JPH02500947A - 動物細胞内でのメッセンジャーｒｎａの安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物細胞内でのメツセンジャーＲＮＡの安定化光里皇宜景 本発明は、リンパ系由来の哺乳動物細胞においてタンパク質生産を増加させる方 法および産物に関する。より詳細には、本発明は、ｍＲＮＡの細胞内分解速度を 遅らせることにより翻訳能力をもつａ＋ＲＮＡの定常状態レベルを増加させてタ ンパク質生産を増加させる方法および産物に関する。

大部分の動物細胞によるタンパク質生産は酵素、構造タンパク質、表面タンパク 質、およびリンフ才力インやホルモンのような特殊な機能をもつ多数のタンパク 質の合成を包含する。一般に、これらのタンパク質は比較的少ない量で生産され る。しかしながら、動物体内での全身的使用のために多量のタンパク質を生産・ 分泌しうる動物細胞型が存在する。このような細胞型の例にはグロブリンおよび フィブリノーゲンを生産する循環系細胞、血清アルブミンを生産する肝細胞、な らびにインシュリンを生産するランゲルハンス島のβ細胞が含まれる。もしもこ の種の高レベル発現に関与する遺伝子機構をリンフ才力イン、抗体または対象の タンパク質系物質の生産に応用することができるならば、価値あるタンパク質を 多量に供給することができるであろう。　□ 真核細胞による内因性ＤＮＡの発現は、そのＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、次いで そのｍＲＮＡのリポソームへの移動、そしてその後に開始シグナルコドンと終結 シグナルコドンとの間のｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列から成るタ ンパク質へのｍＲＮＡのｔＢＮＡ媒介翻訳を伴う。

ギリエス（Ｇｉｌｌｉｅｓ）ら、Ｃｅ１ｌ、　Ｖｏｌ、３３．　ｐ、７１７〜７ ２８．１９８３年７月、および係属中の米国特許出願第５９２２３１号（１９８ ４年３月２２日出願）に開示されるように、細胞のエンハンサ−因子は免疫グロ ブリンを多量に生産する特殊な細胞によるタンパク質の高レベル発現において重 要な役割を演じている。エンハンサ−は内因性ｍＲＮＡポリメラーゼによるＤＮ Ａのｏ＋ＲＮＡへの転写率を高めることにより機能すると思われる。ｍＲＮＡの 濃度が増すと、上記細胞による発現レベルが有意に高まる。このようなエンハン サハンサー配列がタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターから１０，００ ０塩基対またはそれ以上離れた位置に存在していても観察できる。これらの細胞 エンハンサ−は組織特異的であると考えられ、すなわちリンパ系細胞の内因性ゲ ノム中で特定ｌｌｌＲＮＡの生産を増加させるように機能する細胞エンハンサ− の活性は、もしもそのエンハンサ−が非リンパ系細胞を形質転換する、ベクター 中に組み込まれた場合、非常に低下するか又は失われるであろう、しかしながら 、エンハンサ−因子、プロモーター、および目的タンパク質をコードする組換え 遺伝子を含むベクターは、そのエンハンサ−が自然界でその転写率を高める細胞 型と同じ型の細胞へトランスフェクションされるならば、組換え遺伝子を高レベ ルで発現するようにその細胞を首尾よく形質転換することができる。

真核細胞ＤＮＡは終結シグナルのあとにある種の塩基配列を含み、その一部は翻 訳されたｍＲＮＡの終結シグナルの３′側にアデニン残基（以後ポリＡと記す） の付加を開始させるためのシグナルとして作用する。ポリアデニル化は主として 核内で起こり、１度に１個のアデニル酸を付加するポリＡポリメラーゼにより媒 介される。ポリＡは終結コドンが翻訳を終わらせた後でアミノ酸配列をコードし ないが、ｍＲＮＡの安定化ならびにｍＲＮＡコード領域のアミノ酸への翻訳の効 率に寄与すると考えられる。

哺乳動物細胞のｍＲＮＡ中のポリＡは、３′非翻訳（３’　ｕｎｔｒａｎｓｌａ −ｔａｂｌｅ　；以後３’ＵＴと略す）末端部分として知られる配列中に存在す る。３’　ＬＩＴは一般に翻訳産物のための終結コドンからポリＡの末端までの 範囲に及ぶ。哺乳動物ｍＲＮＡの３’ＵＴ領域は通常ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレ オチド配列として知られる相同領域を有する。

この配列はポリＡ付加シグナルであると考えられる。それはしばしばポリＡ付加 部位よりも１１〜３０個の塩基だけ上流に存在する。

３’ＵＴおよびポリＡ　ＳＪｉ域の（存在する場合の）機能は最近ソレク　（Ｓ ｏｒｅｑ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｕ、ｓＪ、ｌ　シｏ １．７Ｂ、Ｎｏ、３＋ｐ、１７４１〜１７４５．１９８１年３月：ザレット（Ｚ ａｒｅｔ）ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、＋１９８４　Ｖｏｌ、１７６、　ｐ、１ ０７〜１３５８バレル（Ｂａｒａｌｌｅ）、ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＲｅｖ ｉｅｗ　ｏｆ　Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、８１＋　ｐ、７１〜１０６　；お よびロス（ＲＯ３Ｓ）ら、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１９８３．Ｖｏｌ、１６７ 、　ｐ、６０７〜６１７によって調査・研究された。

