JPH02501112A - 免疫親和性による精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫親和性による精製方法 及肌＠１１ 本発明は免疫親和性クロマトグラフィー法、特に選択されたペプチド決定基に対 して二価の陽イオンに依存する親和性を持つモノクローナル抗体を用いることか らなる免疫親和性による方法に関する。

従来技術は、合成したリーダーペプチドまたは蛋白質フラグメントをこれらとは 起源を異にするポリペプチドに連結することからなる組換え融合蛋白質について 記載している。このような融合体では、リーダーペプチドまたは蛋白質フラグメ ントが、例えば、組換え体の同定を可能にする酵素活性、細胞の分泌機構によっ て認識されるアミノ酸配列、または、イオン交換、逆相りロマトグラフィー、あ るいはアフィニティータロマドグラフィー媒体による融合蛋白質の精製に有用な 異なる化学的性質あるいは抗原特徴をもつ配列、を提供することによって蛋白質 の発現および精製を容易にすることができる。

イタクラ（Ｉ　ｔａｋｕｒａ）　、米国特許第４，５７１，４２１号は、ソマト スタチン配列およびβ−ガラクトシダーゼ酵素のフラグメントからなるハイブリ ッドポリペプチドであって、２つの蛋白質セグメントの分離を可能にするＣＮＢ ｒ−切断部位によって分離されたハイブリッドポリペプチドについて記載してい る。この方法では、β−ガラクトシダーゼ配列が存在することによって、ソマト スタチン配列を含む形質転換体の同定が可能になる。

シューマン（Ｓｃｈｕ＋＊ａｎ）ら、ジャーナルオンバイ　口ジ　ルグま２」巳 ）−（Ｊ、Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩＩ＋）、２５５．１６８（１９８０）。

およびリード（Ｒｅｅｄ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）、２０．２５５（１９８２） は、β−ガラクトシダーゼの生物活性フラグメントをコードするヌクレオチド配 列および新規に単離した遺伝子の融合を含むこれらの研究方法の変法について開 示している。翻訳されたハイブリッド蛋白質はβ−ガラクトシダーゼの物理的お よび酵素的性質を参考にすることによって単離し、さらに新規単離遺伝子の生産 物に対して特異的な抗血清を調製するために使用された。

ルッテル（Ｒｕｔｔｅｒ）、公開欧州特許出願第３５３８４号（１９８１）はク ローン化したＤＮＡ配列の発現を容易にするために用いられるＤＮＡの構築につ いて開示している。開示された構築には以下に示す融合蛋白質をコードする配列 が含まれ、この融合蛋白質は精製に有用なく所望の蛋白質とは）異なる物理的性 質をもつＮ−末端配列とこれに連結したＣ−末端側部分からなり、両者の間には 特異的に切断されてＮ−末端配列を除去しうる配列が介在する。そのような切断 配列の一例はエンテロキナーゼによって認識されるペプチド配列ＤＤＤＤＫであ る。

精製のために有用な特殊な性質をもつ配列には、イオン交換体に容易に結合する であろうポリ陰イオンセグメントおよびポリ陽イオンセグメントならびに逆相媒 体に結合する能力をもつ疎水性セグメントが含まれる。またこの特許は、アフィ ニティークロマトグラフィ一段階で特異的抗体と結合する能力をもつフラグメン トを含むハイブリッド融合蛋白質についても開示している。

ブルーワー（Ｂ　ｒｅｗｅｒ）ら、米国特許第４，５３２，２０７号は、興味あ るポリペプチドに連結した電荷アミノ酸のポリマー、例えばポリアルギニン、か らなる組換え融合蛋白質について開示している。この融合蛋白質は微生物宿主で 発現させた後、電荷ポリマーをイオン交換媒体に結合させることを含むクロマト グラフィーによって精製される。精製後、電荷ポリマーはエキソペプチダーゼで の限定的消化によって除去される。スミス（Ｓ輸１ｔｈ）ら、ジーン（庄肱吐、 ３２，３２１（１９８４）およびサツセンフエルド（Ｓ　ａｓｓｅｎｆｅｌｄ） 　、バイ　−クノロジー（Ｂ　ｉｏ乙ニｄ、７６頁、１９８４年１月、もまた、 組換え蛋白質の精製のためのこのような研究方法の態様について記載している。

