JPH02500946A - 生合成のヒトの成長ホルモン製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生合成のヒトの成長ホルモン製品 技術分野 本発明は、空気との露出下で付着が必要な哺乳類細胞の培養に使用される改良培 養培地に関する。

更に、本発明は、要望されるポリペプチド用のＤＮＡコードに関する。

背景技術 最構成りＮＡ技術の発展は、要望されるポリペプチド用のＤＮＡコードを連続ｉ 乳類細胞ラインのケノムに挿入させることを可能にさせている。これら細胞ライ ンは、Ｅ、　ｃｏｉｌのような原核生物の宿主細胞の使用に利点を持っている。

これら利点は、蛋白質を分泌しグリコジル化する能カメ、遺伝学的物質を本体の 細胞に発生する遺伝物質に同一形態で処理する能力とを含んでいる。これら利点 に対して重み付けされるものは、蛋白質の生成用の最構成哺乳類細胞の使用が殆 ど無抗生培地における大規模の組織培養を伴っている事実である０組織培養は、 原核生物の細胞培養で実施されるより正確な環境制御、より過酷な仕様及び汚染 を排除した装置の操作が要求される。哺乳類細胞の使用における更なる利点は、 これら細胞の培養に使用される培養培地から要望のポリペプチドを隔離及び精製 することに複雑さを提供する・。

組繊細胞に使用される細胞は、２つの広い範躊、■ハブリドーマ細胞のような分 散培養に無関係に増殖する細胞及び０表面に付着して増殖する細胞に分けること が可能である。前者■の細胞は、細胞が細胞膜を持たず、従って剪断力に敏感で ある事実を考慮した分散培養で増殖できる。第２の範−の細胞は、大規模生成す るために細胞増殖用の増加した表面領域が要求される。文献には、増加した表面 領域を提供する種々の装置、ガラス製のハニカム面、シートを巻回した表面及び 数■径の複数のガラス球を形成した装置が記載されている。文献に記載された種 々の研究の全評論は１９８３年グラッケン氏等のＴｒｅｎｄｓ　１ｎＢｉｏｔｅ ｃｂ’ｍｏｌＢｙ第１巻１０２−１０８頁に示されている。

他の研究は、架橋デキストラン、ポリスチレン或はガラスを含む物質等から構成 できる更に小径の球体粒子を使用することである。時々マイクロキャリアとして 参照するこれら粒子の利点は、１００〜２００マイクロメータ台の直径を持つ粒 子によって、単位質量毎に非常に高い表面領域を持つビーズ群（５０００ｃｍ” ／　ｇ　）を達成することが可能となることである。この研究の行き着く先は、 ビーズ群の外面と同様に内部に細胞を増殖させられる多孔性マイクロキャリアの 使用である。他の可能性は、複数のビーズに相互、に細胞を結合させる中核箇所 として作用する１マイクロメ一タ台の直径のいっそう小径のラテックスビーズ群 を使用することである。ある条件□下では、細胞群或は塊の小集団を形成するた めに、相互に結合する細胞群を誘導することが可能である。複数の細胞がマイク ロキャリア、ビーズ或は塊群に結合した時には、細胞を分散培養に増殖させるこ とが可能である。分散培養で細胞を増殖させる装置は手引書に沿った使用であり 、この装置の使用が薄膜装置のような別の装置を使用しＩ；開発中の技術の問題 を回避している。しかし、マイクロキャリアで増殖させられる細胞に伴う困難さ の１つは、細胞の群生密度が酸素の量で制限されることである。このような制限 は、公知の通気技術で克服されるが、培地が無血清の時に、このような通気が細 胞を支持培地から遊離させる。

発　明　の　開　示 本発明者は、支持培地に付着された細胞を、血清の不存在下でも剥がれないで、 空気培養できる新規な組織培養培地を開発した。更に、本発明者は、付着が必要 な細胞を培養する新規な方法を開発した。