ソレク（Ｓｏｒｅｑ）　らは、ヒト線維芽細胞の第一βインターフェロンａ＋Ｒ ＮＡからのポリＡおよび約１００個の隣接残基の除去が卵母細胞中でのこのｍＲ ＮＡの翻訳活性または機能的安定性を変化させないが、ポリＡおよび約２００個 の隣接残基の欠失がその翻訳効率を低下させることを報告した。第二βインター フェロンｍＲＮＡからの約２００個のポリＡ残基および約２００個の隣接残基の 除去は、卵母細胞中でのこのｍＲＮＡの翻訳活性または機能的安定性のいずれを も変化させなかった。これらの著者は、ポリＡ残基も３′非コード領域の大きい セグメントもこのような卵母細胞中でのヒトβインターフェロンｍＲＮＡの機能 的安定性の維持のために必要でないと結論づけた。

ザレット（Ｚａｒｅｔ）らは、イソ−１−シトクロムＣをコー、ドするＣＹＣ− １遺伝子の３′非コード領域中に３８塩基対の欠失を含む酵母Ｓ、セレビシェ（ Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のｃｙｃｌ−５１２突然変異体について研究した。

彼等は染色体再配列により生ずる別の３′非コ一ド配列がＣＹＣ−１ｍＲＮＡの 安定性を高め且つｍＲＮＡの翻訳効率に様々な影響を及ぼすことを報告した。

バレル（Ｂａｒｅｌｌｅ）の文献：　１７　ｍＲＮＡ　の１−°−およびレーー ー″″　ｌの　・　、において、著者は３′非コード領域のための明らかな機能 は存在せず、これらの遺伝子の発生中に相当の大きさの欠失または挿入が起こる ことは３′非コード領域から成る特定配列がｍＲＮＡの機能にとって不可欠な配 列でないことを示唆するものであると報告した。しかしながら、バレルはポリＡ がｍＲＮＡの安定性を促進する上である種の役割を有すると報告した。例えば、 グロビンｍＲＮＡからのポリＡセグメントの除去は卵母細胞中でのそのｎ＋ＲＮ Ａの半減期をかなり短縮することが判明した。しかしながら、バレルは、ｍＲＮ ＡからポリＡを除去した研究によって証明したように、ポリＡが効果的な翻訳に よって必ずしも必要でないことを示唆している。

ロス（Ｒｏｓｓ）およびピザ口（Ｐｉｚａｒｒｏ）は、ヒトβおよびδグロビン タンパク質の定常状態レベルがそれらのそれぞれのメツセンジャーＲＮＡの細胞 内安定性により部分的に決定されるという仮説を研究した。彼等はｍＲＮＡにお けるδグロビンの急速な回転（ｔｕｒｎｏνｅｒ）が少なくとも部分的に、核を もたない末梢血網状赤血球中のδグロビンｍＲＮＡの低レベルに起因しているこ とを見出し、そしてｍＲＮＡの崩壊速度が３′非翻訳領域に存在するヌクレオチ ド配列シグナルにより決定されると推量した。彼等はβおよびδグロビンｍＲＮ Ａの５′非翻訳領域は類似しているが、それらの３′非翻訳領域が相当に異なっ ていることを観察し、そしてβまたは６３′末端を含むキメラｍＲＮＡのトラン スフェクションした細胞中での半減期を比較することにより、ｍＲＮＡの安定性 を決定する際の３′非翻訳領域の役割を調べることができるであろうと提案した 。

欧州特許第００７７６８９号は、外因性遺伝子の下流に構造遺伝子の３’　ＵＴ が付加された遺伝子を用いて酵母を形質転換する遺伝子操作法を開示している。

その形質転換細胞は、外因性遺伝子が３’　ＵＴを含む場合に、高レベルの発現 を示す。実際に、３’　ＬＩＴに相当する領域が付加されたプラスミドを保有す る酵母での発現は、このような領域を含まないプラスミドを保有する酵母と比較 したとき、約１０倍であることが実証された。

本発明の目的は、ある種の型の動物細胞によるヒトｔＰＡを含む所望タンパク質 の効率のよい生産方法ならびに産物を提供することである。他の目的は、所望タ ンパク質をコードする遺伝子の高レベル発現を誘導すべく動物細胞をトランスフ ェクションするためのベクターを提供することである。他の目的は、培養したと き治療、診断および関連用途のためのタンパク質を多量に生産する形質転換細胞 を提供することである。本発明のさらに他の目的は、細胞内ｍＲＮＡの崩壊速度 を遅らせることによりトランスフェクションした細胞株中でのｍＲＮＡの安定性 を促進し、その結果として発現レベルを高める方法ならびに組換えＤＮＡを提供 することである。

本発明のこれらの目的および他の目的は以下の説明および請求の範囲から当業者 には明らかであるだろう。

主里企皿亙 通常免疫グロブリンを分泌する哺乳動物細胞株において所定のタンパク質の生産 を増大させる方法が今や発見された。３’　ＵＴ領領域短いセグメントおよびポ リアデニル化領域は、それらが対象のタンパク質をコードするＤＮＡ中の終結コ ドンの３′側に結合された場合、対象のタンパク質の生産増加を促進するのに有 力であることが分かった。３’ｔｌＴの小さいセグメントおよびポリアデニル化 部位から成る配列は翻訳領域に相当するｍＲＮＡを安定化して翻訳レベルを高め ると思われる。対象のタンパク質をコードするｍＲＮＡの定常状態レベルは、よ り長い非翻訳領域をもつ昨ＲＮＡに比べて増加する。

