッセイ用に、細胞をトランスフェクト後４
８時間目に回収した。安定形質転換株の選択のために
は、トランスフェクトされた細胞をトランスフェクトの
３日後にＧ４１８ ４００mg／ml又はＨygＢ２００mg／
ml含有培地に移した。各Ｇ４１８又はＨygＢ耐性コロニ
ーを１０mmガラスクローニングシリンダーで単離し、ト
リプシン処理で回収し、プラスチック皿で増殖させた。
クローン系を１０％ＮＣＳ及びＧ４１８（２００mg／m
l）又はＨygＢ（１００mg／ml）含有ＤＭＥで維持し
た。
【００４９】実施例６ＣＡＴアッセイ クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ
ＡＴ）アッセイはゴーマンらの方法を変更して行った
〔ゴーマン（Gorman) ら，モレキュラー・セル・バイオ
ロジー，第２巻，第１０４４頁，１９８２年〕。ＤＮＡ
トランスフェクトの４８時間後、細胞プレートを冷リン
酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、ラバーポリスマンに
よりかき取ってＰＢＳ1.２ml中に回収した。細胞懸濁液
を試験管に移し、９０００xgで１分間遠心した。細胞ペ
レットをＰＢＳ／mlに分散し、前のように再遠心した。
次いで細胞ペレットを撹拌により0.２５Ｍトリス HCl
（pH7.６）１００mlに再懸濁し、しかる後超音波処理又
は５回連続の凍結／解凍サイクルで溶解させた。細胞砕
片を９０００xg、４℃で１５分間の遠心により除去し
た。各抽出物のタンパク質含量は、牛血清アルブミン
〔ＢＳＡ、シグマ（Sigma)〕で作成された標準曲線を用
いてＢＣＡタンパク質アッセイ〔ピアス（Pierce) 社〕
により調べた。等量のタンパク質を含有した細胞抽出物
の一部をＣＡＴアッセイ前に0.２５Ｍトリス HCl（pH7.
６）を加えて各５０mlに調製した。抽出物を0.２５Ｍト
リスHCl 中14Ｃ−クロラムフェニコール〔約 100,000 c
pm、５４m Ci／mmol、アマーシャム（Amersham) 〕及び
アセチル CoA（1.０５６mM、リチウム塩、ファルマシ
ア）の混合液５０mlと共に３７℃で６０分間インキュベ
ートした。薄層クロマトグラフィー後、プレートを−８
０℃でＸ線フィルムに露出させた。クロラムフェニコー
ル及びクロラムフェニコールのアセチル化形に相当する
スポットに含まれる放射能を液体シンチレーションカウ
ンターにより測定した。アセチル化クロラムフェニコー
ルの率は、アセチル化種のクロラムフェニコールのcpm
をすべての形のクロラムフェニコールの全cpm で割って
計算した。
【００５０】細胞系ＣＩＯＴＡＴで行われたＣＡＴアッ
セイの結果は図７で示されている。ＩＰＴＧの検量は、
ＴＡＴ遺伝子発現の抑制解除に関してＩＰＴＧの最適濃
度を調べる目的で行われた。ＣＡＴ活性の最大増加をお
こすＩＰＴＧ濃度は約１０mMであるとわかった。
【００５１】実施例７Lac レプレッサーの免疫ブロット分析 可溶性細胞質抽出物を前記のようにＣＩＯＴＡＴ、ＣＩ
ＯＣＡＴ及びＣＶ−１Ｐ細胞系から得た（フィッグら，
セル，第５２巻，第７１３頁，１９８８年）。１００mm
プレート上の集密化細胞を冷ＰＢＳ５mlで３回洗浄し、
ＰＢＳ５mlでかき取り、遠心した。細胞ペレットを適量
の冷溶解用緩衝液〔pH7.４の0.２Ｍリン酸カリウム、0.
