JPH02222684A - 植物性リボソーム不活化タンパク質をコードするヌクレオチド配列 - Google Patents
植物性リボソーム不活化タンパク質をコードするヌクレオチド配列Info
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- JPH02222684A JPH02222684A JP1039172A JP3917289A JPH02222684A JP H02222684 A JPH02222684 A JP H02222684A JP 1039172 A JP1039172 A JP 1039172A JP 3917289 A JP3917289 A JP 3917289A JP H02222684 A JPH02222684 A JP H02222684A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ｔ！物物性リポソーム不活化タンパ資質係わ
り、特に７ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓのリポソーム不活
化タンパク質に係わる。
り、特に７ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓのリポソーム不活
化タンパク質に係わる。
様々な植物からの抽出物が動物細胞のタンパク質合成を
阻害する。そのような抽出物は、はとんどの場合リポソ
ーム、不活化タンパク質（ＲＩＰ）である、 ＲＩＰは
二つの異なるグループに分類することができる。第２種
のＲＩＰはりシン、アブリン、モデシン及びビスクミン
のような、細胞結合性の８鎖と結合した活性の＾鎖から
成る毒素である。第１種ｏｒｆｉｃｉｎａｌｉｓその他
の植物から抽出された。それらのＲＩＰは、タンパク質
合成を阻害する生物活性は有するが第２種ＲＩＰのよう
な細胞結合活性は有しない単一鎖タンパク質である。！
［［ｌ胞結合能を持たないので、第１種ＲＩＰは毒性で
ない、 １９８３年に５Ｌｉｒｐｅ ｅｔ ａｌ、が、
優秀な安定性を有する第１種ＲＩＰ、即ち５Ｏ−８につ
いて報告している。ＳＯ〜６は凍結乾燥可能であり、か
つ室温で長期間乾燥状態を保ち得る。そのうえ、３７℃
で一晩トリブシンあるいはキモトリプシンで処理しても
ＲＩＰ活性が低下しない、このことは、血流を介して循
環しなければならないタンパク質にとって重要な特性で
ある。
阻害する。そのような抽出物は、はとんどの場合リポソ
ーム、不活化タンパク質（ＲＩＰ）である、 ＲＩＰは
二つの異なるグループに分類することができる。第２種
のＲＩＰはりシン、アブリン、モデシン及びビスクミン
のような、細胞結合性の８鎖と結合した活性の＾鎖から
成る毒素である。第１種ｏｒｆｉｃｉｎａｌｉｓその他
の植物から抽出された。それらのＲＩＰは、タンパク質
合成を阻害する生物活性は有するが第２種ＲＩＰのよう
な細胞結合活性は有しない単一鎖タンパク質である。！
［［ｌ胞結合能を持たないので、第１種ＲＩＰは毒性で
ない、 １９８３年に５Ｌｉｒｐｅ ｅｔ ａｌ、が、
優秀な安定性を有する第１種ＲＩＰ、即ち５Ｏ−８につ
いて報告している。ＳＯ〜６は凍結乾燥可能であり、か
つ室温で長期間乾燥状態を保ち得る。そのうえ、３７℃
で一晩トリブシンあるいはキモトリプシンで処理しても
ＲＩＰ活性が低下しない、このことは、血流を介して循
環しなければならないタンパク質にとって重要な特性で
ある。
５Ｏ−６は分子量３０，０００のタンパク買である。５
Ｏ−６は、Ｎ末端配列において吠バｏｌａｃｃａ ａ＋
ａｅｒｉｅａｎａ由来のＲＩＰと４０％アミノ酸配列配
同であるが、免疫学的にはこのＲＩＰ並びに他の幾つか
のＲＩＰから区別される（Ｌａｐｐｉ ｅｔ ａｌ、、
１９８５）、構造的に高い関連性を有するのは、７
ｏｆ ｒ ｉｃ ｉｎａ Ｉ ｉｓの種子中に存在する
タンパク賞群の主要タンパク雪掻である。それらの種は
いずれも、５Ｏ−６に対する抗血清と交叉反応する（Ｌ
ａｐｐｉ ｅｔ ａｔ、、 １９８６）、 ＴＩ＋ｏｒ
ｐｅｅｔ ａｌ、（１９８５）は５Ｏ−６をイムノトキ
シンの製造に用い、製造したイムノトキシンをマウス＾
ＫＲ−＾リンパ腫充実性Ｍ瘍に対してｉｎ ｖｉｖｏで
試験して、培養＃ＪＩｍ及び生体の両方のＴｈｙ−１，
１表現ｍ胞に対する特異的細胞毒性を認めた。
Ｏ−６は、Ｎ末端配列において吠バｏｌａｃｃａ ａ＋
ａｅｒｉｅａｎａ由来のＲＩＰと４０％アミノ酸配列配
同であるが、免疫学的にはこのＲＩＰ並びに他の幾つか
のＲＩＰから区別される（Ｌａｐｐｉ ｅｔ ａｌ、、
１９８５）、構造的に高い関連性を有するのは、７
ｏｆ ｒ ｉｃ ｉｎａ Ｉ ｉｓの種子中に存在する
タンパク賞群の主要タンパク雪掻である。それらの種は
いずれも、５Ｏ−６に対する抗血清と交叉反応する（Ｌ
ａｐｐｉ ｅｔ ａｔ、、 １９８６）、 ＴＩ＋ｏｒ
ｐｅｅｔ ａｌ、（１９８５）は５Ｏ−６をイムノトキ
シンの製造に用い、製造したイムノトキシンをマウス＾
ＫＲ−＾リンパ腫充実性Ｍ瘍に対してｉｎ ｖｉｖｏで
試験して、培養＃ＪＩｍ及び生体の両方のＴｈｙ−１，
１表現ｍ胞に対する特異的細胞毒性を認めた。
５ｉｅｎａ ｅｔ ａｌ、（１９８７）は、ＣＤ２、Ｃ
Ｄ３及びＣＤ５ Ｔ細胞抗原をそれぞれ検出するモノク
ローナル抗体に５Ｏ−６を結合させて５種類のイムノト
キシンを合成した。これらのイムノトキシンはセルフリ
ーアッセイにおいて末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と結合し
、タンパク質合成を阻害した。温度３７℃で２時間経過
後、マイトジェンによって誘発されるタンパク質合成並
びに細胞増殖が用量次第で阻害され、一方の抗ＣＤ５抗
体を伴って行なうとブロックされたが抗ＣＤ５以外の未
結合抗体を伴って行なってもブロックされず、即ちこの
ことは、細胞毒性のブロックがＣＤＳ＋細胞との特異的
結合によってもたらされたことを示唆する。
Ｄ３及びＣＤ５ Ｔ細胞抗原をそれぞれ検出するモノク
ローナル抗体に５Ｏ−６を結合させて５種類のイムノト
キシンを合成した。これらのイムノトキシンはセルフリ
ーアッセイにおいて末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と結合し
、タンパク質合成を阻害した。温度３７℃で２時間経過
後、マイトジェンによって誘発されるタンパク質合成並
びに細胞増殖が用量次第で阻害され、一方の抗ＣＤ５抗
体を伴って行なうとブロックされたが抗ＣＤ５以外の未
結合抗体を伴って行なってもブロックされず、即ちこの
ことは、細胞毒性のブロックがＣＤＳ＋細胞との特異的
結合によってもたらされたことを示唆する。
毒素とリガントとの間に融合遺伝子を構成するのに、組
み換え体ＤＮＡ法が用いられている。そのような構成の
第一の例を提示したＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ。
み換え体ＤＮＡ法が用いられている。そのような構成の
第一の例を提示したＭｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ。
（１９８６）は、切り取られたジフテリア毒素フラグメ
ントをコードする遺伝子とメラニン細胞刺激ホルモン（
α−Ｈ５Ｈ）をコードする遺伝子とを融合した。
ントをコードする遺伝子とメラニン細胞刺激ホルモン（
α−Ｈ５Ｈ）をコードする遺伝子とを融合した。
この毒素−ホルモンキメラ遺伝子の発現によって、ジフ
テリア毒素のへ〇Ｐ−リボシルトランスフェラーゼ活性
を保持し、かつ該毒素の脂質関連ドメインを保有する融
合タンパク質が得られた。しかし、ジフテリア毒素のレ
セプター結合ドメインはＭＳＩＩ配列に置き換えられた
。このキメラ毒素は、培養中のＭＳＨレセプター陽性で
あるヒト黒色腫細胞にとっては毒性であるが、α−ＭＳ
Ｈレセプターを欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞や
アフリカミドリザル腎臓細胞にとっては毒性でないこと
が判明した。
テリア毒素のへ〇Ｐ−リボシルトランスフェラーゼ活性
を保持し、かつ該毒素の脂質関連ドメインを保有する融
合タンパク質が得られた。しかし、ジフテリア毒素のレ
セプター結合ドメインはＭＳＩＩ配列に置き換えられた
。このキメラ毒素は、培養中のＭＳＨレセプター陽性で
あるヒト黒色腫細胞にとっては毒性であるが、α−ＭＳ
Ｈレセプターを欠くチャイニーズハムスター卵巣細胞や
アフリカミドリザル腎臓細胞にとっては毒性でないこと
が判明した。
最近、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ、（１９８７）が
、インターロイキン２（１１２）をコードする遺伝子を
ジフテリア毒素断片遺伝子と融合させても生物活性なキ
メラＩＬ２毒素が発現されることを示して、上述のよう
な以前からの観測を拡大した。上記融合タンパク質は、
このハイブリッドのリガントコンポーネントのための特
異的表面レセプターを有する活性化されたＴ細胞あるい
は悪性のＴ細胞を選択的に標的とすることが判明し、該
融合タンパク質はＩＬ２レセプターとのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ結合に続くレセプター媒介エンドサイト−シスによっ
て細胞内に取り込まれた。
