JPH0834725B2 - リンホトキシン - Google Patents
リンホトキシンInfo
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- JPH0834725B2 JPH0834725B2 JP60147371A JP14737185A JPH0834725B2 JP H0834725 B2 JPH0834725 B2 JP H0834725B2 JP 60147371 A JP60147371 A JP 60147371A JP 14737185 A JP14737185 A JP 14737185A JP H0834725 B2 JPH0834725 B2 JP H0834725B2
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- Japan
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- gene
- sequence
- dna sequence
- dna
- cells
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト・リンホトキシン遺伝子を含むDNA配
列及びそのDNA配列を有するDNAによつて形質転換された
培養細胞、更にその形質転換細胞を利用したヒト・リン
ホトキンの製造法に係る。
列及びそのDNA配列を有するDNAによつて形質転換された
培養細胞、更にその形質転換細胞を利用したヒト・リン
ホトキンの製造法に係る。
リンホトキシン（LT）は直接あるいは間接的に癌細胞
のみを攻撃し、壊死させる作用を持ち（Evans C.H.ら
（1977年）キヤンサー・リサーチ（Cancer Res.）,37
巻,898頁）、制癌剤としての臨床応用が期待されてい
る。
のみを攻撃し、壊死させる作用を持ち（Evans C.H.ら
（1977年）キヤンサー・リサーチ（Cancer Res.）,37
巻,898頁）、制癌剤としての臨床応用が期待されてい
る。
（従来の技術） リンホトキシン（LT）は、ヒト或いはマウス等の動物
のリンパ球細胞をフイトヘマグルチニン，コンカナバリ
ンＡ等のレクチン或いはフオルボールエステルで刺激す
ることにより誘導されるリンホカインの一種である（De
vlin,J.J.（1984年）リンホカインズ（Lymphokines）,9
巻,313頁）。代表的生産細胞としてはヒトではヒツジ赤
血球とのロゼツト形成で選択されたＴ細胞あるいはＢ細
胞株RPMI 1788（Aggarwal,B.B.ら（1984年）ザ・ジヤ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）,259巻,686頁）が知られている。LTは糖蛋白
であるが（Toth,M.K.とGranger,G.A.（1979年），モリ
キユラー・イミユノロジー（Mol.Immunol.）,16巻,671
頁）、種々の形態構成をとりうる。LTの蛋白化学的研究
はいくつかのグループで研究されているが、分子量約2
0,000の成分がその最小単位であり、その単位成分が会
合したものや他の成分との複合体があるとされている
（Aggarwal,B.B.ら（1984年）ザ・ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー,259巻,686頁）。
のリンパ球細胞をフイトヘマグルチニン，コンカナバリ
ンＡ等のレクチン或いはフオルボールエステルで刺激す
ることにより誘導されるリンホカインの一種である（De
vlin,J.J.（1984年）リンホカインズ（Lymphokines）,9
巻,313頁）。代表的生産細胞としてはヒトではヒツジ赤
血球とのロゼツト形成で選択されたＴ細胞あるいはＢ細
胞株RPMI 1788（Aggarwal,B.B.ら（1984年）ザ・ジヤ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Bio
l.Chem.）,259巻,686頁）が知られている。LTは糖蛋白
であるが（Toth,M.K.とGranger,G.A.（1979年），モリ
キユラー・イミユノロジー（Mol.Immunol.）,16巻,671
頁）、種々の形態構成をとりうる。LTの蛋白化学的研究
はいくつかのグループで研究されているが、分子量約2
0,000の成分がその最小単位であり、その単位成分が会
合したものや他の成分との複合体があるとされている
（Aggarwal,B.B.ら（1984年）ザ・ジヤーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー,259巻,686頁）。
LTは、フオルボールエステル，マイトージエン等で刺
激されたリンパ球が産生することが知られているが、こ
のような生産法では生産されるLTは極めて微量であり、
また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向き
である。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞）をマイトージエン等で刺激するとLTが誘導的に産生
されることが知られているが、生産能は用いる細胞の能
力に大きく依存しており、やはり量産に適した系とは言
えない。近年LTのcDNAがクローニングされ、大腸菌でLT
様蛋白の生産が可能になつた（Gray,P.W.ら（1984年）
ネイチヤー（Nature）,312巻,721頁）。しかし微生物で
つくられるLT様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成
機構が多少異なる為に、つくられる蛋白のアミノ末端が
天然のそれと異なる場合が多い。更に微生物によつてつ
くられるLT様蛋白は、天然のLTが糖鎖を有しているのに
対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋白
合成系によつてつくられたLT様蛋白と天然のLTとは物質
として明らかに異なり、治療薬として長期間使用した
り、頻回使用する場合には、抗原抗体反応の問題が懸念
される。
激されたリンパ球が産生することが知られているが、こ
のような生産法では生産されるLTは極めて微量であり、
また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向き
である。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞）をマイトージエン等で刺激するとLTが誘導的に産生
されることが知られているが、生産能は用いる細胞の能
力に大きく依存しており、やはり量産に適した系とは言
えない。近年LTのcDNAがクローニングされ、大腸菌でLT
様蛋白の生産が可能になつた（Gray,P.W.ら（1984年）
ネイチヤー（Nature）,312巻,721頁）。しかし微生物で
つくられるLT様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成
機構が多少異なる為に、つくられる蛋白のアミノ末端が
天然のそれと異なる場合が多い。更に微生物によつてつ
くられるLT様蛋白は、天然のLTが糖鎖を有しているのに
対し、糖鎖が結合していない。このように微生物の蛋白
合成系によつてつくられたLT様蛋白と天然のLTとは物質
として明らかに異なり、治療薬として長期間使用した
り、頻回使用する場合には、抗原抗体反応の問題が懸念
される。
（発明が解決しようとする問題点） 蛋白のアミノ末端が天然のLTと同じで且つ糖鎖を有す
るLTを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺伝
子組換えの手法の適用が考えられる。この場合、単にLT
遺伝子を動物培養細胞に導入してもLTの産生を観ること
はできないと推定される。すなわちLTは誘導蛋白であ
り、その発現は遺伝子のレベルで制限されているからで
ある。従つて遺伝子導入の手法により、動物培養細胞に
効果的なLT産生能を付与する為には、用いる遺伝子に改
良を加える必要がある。
るLTを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺伝
子組換えの手法の適用が考えられる。この場合、単にLT
遺伝子を動物培養細胞に導入してもLTの産生を観ること
はできないと推定される。すなわちLTは誘導蛋白であ
り、その発現は遺伝子のレベルで制限されているからで
ある。従つて遺伝子導入の手法により、動物培養細胞に
効果的なLT産生能を付与する為には、用いる遺伝子に改
良を加える必要がある。
高等生物の多くの蛋白は、核DNA配列上に、いくつか
に分断されてコードされていることが知られている。成
熟型のメツセンジヤーRNA（mRNA）の配列をコードして
いるDNA配列はエクソン（exon），分断している配列は
介在配列またはイントロン（intron）と呼ばれている。
イントロンの生物学的な意義や機能は現在不明な点も多
いが、オバルブミン（Wickens,M.P.ら（1980年）ネイチ
ヤー,285巻,628頁）やウイルス蛋白（Lai,C−J.ら（197
9年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー・（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA）,76巻,71頁）のイントロンを含まな
