JPH02501190A - 組換ｄｎａ産物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換ＤＮＡ産物及び方法 本発明は、ヒンジ領域中に変更された数のシスティン残基を有する変更され抗体 分子（ａｌｔｅｒｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ；ＡＡＭ）、及び 組換ＤＮＡ技法を用いるその製造方法に関する。

本出願において： ’　Ｍ　Ａ　ｂ　Ｊなる語はモノクローナル抗体を示すために用いられ； 「組換抗体分子Ｊ　（ＲＡＭ）なる語は、組換ＤＮＡ技法を用いる任意の方法に より生産される抗体を記載するために用いられ、天然免疫グロブリンの任意の類 似体又はその断片を包含し；そして 「ヒト化抗体分子」（ｈｕｍａｎｉｓｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｍｏｌｅｃｕｌ ｅ　；　）ＩＡＭ）なる語は、ヒト以外の種の免疫グロブリンに由来する抗原結 合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分がヒトの免疫グロブリンに 由来する分子を記載するために用いられる。該抗原活性部位は定常ドメインに融 合した完全な可変ドメインであってもよ（、又は可変ドメイン中の適切なフレー ムワーク領域に移植された（ｇｒａｆｔｅｄ）相補性決定領域（ｃｏｍ−ｐｌｅ ｍｅｎｔａｒＨｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ　；　ＣＤＲ）のみ であってもよい。

本明細書において、多くの刊行物に番号をもって言及する。

これらの刊行物は本明細書の末尾に番号順に記載する。

天然免疫グロブリンは多年にわたり、その種々の断片、例えばＦａｂ、　（Ｆａ ｂ’　）２及びＦｃ断片、を有するものとして知られており、これらは酵素的開 裂により誘導され得る。天然免疫グロブリンは一般に、各アームの末端に抗原結 合部位を有するＹ形分子から成る。この構造の残りの部分、そして特にＹ形の幹 部分は免疫グロブリンに関連するエフェクター機能を中介する。

Ｙ形分子のアームの連結部にヒンジ領域として知られる部分が存在する。この領 域内には、抗体のクラスに依存して２〜１１個の重鎮間ジスルフィド結合が存在 する。これらのジスルフィド結合は完全な抗体分子の２つの部分を一緒に保持す るために機能する。Ｆａｂ断片において、ヒンジ領域は抗原結合領域から酵素的 に分離されている。従って、Ｆａｂ断片は軽鎖／端が切除された重鎮の二量体か ら成る。しかしながら、（Ｆａｂ’　）、断片においては、Ｆｃ部分がヒンジ領 域のＣ−末端側で抗原結合部位から開裂されている。従って、（Ｆａｂ’　Ｌ断 片は、ヒンジ領域により四量体構造に一緒に保持された、軽鎖／端が切除された 重鎮の二量体２個から成る。

ヒンジ部分は、Ｙ形抗体分子のアームが相互に動くことを可能にする。動きの程 度はヒンジ領域中のジスルフィド結合の数に大きく依存すると推定される。さら に、抗原結合領域から分子のＦｃ部分へのコンホーメーション変化の伝達にヒン ジ領域が重要な役割を演すると信じられる。この様なコンホーメーション変化は 免疫グロブリン分子のエフェクター機能を活性化するために必要であろう。

天然抗体、特にＩｇＧにおいては、ヒンジは蛋白質レベル及び遺伝子レベルの両 方において、抗体の独立な領域を代表する。ヒンジ領域の生体内コンホーメーシ ョンについての高解像データーは今日行われている構造研究からは得られない。

しかしながら之モデル構築が示すところによれば、ヒンジ領域はジスルフィド橋 により連結された比較的単純な延長された又はヘリックス様の構造を形成するこ とができる。

天然免疫グロブリン及びその断片は診断において、そしてより限定された範囲で は治療において使用されている。しかしながら、この様な使用、特に治療におけ る使用は、天然免疫グロブリンのポリクローナル性により障害されている。療法 剤としての免疫グロブリンの可能性の実現への有意な段階は定義された抗原特異 性のモノクローナル抗体の発見であった（１）、はとんどのＭＡｂは修歯動物の 牌細胞と冨歯動物の骨ｌａｉ腫細胞との融合により生産される。従ってこれらは 本質的に薩歯動％ＭＡｂである。ヒトＭＡｂの生産の報告はほとんど無い。