本発明によれば、この発見は対象のタンパク質を生産するベクターおよび方法を 提供するために、又はこのような物質を改良された発現レベルで生産すべく培養 しうる形質転換細胞をもたらすために利用される。外因性または内因性のタンパ ク質が本発明に従って生産され、すなわち宿主細胞の天然ゲノム中にコードされ ていないタンパク質、コードされてはいるが通常宿主細胞により発現されないタ ンパク質、または通常低レベルしか発現されないタンパク質が生産される。

本発明によれば、コード領域、終結シグナルコドン、および対象のタンパク質の ためのポリアデニル化シグナルを含む天然３’　ＬＩＴを含有するＤＮＡが対象 のタンパク質を自然界で生産する細胞から誘導される。このＤＮＡの３’ＵＴ領 域のヌクレオチド配列を改変することにより、終結シグナルとＡＡＴＡＡＡポリ アデニル化シグナルとの間に約３００ヌクレオチド塩基よりも短い改変３’　Ｕ Ｔを含む、完全な、転写能力をもつ、比較的短い組換えＤＮＡが作製される。こ の組換えＤＮＡは通常免疫グロブリンを分泌する所定の哺乳動物細胞株中にトラ ンスフェクションされる。トランスフェクションされた細胞株は培養して対象の タンパク質を生産させる。タンパク質の生産量は比較的長い天然３’ＵＴを含む 対象のタンパク質の未改変ＤＮＡを保有する同一細胞株のそれよりも多量である 。

１つの態様において、その短い組換えＤＮＡは対象のタンパク質のＤＮＡの３’ ＵＴの一部を含むが、他のＤＮＡからの３’ＵＴを使用することもできる。他の 態様において、改変３’ＵＴの少なくとも一部は非細胞性ＤＮＡ　（例えばウィ ルスＤＮＡ　）から得られるが、とりわけそれは哺乳動物ＤＮＡから得られる。

対象のタンパク質は免疫グロブリンまたはその分画、ホルモン、ワクチン、リン フ才力イン、サイトカイン、酵素またはプロ酵素でありうる。例えば、所望のタ ンパク質はヒト組織プラスミノーゲン活性化因本明細書中で実験モデルとして使 用され、詳細に説明される。

哺乳動物細胞株はミエローマ細胞株のような培養可能な細胞株であるが、通常免 疫グロブリンを分泌する他の哺乳動物細胞も使用することができる。

本発明によれば、その方法は対象のタンパク質をコードするＤＮＡに近接して、 細胞エンハンサ−因子から成る［ｌＮＡを結合させて組換えＤＮＡの転写を高め る追加工程を含みうる。本発明はさらに係属中の米国特許出願第８３７５９５号 （１９８６年３月７日出願）に記載されるような遮断因子を特徴としている。こ のような遮断因子は所望タンパク質を高レベルで生産するがマーカータンパク質 を選択に必要なレベルでしか生産しない形質転換体の作製を可能にする。

本発明はさらに、通常免疫グロブリンを分泌する哺乳動物細胞株にトランスフェ クションした場合に、タンパク質を生産しうるベクターを提供する。このベクタ ーは先に概略した方法に従って作製された転写能力をもつＤＮＡを含む。このベ クターは対象のタンパク質をコードする遺伝子に対して固有の天然３’ＵＴ領域 をもつベクター（その他の点では同一）と比べて、所望タンパク質の生産量を高 め゛るように働く。

本発明はさらに対象のタンパク質を生産する形質転換体を提供する。この形質転 換体は好ましくはミエローマ細胞のような通常免疫グロブリンを生産する哺乳動 物細胞から成り、先に概略可能なりＮＡを含むベクターを保有している。この形 質転換体は対象のタンパク質をコードする遺伝子に対して固有の天然３′非翻訳 領域を含む組換えＤＮＡを保有する形質転換体（その他の点では同一）と比べて 、増大した量の対象タンパク質を生産することができる。

本発明に従ってもたらされる発現レベルの増加は、明らかにトランスフェクショ ンした細胞内での対応ｎ＋ＲＮＡの定常状態レベルの増加によって引き起こされ る。融合ａ＋ＲＮＡのａ’ｕｉｓＩ域が短いことは、細胞内でのｍＲＮＡの分解 を低下させるのに役立ち、それによりａ＋ＲＮＡの細胞内半減期を増加させて発 現レベルを高めると考えられる。

ＤＮＡおよびＲＮＡのホスホジエステル結合はその分子の３′末端または５′末 端に作用するエキソヌクレアーゼによって攻撃されることが知られている。３′ 末端に作用する酵素は３′炭素とリン酸基との間のエステル結合を加水分解し、 一方５′酵素はリン酸基とホスホジエステル結合の５′炭素との間のエステル結 合を加水分解する。エンドヌクレアーゼは遊離末端３′または５′−ヒドロキシ ル基を必要とせず、３′または５′結合がポリヌクレオチド鎖中に存在するとこ ろはどこまでも攻撃する。