い遺伝子配列は、イントロンを含む配列に比べ、導入し
た動物細胞内での蛋白の生産が極めて少ないことが知ら
れている。また、イントロンを欠落させたSV40の遺伝子
にβ−globin遺伝子のイントロンを加えることにより、
安定なmRNAの蓄積が起こる事が知られた（Hamer,D.H.R
ら（1979年）セル（Cell）,18巻,1299頁）。
に分断されてコードされていることが知られている。成
熟型のメツセンジヤーRNA（mRNA）の配列をコードして
いるDNA配列はエクソン（exon），分断している配列は
介在配列またはイントロン（intron）と呼ばれている。
イントロンの生物学的な意義や機能は現在不明な点も多
いが、オバルブミン（Wickens,M.P.ら（1980年）ネイチ
ヤー,285巻,628頁）やウイルス蛋白（Lai,C−J.ら（197
9年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー・（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA）,76巻,71頁）のイントロンを含まな
い遺伝子配列は、イントロンを含む配列に比べ、導入し
た動物細胞内での蛋白の生産が極めて少ないことが知ら
れている。また、イントロンを欠落させたSV40の遺伝子
にβ−globin遺伝子のイントロンを加えることにより、
安定なmRNAの蓄積が起こる事が知られた（Hamer,D.H.R
ら（1979年）セル（Cell）,18巻,1299頁）。
遺伝子から転写された初期RNAからのイントロン部分
の配列の除去をスプライシング（Splicing）と呼ぶが、
スプライシングは安定なmRNAの蓄積あるいはmRNAの核か
ら細胞質への移行の為に必要な事象と推定される。
の配列の除去をスプライシング（Splicing）と呼ぶが、
スプライシングは安定なmRNAの蓄積あるいはmRNAの核か
ら細胞質への移行の為に必要な事象と推定される。
正常で機能のある蛋白の発現の為には、イントロンの
正しい位置でのスプライシングが不可欠であるが、イン
シユリン遺伝子とシミアンウイルス40（SV40）のプロモ
ーター領域を結合し、COS細胞に導入した場合の異常な
スプライシングが報告されている（Laub,O.ら（1983
年）ザ・ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー,258巻,6043頁）。またアミラーゼの発現において
は、組織特異的なスプライシングが存在し、同一の遺伝
子から２つの異つたスプライシングを経て、唾液線アミ
ラーゼと膵臓アミラーゼが合成されることが知られてい
る（Young,R.A.ラ（1981年）セル,23巻,451頁）。ま
た、SV40（Berk,A.J.ら（1978年）プロシーデイングズ
・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー,75巻,1274頁），アデノウイルス（Ch
ow,L.T.（1977年）セル,12巻,1頁）等においても、同一
の遺伝子から異つたスプライシングを経て複数のmRNA及
び蛋白が合成されている。従つて、動物培養細胞にイン
トロンを含むLT遺伝子を導入し、LTを産生するには正常
なスプライシングが起こる必要があるが、本発明者らは
LTをコードしている染色体DNA配列に動物培養細胞で機
能する、すなわちmRNA合成を開始する事が可能なプロモ
ーター領域のDNA配列を結合させ、種々の動物培養細胞
に導入した場合、正常にスプライシングが起こり、LTが
培地中に著量分泌される事を見い出した。
正しい位置でのスプライシングが不可欠であるが、イン
シユリン遺伝子とシミアンウイルス40（SV40）のプロモ
ーター領域を結合し、COS細胞に導入した場合の異常な
スプライシングが報告されている（Laub,O.ら（1983
年）ザ・ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー,258巻,6043頁）。またアミラーゼの発現において
は、組織特異的なスプライシングが存在し、同一の遺伝
子から２つの異つたスプライシングを経て、唾液線アミ
ラーゼと膵臓アミラーゼが合成されることが知られてい
る（Young,R.A.ラ（1981年）セル,23巻,451頁）。ま
た、SV40（Berk,A.J.ら（1978年）プロシーデイングズ
・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー,75巻,1274頁），アデノウイルス（Ch
ow,L.T.（1977年）セル,12巻,1頁）等においても、同一
の遺伝子から異つたスプライシングを経て複数のmRNA及
び蛋白が合成されている。従つて、動物培養細胞にイン
トロンを含むLT遺伝子を導入し、LTを産生するには正常
なスプライシングが起こる必要があるが、本発明者らは
LTをコードしている染色体DNA配列に動物培養細胞で機
能する、すなわちmRNA合成を開始する事が可能なプロモ
ーター領域のDNA配列を結合させ、種々の動物培養細胞
に導入した場合、正常にスプライシングが起こり、LTが
培地中に著量分泌される事を見い出した。
LTは糖蛋白である。現在LTの糖鎖の構造については不
明な点が多く、ヒト以外の細胞でつくられたLTとヒト由
来細胞でつくられたLTの糖鎖の構造及び抗原性に違いが
あるかは不明である。しかしヒト由来細胞でつくられる
LTは、天然のLTと極めて類似しているものと考えられ、
ヒト以外の細胞でつくられたLTに比して、より安全性が
高いと考えられる。またヒト以外の細胞でLTをつくる場
合は、LTの製品中にヒト以外の生物の蛋白等の構成成分
や分泌成分が混入する事が考えられ、治療薬としての長
期間の投与におけるアレルギー反応、シヨツク等の問題
が予想されるが、ヒト由来細胞を用いて作つた製品中に
は本質的にヒトの成分、すなわちヒト血液中に存在して
いる物質以外は含まれず生産物の安全性の向上が期待さ
れる。
明な点が多く、ヒト以外の細胞でつくられたLTとヒト由
来細胞でつくられたLTの糖鎖の構造及び抗原性に違いが
あるかは不明である。しかしヒト由来細胞でつくられる
LTは、天然のLTと極めて類似しているものと考えられ、
ヒト以外の細胞でつくられたLTに比して、より安全性が
高いと考えられる。またヒト以外の細胞でLTをつくる場
合は、LTの製品中にヒト以外の生物の蛋白等の構成成分
や分泌成分が混入する事が考えられ、治療薬としての長
期間の投与におけるアレルギー反応、シヨツク等の問題
が予想されるが、ヒト由来細胞を用いて作つた製品中に
は本質的にヒトの成分、すなわちヒト血液中に存在して
いる物質以外は含まれず生産物の安全性の向上が期待さ
れる。
本発明により、安全性の高いLTを大量に供給する事が
可能になるものと考えられる。以下に、本発明を更に詳
細に説明する。
可能になるものと考えられる。以下に、本発明を更に詳
細に説明する。
（問題点を解決するための手段） LTをコードしている染色体遺伝子領域は、本発明者ら
のクローニング及び解析の結果初めて明らかになり、第
１図に示したような制限酵素認識部位を有している。LT
染色体DNA配列とはLTの蛋白合成の開始のアミノ酸であ
るメチオニンのコドンATGから終止コドンTAGまでの塩基
配列を含むDNA配列で、例えば第２図に示したプラスミ
ドpLTB4.2に含まれるBamH I4.2Kb（キロベース）の配列
をさす。
のクローニング及び解析の結果初めて明らかになり、第
１図に示したような制限酵素認識部位を有している。LT
染色体DNA配列とはLTの蛋白合成の開始のアミノ酸であ
るメチオニンのコドンATGから終止コドンTAGまでの塩基
配列を含むDNA配列で、例えば第２図に示したプラスミ
ドpLTB4.2に含まれるBamH I4.2Kb（キロベース）の配列
をさす。
LTをコードする染色体DNA配列は、ヒトDNAからクロー
ン化される。ヒトDNAは、例えばヒト白血球細胞培養細
胞或いは組織などを用い、Blinらの方法（Blin,N.ら（1
976年）ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucleic A
cids Res.）,3巻,2303頁）により調製される。LT遺伝子
のクローニングに用いるベクターはCharon28に代表され
るλフアージベクター,pBR322に代表されるプラスミド
ベクター或いはpHC79に代表されるコスミツドなどが利
用できるが、一般的には、高率で長鎖のDNA断片をクロ
ーニングできるλフアージをベクターとして用いる遺伝
子操作法が用いられる。すなわちヒト高分子DNAを適切
な制限酵素で切断後、λフアージDNAの置換可能領域の
代りに挿入し、リコンビナントフアージDNAをつくる。
次にインビトロパツケージングの手法を用い、感染性の
あるフアージ粒子を作製する。次に宿主大腸菌とともに
プレートにまき、組換え型フアージのプラークを形成さ
せる（Enquist,L.ら（1979年）メソツズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）,68巻,281頁;Hor
n,B.（1979年）メソツズ・イン・エンザイモロジー,68
巻,299頁）。LTをコードするDNA断片を持つ組換え型フ
アージのプラークの検出には、cDNAや合成DNAをプロー
ブとしたプラークハイリダイゼーシヨンの手法（Woo,S.