「ヒト化Ｊ　（ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ）　Ｍ歯動物ＭＡｂについての提案がなさ れている。これらの技法は一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードするＤＮ Ａ配列を操作するために組換ＤＮＡ技法を使用することを含む。この様な方法を 実施するための幾つかの初期の方法がＥＰ−へ一０１７１４９６　（Ｒｅｓ、　 Ｄｅｖ、　Ｃｏｒｐ。

日本）　、ＢＰ−Ａ−０１７３４９４（スタッフォード大学）　、ＥＰ−Ａ−０ １９４２７６（セルチック・リミテッド）、及びＷＯ−Ａ−８７０２６７１（Ｉ ｎｔ、　Ｇｅｎ、　Ｅｎｇ、Ｉｎｃ、）に記載されている。

ＥＰ−Ａ−８７３０２６２０，７（Ｗｉｎｔｅｒ）に記載されている他の方法に おいて、マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、長いオリゴヌクレオチド を用いる部位特定変異誘発によりヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレーム ワーク領域に移［（ｇｒａｆｔ）された。

免疫グロブリン、そして特にＭＡｂが癌の診断及び治療において潜在的に非常に 有用であり得ることが広く示唆されている（２．３）。従って、癌特異抗原に対 して向けられた免疫グロブリン又はＭＡｂの製造を試みる多くの活動が存在する 。今まで、種々のヒト癌に対して向けられた１００を超えるＭＡｂが腫瘍の診断 又は治療の種々の観点において使用されている（４）。

本発明者らの同時に出願された出願ｋ　（ＰＡ１４９）には、可変ドメインの少 なくとも相補性決定領域（ＣＤＲ）がマウスモノクローナル抗体８７２．３　（ Ｂ７２．３　ＭＡｂ）に由来しそしてＲＡＭの残りの免疫グロブリン由来部分が ヒト免疫グロブリンに由来する、抗原結合部位を有するヒト化抗体分子（ＲＡＭ ）　、及びその製造方法が記載されている。

Ｂ７２．３　ＭＡｂは、乳癌のヒト肝臓転移癌の膜冨化抽出物に対して生じたＩ ｇＧ１−カッパー型のマウスＭＡｂである（５）。

Ｂ７２．３　］’ｌＡｂは多数の研究室において広範に研究されている。

このものは、分子量約１０６のムチン（ｍｕｃｉｎ　）様分子である腫瘍関連糖 蛋白質ＴＡＧ−７２を認識することが示されている（６）。

免疫組織化学的研究が示すところによれば、８７２．３　Ｍｎｂは直腸結腸癌の 約９０％、乳癌の８５％及び卵巣癌の９５％を認識する。しかしながら、それは 広範囲の正常ヒト組織と交叉反応性を示さない（７〜１０）。

例えばＥＰ−Ａ−０１９４２７６において示唆されているところによれば、エフ アクタ−分子又はレポーター分子は、療法剤又は診断剤としてのその有効性を増 強するために抗体又はその断片に結合せしめることができる。この結合は共有結 合架橋構造によることができる。あるいは、エフェクター又はレポーター分子が 蛋白質である場合、それを融合蛋白質のＣ−末端部分として同時発現せしめるこ とができ、そのＮ−末端部分は抗体分子又は断片の鎖の１つの少なくとも可変ド メインを含んで成る。

今まで行われた研究のすべてにおいて、抗体分子又は断片中のヒンジ領域は、も し存在するとすれば、抗体分子のＣＨ１ドメインと通常に関連しているものであ った。組換ＤＮＡ技法による操作を容易にするためにＣ−又はＮ−末端配列を変 更することが必要な場合は別として、ヒンジ領域をなんらかの態様で変更すべき であるとする示唆は存在しなかった。

本発明の第一の観点に従えば、抗体分子のＣＨＩドメインに通常関連するヒンジ 領域中に見出されるそれとは異る数のシスティン残基を有するヒンジ領域を有す る変更された抗体分子（ＡＡＭ）が提供される。

本発明のＡＡＭは、十分な長さの重鎮及び軽鎖を有する完全な抗体分子Ｈ（Ｆａ ｂ’　）ｚ断片；又はヒンジ領域を含有する他の任意の断片、を包含することが できる。ＡＡＭの複数の抗原結合部分は、所望により異る特異性を有することが できる。