長い３’ＵＴを含む組換えＤＮＡは、リポソームに結合していない３’　ＵＴの ｍＲＮＡの一部がエンドヌクレアーゼにより切断され、続いてエキソヌクレアー ゼにより消化されると仮定できる。ｍＲＮＡの３’ＵＴ領域が短いと、それがリ ポソームと結合するとき、未結合状態の＋ａＲＮＡがより少なくなり、エンドヌ クレアーゼの攻撃を受ける部位の数が減少する。ポリＡ部位の存在は３′末端を エキソヌクレアーゼから保護する。こうして、ｍＲＮＡの分解速度は３’　ＵＴ 領領域短縮化ゆえに低下する。従って、本発明の手法により、ｍＲＮＡは安定化 され、その生物学的機能は所望タンパク質の発現増加をもたらすように高められ る。

本発明の本質および目的をさらに理解するために、以下の詳細な説明ならびに添 付の図面を参照すべきである。

皿皿企皿垂星説里 第１図は本発明方法の全工程を例示する概略図であり；第２図は所望のタンパク 質産物（ｔＰＡ）をコードする遺伝子と融合させた種々のＤＮＡセグメントを示 す模式図であり；そして第３図はミエローマ細胞によりｔＰＡを生産するのに適 した発現ベクターのプラスミドｐＥＭｐ−ｔＰＡを示す模式図である。このベク ターは現在のところ好適な本発明の態様を示すものである。

許胤星且凱 本発明は、哺乳動物細胞において所定のタンパク質の生産を増大させるための方 法、ベクターおよび形質転換細胞を提供する。対象のタンパク質をコードするＤ ＮＡの３’ＵＴｆ＋ｉ域は、一般に約３００個以下のヌクレオチド塩基から成る ３’ＵＴ領域をもつ比較的短い組換えＤＮＡを生ずるように改変され、そしてそ の遺伝子の終結コドンとＡＡＴＡＡＡポリＡシグポリとの間に２００個以下の塩 基を含みうる。通常免疫グロブリンを生産・分泌する哺乳動物細胞株が得られた 組換えＤＮＡでトランスフェクションされる。

この形質転換細胞を培養することにより、未改変３’ＵＴ領域を含む同一の形質 転換細胞株と比較して、増大した量の対象タンパク質が生産される。

本発明方法を第１図に示す。ＤＮＡ　２は対象のタンパク質をコードするコード 領域６を含む。それはそのタンパク質を自然界で生産する細胞から誘導され、例 えばＤＮＡ配列の知識から慣用技術を用いて合成される。例えば、そのＤＮＡは 自然界に存在するＤＮＡまたは化学的に合成されたＤＮＡでありうる。また、そ のＤＮＡは慣用のｃＤＮＡ技術により誘導された逆転写ｃＤＮＡでありうる。

このＤＮＡ２の非翻訳領域４の一般に長いヌクレオチド配列は、対象のタンパク 質をコードする領域６と、終結シグナルのあとの、ポリＡ付加シグナル８に結合 された約３００ヌクレオチド塩基長以下の３’ＵＴ（７）とを含む、完全な、転 写能力をもつ、比較的短い組換えＤＮＡ５を生ずるように改変される。従って、 組換えＤＮＡ５は対象のタンパク質のコード領域６、終結シグナル１２、および 終結シグナル１２とポリＡ付加シグナル８の間に挿入された比較的短い３’ＵＴ （７と記す）から成る。組換えＤＮＡのポリＡ部位を含む３’　ＵＴは、３’　 ｔｌＴのセグメントをスプライシングすることにより対象のタンパク質をコード するＤＮＡ２から、または他のＤＮＡから得ることができる。組換えＤＮＡ５は プラスミド１０に挿入して発現ベクター１４を作製する。このプラスミドはプロ モーター配列１６および発現可能なま−か一遺伝子１８を含む。この組換えＤＮ Ａを用いて哺乳動物細胞株をトランスフェクションし、クローニングし、そして 遺伝子６を首尾よく取り込んでそれを発現できる細胞のサブ集団についてスクリ ーニングする。トランスフェクションされた細胞株は培養して所望タンパク質を 生産させ、その後そのタンパク質を分離・精製する。

免疫グロブリンを分泌するリンパ系細胞中の非常に豊富な免疫グロブリンｍＲＮ Ａの３’ｔｌＴは比較的短い（約３００ヌクレオチド以下）が、リンパ系細胞中 で発現されないいくつかの対象遺伝子の３’　ＬＩＴは比較的長いことが知られ ている。例えば、ｔＰＡのＵＴ領領域約８００ヌクレオチド長であり〔ベニ力（ Ｐｅｎｎｉｅａ）　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖ、３０１．２１４〜２３１．　１９ ８３年１月を参照〕、〜ｌ因子のそれは約１８００ヌクレオチド長であり〔ウッ ド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ＋Ｖ、３１２．３３０〜３３７．　１９８４年 １１月を参照）、そしてエリトロポエチンのそれは約５６０ヌクレオチド長であ る〔ジャコブ（Ｊａｃｏｂｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖ、３１３．８１６〜８１ ０．　１９８５年２月を参照〕。