L.C.（1979年）メソツズ・イン・エンザイモロジー,68
巻,389頁;Szostak,J.W.ら（1979年）メソツズ・イン・
エンザイモロジー,68巻,419頁）が利用できる。またLT
の遺伝子を持つ組換え型フアージは、プラークハイブリ
ダイゼーシヨンによつて選択されたプラークから回収し
宿主大腸菌と共に培養することにより大量に調製でき
る。また組換え型フアージのDNAはフエノール法等によ
り調製できる（Maniatis,T.ら（1982年）Molecular Clo
ning a Laboratory manual,Cold Spring Harbor Labora
tory）。
ン化される。ヒトDNAは、例えばヒト白血球細胞培養細
胞或いは組織などを用い、Blinらの方法（Blin,N.ら（1
976年）ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucleic A
cids Res.）,3巻,2303頁）により調製される。LT遺伝子
のクローニングに用いるベクターはCharon28に代表され
るλフアージベクター,pBR322に代表されるプラスミド
ベクター或いはpHC79に代表されるコスミツドなどが利
用できるが、一般的には、高率で長鎖のDNA断片をクロ
ーニングできるλフアージをベクターとして用いる遺伝
子操作法が用いられる。すなわちヒト高分子DNAを適切
な制限酵素で切断後、λフアージDNAの置換可能領域の
代りに挿入し、リコンビナントフアージDNAをつくる。
次にインビトロパツケージングの手法を用い、感染性の
あるフアージ粒子を作製する。次に宿主大腸菌とともに
プレートにまき、組換え型フアージのプラークを形成さ
せる（Enquist,L.ら（1979年）メソツズ・イン・エンザ
イモロジー（Methods in Enzymology）,68巻,281頁;Hor
n,B.（1979年）メソツズ・イン・エンザイモロジー,68
巻,299頁）。LTをコードするDNA断片を持つ組換え型フ
アージのプラークの検出には、cDNAや合成DNAをプロー
ブとしたプラークハイリダイゼーシヨンの手法（Woo,S.
L.C.（1979年）メソツズ・イン・エンザイモロジー,68
巻,389頁;Szostak,J.W.ら（1979年）メソツズ・イン・
エンザイモロジー,68巻,419頁）が利用できる。またLT
の遺伝子を持つ組換え型フアージは、プラークハイブリ
ダイゼーシヨンによつて選択されたプラークから回収し
宿主大腸菌と共に培養することにより大量に調製でき
る。また組換え型フアージのDNAはフエノール法等によ
り調製できる（Maniatis,T.ら（1982年）Molecular Clo
ning a Laboratory manual,Cold Spring Harbor Labora
tory）。
動物培養細胞へのDNAの導入法として、トランスフエ
クシヨン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Wigl
er,M.ら（1977年）セル,11巻,223頁）、マイクロインジ
エクシヨン法（Anderson,W.F.ら（1980年）プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・ユーエスエー,77巻,5399頁）、リポゾーム
法、DEAE−デキストラン法或いは細胞融合法（Schoffne
r,W.ら（1980年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエ
ー,77巻,2163頁）等が用いられている。リン酸カルシウ
ム法として用いるDNA材料としては、DNA溶液の他に大腸
菌などの微生物、フアージなども利用できる。細胞融合
法では目的DNA配列をプラスミドとして保有している微
生物のブロトプラストが用いられている。
クシヨン効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Wigl
er,M.ら（1977年）セル,11巻,223頁）、マイクロインジ
エクシヨン法（Anderson,W.F.ら（1980年）プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・ユーエスエー,77巻,5399頁）、リポゾーム
法、DEAE−デキストラン法或いは細胞融合法（Schoffne
r,W.ら（1980年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエ
ー,77巻,2163頁）等が用いられている。リン酸カルシウ
ム法として用いるDNA材料としては、DNA溶液の他に大腸
菌などの微生物、フアージなども利用できる。細胞融合
法では目的DNA配列をプラスミドとして保有している微
生物のブロトプラストが用いられている。
LTは誘導蛋白であり、ヒト白血球細胞を種々のマイト
ージエン等で刺激することにより誘導される。現在マイ
トージエンの刺激が、どのような形でLTの遺伝子に働
き、LTを誘導するかは不明であるが、そのような誘導機
構のない細胞にLTの調節部位を含む遺伝子を導入しても
LTの生産は微弱なものであろう。本発明者らは、動物培
養細胞内で機能する他の遺伝子のプロモーター領域の配
列をLTの染色体DNA配列の５′側に接続し、細胞に導入
することによりLTの非生産細胞を高生産細胞に形質転換
できることを見い出した。この場合、LTのmRNA合成は接
続したプロモーター領域の制御下におかれ、たとえば接
続したプロモーター領域が構成的な蛋白の遺伝子のプロ
モーター領域であれば、細胞内でLTのmRNAは常時合成さ
れ、従つて細胞はLTの構成的生産細胞になる。もし接続
するプロモーター領域が、誘導蛋白のものであれば、形
質転換細胞は、LT誘導蛋白として生産する。
ージエン等で刺激することにより誘導される。現在マイ
トージエンの刺激が、どのような形でLTの遺伝子に働
き、LTを誘導するかは不明であるが、そのような誘導機
構のない細胞にLTの調節部位を含む遺伝子を導入しても
LTの生産は微弱なものであろう。本発明者らは、動物培
養細胞内で機能する他の遺伝子のプロモーター領域の配
列をLTの染色体DNA配列の５′側に接続し、細胞に導入
することによりLTの非生産細胞を高生産細胞に形質転換
できることを見い出した。この場合、LTのmRNA合成は接
続したプロモーター領域の制御下におかれ、たとえば接
続したプロモーター領域が構成的な蛋白の遺伝子のプロ
モーター領域であれば、細胞内でLTのmRNAは常時合成さ
れ、従つて細胞はLTの構成的生産細胞になる。もし接続
するプロモーター領域が、誘導蛋白のものであれば、形
質転換細胞は、LT誘導蛋白として生産する。
動物培養細胞で機能するプロモーターとしてSV40の初
期遺伝子プロモーターが知られている。このプロモータ
ーはSV40DNAのHind III−Pvu IIフラグメント、約350ベ
ースペア（bp）DNA断片に含まれている。また、このDNA
断片は逆向きにSV40の後期遺伝子のプロモーターとして
の活性を有している。SV40の後期プロモーターからの転
写活性は、一般的にSV40のＴ抗原の存在下で増強され
る。従つてSV40の後期プロモーターを接続したLTの遺伝
子が導入される細胞は、Ｔ抗原が発現している細胞が望
ましい。Ｔ抗原が発現している細胞を作製するには、Ｔ
抗原をコードしている遺伝子を細胞に導入すればよい。
またSV40のＴ抗原をコードするDNA配列とSV40の後期プ
ロモーター配列とを接続したLT遺伝子配列が同一の配列
上に存在するDNA配列で培養細胞の形質転換した場合、
多種の細胞株でLTの高発現株が得られるであろう。
期遺伝子プロモーターが知られている。このプロモータ
ーはSV40DNAのHind III−Pvu IIフラグメント、約350ベ
ースペア（bp）DNA断片に含まれている。また、このDNA
断片は逆向きにSV40の後期遺伝子のプロモーターとして
の活性を有している。SV40の後期プロモーターからの転
写活性は、一般的にSV40のＴ抗原の存在下で増強され
る。従つてSV40の後期プロモーターを接続したLTの遺伝
子が導入される細胞は、Ｔ抗原が発現している細胞が望
ましい。Ｔ抗原が発現している細胞を作製するには、Ｔ
抗原をコードしている遺伝子を細胞に導入すればよい。
またSV40のＴ抗原をコードするDNA配列とSV40の後期プ
ロモーター配列とを接続したLT遺伝子配列が同一の配列
上に存在するDNA配列で培養細胞の形質転換した場合、
多種の細胞株でLTの高発現株が得られるであろう。
ヘルペス・シンプレツクス・ウイルス（HSV）タイプ
ＩのチミジンキナーゼプロモーターもSV40初期遺伝子プ
ロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、領域
の構造はWagnerらによつて示されている（Wagner,M.J.