、インターロイキン２（１１２）をコードする遺伝子を
ジフテリア毒素断片遺伝子と融合させても生物活性なキ
メラＩＬ２毒素が発現されることを示して、上述のよう
な以前からの観測を拡大した。上記融合タンパク質は、
このハイブリッドのリガントコンポーネントのための特
異的表面レセプターを有する活性化されたＴ細胞あるい
は悪性のＴ細胞を選択的に標的とすることが判明し、該
融合タンパク質はＩＬ２レセプターとのｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ結合に続くレセプター媒介エンドサイト−シスによっ
て細胞内に取り込まれた。
部位突然変異によって細胞認識ドメインを欠失させた、
クローン化したシュードモナス毒素（ＰＥ）を形質転換
成長因子α（ＴＧＦ−α）と融合させた。大腸菌から精
製したこのキメラタンパク質は上皮成長因子レセプター
を発現する細胞を殺したが、上記レセプターを数個しか
有しない細胞に対しては伍かな活性しか示さなかった（
Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ、。
クローン化したシュードモナス毒素（ＰＥ）を形質転換
成長因子α（ＴＧＦ−α）と融合させた。大腸菌から精
製したこのキメラタンパク質は上皮成長因子レセプター
を発現する細胞を殺したが、上記レセプターを数個しか
有しない細胞に対しては伍かな活性しか示さなかった（
Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ、。
１９８７） 。
本出願人はここに、シリ硫旦ａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎ
ａｌｉｓの第１種ＲＩＰ ５ｏ−６をコードする遺伝子
をクローン（ヒし、かつ発現させた。従って本発明は、
ＤＮＡ配列：ＧＴＣ＾ＣＡテＣＡＡＴＣＡＣＡ’ｒ？Ａ
ＧＡＴＣＴＡＧＴＡ＾Ａ
ＴＣ？Ｆｒ’ｒＧＴＯＧｋＴＡＡＡ
＾ ＴＣＣＡＡＡＣＣＴ
ＧＡＡＡ ＣＩＧＡ τ入ＡＣ？ｒＧＴＡ’ｌ’ＧＴＧＧ？ＣＧＣＧＴＡＴＣ
Ｔ？ＧＣ＾＾丁ＧＧへ〒２５０
コロ０ＡＡＣへＣＧＡＡへＧ’
！’ＴＡＡＴＣＧＧＧＣＡ’ｒＡ？ＴＡＣＴＴＣＡＧ＾
ＴＣＡＧ＾＾＾Ｔ’ＴＡＣ？ＴＣＣＧＣＣＧ八〇ＴＣ＾
八ＣＣＴＣＡＧＡ＾八ＧＣ〒’へＴＡＧ八＾’！’へＣ
ＡＣＡＧ入＾（：Ａ’！’？ＡτＣＡＧＴＣＧＡＴＩ’
Ｇ＾＾＾八ＧＡＡＴＧＣＣＣＡＧＡ’へ’入＾ＣＡＣＡ
ＡＧＧＡＧ＾Ｔ丁ＧＧＧＧＡＴＴＧＡＣＴＴ＾ＣＴＴＴ
ＣＡＡＣＧＴＣＣ＾τＧＧＡＡ
ＣＧＴＧＴＧＧＴ？５０〇 八ＡＡＧＡＣＧＡＡにＣＴＡＧ八Ｔ？ＣへＴＴＣ？ＴＡ
ＴＣＧＣＴ＾丁ＴＣ＾Ｇ八τＧ＾へＧＧＣＷＡＧＧＣＡ
ＧＣＧＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＡＣＡＴＡＣＡ＾ＡＡＣ？
ｒＧＧＴＡＡ０Ｇ τ＾ＴＡ ６５０
〕００人＾丁＾＾＾ＣＡＴ？ＡＴＧＡ
ＡＧフ５０ ＴＧＧＧＡＣＴＣＣＴ’ｒＡＴＧ’ｒＡＡ＾八Ｃ を提供する。
ａｌｉｓの第１種ＲＩＰ ５ｏ−６をコードする遺伝子
をクローン（ヒし、かつ発現させた。従って本発明は、
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この配列の前にシグナル配列が位置し得る。好ましくは
、シグナル配列は ＾ＴＧ＾＾ＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣ＾＾
ＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣ＾＾ＴＴＴＴＣ
ＡＧＣＴＴＩ：ＧＡＣ＾＾Ｃ＾＾ＣＴＧＡＴＧＣＧであ
る。
、シグナル配列は ＾ＴＧ＾＾ＧＡＴＡＴＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＣＡＣ＾＾
ＴＡＧＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＣＴＴＣ＾＾ＴＴＴＴＣ
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る。
配列の最後のコドン＾＾Ｃの後に、ＴＡＧのような終結
コドンを付加することができる。あるいは、細胞と結合
し得るリガント／ハプトマーと融合したＲＩＰを含む融
合タンパク質を得ることが所望である場合は、終結コド
ンを付加しないことも可能である。
コドンを付加することができる。あるいは、細胞と結合
し得るリガント／ハプトマーと融合したＲＩＰを含む融
合タンパク質を得ることが所望である場合は、終結コド
ンを付加しないことも可能である。
ＲＩＰ ５ｏ−６をコードするＤＮＡ配列は、（ｉ ）
７ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓからｍＲＨ＾を単離す
ること、 （ｉｉ） 上記ｍＲＮ＾からｃＤＮ＾を合成すること
、（ｉｉｉ） 得られたｃＤＮ＾をクローニングベク
ターに挿入してｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを得ること、（ｉ
ｖ） ＲＩＰ ５ｏ−６のアミノ酸配列の一部に対応
する１ｌｖａシたＤＮＡプローブでｃＤＮ＾ＤＮＡラリ
ーを探り、上記αＮ＾配列を含むクローンの位置を確認
すること、及び （Ｖ） 任意に、クローンから上記ＤＮＡ配列を含む
ＤＮＡ配列を単離すること を含む方法によって得ることができる。
７ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓからｍＲＨ＾を単離す
ること、 （ｉｉ） 上記ｍＲＮ＾からｃＤＮ＾を合成すること
、（ｉｉｉ） 得られたｃＤＮ＾をクローニングベク
ターに挿入してｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを得ること、（ｉ
ｖ） ＲＩＰ ５ｏ−６のアミノ酸配列の一部に対応
する１ｌｖａシたＤＮＡプローブでｃＤＮ＾ＤＮＡラリ
ーを探り、上記αＮ＾配列を含むクローンの位置を確認
すること、及び （Ｖ） 任意に、クローンから上記ＤＮＡ配列を含む
ＤＮＡ配列を単離すること を含む方法によって得ることができる。
ｍＲＮ＾は、好ましくは７ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの
葉あるいは種子から抽出する。 ｃＤＮ＾は標準的な手
続きに従って製造することができる０例えば、ｅＤＮ＾
の第一の鎖は逆転写酵素を用いて合成可能である。第二
の鎖は一般的には、まずＤＮＡポリメラーゼを、次にＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成する。
葉あるいは種子から抽出する。 ｃＤＮ＾は標準的な手
続きに従って製造することができる０例えば、ｅＤＮ＾
の第一の鎖は逆転写酵素を用いて合成可能である。第二
の鎖は一般的には、まずＤＮＡポリメラーゼを、次にＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて合成する。
ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーを得るべく、ｃＤＮ＾をクローニ
ングベクターに挿入する。クローニングベクターはプラ
スミドあるいはファージウィルスベクターであり得る。
ングベクターに挿入する。クローニングベクターはプラ
スミドあるいはファージウィルスベクターであり得る。
プラスミドの場合、クローニングベクターは天然のプラ
スミドか、あるいは好ましくは様々なプラスミドのフラ
グメントに由来する複合プラスミドであり得る。プラス
ミドは、ＲＩＰ遺伝子の発現を促進するプロモーター配
列を含み得る。ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーは、例えば大腸菌
のような適当な宿主内で増幅させることができる。
スミドか、あるいは好ましくは様々なプラスミドのフラ
グメントに由来する複合プラスミドであり得る。プラス
ミドは、ＲＩＰ遺伝子の発現を促進するプロモーター配
列を含み得る。ｃＤＮ＾ＤＮＡラリーは、例えば大腸菌
のような適当な宿主内で増幅させることができる。
ｃＤＨ＾ＤＮＡラリーを、求める対象の遺伝子に対応す
るＲＩＰのアミノ酸配列の一部に対応する１種以上の標
識したＤＮＡ配列をプローブとして探る。ＲＩＰのＤＮ
Ａ配列が未知である場合、ＤＮＡプローブ配列はＲＩＰ
のアミノ酸配列から推定することができる。
るＲＩＰのアミノ酸配列の一部に対応する１種以上の標
識したＤＮＡ配列をプローブとして探る。ＲＩＰのＤＮ
Ａ配列が未知である場合、ＤＮＡプローブ配列はＲＩＰ
のアミノ酸配列から推定することができる。
プローブ配列はＲＩＰのＣ末端部分あるいはＮ末端部分
に対応し得る。プローブ配列の長さは１２０ｂｐ以下で
あり得る。放射能標識を用いることが可能である。
に対応し得る。プローブ配列の長さは１２０ｂｐ以下で
あり得る。放射能標識を用いることが可能である。
こうして、ｃＤＮ＾ライブラリー中に１個以上存在する
、所望ＲＩＰをコードするＤＮＡ配列を含むクローンの
位置を確認することができる。上記ＤＮＡ配列、あるい
は該配列を含むより長いＤＮＡ配列は適当な制限エンド
ヌクレアーゼを用いて単離し得る。これにより、得られ
たＤＮＡ配列を所望のようにクローン化し、発現させる