この場合、抗体は二元特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）である。

本発明のＡＡＭはそれに結合したエフェクター分子又はレポーター分子を有する ことができる。例えば、ＡＡＭは重金属原子をキレート化するための大環状物質 、又はりシンのごとき毒素でありで、共有結合構造によりそれに結合したものを 有することができる。あるいは、組換ＤＮＡ技法を用いて、完全な抗体分子のＦ ｃ断片又はＣＨ，ドメインが酵素又は毒素分子により置き換えられているＡＡＭ を製造することができる。

好ましくは、本発明のＡＡＭはまた、例えば、前記の係属中の出願に記載されて いるタイプのＲＡＭである。ＲＡＭの可変ドメインは蓋歯動物のＭＡｂの完全な 可変ドメインを含むことができ、又は誓歯動物ＭＡｂのＣＤＲが移植されたヒト 可変ドメインのフレームワーク領域を含むことができる。

ＨＡＭの残りの部分は任意の適当なヒト免疫グロブリンに由来することができる 。しかしながら、それはヒト免疫グロブリンからの蛋白質配列のみを含む必要は ない０例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の部分をコードするＤＮＡ配列がポリペプ チドエフアクタ−又はレポーター分子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に 融合している遺伝子を作製することができる。

本発明のＡＡＭの変更されたヒンジ領域は、ＣＨＩドメインのそれとは異るクラ ス又はサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含んで成ることができる 。すなわち、例えば、クラスγ１のＣＨＩドメインをクラスＴ４のヒンジ領域に 結合せしめることができる。あるいは、新しいヒンジ領域は天然ヒンジの部分、 又は各ユニットが天然ヒンジ領域に由来する反復ユニットを含んで成ることがで きる。他の態様において、天然ヒンジ領域は、１もしくは複数のシスティン残基 をアラニンのごとき中性残基に転換することにより、又は適当に配置された残基 をシスティン残基に転換することにより、変更することができる。従って、ヒン ジ領域中のシスティン残基の数を増加又は減少せしめることができることがわ本 発明の１つの好ましい観点においては、ヒンジ領域中のシスティン残基の数は１ に減少される。これは次の利点を有するであろう。すなわち、単一のジスルフィ ド結合を形成することが必要なだけであるから、抗体分子、特に二元特異的抗体 分子及びＦｃ部分がエフェクター又はレポーター分子により置き換えられている 抗体分子、の集成（ａｒｓｅ…ｂｕｙ）が促進されるであろう。これは、ヒンジ 領域を他のヒンジ領域に又はエフェクターもしくはレポーター分子に化学的手段 により直接的に又は間接的に結合せしめるための特異的標的を提供するであろう 。

他の好ましい観点においては、ヒンジ中のシスティン残基の数が増加される。こ の利点は、エフェクター又はレポーター分子をＡＡＭに結合せしめるためのシス ティンのチオール基の使用を促進することである。例えば、放射性標識である９ ９″テクチニウムを、本発明者らの英国特許出願Ｎα８８００８４３及びＮα８ ８１２２５７に記載されているように大環状リガンドの使用により又は直接的に 、ヒンジ・システィンに結合せしめることができる。システィンの数の増加はま た、隣接するヒンジ間の相互作用を安定化せしめるためにも用いられる。

本発明は、一方において結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）及び集成（ａｓｓｅ＋＋ ＋ｂｌｙ）・の改良された特異性、並びに他方において改良された安定性及び低 下した特異性の間の妥協操作を可能にすることが当業者に理解されよう。

好ましくは、本発明のＡＡＭは組換ＤＮＡ技法により製造される。従って、本発 明の第二の観点に従えば、本発明の第一の観点のＡＡＭの製造方法が提供され、 この方法は、（ａ）抗体分子のＣＨＩドメインと天然に関連するヒンジ領域中に 存在するそれとは異る数のシスティン残基を有するヒンジ領域を持つ抗体重鎮を コードするＤＮＡ配列を含むオペロンを発現ベクター中に生成せしめることを含 む。

このオペロンは、あるクラスの抗体からのＣＨｌ　ｅＭ域をコードするＤＮＡ配 列を異るクラスの抗体からのヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列に継ぐことによ って生成され得る。