ら（1981年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー,79
巻,1441頁）。機能するプロモーター領域とは、mRNAの
合成開始点は含むが、それらのプロモーターが調節して
いる蛋白の最初のアミノ酸であるメチオニンのコドンは
含まないプロモーター領域の配列をさす。機能するプロ
モーター領域の配列とLT染色体DNA配列とが接続したDNA
配列（LT発現ベクター）の作製を実施例３に示した。
ＩのチミジンキナーゼプロモーターもSV40初期遺伝子プ
ロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、領域
の構造はWagnerらによつて示されている（Wagner,M.J.
ら（1981年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシヨナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー,79
巻,1441頁）。機能するプロモーター領域とは、mRNAの
合成開始点は含むが、それらのプロモーターが調節して
いる蛋白の最初のアミノ酸であるメチオニンのコドンは
含まないプロモーター領域の配列をさす。機能するプロ
モーター領域の配列とLT染色体DNA配列とが接続したDNA
配列（LT発現ベクター）の作製を実施例３に示した。
LTのアミノ酸配列は、クローニングされたLT遺伝子の
エクソン部分の塩基配列から推定可能である。塩基配列
はマキサムーギルバート法（Maxam,A.M.ら（1980年）メ
トツズ・イン・エンザイモロジー,65巻,499頁）、或い
はSangerのダイデオキシ法（Sanger,F.（1981年）サイ
エンス（Science）,214巻,1205頁）等で決定される。
エクソン部分の塩基配列から推定可能である。塩基配列
はマキサムーギルバート法（Maxam,A.M.ら（1980年）メ
トツズ・イン・エンザイモロジー,65巻,499頁）、或い
はSangerのダイデオキシ法（Sanger,F.（1981年）サイ
エンス（Science）,214巻,1205頁）等で決定される。
遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は宿主染色
体DNAに安定に組み込まれる場合がある。遺伝子が組み
込まれる染色体上の位置は一見でたらめであり、また組
み込まれるDNAのコピー数も不規則である。LT遺伝子を
細胞に導入した場合、組み込まれた位置やコピー数が細
胞ごとに異なり、各々の細胞のLT生産量は異なる。従つ
て細胞をクローン化することにより種々の生産量を有す
る細胞を得ることができる。目的遺伝子を導入し、安定
に発現する細胞のみを選択的に増殖させる為には、機能
するプロモーター配列とLT遺伝子が接続した配列と選択
マーカー遺伝子を同一DNA配列上に持つDNA配列が適切で
ある。動物細胞での選択マーカー遺伝子としてはEcogpt
（Mulligan,R.C.ら（1980年）サイエンス,209巻,1422
頁）、neo（Southern,P.J.ら（1982年）ジヤーナル・オ
ブ・モレキユラー・アンド・アプライド・ジエネテイツ
クス（J.MOl.Appl.Genet.）,1巻,327頁）、dhfr（Wigle
r,M.ら（1980年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエ
ー,77巻,3567頁）などの遺伝子が用いられる。また、そ
のようなDNA配列を大量に調製する為には、そのようなD
NA配列が、大腸菌で複製し且つ大量調製可能なプラスミ
ドやフアージであることが望ましい。実施例３乃至５に
示したLT発現ベクターは、以上のような目的にかなうプ
ラスミドである。すなわち大腸菌で複製可能にするDNA
複製開始点（ori）と、選択マーカー（アンピシリン耐
性遺伝子）及び動物培養細胞での選択マーカー遺伝子
（Ecogpt）及び機能するプロモーターと接続したLTの染
色体DNA配列が同一のDNA配列上に存在している事を特徴
としたプラスミドである。
体DNAに安定に組み込まれる場合がある。遺伝子が組み
込まれる染色体上の位置は一見でたらめであり、また組
み込まれるDNAのコピー数も不規則である。LT遺伝子を
細胞に導入した場合、組み込まれた位置やコピー数が細
胞ごとに異なり、各々の細胞のLT生産量は異なる。従つ
て細胞をクローン化することにより種々の生産量を有す
る細胞を得ることができる。目的遺伝子を導入し、安定
に発現する細胞のみを選択的に増殖させる為には、機能
するプロモーター配列とLT遺伝子が接続した配列と選択
マーカー遺伝子を同一DNA配列上に持つDNA配列が適切で
ある。動物細胞での選択マーカー遺伝子としてはEcogpt
（Mulligan,R.C.ら（1980年）サイエンス,209巻,1422
頁）、neo（Southern,P.J.ら（1982年）ジヤーナル・オ
ブ・モレキユラー・アンド・アプライド・ジエネテイツ
クス（J.MOl.Appl.Genet.）,1巻,327頁）、dhfr（Wigle
r,M.ら（1980年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシ
ヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエ
ー,77巻,3567頁）などの遺伝子が用いられる。また、そ
のようなDNA配列を大量に調製する為には、そのようなD
NA配列が、大腸菌で複製し且つ大量調製可能なプラスミ
ドやフアージであることが望ましい。実施例３乃至５に
示したLT発現ベクターは、以上のような目的にかなうプ
ラスミドである。すなわち大腸菌で複製可能にするDNA
複製開始点（ori）と、選択マーカー（アンピシリン耐
性遺伝子）及び動物培養細胞での選択マーカー遺伝子
（Ecogpt）及び機能するプロモーターと接続したLTの染
色体DNA配列が同一のDNA配列上に存在している事を特徴
としたプラスミドである。
機能する他の遺伝子のプロモーター領域を接続したLT
の染色体DNA配列を導入された細胞がLTを産生する為に
は、該DNA配列が、用いた細胞固有のRNA合成系、RNAの
成熟、蛋白合成系、蛋白の成熟、分泌等の機能に適合し
ている必要がある。導入されたDNAからはmRNAが合成さ
れるが、mRNAの５′未満はキヤツプ構造の付加、正常な
位置でのスプライシング及び３′末端へのポリアデニレ
ーシヨンが必要である。また活性のあるLTの発現には、
合成されるLTペプタイドの正常な高次構造の形成と維
持、更にはシグナルペプタイドの切断、細胞からの分泌
が正確に行なわれる必要がある。本発明者らが試用した
動物培養細胞はアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨン（ATCC）から入手可能なハムスター、サル、ヒ
ト由来の細胞であるが、本明細書に示されているLTの製
造法を用いれば、少なくとも脊椎動物由来の培養細胞、
融合細胞、正常及び変異細胞、ウイルスによる形質転換
細胞等において活性あるLTを産生することが可能であ
る。またヒトの細胞をSV40で形質転換した株化細胞を生
産細胞として用いる事は、原因不明で癌化或いは株化し
た細胞に比して、適切な手段を講じることにより生産物
の安全性の向上が期待される。SV40の形質転換細胞とし
てW I−26 VA4が知られている。
の染色体DNA配列を導入された細胞がLTを産生する為に
は、該DNA配列が、用いた細胞固有のRNA合成系、RNAの
成熟、蛋白合成系、蛋白の成熟、分泌等の機能に適合し
ている必要がある。導入されたDNAからはmRNAが合成さ
れるが、mRNAの５′未満はキヤツプ構造の付加、正常な
位置でのスプライシング及び３′末端へのポリアデニレ
ーシヨンが必要である。また活性のあるLTの発現には、
合成されるLTペプタイドの正常な高次構造の形成と維