本発明において有用な発現ベクターおよび形質転換体を作製するための組換えＤ ＮＡ技術は開発されており、公知である。それらはＤＮＡを配列特異的に切断し て平滑末端または接着末端を生ずる種々の制＠酵素、ＤＮＡリガーゼ、平滑末端 をもつＤＮＡ分子への接着末端の酵素的付加を可能にする技術、ｃＤＮＡ合成技 術、特定の機能をもつ遺伝子を単離するための合成プローブ、合成りＮＡを作る ためのオリゴヌクレオチドの集成、慣用のトランスフェクション技術、および同 様に慣用のＤＮＡクローニング／サブクローニング技術の使用を伴う。

いろいろな型のベクター、例えばプラスミドやウィルス（動物ウィルスおよびフ ァージを含む）が使用される。ベクターは通常細胞集団のどの個体がベクター１ ４０組換えＤＮＡを首尾よく組み込んだかを同定するために使用しうる、検出可 能な表現型特性をトランスフェクションした細胞に付与するマーカー遺伝子１８ を含むであろう。ミエローマ細胞株において使用するのに適したマーカーは、ト キシン含有培地中でその細胞を生存させうる酵素（通常その細胞によって発現さ れないか、又は低レベルでしか発現されない酵素）をコードするＤＮＡから成る 。このような酵素の例にはチミジンキナーゼ（ＴＫ）　、アデノシン・ホスホリ ボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）、およびヒポキサンチン・ホスホリボシ ル・トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、これらの酵素はＴ１．、ＡＰＲＴまたは ）ＩＰＲＴ欠損細胞をそれぞれヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン培地 中で生育させる；ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＰＲ）、この酵素はＤＨＰＲ欠損 細胞をメトトレキセートの存在下で生育させる；大腸菌酵素キサンチン−グアノ シン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ、　ｇｐｔ遺伝子の産 物）、この酵素は正常細胞をミコフェノール酸の存在下で生育させる；および原 核生物酵素Ｔｎ５ホスホトランスフェラーゼ、この酵素は正常細胞をネオマイシ ンの存在下で生育させる；が含まれる。

その他の適当なマーカー遺伝子も、本発明に従ってミエローマ細胞を形質転換す るために使用されるベクターにおいて有用であるだろう。

本発明のベクターは、エンハンサ−因子の５′末端と３′末端の両方に配置され たプロモーター、または両末端から離れて配置されたプロモーターに作用して、 プロモーターの３′末端に存在する遺伝子の転写を増強するタイプのエンハンサ −因子を含むことができる。エンハンサ−因子にはバナージ（Ｂａｎｅｒｊ　ｉ ）　ら（Ｃｅｌｌ、　Ｖ、２７．２９９〜３０８．１９８１　）　、デビリアー （ｄｅＶｉｌｌｉｅｒｓ）およびシャフナ−（Ｓｈａｆｆｎｅｒ）　（Ｎｕｃｌ 、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｖ、９．６２５１〜６２６４、１９８１）　、または レビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）ら（Ｎａｔｕｒｅ、Ｖ、２９５゜５６８〜５７ ２．１９８２　）によって開示されたようなウィルス由来のＤＮＡが含まれるが 、好ましくはギリエス（Ｇｉｌｌｉｅｓ）およびトネガワ（Ｔｏｎｅｇａｗａ） によって最近発見され、Ｃｅ１ｌ　（Ｖ、３３，７１７〜７２８゜１９８３）に 発表され、より詳細には係属中の米国特許出願第５９２２３１号（１９８４年３ 月２２日出願）に開示されたタイプの細胞エンハンサ−因子である。本発明ベク ターはさらに係属中の米国特許出願第８３７５９５号（１９８６年３月７日出＠ ）に記載されるような遮断因子を含むことができ、この遮断因子はエンハンサ− の影響下に所望タンパク質を高レベルで生産するが、マーカータンパク質を選択 に必要な低レベルでしか生産しない形質転換体の作製を可能にする。

第３閣は本発明に従ってｔＰＡを生産するために使用しうる好適なプラスミドベ クターの制限地図を表す。このベクターはｐＥＦＩｐ−ｔＰＡと呼ばれ、７４９ ８塩基対から構成されている。それはタンパク質（ここではヒトｔＰＡ　）をコ ードする挿入ＤＮＡからのｍＲＮＡの転写を増強するミエローマ細胞由来のエン ハンサ−因子を含み〔ギリエス（Ｇｉｌｌｉｅｓ）ら、Ｃｅ１ｌ、　１９８３． 同上を参照〕、そして係属中の米国特許出願第８３７５９５号に記載の手法に従 ってエンハンサ−機能を選択的に調節するベクター構築原理を利用している。ベ クター構築の詳細を以下に述べ盃。

好適な実施態様において、組換えＤＮＡでトランスフェクションされるべき宿主 細胞は、無限に増殖できるように改変された連続細胞株または確立細胞株である 。従って、これらの細胞は老化する前に限られた世代数にわたって培養下で分裂 する正常細胞と相違している。無限に増殖する能力は対象タンパク質の生産をス ケールアップするのに役立つ。

本発明の実施に際して使用される宿主細胞は、通常免疫グロブリンを生産・分泌 する哺乳動物細胞である。これらの細胞は一般に循環系に存在する。実際に使用 される細胞は予め選択することにより免疫グロブリンを分泌する能力を失ったも のである。