１mMＥＤＴＡ、0.３ mM ＤＴＴ、５％（w/v)デキストロ
ース、２５mMロイペプチン〔ベーリンガーマンハイム
（Boehringer Mannheim)〕、１mg／mlベスタチン（ジク
マ）、１０mg／ml牛パンクレアーゼトリプシン阻害剤
（シグマ）及び１mMフェニルメチルスルホニルフルオリ
ド（ＰＭＳＦ、ＢＲＬ）〕に再懸濁して、２×１０6 細
胞／１００mlの細胞濃度にした。細胞懸濁物を５回連続
凍結／解凍サイクルに付し、遠心して、細胞砕片及び核
を除去した。上澄容量は全タンパク質アッセイ（ＢＣＡ
試薬、ピアス）に基づき同じタンパク質濃度を有するよ
うに調整した。上澄２０mlを等容量の２Ｘ電気泳動試料
用液（pH7.０の２０mMトリスHCl 、５mM ＥＤＴＡ、４
％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％ｂ−メルカプト
エタノール、0.５mg／mlブロモフェノールブルー）と混
ぜた。プロメガ（Promega)から購入した市販 lacＩ／Ｚ
融合タンパク質を電気泳動試料用液に溶解し、陽性コン
トロールとして用いた。各サンプルのタンパク質を既製
のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミ
ドゲル〔１２％又は８〜１６％勾配、シュレイヒャー＆
シュエル（Schleicher & Schuell) 〕で電気泳動に付
し、ニトロセルロース膜に電気移動させた。移動後、膜
をＴＢＳＴ（pH8.０の２５mMトリスHCl 、１２５mM NaC
l 、0.０５％ツイーン２０）で洗浄し、ブロック用緩衝
液（２％ＢＳＡ及び0.１％アジ化ナトリウムを加えたＴ
ＢＳＴ）中室温で一夜インキュベートした。次いでニト
ロセルロース膜をマウス抗lac レプレッサーモノクロー
ナル抗体Ｂ−２ ５mg／ml含有ブロック用緩衝液と共に
室温で３〜５時間インキュベートした。次いでニトロセ
ルロースを無抗体ブロック用緩衝液で洗浄した。次いで
非放射性免疫検出のため、ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリ
ホスファターゼ複合体（プロメガ）の（ブロック用緩衝
液中）１：７５００希釈物をニトロセルロースと共に室
温で４５分間インキュベートした。膜をブロック用緩衝
液で１回５分間洗浄し、しかる後ＴＢＳＴで２回各５分
間リンスした。最後に、膜を５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ，プロメガ）１
６５mg／ml及びニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ，
プロメガ）３３０mg／ml含有発色反応用緩衝液（pH9.２
の１００mMトリスHCl 、１００mM NaCl、５mM MgCl2）
中でインキュベートした。可視バンドが出現した後、膜
を蒸留水でリンスして、発色反応を停止させた。放射能
免疫検出のためには、 125Ｉ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ
（アマーシャム）の（ブロック用緩衝液中）１：１００
０希釈物を膜と共に室温で１時間インキュベートした。
膜をＴＢＳＴで４回各５分間徹底洗浄し、風乾し、−８
０℃でＸ線フィルムに露出させた。放射性及び非放射性
免疫検出法の双方ともlac レプレッサー特異性抗体と反
応する約３８ＫＤのタンパク質バンドを検出したが、こ
れは予想分子量及びlac レプレッサータンパク質の抗原
性と一致した。
【００５２】実施例８ＣＩＯＴＡＴ安定クローンのスクリーニングに関するｂ
−gal 活性のアッセイ 単層細胞のｂ−ガラクトシダーゼ活性に関するアッセイ
は既に記載されている〔ノートン（Norton) 及びコフィ