本発明は、次の段階、 １、細胞が付着して所望の細胞群生濃度に増殖するまで細胞と接触した支持培地 が形成された反応槽における血清含有媒体に哺乳類細胞を培養し、 ２、血清含有媒体を静かに注ぎ、 ３、注がれた媒体を、細胞及び支持培地の回りに膜状のドレナージを減少させる ことによって細胞保護剤として作用する非毒性ポリマ溶液を含む無血清培地に置 換し、４、培養が直接通気を受ける段階を備えた付着が必要な哺乳類細胞の培養 方法からなっている。

科学的に裏付けされた理論を確立していないが、細胞保護剤として作用するポリ マは、細胞が血清の不存在下で直接通気をうける時に、細胞／支持培地の集団口 りに保護膜を形成して、細胞が支持培地と協働しないこと及び細胞の剥離を防止 するものと信じられる。細胞／支持培地集団回りの保護膜は、細胞／支持培地集 団が気泡と接触した時に、細胞を囲む膜状の支持培地かにじみ出ること（ドレナ ージ）を防止するものと信じられる。この支持培地のドレナージは、膜状ドレナ ージと参照する。

勿論、このフィルムは、気泡に起因する物理損傷から細胞を保護する障壁を形成 するものと信じられる。

用語「直接通気」は、培養される細胞がガスの泡に露出される培養培地の通気を 記述するために使用される。

ポリマが非毒性で低発泡であることが好ましい。

本発明の好ましい実施例においては、ポリマがポリエチレングリコール、ポリビ ニールピロリドン或は１個以上の酸化アルケンを含有するポリマである。酸化ア ルケンは、２個或は３個の炭素原子を含むことが好ましい。ポリマは、酸化プロ ピレン及び酸化エチレン共重合体であることが特に好ましい。

本発明の更に好ましい実施例においては、酸化アルケンのポリマが０．１〜１． ０％の濃度で存在している。

本発明の別の好ましい実施例においては、組織培養培地が必須的に蛋白質を含有 しない。

本発明の好ましい実施例においては、反応槽は、培養培地が移動できるが、細胞 が移動できないフィルタの手段によって、培養領域と、無細胞領域とに分割され ている。

培養培地の通気即ち換気は、反応槽の無細胞領域に泡状のガスを通過させること によって達成される。この通気方法は、気泡の量が通常フィルタ手段を通過する ので、培養される細胞が気泡に露出される元となる。しかし、通気が反応槽内に 位置した上昇空気流を使用して導入されることが特に好ましい。

本発明の好ましい実施例においては、哺乳類細胞が連続細胞ライン、特に要望さ れるポリペプチド用のＤＮＡコード特にヒトの成長ホルモン（ｈＧＨ）が挿入さ れた中国産ハムスタ卵巣細胞ラインである。

好ましくは、要望されるポリペプチド用のＤＮＡコードは、必須的に無血清成分 で誘導される誘導性促進子（プロモータ）の制御下におかれている。更に、好ま しい実施例においては、必須的無血清培地が必須的無蛋白質である。

培地の撹拌は、発生する剪断力を低くさせる速度で錨型の羽根のような羽根を使 用して達成できる。明らかに、他の羽根の外形も剪断力発生を弱くして使用され る。

更に、好ましい実施例においては、必須の無血清培地が連続的に補給されて、要 望されるポリペプチドが連続的に回収される。

図面の簡単な説明 本発明の特質を十分に理解するためには、好ましい形態が添付図面を参照して例 として記載されている。

図面は、通気が反応槽内に位置した空気柱（上昇空気流）の手段による反応シス テムの代表例を示すブロック図である。

発明を実施するだめの最良の形態 実施例１ 中国産ハムスタ卵巣（ＣＨＯ）細胞ラインには、強力な調整可能なプロモータ／ 向上子連鋼に連結されたヒトの成長ホルモン用のＤＮＡコードが感染（トランス フェクション）させられた。この細胞の遺伝学的構造は、国際公開番号ＷＯ８６ １０４９２０に詳述されている。