ことが可能となる。
、所望ＲＩＰをコードするＤＮＡ配列を含むクローンの
位置を確認することができる。上記ＤＮＡ配列、あるい
は該配列を含むより長いＤＮＡ配列は適当な制限エンド
ヌクレアーゼを用いて単離し得る。これにより、得られ
たＤＮＡ配列を所望のようにクローン化し、発現させる
ことが可能となる。
ＲＩＰ ５ｏ−６を得るために、本発明によるＤＮＡ配
列を、形質転換した宿主内でＲＩＰ ５ｏ−６を発現さ
せ得る発現ベクターに組み込む０発現ベクター中に本発
明のＤＮＡ配列を、発現調節要素、特にブロモ−現する
べきＤＮＡ配列は、翻訳開始シグナルと翻訳停止シグナ
ルとの間に位置する。ベクターは普通プラスミドである
。
列を、形質転換した宿主内でＲＩＰ ５ｏ−６を発現さ
せ得る発現ベクターに組み込む０発現ベクター中に本発
明のＤＮＡ配列を、発現調節要素、特にブロモ−現する
べきＤＮＡ配列は、翻訳開始シグナルと翻訳停止シグナ
ルとの間に位置する。ベクターは普通プラスミドである
。
本発明によるＤＮＡ配列には、例えばイムノトキシンの
発現が所望である場合、細胞と結合し得るリガント／ハ
プトマーをコードする配列を更に含ント
であり得る。
発現が所望である場合、細胞と結合し得るリガント／ハ
プトマーをコードする配列を更に含ント
であり得る。
その場合、リガント／ハプトマーは抗Ｔａ胞抗体であり
得る。あるいは他の場合には、リガント／ハプトマーは
特定のレセプタ一部位に結合するホルモンタンパク質で
あり得る。また、本発明によって生成したＲＩＰにリガ
ント／ハプトマーを化学的に結合させてイムノトキシン
を得ること′も可能である。
得る。あるいは他の場合には、リガント／ハプトマーは
特定のレセプタ一部位に結合するホルモンタンパク質で
あり得る。また、本発明によって生成したＲＩＰにリガ
ント／ハプトマーを化学的に結合させてイムノトキシン
を得ること′も可能である。
本発明による発現ベクターで形質転換した宿主は、所望
のＲＩＰを得るべく、あるいは上記発現ベクターに組み
込まれたＤＮ＾配列がイムノトキシンのりガント部分を
コードする配列をも含む場合には所望のイムノトキシン
を得るべく培養することができる。宿主は適当なものを
用い得、例えば植物細胞、動物細胞あるいは微生物など
であり得る。
のＲＩＰを得るべく、あるいは上記発現ベクターに組み
込まれたＤＮ＾配列がイムノトキシンのりガント部分を
コードする配列をも含む場合には所望のイムノトキシン
を得るべく培養することができる。宿主は適当なものを
用い得、例えば植物細胞、動物細胞あるいは微生物など
であり得る。
大腸菌のような細菌宿主を用いることもできる。
発現されたＲＩＰあるいはイムノトキシンは、標準的な
方法で培養物から単離し得る。
方法で培養物から単離し得る。
上記のように発現されたイムノトキシン、あるいは細胞
と結合し得るリガントを発現されたＲＩＰに結合させて
得たイムノトキシンは、通常投与のために薬学的に許容
可能なキャリヤあるいは稀釈剤と配合する。イムノトキ
シンは注射によって投与可能である。その場合、イムノ
トキシンは注射用水あるいは生理食塩水のような発熱物
質を含有しない無菌液体と配合し得る。
と結合し得るリガントを発現されたＲＩＰに結合させて
得たイムノトキシンは、通常投与のために薬学的に許容
可能なキャリヤあるいは稀釈剤と配合する。イムノトキ
シンは注射によって投与可能である。その場合、イムノ
トキシンは注射用水あるいは生理食塩水のような発熱物
質を含有しない無菌液体と配合し得る。
本発明を、実施例によって以下に詳述する。
太ｌ自１
ＳＯ−６を、先に述べた５Ｌｉｒｐｅ ｅｔ ａｌ、（
１９８３）の方法に従って製造した。
１９８３）の方法に従って製造した。
ＣＮＢｒ マー メン
１０ｍｇの精製５Ｏ−６を７０％蟻酸３００シ！に溶解
させた。
させた。
約３０ａ＋ＨのＣＮＢｒを添加し、室温で１４〜１８時
間経過後反応混合物を脱イオン水で稀釈して３ｍｌとし
、凍結乾燥した。得られたペプチドを、 Ｓ ｅ ｐ
ｂ ａ ｄ ｅ ｘ Ｇ１００及び疎水性逆相ＨＰＬＣ
でのゲルー過によって精製した。
間経過後反応混合物を脱イオン水で稀釈して３ｍｌとし
、凍結乾燥した。得られたペプチドを、 Ｓ ｅ ｐ
ｂ ａ ｄ ｅ ｘ Ｇ１００及び疎水性逆相ＨＰＬＣ
でのゲルー過によって精製した。
アミノｐ び Ｉ
ＰＩＣＯ−ＴＡＧアナライザー（Ｗａｔｅｒｓ）でアミ
ノ酸分析を実施した。真空下に、フェノール１％含有の
絶えず沸騰するＨＣｌ中で温度１０５℃において２４時
間加水分解を生起させた。ガス相シークエネーター（＾
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、製）で
配列分析を行なった。第１図に、５Ｏ−６の５種類のＣ
ＮＢｒブラグフラグメントノ酸配列を示す、アミノ酸分
析において、ホモセリンの欠失によりＣ末端ＣＮＢｒフ
ラグメントのＣＨＢｒ３を同定した。
ノ酸分析を実施した。真空下に、フェノール１％含有の
絶えず沸騰するＨＣｌ中で温度１０５℃において２４時
間加水分解を生起させた。ガス相シークエネーター（＾
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、製）で
配列分析を行なった。第１図に、５Ｏ−６の５種類のＣ
ＮＢｒブラグフラグメントノ酸配列を示す、アミノ酸分
析において、ホモセリンの欠失によりＣ末端ＣＮＢｒフ
ラグメントのＣＨＢｒ３を同定した。
１０〜２０ｇの冷凍葉を、Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘを
最高速で５分間作動させて６０ｍ１の４．２Ｍグアニジ
ン−チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５
％サルコシル、０．７ｓＭメルカプトエタノール、ｏ、
ｏｉ％消泡剤（ｐＨ７）中で均質化した。得られた均質
スラリーを滅菌ガーゼで濾過し、温度４℃において１０
分間５．０００ｒｐ−で遠心分離した。上澄み液を５．
７Ｍ ＣｓＣ１、ｐ１１５．４の２５ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、０．１Ｍ ＥＤＴ＾の上に重ね、温度２０℃におい
て２０時間ＳＷ ４０ローターで３１ 、ＯＯＯｒｐ
ｍで遠心分離した。全ＲＮ＾ベレットを冷たい７０％エ
タノールで洗浄し、数ミリリットルの１０ｍＭ）リス）
ＩＣＩ、５鏑ＨＥＤＴＡ ｐ）１７中に再懸濁させて一
旦クロロホルムで抽出し、塩を調節して０．３Ｈ酢酸ナ
トリウムとし、２．５容量の冷エタノールで析出させた
。−８０℃で１時間から数時間経過後、ＲＮＡを５ｏｒ
ｖａｌｌ遠心分離機において１０．ＯＯＯｒｐｍで１時
間遠心分離した。ベレットを冷たい７０％エタノールで
洗浄し、結合ＷＬ街液中に再懸濁させた。
最高速で５分間作動させて６０ｍ１の４．２Ｍグアニジ
ン−チオシアネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、５
％サルコシル、０．７ｓＭメルカプトエタノール、ｏ、
ｏｉ％消泡剤（ｐＨ７）中で均質化した。得られた均質
スラリーを滅菌ガーゼで濾過し、温度４℃において１０
分間５．０００ｒｐ−で遠心分離した。上澄み液を５．
７Ｍ ＣｓＣ１、ｐ１１５．４の２５ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、０．１Ｍ ＥＤＴ＾の上に重ね、温度２０℃におい
て２０時間ＳＷ ４０ローターで３１ 、ＯＯＯｒｐ
ｍで遠心分離した。全ＲＮ＾ベレットを冷たい７０％エ
タノールで洗浄し、数ミリリットルの１０ｍＭ）リス）
ＩＣＩ、５鏑ＨＥＤＴＡ ｐ）１７中に再懸濁させて一
旦クロロホルムで抽出し、塩を調節して０．３Ｈ酢酸ナ
トリウムとし、２．５容量の冷エタノールで析出させた
。−８０℃で１時間から数時間経過後、ＲＮＡを５ｏｒ
ｖａｌｌ遠心分離機において１０．ＯＯＯｒｐｍで１時
間遠心分離した。ベレットを冷たい７０％エタノールで
洗浄し、結合ＷＬ街液中に再懸濁させた。
葉から回収した全ＲＮ＾の量は、葉１ｇにつき約１ａ＋
ｇであった。
ｇであった。
オリゴ（ｄＴ）−セルロースでのアフィニティークロマ
トグラフィーによってポリ（＾）＋ ＲＮＡを単離した
（＾ｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ、 １９７２）。
トグラフィーによってポリ（＾）＋ ＲＮＡを単離した
（＾ｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ、 １９７２）。
回収したポリ（＾）十ＲＮ＾の量は、全ＲＮ＾１ｍｇに
つき約２０．ｇであった。ホルムアルデヒドを含む１％
アガロースゲルにおいてポリ（八）÷ＲＮ＾の長さを確
認した。このＲＮＡの大きさは数ｋｂから数百塩基であ
った。
つき約２０．ｇであった。ホルムアルデヒドを含む１％
アガロースゲルにおいてポリ（八）÷ＲＮ＾の長さを確
認した。このＲＮＡの大きさは数ｋｂから数百塩基であ
った。
７−のｃＤＮ＾ のム
第一のｃＤＮＡ鎖の合成を、５０． Ｉの５０ｍＭ ）
リスＨＣ緩衝液ｐＨ８，５，４０ｍＭ ＫＣＩ、１０ｎ
＋）４ ＮｇＣＩｚ、０．４ｍＭＤＴＴ ； １ａ＋Ｍ
ｄＡＴＰ ； １ｍＭ ｄＧＴＰ ； １ｍＭ
ｄＴＴＰ ；０．５ｍＭｄＣＴＰ 、 ０１１−ｇ／
−１オリゴ（ｄＴ） ＋ ！〜＋ｓ 、 ２５０ヒト胎