さらに、ヒトウィルスによるタンパク質産物の汚染の可能性を減らすために、宿 主系は（ヒト細胞ではなく）ネズミまたはラット由来の細胞であることが好まし い。好適な態様では、ミエローマ細胞が宿主培養系を構成する。ミエローマ細胞 は一般に培養が簡単であり、発現産物を細胞外培地中へ分泌する。

第３図に示したベクターおよび他の適当な発現ベクターはミエローマ細胞、好ま しくはネズミ由来のもの、例えば細胞株Ｊ５５８（ＡＴＣＣ−ＴＩＢ６）　、Ｓ ｐ２１０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）　、およびＰ３Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ、１５８０）をトランスフェクションするために本 発明に従って使用される。好適なミエローマ細胞株はＪ５５８Ｌ、である（ＡＴ ＣＣＣＲＬ　９１３２．オイ（Ｏｆ）ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 。

Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　Ｖ、８０．　ｐ、８２５＋　１９８３を参照〕。これら の細胞はＢａ１ｂ／Ｃマウスの循環系からのＢ細胞の悪性形質転換体であり、骨 髄腫組織から誘導される。

上記の細胞型の形質転換体は、リム（Ｆ、Ｌｉｍ）の米国特許第４４０９３３１ 号に記載の方法に従って、懸濁液中または好ましくはマイクロカプセル内で培養 される。タンパク質産物の精製を容易にし且つ分泌後の安定性を高めるために、 細胞は無血清培地で培養することが好適である。細胞外タンパク質は培地を取り 換えるとき毎日回収する。この方法はウシまたはウマ血清中にしばしば存在する 汚染性のタンパク質分解酵素および他の不活化因子の混入していない産物をもた らす利点を有している。好適なＪ５５８Ｌ細胞は免疫グロブリンＡのラムダ軽鎖 を有意量分泌するが、このタンパク質および他の夾雑タンパク質はタンパク質産 物から容易に分離することができる。

本発明はここに記載されるような遺伝子操作された細胞を用いてｔＰＡおよび他 の価値あるタンパク質を多量に生産するために使用される。非限定的な例として 他のプラスミノーゲン活性化因子およびプロ活性化因子、血液凝固因子、ホルモ ン、インターフェロン、抗体、酵素およびプロ酵素、ワクチン、ならびに種々の リンフ才力インおよびサイトカインが含まれる。

以下の実施例はすべての点で例示的であると理解されるべき提供するものである 。

１施■ ｔＰＡ　るミニローマン　−　のノ ｐＥＭｐｌと呼ばれる基本的な発現ベクターは以下のフラグメントから構築した ：　（ａ）　ＳＶ４０エンハンサ−お、よび初期領域プロモーター、大腸菌ｇｐ ｔ遺伝子、ＳＶ４０小型腫瘍抗原介在配列、ならびにＳＶ４０転写終結およびポ リアデニル化シグナルを含むｐＳＶ２−ｇｐｔ　（ミュリガン（Ｍｕｌｌｉｇａ ｎ）およびバーブ（Ｂｅｒｇ）、　５ｃｉｅｎｃｅ。

Ｖ、２０９．１４２２〜１４２７．１９８０を参照〕由来の２．２５ｋｂ　Ｐｖ ｕ　ｎ　−ＢａＩＢ旧フラグメント；Ｑ））アンピシリナーゼ遺伝子および細菌 複製起点を含むｐＢＲ３２２由来の２．３ｋｂ　Ｐｖｕ　Ｉ［−ＥｃｏＲＩフラ グメント〔サトクリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　Ｖ、７５＋３７３’Ｌ１９７８を参照）；（Ｃ） 　免疫グロブリン重鎮エンハンサ−を含む０．３ｋｂ　Ｐｖｕ　ＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉフラグメント〔ギリエス（Ｇｉｌｌｉｅｓ）　ら、Ｃｅ１ｌ、　Ｖ、３３．　 ｐ、７１７〜７２８．１９８３を参照）；（ｄ）　メタロチオネインＩプロモー ターを含む０．２５ｋｂ　５ａｃｌ−ＢＧＬ　Ｉ［フラグメント〔プリンスター （Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、、Ｖ、２９６．３９〜４２．１９８２ を参照〕　；および（ｅ）　ポリアデニル化シグナルを含むグロブリンカッパ軟 鋼遺伝子の３’　ＵＴ領領域らの０．４ｋｂ　Ａｖａ　ＩＩ　−Ｈａｅ　ｍフラ グメント〔マックス（Ｍａｘ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　Ｖ、２５６． ５１１６〜５１２０、１９８１を参照〕。これらのフラグメントは公知の方法論 に従って一連の反応により連結させた〔例えばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ） ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎ ｕａｌコールド・スプリング・ハーバ−、１９８２を参照されたい〕。

この基本的な発現ベクターを使用して、ｔＰＡを発現する一連のベクターを構築 した。　ｐＥＭｌ−ｔＰＡ−Ａ、　−Ｂおよび−Ｃと呼ばれる３種類のベクター はすべてｔＰＡ　ｃＤＮＡの全コード領域を含んでいたが、以下のようにそれら の３′非翻訳領域において相違していた。