この細胞は、液体窒素アンプル内に貯蔵され、その後ルーフラスコ或はローラビ ン内で成長（増殖）させて再構成される。

これらの細胞は、ＥＤＴＡを使用して取出され、ＰＢＳで洗浄され、予め処理さ れたマイクロキャリアに接触させられる。これらのマイクロキャリアは、デキス トラン基剤のシトデックス（Ｃｙｔｏｄｅｘ）　１及び２（ファルマシア社）或 はポリスチレン基剤のバイオシラン（Ｎｕｎｃ）である。マイクロキャリア毎に ６〜１０個の細胞を種付けする密度が好適であると発見され、細胞がマイクロキ ャリアに付着し、中間の最小移植時間と、約１８時間を２度繰り返して増殖され る。培地は、５或は１０％のＦＣ８を含有する合成培地であった。大規模槽に接 種するために十分な細胞数を確立するためには、合流するマイクロキャリアの集 団に新鮮なマイクロキャリアを追加することが可能であり、新鮮なマイクロキャ リアの植民地化が発生する。マイクロキャリアの要望される接種材料が図面に示 す培養土（７アーメンタ）の外形に転移される。

この実施例は、空気柱の原理を使用して実施され、従ってガス相は、物質移動用 のガス相を形成すると同様に低剪断混合を促進するために使用される。ガス相は 、反応槽の頂部で降水筒に接続される反応槽の部分（上昇部分）の底で泡が発生 させられる。上昇部分へのガス相の導入は、この部分の密度を低下させるが、こ の結果、降水部の気泡のない高密度の培養が低密度の培養と置換して、従って反 応槽内で穏健な混合を促進している。種々の反応槽の外形においては、降水部及 び上昇部を合同することが可能である。円筒形の反応槽１５内で同軸配置された 同軸チューブ１４として上昇部を持つ一外形が図面に示されている。この外形は 、ハイブリドーマ細胞の増殖用に既に使用されている。この外形を使用して、マ イクロキャリアに付着しｆ；ＣＨＯ細胞を０．０２ＶＶＭのガス流量で増殖及び 生成物形成が可能であることを示した。使用されたガス相は、基本的に空気であ り、通常の制御方法を使用して二酸化炭素或はアンモニアが補充されて培養ｐＨ を維持することができた。勿論、もし必要ならば、酸素がガス相に追加できて、 過剰ガス速度を使用しないで所望レベルの溶解酸素が維持できる。この作業に使 用しｔ；低ガス速度では、発泡問題が最小であったが、もし発泡が初期段階で発 生したならば、例えば細胞が血清含有媒体で増殖した時に、導体センサ或は追加 時間を使用して、シリコンを基剤とした抗−発泡剤、例えば抗−発泡剤Ｃ或は他 の抗−発泡剤を計量添加して制御することが可能である。勿論、これら抗−発泡 剤が細胞の増殖及び生成物形成を妨害しないことが条件である。増殖段階が発生 し、マイクロキャリアビーズ群が合流した時には、マイクロキャリアを維持する ステンレススチールメツシュを使用して、細胞が１容量部のＰＢＳで洗浄される 。

その後、反応槽には、ｈＧＨの生成用に、酸化プロピレン及び酸化エチレンの共 重合体（プルリオールＰＥ６８００）を含有した無血清培地が必須的に充填され る。この培地は次の成分からなっている。