あるいは、このオペロンは、あるクラスの抗体からのＣＨ１ドメイン及びヒンジ 領域をクローニングし、そして部位特定変異誘発によりシスティン残基をコード するＤＮＡ）リプレットの数を変えることによって、生成せしめることができる 。好ましくは、システィン残基の数を減少すべき場合には、システィンをコード する配列をアラニンをコードする配列に変異せしめる。システィンコード配列の 数を増加すべき場合、任意の適切に配置された非システィン残基を変更すること ができる。

好ましくは、本発明の第二の観点の方法は、（ｂ）前記ベクターによりセルライ ンをトランスフェクトし；そして （ｃ）ｔｉｔ−ランスフェクトされたセルラインを培養してＡＡＭを生産する； 段階を含む。

本発明の第二の観点の方法において、ベクターが重鎮抗体ポリペプチドのみをコ ードする場合、セルラインが相補的軽鎖を生産するように手当てする必要がある 。このことを達成するため、３つの代替可能な方策の１つを用いることができる 。

第一の方法においては、セルラインを相補的軽鎖由来ポリペプチドをコードする 第二のベクターによりトランスフェクトする。好ましくは、各ポリペプチド鎖が 同程度に発現されることを可能な限り保証するために、コード配列及び選択マー カーに関して以外、ベクターは同一である。

第二の方法においては、軽鎖由来ポリペプチド及び重鎮由来ポリペプチドの両者 をコードする配列をベクターが含有することができる。

第三の方法においては、相補的軽鎖を天然に分泌する宿主細胞を用いることによ りＡＡＭを製造することができる。

本発明はまた、本発明の方法において使用されるクローニングベクター及び発現 ベクター並びにトランスフェクトされたセルライン、本発明のＡＡＭを含有する 治療用及び診断用組成物、並びに療法及び診断におけるこれらの組成物の使用ベ クターを作製することができる一般的方法、トランスフェクト法、及び培養方法 はそれ自体よく知られており、そして本発明を構成するものではない。この様な 方法は例えば参照文献１１及び１２に示されている。

本発明はここに、単なる例示として、４つのヒトＩｇＧヒンジ領域の天然アミノ 酸配列を示す添付図面に言及しながら記載される。

本発明者らの前に引用した係属中の同時に出願された出願Ｎｏ、　（ＰＡ１４９ ）において、本発明者らはＢ７２．３　ＭＡｂに基礎を置くヒト化抗体分子の生 産を詳細に記載しており、そして特に全体抗体分子及びＦ（ａｂ’　）ｚ断片の 構成が示される。その出願は種々の発現ベクター及びヒト化８７２．３抗体（Ｂ ７２．３　）ＩＡＭ）の生産におけるその使用を記載している。この研究は、今 記載される研究の基礎を成すものである。

天然ヒ）ＩｇＧは４種類の可能なヒンジ領域の１つを有することができる。これ らのヒンジ領域のアミノ酸配列は添付図面に示される。既知のアミノ酸配列から 、これらの配列、又はシスティンの付加又は除去を伴うその変形体をコードする ようにオリゴヌクレオチドを設計し又は変異せしめることは当業者にとって容易 に可能である。

五−上 ＰＡ１４９出願の例３において、Ｂ７２．３可変領域並びにヒトＩｇＧ４　ＣＨ Ｉドメイン及びヒンジ領域を有する（Ｆａｂ’　）ｚ分子が記載されている。こ の８７２．３　）ＩＡＭのヒンジにおける選択的還元を助長しそして該ヒンジに おけるその後の化学的付加の複雑さを緩和するために、Ｂ７２．３　ＨＭＡ　ヒ ンジ領域中のシスティンの数（これは通常２である）を、第二ヒンジテステイン 残基をアラニン残基により置き換えることにより１個に減少せしめた。

該ヒンジ領域のアミノ酸配列の一部分及びその対応するＤＮＡコード配列を下に 示す。

ＣＣＣＣＣＡ　ＴＧＣＣＣＡ　ＴＣＡ　ＴＧＣＣＣＡＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　 Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｅ　Ｐｒ。

・タ　れた８７２．３キメ−Ｉ匹狙ジ戊二り一シスーインＩＧ４ヒンジ Ｉ　れたＦ（ａｂパ　云　（７）　”’ｌ　ｉｕ１戊ｐＪＡｉｏｓ　（本発明者 等の係属中の出願ＰＡ１４９に記載されている）中のＣＨＩドメインの末端に変 形されたヒンジを構成するため、ＣＨＩドメインの最後の５個のアミノ酸、ヒン ジ配列、２個のインフレーム終止コドン及びＥｃｏＲＩ部位を一緒になってコー ドする４種類のオリゴヌクレオチドを調製した。