ｔＰＡのｃＤＮＡは標準的手法（マニアチス、上記文献参照）により得られた。

全コード領域および約８００塩基対の３’ＬＩＴ領域を含むｔＰＡクローンはヌ クレオチド配列決定により同定・確認した。

ｔＰＡ　ｃＤＮＡは翻訳終結コドンの約４００塩基対下流にあるＢｇｌ　１１部 位で切断し、次に基本ベクターの唯一のＸｈｏ１部位へＸｈｏｌリンカ−を介し て挿入した。従って、この発現ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ａ中のｔＰＡ　３’ ＵＴ領域は、約４００塩基対の天然ｔＰＡ　３’ＵＴおよび２００塩基対の免疫 グロブリンカッパ軽鎖遺伝子の３’ＵＴ領域から成っていた。

ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｂでは、大部分の天然ｔＰＡ　３’ＵＴが翻訳終結 シグナルの３４塩基対下流に位置するＳａｕ　３Ａ部位でクローニン、グし、そ して２００塩基対の免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子の３′ＵＴへ結合させるこ とにより除去された。

ベクターｐＥＭ１−ｔＰＡ−Ｃは、カッパ軽鎖遺伝子（７）　３’　ＵＴ領領域 ＳＶ４０後期遺伝子の３’　ＩＴ領領域らの約２００塩基対ソラグメントと置換 されたという点でｐＥＭｌ−ｔＰＡ−Ｂと異なっていた。

上記の種々の３’ｔｌＴＳｉ域をもつ組換えｔＰＡ遺伝子を第２図に示す。ベク ターｐＥＭ１−　ｔＰＡ−Ａでは終結コドンとＡＡＴＡＡＡポリＡシグポリとの 間が約０．５９ｋｂであり、ｐＥＭｌ−ｔＰＡ−Ｂでは０．２３ｋｂ、そしてｐ ＥＭｌ−ｔＰＡ−Ｃでは０．１６ｋｂである。

ｔＰＡ含有プラスミドはプロトプラスト融合法（ギリエスら、上記文献参照）に よってＪ５５８Ｌ　ミエローマ細胞へトランスフェクションした。このプラスミ ドを含み、それ故にｇｐｔ遺伝子を含む細胞はミコフェノール酸含有培地で培養 することにより選択した。このプラスミドを含む耐性コロニーをサブクローニン グして、ｔＰＡ発現についてスクリーニングした。ｔＰＡの合成および培地中へ のｔＰＡの分泌は、ｔＰＡがプラスミノーゲンをプラスミンに転化し、次いでプ ラスミンが色素原トリペプチド５２２５１を分解する検定法を用いて調べた（ペ ニカら、上記文献参照）。血清はｔＰＡおよびプラスミンの両方の阻害剤を含む ことが知られている〔コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）およびリネン（Ｌｉｊｎｅｎ）、 ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａ ｔｏｌｏｇｙ＋　Ｖ、４＋　２４９〜３０１、１９８６を参照〕ので、検定前に 形質転換細胞を無血清培地中で４８時間培養した。活性は世界保健機構によって 供給された標品に基づいて国際単位（ＩＵ）で測定し、アメリカン・ダイアグノ スティクス社から得られたｔＰＡ標品によって確認した。

ベクターｐＥＭ１−　ｔＰＡ−Ａを用いてトランスフェクションした細胞には、 ｔＰＡをコードするｍＲＮＡが低レベルで存在することが分析の結果分かったが 、有意量のｔＰＡを発現するクローンは全く検出できなかった。ｐＥＭｌ−ｔＰ Ａ−Ｂでトランスフェクションした２６個のクローンのうち、５個がｔＰＡを発 現した。最高発現レベルを相対値１．００とすると、ｐＥＭｌ−ｔＰＡ−Ｂ　） ランスフエクションによるｔＰＡの発現は０．２８〜１．００の範囲であった。

ｐＥＭｌ−ｔＰＡ−Ｃでトランスフェクションした１４個のクローンのうち、６ 個が０．１２〜０．４４の相対レベルでｔＰＡを発現した。

本発明はその精神および範囲から逸脱することなしに他の特定形態に具体化する ことが可能である。

ＦＩＧ　／ 国際調査報告 にＴ／υ５８７１０１９６４ 工工、ＦＸＥＬＤＳ　５ＥＡＲＣＦＥＤ　（ＫＥＹＷＯＲＤＳ　Ｃ０ＮＴ工ＩＥ Ｄ）１ｍ−ａｂｍ″ｌ　Ａｅ＊ａｃａｌ＋ｅＭ　Ｉ＋″”　ＰＣ”／ＩＪＳ８７ １０１９６４