無機塩　鳳ｇ／ｌ ＣａＣ１ｘＣ無水物）　１６２．１５ Ｆｅ（ＮＯｓ）ｘ’　９Ｈ＊Ｏ０，０５ＦｅＳＯ，・７Ｈ＊０　０−４１７ ＫＣ１３５２，５ ＫＨ２ＰＯ４３（１６２ ＭｔＣ１１Ｃ無水物）　２３．３３ Ｍｇ５Ｏ，（無水物）　６１．４８ ＮａＣＩＬ　６９５８．’５ ＮｉＨＣＯｓ　１３３８ Ｎ！Ｈ，ＰＯ，（Ｈ３Ｏ）　６２．５ ＺｎＳＯ，・７Ｈ２００，４３２ Ｎａ２ＨＰＯｉ’　７Ｈ＊０　１２５ アミノ酸 Ｌ−アラニン　９．０ Ｌ−アスパラギン・Ｈ，Ｏ１５，Ｏ Ｌ−アルギニン・ＨＣＡ　２５３．Ｏ Ｌ−アスパラギン酸　１３．Ｏ Ｌ−システィンＨＣ１−ＨｚＯ３５、１３Ｌ−シスチン・２ＨＣ１３１，２９ Ｌ−グルタミン酸　１５．０Ｏ Ｌ−グルタミン　４３８．Ｏ Ｌ−グリシン　２３．Ｏ Ｌ−ヒスチジ＞ＨＣＩ　”　Ｈ２Ｏ４２、ＯＬ−インロイシン　５６．４ Ｌ゛−ロイシン　６５．６ Ｌ−リジンＨＣ１１０９，５ Ｌ−メチオニン　１９．５ Ｌ−フェニルアラニン　３８．Ｏ Ｌ−プロリン　３５．Ｏ Ｌ−セリン　３１．５ Ｌ−スレオニン　５９．４ Ｌ−トリプトファン　１Ｏ６０ アスコルビン酸（ビタミンＣ）　７．５ビオチン（ビタミ７Ｈ）　０．００３７ Ｄ−パントテン酸カルシウム　２．１１９塩化コリン（ビタミンＢ複合体）　８ ．９８葉酸（ビタミンＢ複合体）　２．６６ 量−イノシトール　１２．６１ ニコチンアミド　２．ｏ２ ピリドキサルＨＣＩＩ　（ピリドキシン）　２．０３リボフラビン　０．２２ チアミンＭＣ１１２，１６９ ビタミンＢ＋ｔ　ｏ、ｓｇ 他の成分 Ｄ−グルコース　３１５１ ＨＥＰＥ５　３５７０ ピルビン酸ナトリウム　１１０ ヒポキサンチン（２ナトリウム塩）２．７リノール酸　０．０４５ プトレシン２ＨＣ１Ｏ，０８１ チオクト酸（リポ酸）　０．１０３ チミジン　０．３５ プルリオールＰＥ６８００　２０００ １０’細胞／Ｈの細胞濃度で、反応槽を連続操作で運転し、０．１５時間−１の 流出速度及びＢＯＢ／ｌのｈＧＨ濃度で生成物の流れを形成することが可能であ る。勿論、反応槽は、内容の全部或は部分がステンレススチールメツシュを介し て反応槽から取り出され、新鮮な培地がバッチ或は連続槽で置換されるバッチ或 は反復されたバッチモードで運転することができる。

この技術を使用して、２５０ｍ（／す７トルのｈＧＨ濃度を持つ生成物の流れを 得ることが可能である。

この実施例においては、培地が非毒性、低発泡或は低粘性、非イオン性化合物の ブルリオールＰＥ６８００を含んでいるので、培養培地に直接ガスを泡立てるこ とが可能である。この化合物は、酸化プロピレン及び酸化エチレン共重合化で得 られる。