新しいＣｙｓ−Ａｌａ変形ヒンジ配列を形成するために必要なオリゴヌクレオチ ドは次の配列： ５”ＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＴＧＧＧ３’ＧＴＴ ＣＴＣＴＣＡＡＣＴＣＡＧＧＴＴＴＡＴＡＣＣＣＧＧＧＧＧ５”ＣＣＣＣＣＧＴ ＧＣＣＣＡＴＣＡＧＣＣＣＣＡＴＧＡＴＧ３’　ＣＡＣＧＧＧＴＡＧＴＣＧＧＧ ＧＴＡＣＴＡＣＴＴＡＡを有する。センス鎖を形成するためにオリゴヌクレオチ ド１及び３が使用され、そしてアンチセンス鎖を形成するためにオリゴヌクレオ チド２及び４が使用された。

変形された遺伝子によりコードされた変形されたＣＨ１／ヒンジ領域連結部は次 のアミノ酸配列：Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ終止　終止を有するＣＨ１／ヒンジ領 域連結部はＶａｆｆ残基とＧｌｕ残基との間にある。

オリゴヌクレオチドを集成し、Ｍ１３＋ｎｐＨのポリリンカー中の５ａｌｌ及び ＥｃｏＲＩ間にクローン化し、配列決定し、再単離し、そしてｐＪＡ１０８から のＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ　１７００ｂｐ断片を含有する遺伝子に連結して変形され た（ヒンジのｃｙｓがａｌａへ）キメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮遺伝子 を作製した。

ベクター　゛　云　の 上記のようにして集成された変形されたキメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮 遺伝子断片を、次に、ｐＪＡ９６のＥｃｏＲＩベクター断片にりローニングして ｐＪＡ１１５を得た。

ＣＯＳ　での゛　−の− ＰＡ１４９出願に記載されているようにして遺伝子をＣＯ３細胞中で試験した。

非還元５ＯＳ−ＰＡＧＥにおいて、材料はＦ（ａｂ’　）材料のみとして生成さ れるようである。還元５ＤＳ−ＰＡＧＥは、変形されたＦ（ａｂ’　）遺伝子か ら予想されるそれと同等な端が切除された重鎮、及び軽鎖の存在を示した。

ＣＨＯ・のＳ′ｔセル−インの ＨＣＭＶプロモーターから発現される、ヒンジが変形されたＢ７２．３キメラＦ （ａｂ’　）重鎮遺伝子断片を含んで成る発現プラスミドｐＪＡ１１５を、ニレ クロトボレーションにより、ＰＡ１４９出願に記載されているＣＨＯセルライン ｃＬ１８に導入した。この方法は全長キメラ重鎖の導入について記載されている それと類似するが、但し５ａｌＩ消化を省略しそしてＤＮＡを閉環ＤＮＡとして 導入した。ミコフェノル酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）に対して耐 性でありそして機能的な変形されたＦ（ａｂ’　）抗体を発現するセルラインを 、すでに記載されている様にして抗原結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて培養上清 をスクリーニングすることにより同定した。０．１〜１０ｘ／ｄの変形されたＦ （ａｂ’　）を発現するセルラインを単離した。１つのセルライン１８ΔＦ９を 更なる研究のために用いた。

変形されたＦ（ａｂ’　）を発現するＣＨＯセルラインはまた遺伝子増幅を用い て単離された。それぞれ別々にＨＣＭＶプロモーターから発現されるキメラ軽鎖 及び変形されたＦ（ａｂ’　）重鎮遺伝子断片、並びに本発明者らの国際特許出 願ＮαＰＣＴ／ＧＢ８８１００６０２中に記載されているグルタミン・シンセタ ーゼ（ＣＳ）ミニ遺伝子、を含んで成るプラスミドベクターを、リン酸カルシウ ム沈澱法によりＣｌ０−Ｋｌ細胞に導入した。

本発明者等の国際特許出願Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＧＢ８８１００６０２に記載されて いるように２′０茹メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ　）を含有するＧＭＥＭ 培地中で形質導入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を選択した。