組換え蛋白質の発現および精製技術の改良は、バイオテクノロジー、製薬および 化学工業にとって重要な興味の一つである。

ル叶へＡ更 本発明は、多数の陰イオンアミノ酸残基からなる同定用配列を末端にもつ組換え 融合蛋白質を精製するための方法であり；蛋白質の配列に特異的であり且つ二価 の陽イオンに依存するモノクローナル抗体と該蛋白質との複合体を形成すること 、該複合体を単離すること、および該複合体と接触している二価陽イオンの濃度 を選択的に減少させることによって抗体および蛋白質を解離すること；からなる 上記の精製方法を提供する。

凡吸立用胆！；ｒ、、！！！Ｌ 本発明は蛋白質を単離するための効率的方法であり、多数の陰イオンアミノ酸残 基をもつ同定用ペプチドを陽イオン依存性モノクローナル抗体と共に用いる上記 方法を提供する。そのようなペプチドは高い免疫原性ペプチド決定基を提供し、 かつ多数の陰イオンアミノ酸残基の存在は陽イオン依存性抗体の単離を容易にす る。天然および合成の陰イオンアミノ酸の両方を同定ペプチドに組み込むことが できると考えられるが、アスパラギン酸およびグルタミン酸が好適である。天然 アミノ酸を用いるならば、それらを組換えポリペプチドの成分として慣用の蛋白 質翻訳システムで発現させることができる。一般的には、３〜６個のアスパラギ ン酸あるいはグルタミン酸残基またはその混合物からなる末端同定ペプチドが有 用である。

この着想に特に好適な実施態様はアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ　−Ｌｙｓ　−Ａ ｓｐ　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ、またはＤＹＫＤＤＤＤＫ　、 をＮ−末端同定ペプチドとして用いることを含む、この配列は免疫原性を持ち、 かつエンテロキナーゼ認識サイトを含んでいる。Ｎ−末端ＤＹＫＤＤＤＤＫ“フ ラッグ（ｆｌａε）”と共に発現する融合蛋白質は、フラッグ決定基を特異的に 認識する固定化モノクローナル抗体を使用することによって精製しうる。所望す るならば、フラッグ配列はエンテロキナーゼを用いることによって融合蛋白質の 残留部から除去しうる；この切断段階は、結合フラッグリガンドの固定化抗体か らの分離前または後に着手しうる。

慣用の組換えＤＮＡ技術はＮ−末端またはＣ−末端同定ペプチド、例えばＮ−末 端ＤＹＫＤＤＤＤＫフラッグ、およびこれに結合させた単離しようとするポリペ プチド配列を持つ融合蛋白質をコードするＤＮＡベクターを構築するために用い られる。

形質転換した微生物を培養して融合蛋白質を発現させた役、この融合蛋白質は粗 抽出物または培養上澄液から特異的な抗フラッグ抗体を用いた単一のアフィニテ ィ一段階によって分離することができる。ＤＹＫＤＤＤＤＫフラッグは親木性残 基および芳香族残基の両方が存在することにより卓越した同定性能および精製能 を提供する。このような組み合わせはフラッグ構築物に高い免疫原性を与え、か つフラッグ決定基を非常に大きい蛋白質分子と結合させた場合でさえも、フラッ グ決定基が生理条件下で水性媒質内の抗体と通常どおり容易に接触することを可 能にする。ＤＹＫＤＤＤＤｋフラッグ方法に関するさらなる情報は米国特許第４ ．７０３，００４号に提供されており、その内容は参照によって本明細書の一部 を形成する。

本発明を特徴付ける改良は、結合が二価の金属陽イオンの存在に依存する抗体− 抗原システムである。特に好適な実施態様においては、ハイブリドーマ細胞系（ ４Ｅ１１と命名した）が生産するＤＹＫＤＤＤＤＫフラッグペプチドに特異的な カルシウム依存性の抗−フラッグモノクローナル抗体を使用する。この細胞系は アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル（Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ）　、メリーランド、米国（受託番号ＨＢ−９２５９）に寄託 されている。カルシウム依存性抗体は以前にも報告されているが、［例えばマウ レル（Ｍａｕｒｅｒ）ら。

ジャーナル　ブ　イミュノロジ−（Ｊ、Ｉ＋＋ｕ＋＋ｕｎｏ１．　）、１０５゜ ５６７（１９７０）およびマウレル（Ｍａｕｒｅｒ）ら、Ｌムム丘−を久”ｘ＞ 　４％Ｏ’；　二（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　）、７０．４９（１９ ８０）を参照されたいコ、免疫親和性試薬としてそのような抗体を用いることに ついては開示されていない。