持、更にはシグナルペプタイドの切断、細胞からの分泌
が正確に行なわれる必要がある。本発明者らが試用した
動物培養細胞はアメリカン・タイプ・カルチヤー・コレ
クシヨン（ATCC）から入手可能なハムスター、サル、ヒ
ト由来の細胞であるが、本明細書に示されているLTの製
造法を用いれば、少なくとも脊椎動物由来の培養細胞、
融合細胞、正常及び変異細胞、ウイルスによる形質転換
細胞等において活性あるLTを産生することが可能であ
る。またヒトの細胞をSV40で形質転換した株化細胞を生
産細胞として用いる事は、原因不明で癌化或いは株化し
た細胞に比して、適切な手段を講じることにより生産物
の安全性の向上が期待される。SV40の形質転換細胞とし
てW I−26 VA4が知られている。
機能するプロモーターを接続したLT染色体DNA配列
を、例えばリン酸カルシウム法で動物培養細胞に導入
し、LTを産生するようになつた細胞は、通常細胞の培養
に用いられる血清を含んだ培地ばかりでなく、全く血清
を含まない無血清培地でもLTを産生する事を見い出し
た。LTの生産に無血清培地を用いる事はLTの培地からの
回収精製をより容易にするばかりでなく、製品への血清
成分の混入を防ぐことになる。
を、例えばリン酸カルシウム法で動物培養細胞に導入
し、LTを産生するようになつた細胞は、通常細胞の培養
に用いられる血清を含んだ培地ばかりでなく、全く血清
を含まない無血清培地でもLTを産生する事を見い出し
た。LTの生産に無血清培地を用いる事はLTの培地からの
回収精製をより容易にするばかりでなく、製品への血清
成分の混入を防ぐことになる。
（実施例） 以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総
理大臣の定める「組換えDNA実験指針」に従つて行つ
た。また実施例中のフアージ、プラスミド、DNA、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、成書を参考とした。
理大臣の定める「組換えDNA実験指針」に従つて行つ
た。また実施例中のフアージ、プラスミド、DNA、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、成書を参考とした。
1.蛋白質 核酸 酵素,26巻,4号，（1981年）臨時増刊
遺伝子操作（共立出版） 2.遺伝子操作実験法，高木康敬 編著（1980年）講談社 3.遺伝子操作マニユアル，高木康敬 編著（1982年）講
談社 4.Molecular Cloning a laboratory manual,T.Maniatis
ら編（1982年）Cold Spring Harbor Laboratory 5.Methods in Enzymology,65巻,L.Grossmanら編（1980
年）Academic Press 6.Methods in Enzymology,68巻,R.Wu編（1979年）Acade
mic Press 実施例１ LT遺伝子のクローニング 複数の健康成人からヘパリン採血し、市販のリン酸緩
衝液（PBS）（フローラボラトリー社製）で２倍希釈
後、フイコールパツク（フアルマシア社製）液に上層
し、2000回転、30分遠心し白血球層を分離し、更にPBS
で２回洗浄した。108個の細胞に対して20mlの0.5M EDT
A−0.5％ザルコシル溶液を加え、2mgのプロテアーゼＫ
を入れ、50℃で３時間インキユベートした。フエノール
抽出を２回行い、水層を50mMトリス−10mM EDTA−10mM
塩化ナトリウム（pH8.0）に１晩透析した。R Nase Aを1
00μg/mlになるように加え、37℃で３時間処理後、フエ
ノール抽出を２回行い、水層を50mMトリス−10mM EDTA
に透析し、高分子ヒトDNAを得た。ヒトDNAを制限酵素Sa
u3A Iで部分切断後、庶糖密度勾配遠心により約15〜20
キロベースの大きさのSau3A I DNA断片を調製した。ラ
ムダフアージベクターCharon28DNAをBamH Iで切断後、
庶糖密度勾配遠心によりCharon28の左端断片及び右端断
片を含む画分を集め、エタノール沈澱により回収した。
遺伝子操作（共立出版） 2.遺伝子操作実験法，高木康敬 編著（1980年）講談社 3.遺伝子操作マニユアル，高木康敬 編著（1982年）講
談社 4.Molecular Cloning a laboratory manual,T.Maniatis
ら編（1982年）Cold Spring Harbor Laboratory 5.Methods in Enzymology,65巻,L.Grossmanら編（1980
年）Academic Press 6.Methods in Enzymology,68巻,R.Wu編（1979年）Acade
mic Press 実施例１ LT遺伝子のクローニング 複数の健康成人からヘパリン採血し、市販のリン酸緩
衝液（PBS）（フローラボラトリー社製）で２倍希釈
後、フイコールパツク（フアルマシア社製）液に上層
し、2000回転、30分遠心し白血球層を分離し、更にPBS
で２回洗浄した。108個の細胞に対して20mlの0.5M EDT
A−0.5％ザルコシル溶液を加え、2mgのプロテアーゼＫ
を入れ、50℃で３時間インキユベートした。フエノール
抽出を２回行い、水層を50mMトリス−10mM EDTA−10mM
塩化ナトリウム（pH8.0）に１晩透析した。R Nase Aを1
00μg/mlになるように加え、37℃で３時間処理後、フエ
ノール抽出を２回行い、水層を50mMトリス−10mM EDTA
に透析し、高分子ヒトDNAを得た。ヒトDNAを制限酵素Sa
u3A Iで部分切断後、庶糖密度勾配遠心により約15〜20
キロベースの大きさのSau3A I DNA断片を調製した。ラ
ムダフアージベクターCharon28DNAをBamH Iで切断後、
庶糖密度勾配遠心によりCharon28の左端断片及び右端断
片を含む画分を集め、エタノール沈澱により回収した。
Charon28の両端のDNA断片とヒト15〜20キロベースSau
3A I断片をT4DNAリガーゼで結合後、エンキストとスタ
ンバーグの方法（L.EnquistとN.Sternberg（1979年）メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー,68巻,281頁）により
インビトロパツケージングを行い、大腸菌LE392を宿主
として組換え型フアージのプラークを形成させた。次に
プラークハイブリダイゼーシヨンの手法（Benton,W.
D。,Davis,R.W.（1977）サイエンス,196巻,180頁）によ
りLTの遺伝子を持つ組換え型フアージクローンを選択し
た。プローブとしては、LTの遺伝子に存在する配列を持
つオリゴヌクレオチドATGACACCACCTGAACGT,TCTACTCCCAG
GTGGTC及びACTGTCTTCTTTGGAGCC（これらの配列はLTのア
ミノ酸配列−34から−29,75から80及び163から168に対
応している:Gray,P.W.ら（1984年）ネイチヤー,312巻,7
21頁）をホスホトリエステル法（Miyoshi,K。ら（198
0）ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ,8巻,5507頁）で
合成し、５′−OHを〔γ−32P〕ATP及びT4ポリヌクレオ
チドキナーゼで標識して用いた。
3A I断片をT4DNAリガーゼで結合後、エンキストとスタ
ンバーグの方法（L.EnquistとN.Sternberg（1979年）メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー,68巻,281頁）により
インビトロパツケージングを行い、大腸菌LE392を宿主
として組換え型フアージのプラークを形成させた。次に
プラークハイブリダイゼーシヨンの手法（Benton,W.