盤リボヌクレアーゼ阻害剤；２０ｐＣｉ ［α−３”Ｐ
］ ｄＣＴＰ３．０ＯＯＣｉ／５ｖｏｌ、５ｐｇポリ（
＾）＋ ＲＮＡ並びに４０単位のＡＭＶ逆転写酵素中で
温度４２℃で４０分間実施した。
リスＨＣ緩衝液ｐＨ８，５，４０ｍＭ ＫＣＩ、１０ｎ
＋）４ ＮｇＣＩｚ、０．４ｍＭＤＴＴ ； １ａ＋Ｍ
ｄＡＴＰ ； １ｍＭ ｄＧＴＰ ； １ｍＭ
ｄＴＴＰ ；０．５ｍＭｄＣＴＰ 、 ０１１−ｇ／
−１オリゴ（ｄＴ） ＋ ！〜＋ｓ 、 ２５０ヒト胎
盤リボヌクレアーゼ阻害剤；２０ｐＣｉ ［α−３”Ｐ
］ ｄＣＴＰ３．０ＯＯＣｉ／５ｖｏｌ、５ｐｇポリ（
＾）＋ ＲＮＡ並びに４０単位のＡＭＶ逆転写酵素中で
温度４２℃で４０分間実施した。
−のｃＤＮ＾ の４
第一のｃＤＮＡ鎖の反応混合物に、９３．５．１の第二
鎖ｙＬ街液（１００ｍＭ ＩＩＥＰＥＳ ｐＨ６，９，
１００ｍＭ ＫＣＩ、１０ｍＭＭｇＣＩｚ） ； ２０
ｕＣｉ ［ａ −”Ｐ］ ｄＣＴＰ ３，０００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ ； ４Ｕ大腸菌リボヌクレアーゼＩｆ；１１
５０大腸菌ＤＮ＾ポリメラーゼ■を添加して、最終量を
２５０μｍとした。
鎖ｙＬ街液（１００ｍＭ ＩＩＥＰＥＳ ｐＨ６，９，
１００ｍＭ ＫＣＩ、１０ｍＭＭｇＣＩｚ） ； ２０
ｕＣｉ ［ａ −”Ｐ］ ｄＣＴＰ ３，０００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ ； ４Ｕ大腸菌リボヌクレアーゼＩｆ；１１
５０大腸菌ＤＮ＾ポリメラーゼ■を添加して、最終量を
２５０μｍとした。
反応混合物を１２℃に１時間、２２℃に１時間、更に７
０℃に１０分間保温した。混合物を氷上で冷却してから
１０ＵのＴ４ ＯＮ＾ポリメラーゼを添加し、その後１
０分間混合物を３７℃に保温した。
０℃に１０分間保温した。混合物を氷上で冷却してから
１０ＵのＴ４ ＯＮ＾ポリメラーゼを添加し、その後１
０分間混合物を３７℃に保温した。
ＥｃｏＲ’ン −の びにＥｃｏＲフェノール：ク
ロロホルム（１： １）抽出及びエタノール析出によっ
てｃＤＮ＾を精製した。Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼＩＵの存
在下に、６６ｍＭ トリスＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍ
ＭＭｇＣ１２，５鱈ジチオトレイトール並びに１ｍＭ＾
ＴＰ（連結反応緩衝液）を含有する反応物ｚｏｕｌ中の
二重鎖ｃＤＮ＾析出物にホスホリル化したＥｃｏＲＩリ
ンカ−ＩＩＩＩｇを添加した。混合物を一晩１２℃に保
温した。
ロロホルム（１： １）抽出及びエタノール析出によっ
てｃＤＮ＾を精製した。Ｔ４ ＤＮ＾リガーゼＩＵの存
在下に、６６ｍＭ トリスＨＣＩ ｐＨ７，５，５ｍ
ＭＭｇＣ１２，５鱈ジチオトレイトール並びに１ｍＭ＾
ＴＰ（連結反応緩衝液）を含有する反応物ｚｏｕｌ中の
二重鎖ｃＤＮ＾析出物にホスホリル化したＥｃｏＲＩリ
ンカ−ＩＩＩＩｇを添加した。混合物を一晩１２℃に保
温した。
Ｎａ１ｌ及びスペルミジンを添加して最終濃度をそれぞ
れ１００ｍＭ及び２．５ｍＭとし、また３０単位のＥｃ
ｏＲＩをも添加して最終量をＩＧＯｐｌとした後、混合
物を２時間３７℃に保温した。
れ１００ｍＭ及び２．５ｍＭとし、また３０単位のＥｃ
ｏＲＩをも添加して最終量をＩＧＯｐｌとした後、混合
物を２時間３７℃に保温した。
混合物を５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムの０．３Ｍ
Ｎａ１ｌ、１０ＩＩＩＨトリスＨＣＩ ｐｉ（８、ｌ
＋ＨＥＤＴＡに通して、組み込まれていないリンカ−か
らｃＤＮ八を精製した。８ｋｌ）から０．５ｋｂの大き
さのｃＤＮ＾フラクシジンをプールし、エタノール析出
させた。
Ｎａ１ｌ、１０ＩＩＩＨトリスＨＣＩ ｐｉ（８、ｌ
＋ＨＥＤＴＡに通して、組み込まれていないリンカ−か
らｃＤＮ八を精製した。８ｋｌ）から０．５ｋｂの大き
さのｃＤＮ＾フラクシジンをプールし、エタノール析出
させた。
ｃＤＮ＾のλ Ｌ １０ア一ムａｒｍｓ の 応
びにｉｎ ｖｉＬｒｏパッケージン 最終量５．１の連結反応緩衝液中で０．５．ｇのλｇｔ
１０アーム（ａｒｍｓ）をＴ４ ＤＮ＾リガーゼ２．５
単位によってｃＤＮ＾と連結させ、−晩１５℃に保温し
た。
びにｉｎ ｖｉＬｒｏパッケージン 最終量５．１の連結反応緩衝液中で０．５．ｇのλｇｔ
１０アーム（ａｒｍｓ）をＴ４ ＤＮ＾リガーゼ２．５
単位によってｃＤＮ＾と連結させ、−晩１５℃に保温し
た。
その後ＤＮＡをエタノール析出させ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
パッケージング混合物（＾ｍｅｒｓｈａｍ）でのｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングのため２．５９１の１０ｍＭ
）リスＨＣＩ ｐＨ７，５、ｂ＋Ｍ ＥＤＴＡ中に入
念に再懸濁させた。
パッケージング混合物（＾ｍｅｒｓｈａｍ）でのｉｎ
ｖｉｔｒｏパッケージングのため２．５９１の１０ｍＭ
）リスＨＣＩ ｐＨ７，５、ｂ＋Ｍ ＥＤＴＡ中に入
念に再懸濁させた。
得られたライブラリーを大腸菌８８５１４宿主を用いて
増幅させた。得られた独立クローンの数は、３６％の非
組み換え体相を背景に３．３Ｘ１０１ｏであった。
増幅させた。得られた独立クローンの数は、３６％の非
組み換え体相を背景に３．３Ｘ１０１ｏであった。
ａ）長さ１ｌｌｂｐのオリゴヌクレオチドの合成この長
いオリゴヌクレオチドは、５Ｏ−６ＲＩＰのＮＨ，末端
に位置するアミノ酸の最初の３７個に対応した。配列デ
ータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）から推定できる範囲で配
列決定した種子貯蔵タンパク質のコトン頻度に基づいて
コドン使用を選択した。＾ｐ−ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、の自動ＤＮＡ合成装置Ｎｏｄ３８
０Ｂを用いてこの長いオリゴヌクレオチドを合成し、逆
相）ＩＰＬＣによって精製し、かつ８糧の異なるオリゴ
ヌクレオチド（長さ１９〜２８塩基）と組み合わせて二
重鎮状にした。
いオリゴヌクレオチドは、５Ｏ−６ＲＩＰのＮＨ，末端
に位置するアミノ酸の最初の３７個に対応した。配列デ
ータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）から推定できる範囲で配
列決定した種子貯蔵タンパク質のコトン頻度に基づいて
コドン使用を選択した。＾ｐ−ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、の自動ＤＮＡ合成装置Ｎｏｄ３８
０Ｂを用いてこの長いオリゴヌクレオチドを合成し、逆
相）ＩＰＬＣによって精製し、かつ８糧の異なるオリゴ
ヌクレオチド（長さ１９〜２８塩基）と組み合わせて二
重鎮状にした。
オリゴヌクレオチド同士を連結反応させ、得られた二重
鎖オリゴヌクレオチドをＭ１３ｍｐ８のＳｅａ １部位
に挿入し、ヌクレオチド配列を確認するべく配列分析を
行なった。
鎖オリゴヌクレオチドをＭ１３ｍｐ８のＳｅａ １部位
に挿入し、ヌクレオチド配列を確認するべく配列分析を
行なった。
ｂ）短いオリゴヌクレオチドの合成
５Ｏ−６のＣ末端のＣＮＢｒフラグメントに対応する１
６種の短い（２１塩基）オリゴヌクレオチドの混合物を
、上記＾ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ
、製の合成装置を用いて合成した。
６種の短い（２１塩基）オリゴヌクレオチドの混合物を
、上記＾ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ
、製の合成装置を用いて合成した。
一号ゴ し ゛の、：
ａ ） １ｌｌｂｐの“長い”オリゴヌクレオチド上述
のようにｓｓ ＤＮΔファージＨ１３ｍｐ８に挿入した
このオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドに隣
接する８１３配列と相補的なブライマーヘアニーリング
した後、ＤＮＡポリメラーゼによって標識した。３０．
１の７ｍＭ ）リスＨＣＩ ｐＨ７，５，７ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｚ、５０ｄ ＮａＣ１，１０ｍ１’ｌ ＤＴＴ
、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８，ｏ（ＩＸＫｌｅ
ｎｏ＋緩衝液）中でＭ１３ａ＋ｐ８−１１１オリゴヌク
レオチド５μｇを温度６０℃で１時間約６１Ｈのブライ
マーとアニーリングさせ、５０ｉ１の［α−３２Ｐ］
ｄＣＴＰ ３，０００Ｃｉ／ｍｓ＋ｏｌ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、最終濃度５０．ＭのｄＡＴＰ、並びに５単位の
ＤＮＡポリメラーゼ（にｌｅｎｏｗフラグメント）を添
加して最終量４５μｍとした。
のようにｓｓ ＤＮΔファージＨ１３ｍｐ８に挿入した
このオリゴヌクレオチドを、該オリゴヌクレオチドに隣
接する８１３配列と相補的なブライマーヘアニーリング
した後、ＤＮＡポリメラーゼによって標識した。３０．