陽イオンに依存する親和性媒体は、適切な陽イオン存在下でのみしっかりとリガ ンドと結合し、固定化抗体とリガンドとの複合体と接触する二価の金属陽イオン の濃度を選択的に減少させることによってリガンドからの遊離を誘発させること ができる。このことは親和性媒質を特定の陽イオンを除去した溶液で単に洗滌す ることによって、またはより好適にはＥＤＴＡ塩（エチレン　ジアミン　テトラ 酸Ｉ６）あるいはＥＧＴＡ［エチレングリコール−ビス（β−アミノエチル　エ ーテル）Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラ酢酸］のようなキレート剤で溶出すること によって成し遂げられ得る。このような方法を用いれば、高塩濃度、低ｐＨ１ま たはカオトロピック試薬を用いた、非可逆的変性を起こす可能性のあるアフィニ ティー溶出方法を使用せずに済む、陽イオンを除去または減少させることによる 溶出はフラッグ−抗体複合体に高い特異性を持つため、回収された蛋白質は抗体 結合部位以外の部位でアフィニティーカラムに結合した外来性蛋白質の混入がよ り少ないであろう。

陽イオン依存性抗体を固定化するために用いる媒体はアガロース、セファロース 、アクリルアミド、セルロース材料、または当業者に既知のこれら以外の適切な マトリックスである。好適には、抗体は例えば遊離アミノ基とＮ−ヒドロキシス クシンイミドエステルとの反応を含む方法を用いてセファロース（Ｓ　ｅｐｈａ ｒｏｓｅ）　［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ウプサラ（Ｕ　ｐｐｓａ ｌａ）　。

スウェーデンコまたはアフィーゲル１０（Ａｆｆｉ　Ｇｅｌ　１０）［バイオラ ッド　ラボラトリ−（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。

リッチモラド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）　、カリフォルニア、米国］にカップリング することによって、媒体に共有結合させる。この方法のためのキット（Ｋｉｔ） は市販されている；慣用法はウィルチェック（Ｗｉｌｅｈｅｋ）ら、Ｒ４Ｓ７． ｈ課Ｊ：二ｘＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　）、１　０　。

２８２８（１９７１）に開示されている。ここに開示した方法に関連して用いら れる免疫親和性による精製方法は、バッチ法またはカラムクロマトグラフィー法 で行なうことができる。さらに発現した融合蛋白質についての数多くのイムノア ッセイが、二価の陽イオン依存性抗体のフラッグ決定基に対する特異性を基本と して考案されうる。

単離されるモノクローナル抗体の個々の特徴により、いろいろな二価の陽イオン が抗体と抗原を効率的に結合させるために適切であろう、そのような陽イオンに はＣａ″″、Ｍｇ″″、　Ｍ　ｎ″″。

Ｃｕ″”、Ｎｉ″”、Ｚｎ”、Ｃｄ″”、Ｂａ″″またはＳｒ″′が含まれる。

前記陽イオンのうち、Ｃａ″″がより一般的に陽イオン依存性結合感度に関係す ることが見い出され、それ故Ｃａ″″が好適である。

一般的に、有効な結合を確立するための陽イオン濃度は少なくともＯ−３〜１＋ ｓＭであるべきである。溶出液として少なくとも０．５ＪのＥＤＴＡ溶液、また は実際の陽イオン濃度以上の濃度のＥＤＴＡ溶液を用いると、陽イオン濃度は実 質上蛋白質の遊離を可能にするレベルにまで低下する。

ベブ　ド　７、のム 合成した同定ペプチドはペプチド免疫原を調製するために脂肪酸−誘導アミノ酸 に結合させる。このペプチド免疫原は抗ペプチド抗体を上昇させるためにマウス に投与する。脂肪酸−誘導アミノ酸をペプチドのＣ−末端領域に添加し、その結 果得られたペプチドが水性媒質中でミセルを形成するようにする。線状の疎水性 脂肪酸銀はミセル核を形成し、これに対してより親水性のリガンド蛋白質のＮ− 末端部分はミセル周囲の抗体側に存在する。

親水性残基を誘導アミノ酸残基から隔離するためのスペーサーとして１個以上の アミノ酸が使用され得る。好適にはＧ　ｌｙ。

ＰｒｏまたはＳｅｒからなる群より選択された１〜６個の中性アミノ酸がこの目 的のために用いられる。脂肪酸との誘導体を形成するアミノ酸はリジンおよびオ ルニチンからなる群より選択されることが望ましく、その数は１〜３個であるこ とができる。