D。,Davis,R.W.（1977）サイエンス,196巻,180頁）によ
りLTの遺伝子を持つ組換え型フアージクローンを選択し
た。プローブとしては、LTの遺伝子に存在する配列を持
つオリゴヌクレオチドATGACACCACCTGAACGT,TCTACTCCCAG
GTGGTC及びACTGTCTTCTTTGGAGCC（これらの配列はLTのア
ミノ酸配列−34から−29,75から80及び163から168に対
応している:Gray,P.W.ら（1984年）ネイチヤー,312巻,7
21頁）をホスホトリエステル法（Miyoshi,K。ら（198
0）ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ,8巻,5507頁）で
合成し、５′−OHを〔γ−32P〕ATP及びT4ポリヌクレオ
チドキナーゼで標識して用いた。
約60万の組換え型フアージクローンから用いた３種の
合成DNAプローブすべてとハイブリダイズするフアージ
クローン11株を得た。このうちの１つのフアージクロー
ン４−１を種々の制限酵素で切断し、アガロース電気泳
動を行い、ニトロセルロースフイルターにトランスフア
ー後、３種の合成DNAプローブを用いたサザーンハイブ
リダイゼーシヨン（Southern,E.M.（1975年）ジヤーナ
ル・オブ・モレキユラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）98巻,503頁）を行つたところ、BamH I 4.2Kb,EcoR
I 2.3KbおよびSma I 2.7Kb断片が３種のプローブと
ハイブリダイズし、これらの断片の中にLTのアミノ酸配
列をコードしているDNA配列が含まれていることが明ら
かになつた。また、いくつかのフアージクローンのDNA
の制限酵素解析の結果、LT染色体DNA配列及び隣接した
配列の制限酵素認識部位は第１図のようにマツプされ
た。
合成DNAプローブすべてとハイブリダイズするフアージ
クローン11株を得た。このうちの１つのフアージクロー
ン４−１を種々の制限酵素で切断し、アガロース電気泳
動を行い、ニトロセルロースフイルターにトランスフア
ー後、３種の合成DNAプローブを用いたサザーンハイブ
リダイゼーシヨン（Southern,E.M.（1975年）ジヤーナ
ル・オブ・モレキユラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）98巻,503頁）を行つたところ、BamH I 4.2Kb,EcoR
I 2.3KbおよびSma I 2.7Kb断片が３種のプローブと
ハイブリダイズし、これらの断片の中にLTのアミノ酸配
列をコードしているDNA配列が含まれていることが明ら
かになつた。また、いくつかのフアージクローンのDNA
の制限酵素解析の結果、LT染色体DNA配列及び隣接した
配列の制限酵素認識部位は第１図のようにマツプされ
た。
実施例２ LT遺伝子のサブクローニング フアージクローン４−１のDNAを制限酵素BamH Iで切
断し、生じた4.2Kbの断片をプラスミドpUC9（Vieira,J
とMessing,J（1982年）ジーン（Gene）,19巻,259頁）の
BamH I部位に挿入しpLTB4.2を作製した（第２図）。
断し、生じた4.2Kbの断片をプラスミドpUC9（Vieira,J
とMessing,J（1982年）ジーン（Gene）,19巻,259頁）の
BamH I部位に挿入しpLTB4.2を作製した（第２図）。
市販されているpUC9のプライマーCAGGAAACAGCTATGAC,
AGTCACGACGTTGTA（以上宝酒造製）及びLTのアミノ酸−2
3から−28,75から80,163から168に対応するオリゴーマ
ーACCCTTGGGAGGAAGAG,TCTACTCCCAGGTGGTC,ACTGTCTTCTTT
GGAGCCをプライマーとしたダイデオキシ法による塩基配
列の決定（Wallace,R.B.ら（1981年）ジーン,16巻,21
頁）をpLTB4.2に実施した。その結果LTの５′側は、 の配列を有し、３′側は、 の配列を有していることが分つた。
AGTCACGACGTTGTA（以上宝酒造製）及びLTのアミノ酸−2
3から−28,75から80,163から168に対応するオリゴーマ
ーACCCTTGGGAGGAAGAG,TCTACTCCCAGGTGGTC,ACTGTCTTCTTT
GGAGCCをプライマーとしたダイデオキシ法による塩基配
列の決定（Wallace,R.B.ら（1981年）ジーン,16巻,21
頁）をpLTB4.2に実施した。その結果LTの５′側は、 の配列を有し、３′側は、 の配列を有していることが分つた。
実施例３ pSVeSma I LT,pSVpTKLT,pSV2LLT及びpSV3LLTの作製 SV40の初期遺伝子プロモーター領域の配列とLT染色体
DNA配列とが接続した配列を持つプラスミドであるpSVeS
ma I LTはpLTB4.2,pSV2gpt及びpSV3gpt（Mulligan,R.C.
とBerg,P.（1980年）サイエンス,209巻,1422頁）を出発
材料として、第３図−（ａ），−（ｂ）に示した手順に
より作製した。
DNA配列とが接続した配列を持つプラスミドであるpSVeS
ma I LTはpLTB4.2,pSV2gpt及びpSV3gpt（Mulligan,R.C.