機能的な変形されたＦ（ａｂ’　）抗体を発現するセルラインを、本発明者等の 係属中の出願中に記載されているようにして抗原結合ＥＬＩＳＡ測定において培 養上清をスクリーニングすることにより同定した。　０．０５〜１　ｎ／１ｎｆ ｌの変形されたＦ（ａｂ’　）を発現するセルラインを得、そして３０〜５００ ０ｍのＭＳＸ濃度でプレートアウトすることにより、遺伝子増幅についてのスク リーニングにかけた。ＭＳＸを２００団で含有する培地中で増殖する増幅された セルラインは変形されたＦ（ａｂ’　）を１０〜２０ｔｒｇ　／　ｒｍのレベル に発現することが見出された。１つの増幅されたセルライン３１．２をさらなる 研究のために使用した。

・ノされたキメ−Ｆ（ａｂ’　）　の　１ヒンジ変形キノラＦ（ａｂ’　）をＣ ＨＯ細胞上清から標準法により精製した。変形されたキメラＦ（ａｂ’　）を含 有するＣＨＯ細胞培養土清を６０％硫酸アンモニウムに調整し、沈澱を適当な緩 衝液に再懸濁し、そしてＤＥＡＲ−セファロースカラムに通した＊　Ｆ（ａｂ’ 　）材料を含有する百分をプールし、そして透析した後、Ｓ−セファロースを通 した。　Ｆ（ａｂ’　）材料を含有する画分をプールし、そして次にＰＢＳに十 分に透析し、そして限外濾過により濃縮した。この方法により、Ｆ（ａｂ’　） ｚの収率は約４０％の最終精製物に増加する。

ヒンジ変形Ｆ（ａｂ’　）をＣＩＯ細胞上清から免疫精製を用いて精製した。ヒ ト・カッパー鎖配列に対して特異性を有する抗体ＮＨ３／４１を標準的方法によ り臭化シアン活性化セファロースに連結する゛ことにより免疫精製試薬を調製し た。この材料をカラムに充填しそしてＰＢＳにより平衡化した。変形されたキメ ラＰ（ａｂ’　）を含有するＣＨＯ細胞培養上清を該カラムに適用し、そしてカ ラムをＰＢＳにより洗浄した。次に、４．５Ｍ塩酸グアニジンを用いて変形され たキメラＦ（ａｂ’　）の溶出を行った０次に、変形されたキメラＦ（ａｂ’　 ）を含有する百分をＰＢＳに十分に透析し、そして限外濾過によりｆｉ縮した０ 反復精製において、材料の約１０％が更なる処理を伴わないで形成されるＦ（ａ ｂ’　）ｚとして存在し得る。

・ノ　れたキメ−Ｆ（ａｂ’　の加 全体抗体の酵素的消化により調製されたマウス８７２．３からのＦ（ａｂ’　） ｚ材料、及び前項に記載したようにして調製された変形されたキメラＦ（ａｂ’ 　）材料を、ホモニ官能架橋剤１．６−ピスマレイミドヘキサン（シグマ）を用 いてチオエーテル結合を介して半一システィン残基を連結することにより、化学 的に架橋した。２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する０、１５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８， ０）中１〜５■／Ｉｄの８７２．３　Ｆ（ａｂ’　）！又は変形されたキメラＦ （ａｂ’　）を、最終濃度５ｍｎへの２−メルカプトエチルアミンの添加により 還元し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。還元の後、０．１Ｍク エン酸／　０．２　Ｍ　Ｎａ＊ＰＯａ（ｐＨ６，０）　／　２　ｍＭ　ＥＤＴＡ により平衡化されたセファデックスＧ２５カラム上でサンプルを脱塩した。架橋 剤をジメチルホルムアミド中に７２ｍＭの最終濃度に溶解し、そして新たに還元 されたＦ（ａｂ’　）ＳＨに１．９ｏ＋Ｍ（チオールに対して約２２倍過剰）の レベルで添加し、そして常に混合しながら９０分間インキュベートした。Ｎ−エ チルマレイミドを９ｍＭの最終濃度に加え、そしてさらに３０分間インキュベー トした後、０．１Ｍクエン酸／　０．２　Ｍ　ＮａｚＳＯａ（ｐＨ６，０）　／ 　２＋＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ　ニ脱塩した。

マレイミド化されたＦ（ａｌｈ”）　（（Ｆａｂ’　）　（ＭＭＣ）　）をＦ（ ａｂ’　）ＳＲの新鮮なバッチに１．１：１．０のモル比ですぐに加え、そして 室温にて一定混合しながら２０時間インキュベートした。