パルミチン酸、オレイン酸およびステアリン酸が有用な脂肪酸であり；パルミチ ン酸が好適である。ペプチド抗原は任意の適切な方法、例えば自動ペプチド合成 装置と関連して広く用いられているメリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ＞ の固相法、によって合成され得る。１つの適切な方法が米国特許第４，７０３゜ ００４号に詳細に記載されている。

これとは別に、固定用ペプチドをキャリアーポリペプチドまたは蛋白質に結合さ せてフラッグ免疫原を提供することもできる。適切なキャリアー蛋白質にはグロ ブリン画分、いろいろな種の血清アルブミン、ヘモシアニン、オボアルブミン、 ラクトアルブミン、チログロブリン、フィブリノーゲン、または合成ポリペプチ ド、例えばポリ（Ｌ−リジン）が含まれる。キャリアー蛋白質に結合するハプテ ンの数は結合条件によって２〜５０と変化しうる。好適には、提供されたキャリ アーは平均で少なくとも５個のペプチドハブテンと共有結合される。一般的に、 より高い抗体力価はより高いエピトープ密度を持つ結合体を用いることによって 得られる。ハブテンとキャリアーを結合させるた１５１（１９８０）：レイクリ ン（Ｒｅｉｃｈｌｉｎ）、メソッド　イン１７　４　％ＯＥ／’　二（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　５ｏｌｏ　）、７０　、１５９（１９８０）；キタガワ （Ｋ　ｉｔａｇａｗａ）ら、ジ　−ナル　ブ　バイｆｓ入ｂ’　（Ｊ、　Ｂｉｏ ｃｈｅａ＋、　）、旦、１１６５（１９８３）；およびレルネル（Ｌ　ｅｒｎｅ ｒ）　、５（Ｎ　ａｔｕｒｅ）　、　２９９５９２（１９８２）によって挙げら れたいろいろな参考文献に開示されている。

モノクローナル　の；制 誘導体または複合体とされたペプチド免疫原は、例えば米国特許第４，４１１． ９’９３号に開示した技術のような慣用的技術を用いてペプチドハブテンに対す るモノクローナル抗体を生産するために使用される。この方法では、免疫原を完 全フロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）で乳化し、 １０〜１００μＳの範囲の量をＢａ１ｂ／ｃマウスに皮下注射する。１０〜１２ 日後、さらに不完全フロインドアジュバントで乳化した免疫原を投与して免疫し た動物を追加免疫し、その後さらに１週間に１回〜２週間に１回免疫原を定期的 に投与することによって抗体を上昇させた。血清サンプルはドツト・プロットア ッセイ（ｄｏｔ−ｂｌｏｔ　ａｓｓａｙ）（抗体サンドイツチ法）またはＥＬＩ ＳＡ［エンザイム　リンクドイムノソルベント　アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−１ｉ ｎｋｅｄ　ｉｍ＋＊ｕｎｏｓｏｒｂｅｒ＋ｔ　ａｓｓａｙ）］によって試験する ために眼窩後方の出血または尾先端部の切除によって定期的に採取した。他のア ッセイ法もまた適切である。適切な抗体力価が検出された後、陽性動物には抗原 を含む生理食塩水を静脈注射する。３〜４日後、動物を層殺し、その牌ｂＡ：ｔ ＰＡ胞を採取し、マウスの骨髄腫細胞系ＮＳＩと融合させる。この方法によって 生じたハイブリドーマ細胞系は、未融合の細胞、骨髄腫ハイブリッドおよび脛臓 細胞ハイブリッドの増殖を諌止するＨＡＴ選択培地（ヒボキサンチン、アミノプ テリンおよびチミジン）と入れた多数のミクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔ ｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）で平板培養する。　このようにして発生したハイブリド ーマクローンはカルシウムまたは他の二価の金属陽イオンの存在下および不在下 での免疫原との反応性についてＥＬＩＳＡ試験を行なうことによって選択できる 。一般的に、金属陽イオン濃度は０．１〜１０ｍＭの範囲が適切である。ＥＬＩ ＳＡ法はエングバール（Ｅｎｇｖａｌｌ）ら、イムノケミスト’ＬＪ上−ｕｎｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒ　）　、　８　＋８７１（１９７１）および米国特許第４，７ ０３，００４号に開示されている。その後、陽性クローンを同系Ｂ　ａ　Ｉ　ｂ 　／　ｃマウスの腹腔内に注射して高濃度（＞　１　ｔａｇ／　ｍｉ’）の抗ペ プチドモノクローナル抗体を含む腹水を作り出す。得られたモノクローナル抗体 は、硫酸アンモニウム沈澱、次いでゲル排除クロマトグラフィー、および／また は抗体とスタフィロコックス　アウレウス（Ｓ　ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　 ａｕｒｅｕｓ）のプロティンＡとの結合あるいは固定化同定ペプチドとの結合を 基本としたアフィニティー　りロマトグラフィーによって精製されうる。