とBerg,P.（1980年）サイエンス,209巻,1422頁）を出発
材料として、第３図−（ａ），−（ｂ）に示した手順に
より作製した。
すなわちpSV3gptをHind IIIで切断し、最も大きいDNA
断片をT4DNAリガーゼで環状化しpH Iを作製した。次にp
H IのPvu II部位をSal Iリンカーを用いてSal I部位に
改め、pH IIを作製した。更にpH IIのHind III部位をHi
nd III−Sma Iアダプターを用いてSma I部位を導入し、
pHSma Iを作製した。pHSma IをSal I,EcoR I切断しpSV2
gptのBamH I部位をBamH Iで切断後、DNAポリメラーゼＩ
（Klenow）で平滑末端にしT4DNAリガーゼで環状化して
作製したpS Iを同じくSal I,EcoR I切断し、アンピシリ
ン耐性遺伝子を持つDNA断片とT4DNAリガーゼで結合させ
pSVeSma Iをつくつた。次にpLTB4.2をSma Iで切断し、L
T遺伝子配列を持つDNA断片を得、これをSma I切断したp
SVeSma Iに導入し、pSVeSma I LTを作製した。
断片をT4DNAリガーゼで環状化しpH Iを作製した。次にp
H IのPvu II部位をSal Iリンカーを用いてSal I部位に
改め、pH IIを作製した。更にpH IIのHind III部位をHi
nd III−Sma Iアダプターを用いてSma I部位を導入し、
pHSma Iを作製した。pHSma IをSal I,EcoR I切断しpSV2
gptのBamH I部位をBamH Iで切断後、DNAポリメラーゼＩ
（Klenow）で平滑末端にしT4DNAリガーゼで環状化して
作製したpS Iを同じくSal I,EcoR I切断し、アンピシリ
ン耐性遺伝子を持つDNA断片とT4DNAリガーゼで結合させ
pSVeSma Iをつくつた。次にpLTB4.2をSma Iで切断し、L
T遺伝子配列を持つDNA断片を得、これをSma I切断したp
SVeSma Iに導入し、pSVeSma I LTを作製した。
用いたSal IリンカーとSma Iアダプターは、それぞれ
ｄ（dGGTCGACC）及びｄ（pAGCTCCCGGG）の配列を持つも
のを使用した。またDNAポリメラーゼＩはKlenowフラグ
メントを用いた。
ｄ（dGGTCGACC）及びｄ（pAGCTCCCGGG）の配列を持つも
のを使用した。またDNAポリメラーゼＩはKlenowフラグ
メントを用いた。
ヘルペスシンプレツクスウイルスタイプ１のチミジン
キナーゼのプロモーター領域の配列とLT遺伝子が接続し
た配列を持つプラスミドであるPSVpTKLTは、pLTB4.2,pH
SV106（McKnight,S.L.とGabis,E.R.（1980年）ヌクレイ
ツク・アシツズ・リサーチ,8巻,5931頁）及びpSVeSma I
を出発材料にして第４図に示した方法により作製した。
すなわちpLTB4.2に含まれるLT遺伝子BamH I−Sam I断片
をpHSV106のBgl II−Sma I部位に挿入しpHSVLTを作製し
た。次にpHSVLTからTKプロモーターのついたLT遺伝子Ba
mH I−Sma I断片をpSVeSma IのBamH I−Sma I部位に導
入しpSVpTKLTを作製した。
キナーゼのプロモーター領域の配列とLT遺伝子が接続し
た配列を持つプラスミドであるPSVpTKLTは、pLTB4.2,pH
SV106（McKnight,S.L.とGabis,E.R.（1980年）ヌクレイ
ツク・アシツズ・リサーチ,8巻,5931頁）及びpSVeSma I
を出発材料にして第４図に示した方法により作製した。
すなわちpLTB4.2に含まれるLT遺伝子BamH I−Sam I断片
をpHSV106のBgl II−Sma I部位に挿入しpHSVLTを作製し
た。次にpHSVLTからTKプロモーターのついたLT遺伝子Ba
mH I−Sma I断片をpSVeSma IのBamH I−Sma I部位に導
入しpSVpTKLTを作製した。
またSV40の後期遺伝子プロモーター領域の配列とLT遺
伝子が接続した配列を持つプラスミドであるpSV2LLT及
びpSV3LLTはpLTB4.2,pSV2gpt及びpSV3gptを出発材料に
して、第５図，第６図に示した方法により作製した。す
なわちpLTB4.2に含まれるLT遺伝子Sma I−Sma I2.5Kb断
片をpSV2gptのPvu II部位に結合させpSV2LLTを作製し
た。次にpsV2LLTをBamH Iで部分切断し、そこへpSV3gpt
の持つＴ抗原遺伝子BamH I断片を結合させpSV3LLTを作
製した。
伝子が接続した配列を持つプラスミドであるpSV2LLT及
びpSV3LLTはpLTB4.2,pSV2gpt及びpSV3gptを出発材料に
して、第５図，第６図に示した方法により作製した。す
なわちpLTB4.2に含まれるLT遺伝子Sma I−Sma I2.5Kb断
片をpSV2gptのPvu II部位に結合させpSV2LLTを作製し
た。次にpsV2LLTをBamH Iで部分切断し、そこへpSV3gpt
の持つＴ抗原遺伝子BamH I断片を結合させpSV3LLTを作
製した。
実施例４ pSVeSma I LT,pSVpTKLT,pSV2LLT及びpSV3LLTの培養細胞
への導入とLTの産生 形質発現ベクターpSVeSma I LT,pSVpTKLT,pSV2LLT及
びpSV3LLTに含まれるLT遺伝子の発現を調べる為に、種
々の動物培養細胞へWiglerらの方法（Wiglerら（1977
年）セル,11巻,223頁）に準じてプラスミドの導入を行
つた。本願特許請求の範囲各項に記載のDNA配列は第３
図（ｂ）に示すBamH I−Sma I断片の配列である。プラ
ミスド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め10％牛新生児
血清を含むイーグルMEM培地で生育させた細胞（２×105
細胞/3ml培地／直径6cm培養皿）に加え、15時間後に培
地を更新し、培養をつづけ48時間後の培地に含まれるLT
を、L929細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定した
（Ruff,M.R.とGifford,G.E.（1981年）リンホカインズ,
2巻,235頁）。すなわち96穴マルチデイツシユに２×104
細胞/well/100μ培地で１日培養後、培養液を除き、
アクシノマイシンＤ １μg/ml、５％牛胎児血清を含む
イーグルMEM培地で種々の濃度に希釈したサンプルを100
μ加え、20時間後の細胞の変性致死効果を測定した。
LT1ユニツトは50％の致死率を与える濃度とした。下表
に示すようにpSVeSma I LT,pSVpTKLT,pSV2LLT或いは、p
SV3LLTを導入した全ての培養細胞でLTの発現がみられ
た。また全ての培養細胞でpSV2LLTよりもpSV3LLTの発現
が高かつた。
への導入とLTの産生 形質発現ベクターpSVeSma I LT,pSVpTKLT,pSV2LLT及
びpSV3LLTに含まれるLT遺伝子の発現を調べる為に、種
々の動物培養細胞へWiglerらの方法（Wiglerら（1977
年）セル,11巻,223頁）に準じてプラスミドの導入を行
つた。本願特許請求の範囲各項に記載のDNA配列は第３
図（ｂ）に示すBamH I−Sma I断片の配列である。プラ
ミスド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め10％牛新生児
血清を含むイーグルMEM培地で生育させた細胞（２×105
細胞/3ml培地／直径6cm培養皿）に加え、15時間後に培
地を更新し、培養をつづけ48時間後の培地に含まれるLT
を、L929細胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定した
（Ruff,M.R.とGifford,G.E.（1981年）リンホカインズ,
2巻,235頁）。すなわち96穴マルチデイツシユに２×104
細胞/well/100μ培地で１日培養後、培養液を除き、
アクシノマイシンＤ １μg/ml、５％牛胎児血清を含む
イーグルMEM培地で種々の濃度に希釈したサンプルを100
μ加え、20時間後の細胞の変性致死効果を測定した。
LT1ユニツトは50％の致死率を与える濃度とした。下表
に示すようにpSVeSma I LT,pSVpTKLT,pSV2LLT或いは、p
SV3LLTを導入した全ての培養細胞でLTの発現がみられ
た。また全ての培養細胞でpSV2LLTよりもpSV3LLTの発現
が高かつた。
実施例５ LTの通常培地及び無血清培地での生産 実施例４でpSVeSma I LT,pSVpTKLT或いはpSV3LLTを導
入したBHK−21（Ｃ−13）の培地を10％牛胎児血清、25
μg/mlミコフエノール酸、250μg/mlキサンチンを含むM
EM培地に更新し、ミコフエノール酸耐性株を分離した。
ミコフエノール酸耐性株を24穴マルチデイツシユの底面
全面に生育させ、５％牛胎児血清（FCS）を含むMEM培地
と牛胎児血清を全く含まないMEM培地で24時間培養し、
培地中に含まれるLT活性を測定した。下表に示すよう
に、分離された細胞株は血清の有無にかかわらずLTを生
産した。
入したBHK−21（Ｃ−13）の培地を10％牛胎児血清、25
μg/mlミコフエノール酸、250μg/mlキサンチンを含むM
EM培地に更新し、ミコフエノール酸耐性株を分離した。
ミコフエノール酸耐性株を24穴マルチデイツシユの底面
全面に生育させ、５％牛胎児血清（FCS）を含むMEM培地
と牛胎児血清を全く含まないMEM培地で24時間培養し、
培地中に含まれるLT活性を測定した。下表に示すよう
に、分離された細胞株は血清の有無にかかわらずLTを生
産した。
第１図は、LT遺伝子を含む染色体DNA断片をクローニン
グした組換えフアージDNAを示す模式図、第２図はプラ
ミスドpLTB4.2を示す模式図、第３図−（ａ）はプラス
ミドpSVeSma I作製の模式図、第３図−（ｂ）はプラス
ミドpSVeSma I LT作製の模式図、第４図はプラスミドpS
VpTKLT作製の模式図、第５図はプラスミドpSV2LLT作製
の模式図、第６図はプラスミドpSV3LLT作製の模式図で