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．通常免疫グロブリンを分泌する哺乳動物細胞株においてタンパク質を生産す る方法であって、 （ａ）該タンパク質を自然界で生産する細胞に由来し、順次コード領域、終結シ グナルコドン、およびポリアデニル化シグナルを含む非翻訳領域からなるＤＮＡ を用意し；（ｂ）該ＤＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列を改変し、それによ り終結シグナルコドンとポリアデニル化シグナルとの間に約３００個以下のヌク レオチド塩基を含む改変された非翻訳領域を有する、完全な、転写能力をもつ、 より短い組換えＤＮＡを作製し； （ｃ）該組換えＤＮＡを用いて上記哺乳動物細胞株をトランスフェクションし； そして （ｄ）トランスフェクションした細胞株を培養して上記タンパク質を生産させる ； 各工程から成り、上記のトランスフェクションした細胞株が生産するタンパク質 の量は工程（ａ）に記載のＤＮＡを含む細胞株（その他の点では同一）が生産す るタンパク質の量よりも多量であることを特徴とする上記方法。
2. ２．上記の改変された非翻訳領域は配列ＡＡＴＡＡＡ（ここでＡはアデニンであ り、Ｔはチミンである）を含む、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．上記のより短いＤＮＡは上記ＤＮＡの非翻訳領域の一部を含む、請求の範囲 第１項記載の方法。
4. ４．上記の改変された非翻訳領域の少なくとも一部は哺乳動物以外のＤＮＡから 得られる、請求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．上記の改変された非翻訳領域の少なくとも一部は哺乳動物の遺伝子から得ら れる、請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．上記コード領域は免疫グロブリン、ホルモン、ワクチン、リンフォカイン、 サイトカイン、酵素およびプロ酵素から成る群より選ばれるタンパク質をンドす る、請求の範囲第１項記載方法。
7. ７．上記コード領域はプラスミノーゲン活性化因子をコードする、請求の範囲第 １項記載の方法。
8. ８．上記活性化因子はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である、請求の範囲 第７項記載の方法。
9. ９．上記哺乳動物細胞株はミエローマ細胞株である、請求の範囲第１項記載の方 法。
10. １０．上記組換えＤＮＡの転写を促進するために、該タンパク質をコードするＤ ＮＡに近接して、細胞エンハンサー因子から成るＤＮＡを結合させる追加工程を 含む、請求の範囲第１項記載の方法。
11. １１．通常免疫グロブリンを分泌する哺乳動物細胞株にトランスフェクションし た場合タンパク質を生産するベクターであって、 該ベクターは順次プロモーター配列から成る第１ＤＮＡセグメント、該第１セグ メントに連結されたタンパク質をコードする第２ＤＮＡセグメント、および終結 シグナルコドンを有する、複製可能な、転写能力をもつＤＮＡから成り、該ＤＮ Ａは上記終結シグナルコドンの３′側に、ポリアデニル化シグナルおよび該終結 コドンと該ポリアデニル化シグナルの間に約３００個以下の塩基対を含む天然の ものでない非翻訳領域から成る第３ＤＮＡセグメントをさらに含むことを特徴と し、該タンパク質をコードする遺伝子に対して固有の天然３′非翻訳領域を含む ベクター（その他の点では同一）に比べて、増大した量のタンパク質を生産させ るべく使用しうる上記ベクター。
12. １２．上記第３ＤＮＡセグメントは配列ＡＡＴＡＡＡ（ここでＡはアデニンであ り、Ｔはチミンである）を含む、請求の範囲第１１項記載のベクター。
13. １３．上記第２ＤＮＡセグメントは免疫グロブリン、ワクチン、リンフォカイン 、サイトカイン、酵素およびプロ酵素から成る群より選ばれる物質をコードする 、請求の範囲第１１項記載のベクター。
14. １４．上記第２ＤＮＡセグメントはプラスミノーゲン活性化因子をコードする、 請求の範囲第１１項記載のベクター。
15. １５．上記活性化因子はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である、請求の範 囲第１４項記載のベクター。
16. １６．通常免疫グロブリンを生産する哺乳動物細胞から成るタンパク質生産用の 形質転換体であって、 該形質転換体は順次 （ａ）プロモーター配列から成る第１ＤＮＡセグメント；（ｂ）該第１セグメン トに連結された、上記タンパク質をコードする第２ＤＮＡセグメント； （ｃ）終結シグナルコドン；および （ｄ）該終結シグナルコドンの３′側にある、ポリアデニル化シグナルを含み且 つ該終結コドンと該ポリアデニル化シグナルの間に約３００個以下の塩基対を有 する天然のものではない非翻訳領域から成る第３ＤＮＡセグメント；を含む発現 可能なＤＮＡを保有しており、該タンパク質をコードする遺伝子に対して固有の 天然３′非翻訳領域を含む組換えＤＮＡを保有する形質転換体（その他の点では 同一）に比べて、増大した量のタンパク質を生産することが可能である上記形質 転換体。
17. １７．上記第３ＤＮＡセグメントは配列ＡＡＴＡＡＡ（ここでＡはアデニンであ り、Ｔはチミンである）を含む、請求の範囲第１６項記載の形質転換体。
18. １８．上記第２ＤＮＡセグメントは免疫グロブリン、ワクチン、リンフォカイン 、サイトカイン、ホルモン、酵素およびプロ酵素から成る群より選ばれる物質を コードし、上記形質転換体が該物質を発現する、請求の範囲第１６項記載の形質 転換体。
19. １９．上記第２ＤＮＡセグメントはプラスミノーゲン活性化因子をコードする、 請求の範囲第１６項記載の形質転換体。
20. ２０．上記活性化因子はヒト組織プラスミノーゲン活性化因子である、請求の範 囲第１９項記載の形質転換体。
21. ２１．上記哺乳動物細胞はミエローマ細胞である、請求の範囲第１９項記載の形 質転換体。