以下の実施例は本発明の各々の態様を例示するものである。

１：４Ｅ１１　の；制 ４Ｅ１１と命名したマウスのハイブリドーマクローンは、ヒトのインターロイキ ン２（ＩＬ−２）のＮ−末端に融きさせたＤＹＫＤＤＤＤＫフラッグと特異的に 結合する能力を持つモノクローナル抗体を選択することによって単離された。４ Ｅ１１ハイブリドーマを同系マウスに注射することによって作り出された抗体を 含有する腹水は、硫酸アンモニウム沈澱、アフィニティークロマトグラフィーお よび限外ｒ通を含む標準的方法によって精製し濃縮した。約２．６＋ｎｙ／ｍｌ の４Ｅ１１モノクローナル抗体を含む精製し濃縮された蛋白質溶液１０＋＊Ｎを ４１の０　、　Ｉ　ＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７，５，４℃で透析した。約４８時 間の間に透析用緩衝液を３回交換し、その後透析チューブの内容物（約７．５ｍ ＋１）を５０社のポリプロピレンチューブに移し、４℃に保った。アフィゲル− １０（Ａｆｆｉ−ｔｅｌ　−１０）［ω−アミンへキシルアガロース；バイオラ ド（Ｂｉｏｒａｄ）、リッチモラド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）　。

カリフォルニア、米国］を焼結したガラス漏斗に移し、過剰量のインプロパツー ル、次いで脱イオン水で洗滌した。製造業者の教えに従って、およそ１０ｍ１の 洗滌ゲルを抗体溶液を入れたチューブに加え、さらに−晩回転器（ｒｏｔａｔｏ ｒ）上で４℃で反応させた。翌日、親和性媒体の未反応部位をブロックするため 、１００μｌの１ＭグリシンエチルエステルｐＨ８を媒体に加え、さらに１．５ 時間４℃で暖やかに撹拌した。

その結果得られた抗体結合ゲルはおよそ３．２１抗体／ｍｌゲルを含み、これを リン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　；０．９Ｍ−ＮａＣ１！、０．ＩＮ−ＫＨＰＯ ＝、ｐＨ７，０）、次イテＰ　Ｂ　Ｓ　１０．０２＄アジ化ナトリウムテ洗滌し 、その後４℃で保存した。

２：フラッグーＢＰＡ８ム　の　１ 酵母発現プラスミドｐＢＣ６５を構築した。このプラスミドは大ＪＩＬｉ（旦、 　ｃｏｌｉ）で選択しかつ複製するためのｐＢＲ３２２のＤＮＡ配列（Ａｐ　ｒ 遺伝子および複製開始点）ならびに選択可能マーカーおよび酵母の２μ複製開始 点としてのＴＲＰＩ遺伝子を含む酵母のＤＮＡ配列からなる。ｐＢＣ６５はまた 、グルコース抑制性のアルコールデヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）プロモーター 、および酵母宿主からの異種蛋白質の分泌を可能にするためのα−因子リーダー 配列をも含む、フレームが合うようにα−因子配列とフラッグ融合蛋白質をコー ドする挿入ＤＮＡ配列とを融合させた；この配列はＤＹＫＤＤＤＤＫ配列、およ びこれに連結した推定しトＢＰＦ（バースト促進因子）（ｂｕｒｓｔｐｒｏｍｏ ｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ）蛋白質をコードするｃＤＮＡからなる。！乞エ　セレ ビシアエ（Ｓ　、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　７９株およびＸＶ２１８１株（Ｔ ｒｐ−）をヒンメン（Ｈ１ｎｎｅｎ）らの方法、プロシーディゲス　オン　ザ　 ナショナル　アカデミ−オンサイエンス　オン　ザ　ユテイテッド　ステイン　 オン　アメリカ（Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　 Ａ、　）７５゜１９２９（１９７８）、に従ってｐＢＣ６５で形質転換し、Ｔｒ ｐ”形質転換体を選択した。各々の酵母株の形質転換体を発現させるために８０ μｇ／ｌｎｌアデニンおよび８０μｇ／ｍｌウラシルを追加した１％酵母エキス 、２％ペプトンおよび１％グルコースを含む濃厚培地でクローン化し増殖させた 。ＡＤＨ２ブロモータ−の抑制解除および融合蛋白質の発現は培地のグルコース が消耗され尽くすと誘導された。酵母の順化培地上澄液の粗製物を発酵混合物か ら一過により収集し、使用する迄４℃に保った。