ある。 第１図中、Ｅは制限酵素EcoR I の認識部位を、Ｂは制
限酵素BamH I の認識部位を示す。 第２〜６図中、Sma I,Ava I,BamH I,Acc I,Sca I,EcoR
I,Sac I,Hind III,Pvu II,Sal I及びBgl IIは夫々の制
限酵素の認識部位を示す。HuLTはヒトLT遺伝子、pUC9は
ベクタープラスミドpUC9由来の領域、Ampγはアンピシ
リン耐性遺伝子、Ecogptは大腸菌のグアニン・ホスホリ
ボシルトランスフエラーゼ遺伝子、SVeはSV40ウイルス
の初期遺伝子プロモーター領域Ｔ−agはSV40のＴ−抗原
遺伝子、pTKはチミジンキナーゼのプロモーター領域、T
Kはチミジンキナーゼ遺伝子、（Pvu II/Sma I）は制限
酵素Pvu II切断部位とSma I切断部位を結合したものを
示す。
グした組換えフアージDNAを示す模式図、第２図はプラ
ミスドpLTB4.2を示す模式図、第３図−（ａ）はプラス
ミドpSVeSma I作製の模式図、第３図−（ｂ）はプラス
ミドpSVeSma I LT作製の模式図、第４図はプラスミドpS
VpTKLT作製の模式図、第５図はプラスミドpSV2LLT作製
の模式図、第６図はプラスミドpSV3LLT作製の模式図で
ある。 第１図中、Ｅは制限酵素EcoR I の認識部位を、Ｂは制
限酵素BamH I の認識部位を示す。 第２〜６図中、Sma I,Ava I,BamH I,Acc I,Sca I,EcoR
I,Sac I,Hind III,Pvu II,Sal I及びBgl IIは夫々の制
限酵素の認識部位を示す。HuLTはヒトLT遺伝子、pUC9は
ベクタープラスミドpUC9由来の領域、Ampγはアンピシ
リン耐性遺伝子、Ecogptは大腸菌のグアニン・ホスホリ
ボシルトランスフエラーゼ遺伝子、SVeはSV40ウイルス
の初期遺伝子プロモーター領域Ｔ−agはSV40のＴ−抗原
遺伝子、pTKはチミジンキナーゼのプロモーター領域、T
Kはチミジンキナーゼ遺伝子、（Pvu II/Sma I）は制限
酵素Pvu II切断部位とSma I切断部位を結合したものを
示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｌ 9282−4Ｂ (72)発明者 川原田 肇 兵庫県加古川市平岡町新在家2183の４ (72)発明者 渡辺 清 兵庫県明石市松が丘５丁目15の41 (56)参考文献 特開 昭56−160993（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，312，Ｐ．721〜724 （1984) 「遺伝子組換え実用化技術第２集」（昭 和56年３月15日）株式会社サイエンスフォ ーラム，Ｐ．33〜34 Ｎａｔｕｒｅ，209，Ｐ．1422〜1427 （1980)
Claims (11)
- 【請求項１】５′側において の配列を有し、３′側は、 の配列を有し、下記の制限酵素開裂地図に特徴づけられ
るヒト・リンホトキシン染色体DNA配列と動物培養細胞
で機能する構成的な発現をしている遺伝子のプロモータ
ー領域の配列とが接続したDNA配列 - 【請求項２】プロモーター領域がSV40の初期遺伝子或い
は単純ヘルペスウイルス（HSV−Ｉ）のチミジンキナー
ゼ遺伝子のプロモーター領域である特許請求の範囲第１
項記載のDNA配列。 - 【請求項３】プロモーター領域がSV40の後期遺伝子のプ
ロモーター領域である特許請求の範囲第１項記載のDNA
配列。 - 【請求項４】DNA配列がSV40のＴ抗原遺伝子配列と同一D
NA配列上に存在する特許請求の範囲第３項記載のDNA配
列。 - 【請求項５】DNA配列がプラスミドpSVeSmalLT,pSVpTKL
T,pSV2LLT或いはpSV3LLTのDNA配列である特許請求の範
囲第１項乃至第４項の何れかの項記載のDNA配列。 - 【請求項６】５′側において の配列を有し、３′側は、 の配列を有し、下記の制限酵素開裂地図に特徴づけられ
るヒト・リンホトキシン染色体DNA配列と動物培養細胞
で機能する構成的な発現をしている遺伝子のプロモータ
ー領域の配列とが接続したDNA配列を有するDNAによって
形質転換された動物培養細胞。 - 【請求項７】細胞の由来が哺乳類動物である特許請求の
範囲第６項記載の動物培養細胞。 - 【請求項８】細胞の由来がヒトである特許請求の範囲第
６項記載の動物培養細胞。 - 【請求項９】細胞がSV40で形質転換された細胞である特
許請求の範囲第６項乃至第８項の何れかの項記載の動物
培養細胞。 - 【請求項１０】細胞がCHO−K1,Vero,Wl−26 VA4,BHK−2
1（Ｃ−13）或いはL929である特許請求の範囲第６項記
載の動物培養細胞。 - 【請求項１１】５′側において の配列を有し、３′側は、 の配列を有し、下記の制限酵素開裂地図に特徴づけられ
るヒト・リンホトキシン染色体DNA配列と動物培養細胞
で機能する構成的な発現をしている遺伝子のプロモータ
ー領域の配列とが接続したDNA配列を有するDNAを含有す
る微生物。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60147371A JPH0834725B2 (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | リンホトキシン |
| AU59453/86A AU603768B2 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-01 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| CA000512923A CA1302921C (en) | 1985-07-04 | 1986-07-02 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| US06/882,109 US4988624A (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin DNA, lymphotoxin expression vector |
| EP86109069A EP0207518B1 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| DE8686109069T DE3686909T2 (de) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin-dns, lymphotoxin-expressionsvektor, lymphotoxin-expressionsvektor enthaltender transformant und verfahren zur herstellung von lymphotoxin. |
| JP4306012A JP2645785B2 (ja) | 1985-07-04 | 1992-10-19 | ヒト・リンホトキシンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60147371A JPH0834725B2 (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | リンホトキシン |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4306012A Division JP2645785B2 (ja) | 1985-07-04 | 1992-10-19 | ヒト・リンホトキシンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6211095A JPS6211095A (ja) | 1987-01-20 |
| JPH0834725B2 true JPH0834725B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=15428715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60147371A Expired - Fee Related JPH0834725B2 (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | リンホトキシン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0834725B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993014203A1 (fr) * | 1992-01-21 | 1993-07-22 | Tsumura & Co. | Lymphotoxines, vecteur d'expression pour lymphotoxines, et production de lymphotoxines au moyen de ce vecteur |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811895B (en) * | 1980-04-07 | 1982-04-28 | Univ California | Expression of hormone genomic clones |
-
1985
- 1985-07-04 JP JP60147371A patent/JPH0834725B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 「遺伝子組換え実用化技術第２集」（昭和５６年３月１５日）株式会社サイエンスフォーラム，Ｐ．３３〜３４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，２０９，Ｐ．１４２２〜１４２７（１９８０） |
| Ｎａｔｕｒｅ，３１２，Ｐ．７２１〜７２４（１９８４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6211095A (ja) | 1987-01-20 |
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