ン（Coffin) 、モレキュラー・セル・バイオロジー，第
５巻，第２８１頁，１９８５年〕。この分光スペクトル
測定アッセイを安定なＣＩＯＴＡＴトランスフェクト体
をスクリーニングしうるように改変した。個別のＨygＢ
R コロニーを増殖させた後、同数の細胞を６ウェル組織
培養皿（３５mm径ウェル）のうち３ウェルに接種した。
ＩＰＴＧを前インキュベートのため最終濃度２０mMでウ
ェルの１つに加えた。ｐＣＤ２３lac ＺプラスミドＤＮ
Ａ（実施例３記載のように組立てられた）を用いて、リ
ン酸カルシウム沈降物を（実施例５記載のように）得
た。一方はＩＰＴＧ非含有で他方は２０mMＩＰＴＧ含有
である３つのうち２つのウェルをプラスミドｐＣＤ２３
lac Ｚトランスフェクトした。１ウェルは擬似トランス
フェクトし、細胞砕片による内在ｂ−gal 活性及び光散
乱の陰性コントロールとして用いた。トランスフェクト
後４８〜７２時間目に、細胞をＰＢＳ（ギブコ）で２回
リンスし、ＰＢＳ中0.１％ＳＤＳ0.２ml内で溶解させ
た。次いでＺ緩衝液〔６０mM Na2HPO4、４０mM NaH2P
O4、１０mM KCl、１mM MgSO4、５０mM β−メルカプト
エタノール；pH7.０〔ミラー（Miller),１９７２年、分
子遺伝学の実験（Experiments in Molecular Genetic
s), コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
ズ，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク
州〕〕0.８mlを加えた。サンプルを撹拌し、黄色が認め
られるまで３７℃でインキュベートした。次いでチュー
ブを氷上におき、1.０Ｍ Na2CO3 0.５mlを加えることで
反応を終結させた。反応時間（分）及び４２０nm吸光度
を用いて、ｂ−gal 比活性を計算した。細胞系ＣＩＯＴ
ＡＴで行われたｂ−gal アッセイの結果は図８で示され
ている。ＩＰＴＧの検量は最適ＩＰＴＧ濃度を調べる目
的で行われたが、その濃度はｂ−gal 活性の最大増加を
誘導し、約１０mMであるとわかった。
【００５３】実施例９コウモリプラスミノーゲンアクチベーターのスペクトロ
ライズアッセイ ３種のプラスミドｐＣＭＶlac Ｉ、ｐＳＶlac ＯＳＯ３
ＴＡＴ及びｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡをすべて有しかつ同時
発現する細胞を、６ウェルマイクロタイタープレートに
おける様々な濃度のＩＰＴＧ含有培地中に、２×１０5
細胞／ウェルでいれた。培地の一部をＩＰＴＧ誘導後
２，３，４及び６日間後に集め、ガーデルら（ジャーナ
ル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，第２６４
巻，印刷中，１９８９年）に従い変更したスペクトロラ
イズ（Spectrolyse)ｔ−ＰＡアッセイキット（アメリカ
ン・ジアグノスチカ社）を用いてＢat−ＰＡ活性に関し
て調べた。プラスミノーゲンアクチベーターをpH8.０の
0.１ＭトリスHCl 及び0.１％ツイーン８０中でヒトＧlu
プラスミノーゲン（４０mg／ml）、スペクトロザイム
（Spectrozyme)ＰＬ（0.４ml）及びＤＳＡＦＩＢ（８０
mg／ml）と共にインキュベートした。反応を９６穴マイ
クロタイタープレートにおいて室温で３０分間行い、発
色素物質からの遊離ｐ−ニトロアニリン放出量をバイオ
ラッド・キネティック・リーダー（BioRad kinetic rea
der)（モデル３５５０）で分光スペクトル測定した。
【００５４】Ｂat−ＰＡ活性（国際単位／ml）は、サン
プルのＡ405 における増加量を標準ｔ−ＰＡ活性曲線と
比較することにより調べた。結果は図９で示されてい