４Ｅ１１抗体を結合させたアフィニティーゲルスラリー５ｍＮを上記実施例１の ように調製し、ポリプロピレンカラムに加えてベッド容量を約１．５ｍｌとした 。次いでカラムに１５ｍＩＰＢＳ。

次いで１５ｍｆの０．１トゲリシン塩酸ｐＨ３，ＯＪ後に２５ｍ１のＰＢＳを流 した。

７０ｖａｌの７９：ｐＢＣ６５酵８．順化培地上澄液に７１の１０倍濃度ＰＢＳ を加えて処理し、抽出液のｐＨを７．１２に上昇させた。

そうして得られた緩衝化酵母上澄液を１０ｍｍ！アリコートずつ２度、４Ｅ１１ 免疫親和性カラムに負荷した。試料を負荷した後、カラムを９ｍＩＰＢＳで洗滌 し、４℃に一装置いた。カラムに１醜！の０．１トゲリシン塩酸を５回加えて溶 出し、その間１ｗ＋１ずつ分画収集した。溶出後、カラムは過剰のＰＢＳで洗滌 し、Ｐ　Ｂ　Ｓ／　０．０２％アジアジ化ナトリウム中で保存した。

洗滌および溶出画分のサンプルは５ＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンイミノプロット （Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｓ）の組合せによって行ない、ゲルお よび４Ｅ１１抗体を銀染色することによって分析した。ウェスタントランスファ ー（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）によると、洗滌画分に約２８．０００ ダルトンの見がけの分子量をもつ４Ｅ１１反応性物質の存在が示唆され、このこ とは結合が起らなかったことを示している。

次に、第二回目の試行用の４Ｅ１１免疫親和性カラムを調製し、酵母の上澄液の 一方に対して用いる洗滌用緩衝液に０．５ｍＭＭ　ｇ　ＣＲ２および１．０ｆｉ ＭＣａＣ１２を含ませた。この第２回目の実験では、およそ１１２＋ｅｔ’の７ ９：ｐＢＣ６５酵母上澄液（ｐＨ７，０４）を１０ＩＩＩＺずつ２度カラムに負 荷した。カラムは０．５ｍＭ　Ｍｒ、Ｃ１／１、Ｏｎ＋Ｍ　ＣａＣｌｘ含有ＰＢ Ｓで洗滌し、次いで前述のように０．１Ｍグリシン−塩酸で溶出した。集めた両 分のＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　、／ウニスフン分析は、４Ｅ１１反応性物 質がグリジン−塩酸で溶出するまでカラムに結合していたことを示唆した。酵母 蛋白質の大部分はカラムから洗滌画分に除去されていた。

大」１何づトＥｌう、ングーＧＭ−Ｃ３Ｆ融合蛋白　の精側ＤＹＫＤＤＤＤＫ配 列をコードするＤＮＡ、およびこれに融合させた成熟型ヒト顆粒球−マクロファ ージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）をコードするＤＮＡを含む酵母発現ベク ターを次のようにして構築した。

野生型ヒトＧ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆ遺伝子のコード領域の大部分および３′フランキ ング領域の一部を含む４１７塩基対のＡｈａ［−ＮｃｏＩフラグメントをプラス ミドｐＹαｆＨｕＧＭより切り出し、成熟蛋白質のＮ−末端２４アミノ酸に相当 する配列が欠如したフラグメントを提供した。遺伝子の欠如部分は、次に示す修 正５′−ヌクレオチド配列を提供するオリゴヌクレオチドを用いて再構築された ；この修正５゛ヌクレオチド配列は成熟ＧＭ−ＣＳＦ蛋白質の最初の２２個のア ミノ酸と一致するアミノ酸配列をコードするが、５′尺匹工末端制限サイト、ア ミノ酸コドン４番目にｋｎサイト、アミノ酸コドン１２番目に第２のよびＨｉｎ ｄｌＩ［サイト、ならびに２３番目のアミノ酸にロイシン残基を提供するための コドンの置換を含む、このリンカ−配列を下に示す： Ａｌａ　ＰｒｏΔＩａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