１の７ｍＭ ）リスＨＣＩ ｐＨ７，５，７ｍＭ Ｍｇ
Ｃ１ｚ、５０ｄ ＮａＣ１，１０ｍ１’ｌ ＤＴＴ
、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８，ｏ（ＩＸＫｌｅ
ｎｏ＋緩衝液）中でＭ１３ａ＋ｐ８−１１１オリゴヌク
レオチド５μｇを温度６０℃で１時間約６１Ｈのブライ
マーとアニーリングさせ、５０ｉ１の［α−３２Ｐ］
ｄＣＴＰ ３，０００Ｃｉ／ｍｓ＋ｏｌ、ｄＣＴＰ、ｄ
ＴＴＰ、最終濃度５０．ＭのｄＡＴＰ、並びに５単位の
ＤＮＡポリメラーゼ（にｌｅｎｏｗフラグメント）を添
加して最終量４５μｍとした。
１５分間室温に保温した後１ｕｌの１ｍＭ ｄＣＴＰを
添加し、この混合物を再び１５分間室温に保温した。
添加し、この混合物を再び１５分間室温に保温した。
前記ＤＮＡポリメラーゼを７０℃で１０分間失活させた
。 １．３！ｌの５８ ＮａＣｌ並びに各２０単位のＥ
ｃｏＲＩ及びＢａｗｌ Ｉの添加後、長さ１ｌｌｂｐの
オリゴヌクレオチドをファージベクターから切り出すべ
く混合物を３７℃に２時間保温した。その後、オリゴヌ
クレオチドを３．５％ＰＡＧＥにおいてベクターから分
離し、かつ−晩３７℃のＨ２Ｏ中に溶離した。比活性は
、ＤＮＡ１μｇ当たり約５ｘ １０”ＤＰｔ４であった
。
。 １．３！ｌの５８ ＮａＣｌ並びに各２０単位のＥ
ｃｏＲＩ及びＢａｗｌ Ｉの添加後、長さ１ｌｌｂｐの
オリゴヌクレオチドをファージベクターから切り出すべ
く混合物を３７℃に２時間保温した。その後、オリゴヌ
クレオチドを３．５％ＰＡＧＥにおいてベクターから分
離し、かつ−晩３７℃のＨ２Ｏ中に溶離した。比活性は
、ＤＮＡ１μｇ当たり約５ｘ １０”ＤＰｔ４であった
。
ｂ）“短い゛′混合オリゴヌクレオチド短い（２１ｂｐ
）オリゴヌクレオチドの混合物を、１９８６年にＤａｖ
ｉｅｓ ｅｔ ａｌ、が述べているようにＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼを用いて末端標識した５ａ ） ｃＤ
Ｎ＾ＤＮＡラリーの、長さ１１１ｂρのオリゴヌクレオ
チドでのスクリーニング 約２００．０００個のファージを、密集状態の大腸菌Ｎ
Ｍ５１４．ｍ胞上で平板培養した。３７℃で一晩成長さ
せた後、組み換え体ファージを二重ニトロセルロースフ
ィルターに移し、そのＤＮＡを変性させ、中和し、かつ
真空下に８０℃で２時間ベークした。
）オリゴヌクレオチドの混合物を、１９８６年にＤａｖ
ｉｅｓ ｅｔ ａｌ、が述べているようにＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼを用いて末端標識した５ａ ） ｃＤ
Ｎ＾ＤＮＡラリーの、長さ１１１ｂρのオリゴヌクレオ
チドでのスクリーニング 約２００．０００個のファージを、密集状態の大腸菌Ｎ
Ｍ５１４．ｍ胞上で平板培養した。３７℃で一晩成長さ
せた後、組み換え体ファージを二重ニトロセルロースフ
ィルターに移し、そのＤＮＡを変性させ、中和し、かつ
真空下に８０℃で２時間ベークした。
該フィルターを、まずｅｘｓｓｃ、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ ｓ、０．１％ＳＤＳ、１００μｓ／−１サケ精
子ＤＮＡ中、５０℃で２時間掛けてハイブリダイゼーシ
ョンした。
ｄｔ’ ｓ、０．１％ＳＤＳ、１００μｓ／−１サケ精
子ＤＮＡ中、５０℃で２時間掛けてハイブリダイゼーシ
ョンした。
これを更に、上記と同じ混合物に標識したプローブ（プ
ローブａ）ＩＸ １０＠ｃｐｓ＋／論１を添加したもの
の中で５０℃で一晩ハイプリダイゼーションした。該フ
ィルターを６０℃の０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中
で洗浄し、オートラジオグラフィーに掛けた。
ローブａ）ＩＸ １０＠ｃｐｓ＋／論１を添加したもの
の中で５０℃で一晩ハイプリダイゼーションした。該フ
ィルターを６０℃の０．ｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳ中
で洗浄し、オートラジオグラフィーに掛けた。
陽性ファージプラークを単離し、単独クローンを単離す
るべく更に２回スクリーニングした。
るべく更に２回スクリーニングした。
ｂ）陽性クローンの、オリゴヌクレオチド混合物（プロ
ーブｂ）でのスクリーニング １１１ｂｐプローブとのハイブリッドを形成したクロー
ンを平板培養し、標識した“短い”オリゴヌクレオチド
の混合物でスクリーニングした。
ーブｂ）でのスクリーニング １１１ｂｐプローブとのハイブリッドを形成したクロー
ンを平板培養し、標識した“短い”オリゴヌクレオチド
の混合物でスクリーニングした。
このフィルターを、まず６ＸＳＳＣ１ｓｘ Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ’ ｓ、０．１％ＳＯＳ、１０ｈｇ／＋ｅｌサケ
精子ＤＮ＾中で４２℃でハイブリダイゼーションした。
ｒｄｔ’ ｓ、０．１％ＳＯＳ、１０ｈｇ／＋ｅｌサケ
精子ＤＮ＾中で４２℃でハイブリダイゼーションした。
続いて標識オリゴヌクレオチド混合物を添加してから、
上記フィルターを４２℃で−晩ハイブリダイゼーション
した。
上記フィルターを４２℃で−晩ハイブリダイゼーション
した。
その後、フィルターを４５℃の６ Ｘ ５ＳＣ１０，１
％ＳＤＳ中で洗浄し、オートラジオグラフィーに掛けた
。
％ＳＤＳ中で洗浄し、オートラジオグラフィーに掛けた
。
両１０−プに陽性のクローンを１個単離し、配列を分析
した。
した。
叶人配ｊＬ別哲−
陽性クローンｐａｕのＯＮ＾をＰｒｏｍｅｇａ Ｌａ翰
ｂｄａＳｏｒｂファージ吸着剤法で単離し、挿入断片を
ＥｃｏＲＩで除去し、かつ両方向においてＭ１３ａ＋ｐ
８のＥｃｏＲ１部位と連結させた。 ｐＢＬ６クローン
の制限エンドヌクレアーゼ地図を第２図に示す、配列分
析はＳａｎｇｅｒ法で行なった。遺伝子の両方の鎖を配
列分析したところ、２８０アミノ酸のタンパク質をコー
ドする読み取り枠が明らかになった。
ｂｄａＳｏｒｂファージ吸着剤法で単離し、挿入断片を
ＥｃｏＲＩで除去し、かつ両方向においてＭ１３ａ＋ｐ
８のＥｃｏＲ１部位と連結させた。 ｐＢＬ６クローン
の制限エンドヌクレアーゼ地図を第２図に示す、配列分
析はＳａｎｇｅｒ法で行なった。遺伝子の両方の鎖を配
列分析したところ、２８０アミノ酸のタンパク質をコー
ドする読み取り枠が明らかになった。
Ｌａｐｐｉ ｅｔ ａｌＪ１９８５）が報告している５
Ｏ−６の公知Ｎ末端アミノ酸配列をクローンｐＢＬ６の
配列と比較することにより、本発明クローンによってコ
ードされた成熟タンパク質のアミノ酸配列開始点を予測
できたく第３図）、翻訳開始部位は、ヌクレオチド残基
−７２〜−７０に位置するメチオニンコドンｄ（ＡＴＧ
）によって規定された。第３図に示した配列から、Ｎ末
端でシグナルペプチドである２４個のアミノ酸が伸長す
ることが予測できる。このデータはりシンシグナルペプ
チドの長さ（２４アミノ酸）に一致する。しかし、５Ｏ
−６のＣＮＢｒフラグメントを予測されたクローンｐ
Ｂ Ｉ、６のアミノ酸配列と比較したところ、個々のア
ミノ酸残基において六つの相違が判明した（第４図）、
このことは、アミノ酸配列決定上の誤りか、あるいはＳ
ａ ｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉ−ｎａｌｉｓから精製
したＲＩＰにおける配列の不均一性（Ｓｔｉｒｐｅ ｅ
ｔ ａｔ、、 １９８３）に起因し得よう。
Ｏ−６の公知Ｎ末端アミノ酸配列をクローンｐＢＬ６の
配列と比較することにより、本発明クローンによってコ
ードされた成熟タンパク質のアミノ酸配列開始点を予測
できたく第３図）、翻訳開始部位は、ヌクレオチド残基
−７２〜−７０に位置するメチオニンコドンｄ（ＡＴＧ
）によって規定された。第３図に示した配列から、Ｎ末
端でシグナルペプチドである２４個のアミノ酸が伸長す
ることが予測できる。このデータはりシンシグナルペプ
チドの長さ（２４アミノ酸）に一致する。しかし、５Ｏ
−６のＣＮＢｒフラグメントを予測されたクローンｐ
Ｂ Ｉ、６のアミノ酸配列と比較したところ、個々のア
ミノ酸残基において六つの相違が判明した（第４図）、
このことは、アミノ酸配列決定上の誤りか、あるいはＳ
ａ ｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉ−ｎａｌｉｓから精製
したＲＩＰにおける配列の不均一性（Ｓｔｉｒｐｅ ｅ
ｔ ａｔ、、 １９８３）に起因し得よう。
（４） こお番・る
クローンｐＢＬ６の持つ５Ｏ−６遺伝子から始め、９０
０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント（第２図）をベクター
ｐｕｃ ８（＾ｍｅｒｓｈａｍ、 ＩＪ、に、）のＥｃ
ｏＲｆ部位へとサブクローン化した。こうして得たプラ
スミドをＢｇｌ■及びＰｓｔ ｌで切断して、５Ｏ−６
遺伝子を含むがシグナルペプチド並びに最初の６アミノ
酸残基をコードする５′領域に欠けるフラグメントを回
収した（第２図及び第３図）、フラグメントの３′末端
には、５Ｏ−６ｃＤＮ＾に続き、ＥａｏＲ１部位とＰｓ
Ｌ １部位との間に位置するｐｕｃ ８ポリリンカーに
由来するＤＮ八へが更に位置した。