る。ＩＰＴＧ検量では、１〜５mM ＩＰＴＧが最大Ｂat
−ＰＡ活性をおこすことを示した。１mM ＩＰＴＧ誘導
の６日後に、Ｂat−ＰＡ活性は約2.５mg／mlまで少なく
とも８０倍増加したが、その場合５００国際単位／mlが
１mg／mlに相当する。これはＴＡＴ遺伝子発現を誘導し
てｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡのＣＤ２３プロモーターをトラ
ンスで活性化しうるＩＰＴＧの能力について立証してお
り、高レベルのＢat−ＰＡ発現を誘導する一方で、ＩＰ
ＴＧ誘導前はＢat−ＰＡレベルを低く抑えている。
【００５５】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は誘導性プロモーターカスケード系の模式
図である。左側は抑制、即ちオフ状態にある糸を示す。
右側は脱抑制、即ちオン状態にある系を示す図である。
【図２】図２はｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴを組立てるた
めに用いられる組換えクローニング法を示した概略図で
ある。
【図３】図３はｐＳＶlac ＯＳＯ３ＴＡＴ−tkＨygの模
式図である。
【図４】図４はｐＣＤ２３ＣＡＴの模式図である。
【図５】図５はｐＣＤ２３ＬacＺの模式図である。
【図６】図６はｐＣＤ２３Ｂat−ＰＡの模式図である。
【図７】図７は様々な濃度のＩＰＴＧで誘導されたＣＩ
ＰＴＡＴ細胞に関する一過性ＣＡＴ発現アッセイの棒グ
ラフであり、ＣＡＴ変換％（棒上の太い数字）及び非誘
導ＣＩＯＴＡＴ細胞に対するＣＡＴ発現の各増加倍率
（かっこ内の数字）を示す。
【図８】図８は様々な濃度のＩＰＴＧで誘導されたＣＩ
ＯＴＡＴ細胞に関する一過性β−gal 発現アッセイの棒
グラフであり、β−gal 活性（棒上の数字）及び非誘導
ＣＩＯＴＡＴ細胞に対するβ−gal 発現の各増加倍率
（かっこ内の数字）を示す。
【図９】図９はＣＩＯＴＡＴ−Ｂat−ＰＡ細胞において
様々な濃度のＩＰＴＧ誘導後２，３，４及び６日目に測
定されたＢat−ＰＡ活性の一連の棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミン−ファン ロウ アメリカ合衆国，92129 カリフォルニア, サン ディエゴ，ピクラス ストリート 12344 (72)発明者 メルヴィン シルバークラング アメリカ合衆国，07631 ニュージャーシ ィ，イングルウッド，ヒルサイド アヴェ ニュー 21 (72)発明者 ジョージ イー．マーク ザ サード アメリカ合衆国，07550 ニュージャーシ ィ，プリンストン ジャンクション，リッ チモンド ストリート ４

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 lac オペレーターをコードするＤＮＡで
    転写上調節されるＨＩＶ ＴＡＴタンパク質についてコ
    ードするＤＮＡを含んだプラスミド。
  2. 【請求項２】 誘導可能な遺伝子発現系での使用のため
    クローン化される外来遺伝子の転写を制御してＴＡＴタ
    ンパク質でトランス活性化できるＨＩＶ ＬＴＲプロモ
    ーターＤＮＡを含んだプラスミド。
  3. 【請求項３】 クローン化される外来遺伝子がコウモリ
    プラスミノーゲンアクチベーターをコードするＤＮＡか
    らなる、請求項２記載のプラスミド。
  4. 【請求項４】 lac レプレッサータンパク質を発現しか
    つlac オペレーターをコードするＤＮＡで転写上調節さ
    れるＨＩＶ ＴＡＴタンパク質をコードするＤＮＡを含
    んだ組換え哺乳動物細胞系。
  5. 【請求項５】 ａ）lac レプレッサータンパク質を発現