むユＩ　Ｂｄｌ　１ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　 ＶａｌΔｓｎ　Ａｌａ　１ｉｅＴＣＴ　ＣＣＡ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　Ｃ＾＾ＣＣＡ 　ＴＣＧ　に＾＾ＣＡＣにＴＴ＾ΔＣにＣＴ　ＡＴＴ＾ＧＡ　ＧＧＴ　ＡＧＡ　 ＴＣ：Ａ　（：ＴＴ　（：（：Ｔ　ＡＣＣＣＴＴ　ＣＴＣＣ＾＾　ＴＴＧ　Ｃに Ａ　Ｔへ＾町且Ｉ　如土■ にＩＬＩ　Ｇｌｕ＾Ｉａ　Ｌｅｕ こうして得られた構築物をＫｐ＋すおよびＮｃｏＩで切断したプラスミドｐＢＣ １１（ｐＢＲ３２２の誘導体）にクローン化してプラスミドｐＢＣ２５を作り出 した。このプラスミドは、ｐｙαｆＨｕＧＭのα−因子プロモーターのかわりに グルコース抑制性アルコールデヒドロゲナーゼ２＜ＡＤＨ２）プロモーターを用 いることを除いてはｐｙαｆＨｕＧＭとはゾ同様の文Ｌｆ主ミケス　セレビシτ Ｉ（Ｓ、　ｅｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発現ベクターである。

次いでｐＢＣ２５はＫｐｎｌおよびＢｇ］［で切断して、次に示すオリゴヌクレ オチドに連結した二二のオリゴヌクレオチドは、酵母のα−因子リーダー配列の ３′フラグメントをコードするＤＮＡ配列、ならびにこれとアレーン・が合うよ うに融合させたｌｊ立ｏ＝２ｘ　セレビシアエ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）　Ｋ　Ｅ　Ｘ　２プロテア一ゼ認識部位、フラッグ同定用ペプチド、および成 熟型ヒ）ＧＭ−ＣＳＦの最初の３〜５個のアミノ酸を提供する。

１−　フラッグ決定基　→　Ｉ Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　 Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ５’−ＣＴ　ＴＴＧ　ＣＡＴ　八＾＾　＾にＡ　ＧＡＣ ＴＡＣ＾＾に　にＡＣにＡＣＧＡＴ　にＡＣへへＧ＝３’　−ＣＡＴ　Ｇに＾＾ ＾ＣＣＴＡ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＡＴＧ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴに　ＣＴＡ　 ＣＴＧ　ＴＴＣ−１リーＩ　↑−ＫＥＸ２　エンテロキナーゼ−↑切断サイト　 切断サイト Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ ＣＣＴ　ＣＣＡ　ＧＣＴΔ−３゜ ＣＧＡ　ににＴ　ＣにＡ　ＴＣＴ　ＡＧ−５’ｈ±ＩＮ このベクターを用いて、成熟ヒトＧ　Ｍ−ＣＳ　ＦのＮ末端のアラニンに連結し たフラッグ決定基を含む融合蛋白質を酵母宿主で発現させ分泌させた。α因子分 泌機構はＬｙｓ−ＡｒｇＫ　Ｅ　Ｘ　２認識サイトに続く翻訳ポリペプチドを切 断する。このベクターを用いて酵１ＸＶ２１８１株を標準的な方法で形質転換し 、０．６７２酵母窒素塩基、０．５Ｘカザミノ酸、２％グルコース、１０μ２／ ｍ！アデニンおよび２０ｔｔｇ／ｍｌウラシルからなる選択培地で培養してＴｒ ｐ”形質転換体を選択した。

形質転換した酵母は濃厚培地（１％酵母エキス、２％ペプトン。

および１％グルコースに８０μｇ／Ｉａ１．アデニンおよび８０μｇ／ｍ１ウラ シルを補足）、３０℃で増殖させた。酵母を遠心分離によって除去した後、得ら れた順化培地を０．４５μ酢酸セルロースフィルターで沢過することによってア ッセイ用に調製した。

上記実施例１の方法に従って調製した４Ｅ１１抗体免疫親和性ゲルスラリー５ｍ Ｎをポリプロピレンカラムに移し、ベッド容量を約１．５ｍｌとした。カラムは １５＋＋ｉ’　ＰＢＳ、次いで１５ＩＩｌｒノ０６１Ｍグリシン塩酸ｐＨ３、そ の後さらなる３０ｍ１ＰＢＳで洗滌した。