０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント（第２図）をベクター
ｐｕｃ ８（＾ｍｅｒｓｈａｍ、 ＩＪ、に、）のＥｃ
ｏＲｆ部位へとサブクローン化した。こうして得たプラ
スミドをＢｇｌ■及びＰｓｔ ｌで切断して、５Ｏ−６
遺伝子を含むがシグナルペプチド並びに最初の６アミノ
酸残基をコードする５′領域に欠けるフラグメントを回
収した（第２図及び第３図）、フラグメントの３′末端
には、５Ｏ−６ｃＤＮ＾に続き、ＥａｏＲ１部位とＰｓ
Ｌ １部位との間に位置するｐｕｃ ８ポリリンカーに
由来するＤＮ八へが更に位置した。
５Ｏ−６のための遺伝子を持つＢｇｌ ｎ −Ｐｓｔ
１フラグメントと、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔ Ｉで切断し
た発現ベクターｐｔｌＥＸ３（Ｂｒｅｓｓａｎ ａｎｄ
５ｔａｎｌｅｙ、 １９８７）との連結反応により、
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（Ｓｔａｎｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｌｕｚｉｏ、 １９８４）と５Ｏ−６の
ためのコード配列のほとんどを含む遺伝子との枠内（ｉ
ｎ−ｆｒａ＋＊ｅ）融合が生起した。 ５ｏ−６遺伝子
下流において、ベクターｐｌＪＥＸＢ中に存在する終結
コドンが翻訳を終了させた。
１フラグメントと、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔ Ｉで切断し
た発現ベクターｐｔｌＥＸ３（Ｂｒｅｓｓａｎ ａｎｄ
５ｔａｎｌｅｙ、 １９８７）との連結反応により、
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（Ｓｔａｎｌ
ｅｙ ａｎｄ Ｌｕｚｉｏ、 １９８４）と５Ｏ−６の
ためのコード配列のほとんどを含む遺伝子との枠内（ｉ
ｎ−ｆｒａ＋＊ｅ）融合が生起した。 ５ｏ−６遺伝子
下流において、ベクターｐｌＪＥＸＢ中に存在する終結
コドンが翻訳を終了させた。
こうして得た組み換え体プラスミドを、細菌宿主である
大腸菌ＤＨ１０５（＾ｍｅｒｓｈａｓ＋、 ＩＪ、に、
）の形質転換に用いた。λ−Ｒ，プロモーターによって
調節されるハイブリッド遺伝子は、実雪的にＺａｂｅａ
ｕ ａｎｄＳｔａｎｌｅｙが述べている（１９８２）よ
うに発現した。細菌を３０℃で成長させて、００．。。
大腸菌ＤＨ１０５（＾ｍｅｒｓｈａｓ＋、 ＩＪ、に、
）の形質転換に用いた。λ−Ｒ，プロモーターによって
調節されるハイブリッド遺伝子は、実雪的にＺａｂｅａ
ｕ ａｎｄＳｔａｎｌｅｙが述べている（１９８２）よ
うに発現した。細菌を３０℃で成長させて、００．。。
を０６９とした。予め加熱して５４℃としたブイヨンを
等量添加することにより、急激に温度を４２℃まで上昇
させた。培養物を４２℃に２時間保温してから収穫した
。全■胞溶解物を、Ｌａｅｍｍ ｌ ｉ法を用いて（適
当濃度の）ポリアクリルアミドスラブゲル上に装荷した
。イムノブロッティングのため上記ゲルを、２５＋ａＭ
トリス塩基、１９２＋８グリシン、２０％メタノール中
で４℃で４時間、０．２八でトランスプロット装置（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースフィルター上
に移転した。移転後、フィルターを蒸留水で洗浄し、Ｐ
ＢＳ＋３％ＢＳ＾と共に穏やかに振盪しつつ１時間保温
した。フィルターを再び蒸留水で洗浄し、 ＰＢＳで１
：２５０に稀釈したウサギ由来の抗５Ｏ−６血清と共に
１時間室温に保温した。 ＰＢＳ並びにＰＢＳ＋０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した後、これを１ ＋
７，５００に稀釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ
と結合したヤギ由来の抗つサギＩｇＧ血清と共に１時間
室温に保温した。更に２回洗浄した後、フィルターを４
−クロロ−１−ナフトールで染色した。
等量添加することにより、急激に温度を４２℃まで上昇
させた。培養物を４２℃に２時間保温してから収穫した
。全■胞溶解物を、Ｌａｅｍｍ ｌ ｉ法を用いて（適
当濃度の）ポリアクリルアミドスラブゲル上に装荷した
。イムノブロッティングのため上記ゲルを、２５＋ａＭ
トリス塩基、１９２＋８グリシン、２０％メタノール中
で４℃で４時間、０．２八でトランスプロット装置（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）を用いてニトロセルロースフィルター上
に移転した。移転後、フィルターを蒸留水で洗浄し、Ｐ
ＢＳ＋３％ＢＳ＾と共に穏やかに振盪しつつ１時間保温
した。フィルターを再び蒸留水で洗浄し、 ＰＢＳで１
：２５０に稀釈したウサギ由来の抗５Ｏ−６血清と共に
１時間室温に保温した。 ＰＢＳ並びにＰＢＳ＋０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した後、これを１ ＋
７，５００に稀釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ
と結合したヤギ由来の抗つサギＩｇＧ血清と共に１時間
室温に保温した。更に２回洗浄した後、フィルターを４
−クロロ−１−ナフトールで染色した。
上述の操作により、ハイブリッドβ−ガラクトシダーゼ
−８Ｏ−６タンパク質の分子量は予想どおり５ＯＳ−Ｐ
ＡＧＥにおいて１４５ｋｄであることが判明した。
−８Ｏ−６タンパク質の分子量は予想どおり５ＯＳ−Ｐ
ＡＧＥにおいて１４５ｋｄであることが判明した。
ゲル上のこの地点に移動するバンドを、上記イムノブロ
ッティング法により抗５Ｏ−６血清で特異的に確認した
。
ッティング法により抗５Ｏ−６血清で特異的に確認した
。
ハイブリッドタンパク質の精製には次の方法を用いた。
培養物１００１から得た細菌ベレットを３〜５ｍｌの緩
衝液＾（５０ｍＨトリスＨＣＩ ｐＨ７，４，１７０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，２，５Ｂ／ｍｌリゾチーム）中に再懸濁
させ、水中で３０分間保温し、更に氷上で２０秒％けて
５回音波処理した。遠心分Ｎ （Ｓｏｒｖａ Ｉ Ｉ
５Ｓ３４０−ターで４℃で４０分間、１０，０ＯＯｒｐ
躊）後、ベレットを１０論１の桜ｗｒ液Ｂ（７Ｍ尿素、
１０ＩＩＨトリスＨＣＩ ｐＨ７，４，１ｍＨＥＤＴ＾
）中に再懸濁させ、３０分間室温に放置した。この懸濁
液を上記と同様に遠心分離し、上澄み液を２１の５０ｍ
ＭトリスＨＣＩ ｐＨ７，４に対し４℃で大規模に透析
した。
衝液＾（５０ｍＨトリスＨＣＩ ｐＨ７，４，１７０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，２，５Ｂ／ｍｌリゾチーム）中に再懸濁
させ、水中で３０分間保温し、更に氷上で２０秒％けて
５回音波処理した。遠心分Ｎ （Ｓｏｒｖａ Ｉ Ｉ
５Ｓ３４０−ターで４℃で４０分間、１０，０ＯＯｒｐ
躊）後、ベレットを１０論１の桜ｗｒ液Ｂ（７Ｍ尿素、
１０ＩＩＨトリスＨＣＩ ｐＨ７，４，１ｍＨＥＤＴ＾
）中に再懸濁させ、３０分間室温に放置した。この懸濁
液を上記と同様に遠心分離し、上澄み液を２１の５０ｍ
ＭトリスＨＣＩ ｐＨ７，４に対し４℃で大規模に透析
した。
精製は、ｔｌｌｌｍａｎｎ（１９８４）が述べているよ
うにｐ−アミノフェニルチオガラクトシド−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅでのアフィニティークロマトグラフィーで達成
した。精製物質の５ＯＳ−ＰＡＧＥを上述の未精製物質
の５ＯＳ−ＰＡＧＥに並行して実施したところ、既に述
べた手順によるイムノブロッティング後、特異的抗５Ｏ
−６血清で確認した予想分子量の際立ったバンドが明ら
かになった。精製した組み換え体タンパク買は移動にお
いて、誘導大腸菌株の抽出物中に存在するハイブリッド
β−ガラクトシダーゼ−５ｏ−６に対応した。
うにｐ−アミノフェニルチオガラクトシド−５ｅｐｈａ
ｒｏｓｅでのアフィニティークロマトグラフィーで達成
した。精製物質の５ＯＳ−ＰＡＧＥを上述の未精製物質
の５ＯＳ−ＰＡＧＥに並行して実施したところ、既に述
べた手順によるイムノブロッティング後、特異的抗５Ｏ
−６血清で確認した予想分子量の際立ったバンドが明ら
かになった。精製した組み換え体タンパク買は移動にお
いて、誘導大腸菌株の抽出物中に存在するハイブリッド
β−ガラクトシダーゼ−５ｏ−６に対応した。
下ずどｔｐｒ Ｌｔｆｆ、ｒｔ ｓｌ＃’ｆすｒ＜
７１ 功 蝉ｆ＜４ｉｓ ｆｌｒ４ 、’入ｖｉｖ
ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ、 Ｐｔｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ、 ６９
（１９）２）１４０１１゜ ｙｓｔｅｍ＊ａｎ Ｊ１１’ｌ１５５ｔａｎｘｅｙ、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒａ５ｅａｒｃｈ １５．
１００５６゜１９１１フ。
７１ 功 蝉ｆ＜４ｉｓ ｆｌｒ４ 、’入ｖｉｖ
ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ、 Ｐｔｏｃ、 Ｎａｔｌ
、 Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、 ＵＳＡ、 ６９
（１９）２）１４０１１゜ ｙｓｔｅｍ＊ａｎ Ｊ１１’ｌ１５５ｔａｎｘｅｙ、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒａ５ｅａｒｃｈ １５．
１００５６゜１９１１フ。
Ｃｈａｕ４ｈａｘｙ ＠ｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ５ｃｉ、 Ｏ５＾
、 ８４ （１９８））４５３Ｂ−４５４２゜ Ｄａｖｉｓ ａｔ ａｌ、 Ｂａ５ｉｃ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ｍｏｌ＠ｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、 １
９８ｇ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 ５ｃｉ、 Ｏ５＾
、 ８４ （１９８））４５３Ｂ−４５４２゜ Ｄａｖｉｓ ａｔ ａｌ、 Ｂａ５ｉｃ ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ ｍｏｌ＠ｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ、 １
９８ｇ。
ＥｌｓｅｖｉｅｔＳｃｉｅｎｃ＠Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ＋、 Ｘｎｃ。
Ｃｏ＋、 Ｘｎｃ。
Ｌａｐｐｉ ＠ｔ ａｌ、 Ｂｉｏｃｈ＊ｍ、 Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｗｓ、、 １２９ （１９
８５）９３４−９４２゜ ＬａｐｐＬ ａｔ ａｌ、 ＾ｂｓ、 １５ｔ
ｈ ａｎｎｕａｌ ０ＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｌａ
ｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｐａｒｋ υヒａｈ
、 Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２２゜Ｍａｒｃｈ ２３．
１５８６゜ Ｍｕｒｐｈｙ ＠ｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 ＳＣＬｍｇυＳＡ、 ８３ （１９８６）
８２５Ｂ−８２６２゜ Ｓｉ＠ｎａ ＠Ｌ ａｌ、 Ａｂｓｔ、 ＾ｍ
ｅｒｉｃａｎ Ａｓ５ｏｃ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ、。
ｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｗｓ、、 １２９ （１９
８５）９３４−９４２゜ ＬａｐｐＬ ａｔ ａｌ、 ＾ｂｓ、 １５ｔ
ｈ ａｎｎｕａｌ ０ＣＬＡ Ｓｙｍｐｏｓｌａ
ｏｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｐａｒｋ υヒａｈ
、 Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２２゜Ｍａｒｃｈ ２３．
１５８６゜ Ｍｕｒｐｈｙ ＠ｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 ＳＣＬｍｇυＳＡ、 ８３ （１９８６）
８２５Ｂ−８２６２゜ Ｓｉ＠ｎａ ＠Ｌ ａｌ、 Ａｂｓｔ、 ＾ｍ
ｅｒｉｃａｎ Ａｓ５ｏｃ、 Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ、。
Ａｔ１ａｎｔａ、ＧＡ、、１９６７゜
５ｔａｎｌｅｙ ａｎｄ Ｌｕｚｉｏ、 ＥＭＢＯｊｏ
ｕ＋：ｎａｌ ３．１４２９−１４３４．１９Ｂ４゜５
ｔｉｒｐ＠ｅｔ ａｌ、 ＢＬｏｃｈ＠＋ｙ＋、 Ｊ、
、 ２１６ （１９１１３１６１７−６２５゜？ｈｏｒ
ｐａ ａｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｎ、 Ｃ，Ｘ、、 ７５
（１９８５） １５１−１５９゜ｔｌｌｌａａｎｎ、
Ｇｅｎｅ ２９． ２７−コｌ、 Ｌ９１１４゜
Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ ４！ｔ ａｌ、 Ａｂｓｔ、 Ｘ
ｎｔ、 ｆｌｙｍｐ＝ ”ｐｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎ＠
＠ｒｌｎｇ’８７＠、 ０ｘｆｏｒｄ、 ｔｉＫ、 ５
−８＾ｐｒｉｌ、 １９８７゜Ｚａｂ＊ａｕ ａｎｄ
５ｔａｎｌｅｙ、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ ｌ、 １
２１７−１２２４．１９８２゜
ｕ＋：ｎａｌ ３．１４２９−１４３４．１９Ｂ４゜５
ｔｉｒｐ＠ｅｔ ａｌ、 ＢＬｏｃｈ＠＋ｙ＋、 Ｊ、
、 ２１６ （１９１１３１６１７−６２５゜？ｈｏｒ
ｐａ ａｔ ａｌ、 Ｊ、 Ｎ、 Ｃ，Ｘ、、 ７５
（１９８５） １５１−１５９゜ｔｌｌｌａａｎｎ、
Ｇｅｎｅ ２９． ２７−コｌ、 Ｌ９１１４゜
Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ ４！ｔ ａｌ、 Ａｂｓｔ、 Ｘ
ｎｔ、 ｆｌｙｍｐ＝ ”ｐｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎ＠
＠ｒｌｎｇ’８７＠、 ０ｘｆｏｒｄ、 ｔｉＫ、 ５
−８＾ｐｒｉｌ、 １９８７゜Ｚａｂ＊ａｕ ａｎｄ
５ｔａｎｌｅｙ、 ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ ｌ、 １
２１７−１２２４．１９８２゜
第１図は５Ｏ−６の５種類のＣＮＢｒフラグメントのア
ミノ酸配列を示す説明図、第２図はクローンｐＢＬ６の
ＥｃｏＲＩ挿入断片の制限酵素地図、第３図はクローン
ｐＢＬ６のＥｃｏＲＩ ’１ｆｆｔ人断片のＤＮ＾配列
と、予測される対応アミノ酸配列とを示す説明図、第４
図は５Ｏ−６のＣＮＢｒフラグメントを予測されるアミ
ノ酸配列と比較する説明図である。
ミノ酸配列を示す説明図、第２図はクローンｐＢＬ６の
ＥｃｏＲＩ挿入断片の制限酵素地図、第３図はクローン
ｐＢＬ６のＥｃｏＲＩ ’１ｆｆｔ人断片のＤＮ＾配列
と、予測される対応アミノ酸配列とを示す説明図、第４
図は５Ｏ−６のＣＮＢｒフラグメントを予測されるアミ
ノ酸配列と比較する説明図である。
Claims (12)
- （１）リボソーム不活化タンパク質（ＲＩＰ）ＳＯ−６
をコードするＤＮＡ配列であって、配列順序が【遺伝子
配列があります】 であるＤＮＡ配列。 - （２）直前にシグナル配列 【遺伝子配列があります】 が位置する請求項１のＤＮＡ配列から成るＤＮＡ配列。
- （３）添付図面の第３図に示したＤＮＡ配列。
- （４）請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配
列を含むクローニングベクター。 - （５）プラスミドであることを特徴とする請求項４に記
載のベクター。 - （６）ファージウィルスベクターであることを特徴とす
る請求項５に記載のベクター。 - （７）形質転換した宿主内でＲＩＰＳＯ−６を発現し得
る、請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列
を含む発現ベクター。 - （８）プラスミドであることを特徴とする請求項７に記
載のベクター。 - （９）形質転換した宿主内で、細胞と結合し得るリガン
トと結合したＲＩＰＳＯ−６を含む結合体を発現し得る
ことを特徴とする請求項７または８に記載のベクター。 - （１０）請求項７から９のいずれか１項に記載のベクタ
ーで形質転換させた宿主。 - （１１）ＲＩＰＳＯ−６か、あるいは細胞と結合し得る
リガントと結合したＲＩＰＳＯ−６を含む結合体を製造
する方法であって、請求項１０に記載の形質転換宿主を
培養すること、及びそのようにして生産したＲＩＰある
いは結合体を単離することを含む製造方法。 - （１２）請求項１１に記載の方法で製造した結合体と、
薬学的に許容可能なキャリヤあるいは希釈剤とを含有す
る薬剤組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888801877A GB8801877D0 (en) | 1988-01-28 | 1988-01-28 | Nucleotide sequence encoding plant ribosome inactivating protein |
| EP89306016A EP0402544B1 (en) | 1988-01-28 | 1989-06-14 | Nucleotide sequence encoding plant ribosome inactivating protein |
| AU36540/89A AU613770B2 (en) | 1988-01-28 | 1989-06-19 | Nucleotide sequence encoding plant ribosome inactivating protein |