    し； ｂ）lac オペレーターをコードするＤＮＡで調節される
    ＨＩＶ ＴＡＴタンパク質についてコードするＤＮＡを
    含み；及び ｃ）コウモリプラスミノーゲンアクチベーターをコード
    するＤＮＡの転写を制御してＴＡＴタンパク質でトラン
    ス活性化できるＨＩＶ ＬＴＲプロモーターを含んだＤ
    ＮＡを含む；組換え哺乳動物細胞系。
  6. 【請求項６】 哺乳動物細胞においてクローン化される
    遺伝子の制御的発現用に誘導可能な遺伝子発現系であっ
    て、 ａ）組換え哺乳動物細胞系が転写レプレッサータンパク
    質を発現し、かつ転写レプレッサータンパク質に関する
    標的をコードするＤＮＡで調節されるトランスアクチベ
    ータータンパク質についてコードするＤＮＡを含む； ｂ）プラスミドが上記組換え細胞系に導入されるが、こ
    のプラスミドはクローン化される外来遺伝子の転写を制
    御してトランスアクチベータータンパク質でトランス活
    性化できるプロモーターを含み、誘導可能な遺伝子発現
    系を形成する； ｃ）上記系はインデューサーの添加でクローン化される
    遺伝子の発現用に誘導できるが、そのインデューサーは
    トランスアクチベータータンパク質発現の抑制解除しか
    る後(b) のトランス活性化しうるプロモーターのトラン
    ス活性化をおこす；ことを特徴とする遺伝子発現系。
  7. 【請求項７】 哺乳動物細胞においてクローン化される
    遺伝子の制御的発現用に誘導可能な遺伝子発現系であっ
    て、 ａ）組換え哺乳動物細胞系がlac レプレッサータンパク
    質を発現し、かつlacオペレーターをコードするＤＮＡ
    で調節されるトランスアクチベータータンパク質につい
    てコードするＤＮＡを含む； ｂ）プラスミドが上記組換え細胞系に導入されるが、こ
    のプラスミドはクローン化される外来遺伝子の転写を制
    御してトランスアクチベータータンパク質でトランス活
    性化できるプロモーターを含み、誘導可能な遺伝子発現
    系を形成する； ｃ）上記系は化学的インデューサーの添加でクローン化
    される遺伝子の発現用に誘導できるが、そのインデュー
    サーはトランスアクチベータータンパク質発現の抑制解
    除しかる後(b) のトランス活性化しうるプロモーターの
    トランス活性化をおこす；ことを特徴とする遺伝子発現
    系。
  8. 【請求項８】 哺乳動物細胞においてクローン化される
    遺伝子の制御的発現用に誘導可能な遺伝子発現系であっ
    て、 ａ）組換え哺乳動物細胞系がlac レプレッサータンパク
    質を発現し、かつlacオペレーターをコードするＤＮＡ
    で調節されるＨＩＶ ＴＡＴタンパク質についてコード
    するＤＮＡを含む； ｂ）プラスミドが上記組換え細胞系に導入されるが、こ
    のプラスミドはクローン化される外来遺伝子の転写を制
    御してＴＡＴタンパク質でトランス活性化できるＨＩＶ
    ＬＴＲプロモーターを含み、誘導可能な遺伝子発現系
    を形成する； ｃ）上記系は化学的インデューサーの添加でクローン化
    される遺伝子の発現用に誘導できるが、そのインデュー
    サーはＴＡＴ発現の抑制解除しかる後ＨＩＶＬＴＲプロ
    モーターのトランス活性化をおこす；ことを特徴とする
    遺伝子発現系。
  9. 【請求項９】 ＡＴＣＣ寄託受理NO. ＣＲＬ−１０４０
    ４である、請求項３記載の組換え哺乳動物細胞系。
  10. 【請求項１０】 ＡＴＣＣ寄託受理NO. ＣＲＬ−１０４
    ０５である、請求項４記載の組換え哺乳動物細胞系。
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