培養培地内のこの化合物の存在は、支持培地から細胞を剥がれにくくさせ、しか も通気即ち空気との接触ができる。

ＷＯ８８７００９６７ Ｆｉｇ東ヱま Ｆｉｇ匹Ｌ２゜ 肚競堕ユ　肚匹堕」 国際調査報告 八Ｎｌｌ［Ｘ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＵＩＩｌｊＡＴＩＯＮＡＩ　Ｓ［ＡＲＣＭ 　Ｒ［ＰＯＲＴ　０１１１ＮＴ［ＲＮＡＴ１０１１ＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯ Ｉ；　１１０．　ＰＣＴ／ＡＵ８７　／　ＺＩＡＵ　５４４５６／８０　ＥＰ１ ４５１９　ＪＰ　５５１１３７２２　ＩＩｓ　４３５０６８３ｔ’ｓ　４３９０ ６２３　ＥＰ　４９６１１　ＪＰ　５８０２９７１４ＡＵ３８５７１／８５　Ｄ Ｅ３５０４７４８　ＦＲ２５５９５００ＧＢ２１５４２砺ＪＰ　６０１９９３８ ０ ｍ　２２３２６／８３　ＥＰ　１１２１５５　Ｒ５９１７５８７７ＡＵ　７５２ ６９／８１　ＥＰ　４％３２　ＪＰ　５７０６５１７９　ｔＪｓ４４３１７３８ ３０Ｆ　ＡＭＸ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞が付着して所望の細胞群生濃度に増殖するまで細胞と接触した支持培地 が形成された反応槽における血清含有媒体に哺乳類細胞を培養し、 血清含有媒体を静かに注ぎ、 注がれた媒体を、細胞及び支持培地の回りに膜状のドレナージを減少させること によって細胞保護剤として作用する非毒性ポリマ溶液を含む無血清培地に置換し 、培養が直接通気を受ける段階を備えた付着が必要な哺乳類細胞の培養方法。
2. ２．前記無血清培地に存在する前記非毒性ポリマがポリエチレングリコール及び ポリビニールピロリドンからなる群から選択される請求の範囲第１項記載の方法 。
3. ３．前記無血清培地に存在する前記非毒性ポリマが１個以上の酸化アルケンを含 有するポリマである請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．前記酸化アルケンが２個或は３個の炭素厚子を含む請求の範囲第３項記載の 方法。
5. ５．前記ポリマが酸化プロピレン及び酸化エチレン共重合体である請求の範囲第 ４項記載の方法。
6. ６．前記酸化アルケンのポリマが０．１〜１．０重量％の濃度で培地に存在して いる請求の範囲第３項記載の方法。
7. ７．前記反応槽は、前記培養培地が移動できるが、細胞が移動できない７イルタ の手段によって、培養領域と、無細胞領域とに分割されている請求の範囲第１項 記載の方法。
8. ８．前記培養培地の通気は、反応槽の無細胞領域に泡状のガスを通過させること によって導入される請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記通気が前記反応椿内に存在する上昇ガス流れの手段によって実行される 請求の範囲第１項記載の方法。
10. １０．前記哺乳類細胞は、該細胞の増殖がポリペプチドの生成となるように、ポ リペプチドをＤＮＡコード化を含有するように遺伝学的に作られる請求の範囲第 １項記載の方法。
11. １１．前記ポリペプチドは、反応槽内の無細胞領域から実施される培養培地から 回収され、精製される請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．前記ポリペプチド用のＤＮＡコードは、必須無血清成分で誘導される誘導 性促進子の制御下におかれている請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．前記哺乳類細胞が連続細胞ラインである請求の範囲第１０項記載の方法。
14. １４．前記連続細胞ラインが中国産ハムスタ卵巣細胞ラインである請求の範囲第 １３項記載の方法。
15. １５．前記ポリペプチドがヒトの成長ホルモンである請求の範囲第１０項記載の 方法。
16. １６．前記無血清培地が必須的に無蛋白質である請求の範囲第１項から第１５項 までのいずれかに記載の方法。
17. １７．前記培地は、発生する剪断力を低くする方法で撹拝される一請求の範囲第 １項記載の方法。
18. １８．前記ポリペプチドは、反応槽から連続的に取り出された培養培地から回収 され、新鮮な必須無血清培地が反応槽に連続的に補給される請求の範囲第１０項 記載の方法。