| CA000603421A CA1340805C (en) | 1988-01-28 | 1989-06-21 | Nucleotide sequence incoding plant ribosome inactivating protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02222684A true JPH02222684A (ja) | 1990-09-05 |
| JP2771220B2 JP2771220B2 (ja) | 1998-07-02 |
Family
ID=33568643
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1039172A Expired - Lifetime JP2771220B2 (ja) | 1988-01-28 | 1989-02-17 | 植物性リボソーム不活化タンパク質をコードするヌクレオチド配列 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0402544B1 (ja) |
| JP (1) | JP2771220B2 (ja) |
| AU (1) | AU613770B2 (ja) |
| CA (1) | CA1340805C (ja) |
| DE (1) | DE68922488T2 (ja) |
| GB (2) | GB8801877D0 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8801877D0 (en) * | 1988-01-28 | 1988-02-24 | Erba Carlo Spa | Nucleotide sequence encoding plant ribosome inactivating protein |
| US5529932A (en) * | 1988-01-28 | 1996-06-25 | Pharmacia, S.P.A. | Isolated DNA encoding a plant ribosome inactivating protein from the leaves of saponaria officinalis |
| US5635384A (en) * | 1990-06-11 | 1997-06-03 | Dowelanco | Ribosome-inactivating proteins, inactive precursor forms thereof, a process for making and a method of using |
| US5248606A (en) * | 1990-06-11 | 1993-09-28 | Dowelanco | Dna encoding inactive precursor and active forms of maize ribosome inactivating protein |
| IE912716A1 (en) * | 1990-08-14 | 1992-02-26 | Res Dev Foundation | Protein Structure of the Plant Toxin Gelonin |
| DE4040954C2 (de) * | 1990-12-20 | 2001-05-17 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Erzeugung von pathogen-resistenten Pflanzen |
| JPH06509471A (ja) * | 1991-07-31 | 1994-10-27 | イタルファルマコ エッセ．ピ．ア． | リボソーム不活性化タンパク質をコードするヌクレオチド配列 |
| US5376546A (en) * | 1991-11-04 | 1994-12-27 | Xoma Corporation | Analogs of ribosome-inactivating proteins |
| US6146850A (en) | 1991-11-04 | 2000-11-14 | Xoma Corporation | Proteins encoding gelonin sequences |
| US5621083A (en) | 1991-11-04 | 1997-04-15 | Xoma Corporation | Immunotoxins comprising ribosome-inactivating proteins |
| US5837491A (en) * | 1991-11-04 | 1998-11-17 | Xoma Corporation | Polynucleotides encoding gelonin sequences |
| GB9304905D0 (en) * | 1992-03-16 | 1993-04-28 | Zeneca Ltd | Processes |
| US5916772A (en) * | 1992-06-16 | 1999-06-29 | Whittier Institute For Diabetes And Endocrinology | Recombinant production of saporin-containing proteins |
| AU7475694A (en) * | 1993-08-02 | 1995-02-28 | Prizm Pharmaceuticals, Inc. | Monogenous preparations of cytotoxic conjugates |
| KR970001565B1 (ko) * | 1993-08-28 | 1997-02-11 | 장기하 | 섬자리공 항바이러스성 단백질(pip) 유전자 및 이를 발현하는 미생물 |
| US6551618B2 (en) | 1994-03-15 | 2003-04-22 | University Of Birmingham | Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3724323C2 (de) * | 1986-07-29 | 1995-07-20 | Erba Farmitalia | Ein neuer Inhibitor für die Proteinsynthese |
| GB8801877D0 (en) * | 1988-01-28 | 1988-02-24 | Erba Carlo Spa | Nucleotide sequence encoding plant ribosome inactivating protein |
-
1988
- 1988-01-28 GB GB888801877A patent/GB8801877D0/en active Pending
-
1989
- 1989-01-27 GB GB8901892A patent/GB2216891B/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-02-17 JP JP1039172A patent/JP2771220B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-14 EP EP89306016A patent/EP0402544B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-06-14 DE DE68922488T patent/DE68922488T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-06-19 AU AU36540/89A patent/AU613770B2/en not_active Ceased
- 1989-06-21 CA CA000603421A patent/CA1340805C/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS=1985 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68922488T2 (de) | 1996-01-25 |
| GB2216891B (en) | 1992-06-03 |
| JP2771220B2 (ja) | 1998-07-02 |
| AU613770B2 (en) | 1991-08-08 |
| DE68922488D1 (de) | 1995-06-08 |
| GB2216891A (en) | 1989-10-18 |
| CA1340805C (en) | 1999-10-26 |
| EP0402544B1 (en) | 1995-05-03 |
| GB8801877D0 (en) | 1988-02-24 |
| EP0402544A1 (en) | 1990-12-19 |
| AU3654089A (en) | 1990-12-20 |
| GB8901892D0 (en) | 1989-03-15 |
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