１１ｍ１の１０倍濃度ＰＢＳを１００ｍ１の酵母抽出液に加え、ｐＨを約６．９ に上昇させた。こうして得られた希釈酵母抽出液３０ｍ１を免疫親和性カラムに 負荷し、その後１社アリコートのＰＢＳ／１ｍＭ　ＣａＣＬで５回、それぞれの アリコートの間は５分間隔で洗滌した。負荷のたびごとに両分を収集した。その 後、カラムは１．５ｏ＋ＩＰ　Ｂ　Ｓ　、次いで１時間毎にそれぞれ１に＋１ア リコートのＰＢＳをさらに４回加えて溶出した。その後１０…ＭＥＤＴＡ含有の ＰＢＳｌ、５ｍｆを加え、次いで１時間間隔でｌ＠ＩｌアリコートのＰＢＳ／１ ０ｍＭ　ＥＤＴＡをさらに４回加えた。

最後に、４ｍｌグリシン−ＨＣ４’、ｐＨ３を加え、一つの両分として収集し、 この両分は５０μｌのＩ　Ｍ　）リス−ＨＣｆ　ｐＨ７，０を加えて中和した０ 次いで、すべての両分を５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、次いで銀染色した。その結果 は、酵母上澄液に存在する蛋白質および他の混在物質の大部分がＰ　Ｂ　Ｓ／１ ．ＯＩｌ＋Ｍ　ＣａＣ１ｚによる最初の洗滌でカラムから溶出されるのに対して 、フラッグ−〇Ｍ−Ｃ８Ｆ融合蛋白質は結合状態のま１であることを示唆した。

ｔｌ！合蛋白質はＣａ″″イオン無添加のＰＢＳによる最初の洗滌で比較的鋭い ピークとして溶出した。ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液を加えると適正な分子量をもつ物 質がさらに少量カラムから溶出されることが認められた。

前述の実験を上記方法とはゾ同じようにくり返したが、但し、融合蛋白質はＰ　 Ｂ　Ｓ／　１　ｍＭ　ＣａＣｌ１２による洗滌？＆ＰＢＳ／１０ｍＭ　ＥＤＴＡ 溶液を用いてカラムから溶出した。この実験では、検出可能な４Ｅ１１−反応性 物質のすべてが、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶出液の使用により鋭いピークとしてカラム から溶出され、他の蛋白質混在物質から分離された。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．多数の陰イオンアミノ酸残基からなる末端ペプチド同定用配列を持つ組換え 融合蛋白質を精製するための方法であり；該配列に特異的な二価陽イオン依存性 モノクローナル抗体と蛋白質との複合体を形成させること、該複合体を単離する こと、ならびに該複合体と接触する二価陽イオンの濃度を選択的に減少させるこ とによって抗体および蛋白質を解離させること；からなる上記の精製方法。
2. ２．二価陽イオンがＣａ■，Ｍｇ■，Ｍｎ■，Ｃｕ■，Ｎｉ■，Ｚｎ■，Ｃｄ■ ，Ｂａ■およびＳｒ■からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
3. ３．キレート剤を用いて陽イオンを減少させることによって抗体および蛋白質を 解離させる、請求項１記載の方法。
4. ４．キレート剤がＥＤＴＡである、請求項３記載の方法。
5. ５．二価陽イオンがＣａ■である、請求項２記載の方法。
6. ６．同定用配列がＮ−末端ＤＹＫＤＤＤＤＫである、請求項５記載の方法。
7. ７．モノクローナル抗体がネズミのハイブリドーマ４Ｅ１１（ＡＴＣＣ　ＨＢ９ ２５９）により分泌される抗体である、請求項６記載の方法。
8. ８．原核生物または真核生物の発現ベクターに挿入した構造遺伝子によってコー ドされるポリペプチドを生産する方法であり；構造遺伝子に隣接した位置に多数 の陰イオンアミノ酸の残基からなる末端同定用ペプチドをコードするＤＮＡ配列 を挿入すること、構造遺伝子をポリペプチドと共有結合した同定用ペプチドから なる融合蛋白質として発現させること、および該融合蛋白質を同定用ペプチドに 特異的な陽イオン依存性モノクローナル抗体を使用して混在物質から分離するこ と；からなる上記ペプチド生産方法。
9. ９．マウスのハイブリドーマ４Ｅ１１（ＡＴＣＣ　ＨＢ９２５９）。
10. １０．マウスのハイブリドーマ４Ｅ１１（ＡＴＣＣ　ＨＢ９２５９）によって分 泌されるモノクローナル抗体。