架橋反応の組成を一夜のインキュベーションの後ＨＰＬＣゲル濾過により決定し た。１０Ｉの反応混合物を１０４の２００ａ＋Ｍ２−メルカプトエチルアミンに 加え、そして１５分間インキュベートした。２０Ｊ１１の８００ｍＭヨードアセ タミドをさらに添加し、そして１５分間インキュベートした０次に、還元されそ してアルキル化されたサンプルをＨＰＬＣＧＦ　２５０により分析し、クロマト グラムの組成の％を積分により決定した。

Ｆ（ａｂ’　）ｚの位置で溶出する材料を化学的に架橋されたＦ（ａｂ’　）。

と推定した。溶出時間は、種々の標準の予想されるＦ（ａｂ’　）を保持時間と よく一致した。架橋の％はマウスＦ（ａｂ’　）材料（ヒンジ中３個のシスティ ン）についてよりもキメラＦ（ａｂ’　）材料（ヒンジ中に１個のシスティン） について高く、そしてより少ない凝集物を含有していた。従ってこの方法による ヒンジの複雑さの減少がより効果的な架橋及び卓越した生成物をもたらすであろ う。

朶り一亀 キメ−８７２，３１Ｇ４　Ｆ（ａｂ’　）ｚ　（Ｉ　ＧｌヒンジＦ（ａｂ’　Ｓ ”’　−の　制 ヒンジ変形遺伝子を作製するため、Ｂ７２．３　ＶＨ／ＩｇＧ４遺伝子を含有す るキ・メラＦ（ａｂ）　領域をＪＡ１０８（本発明者らの係属中の特許出願ＰＡ １４９に記載されている）からの０．７　ｋｂｐ断片として次の様にして単離し た。すなわち、ＤＮＡを５ａｉｌで処理し、ウシ腸ホスファターゼＣＣＩＰ）に より５ａｌｌ部位から５′リン酸を除去し、ＤＮＡをＥｃｏＲＩにより再切断し た。

ＩｇＧ１ヒンジをコードするように適切なオリゴヌクレオチドを調製することに よりＩｇＧ１ヒンジを集成した１　５００ｐｍの玉鎖及び下鏡オリゴヌクレオチ ドをキナーゼ標識し、そしてキナよりアニールせしめた。ヒンジ断片を前記の様 にして調製したＪＡｌｏＢからの０．７　ｋｂｐ断片に連結し、そしてＣＩＰ処 理された５′末端をキナーゼ処理した。

ベク　−　゛　云　の 前記のようにして集成されたキメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮遺伝子断片 を、次に、ＪＡ９６のＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理されたベクターにクローニングし てＴＲ０ＯＩを得た。有用な軽鎖、例えばキメラ又はヒト８７２．３を生産する ことができる発現ベクターを伴う適当な細胞中でのＴＲ０ＯＩの発現が、集成し てＦ（ａｂ’　）をもたらしそして生体内又は生体外での適当な翻訳後変形の後 にＦ（ａｂ”）ｚをもたらすであろう材料を生成せしめる。

脂Ｌ−１ キ　−８７２．３１　Ｇ４　Ｆ　ａｂ’　Ｉ　Ｇ２ヒンジＦ（ａｂ’　−Ｓ”゛ 　云　の　リ ヒンジ変形遺伝子を作製するため、Ｂ７２．３Ｖ）ｌ／１ｇＧ４を含有するキメ ラＦ　（ａｂ）領域を例２に記載したようにして単離した。

５００ｐｍの玉鎖及び下鏡オリゴヌクレオチドをキナーゼ標識し、そして該オリ ゴヌクレオチドをキナーゼ緩衝液中で７０°Ｃに加熱しそして室温に冷却するこ とによりアニーリングして、ＩｇＧ２ヒンジを集成した。このヒンジ断片を上記 の様にして調製したＪＡ１０８からの０．７　ｋｂｐ断片に連結し、そしてＣＩ Ｐで処理された５′末端をキナーゼ処理した。

ベク　−　゛　云　の 上記のようにして集成されたキメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮遺伝子断片 を、次に、ＪＡ９６のＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理されたベクター中にクローニング してＴＲ０Ｏ３を得た。有用な軽鎖、例えばキメラ又はヒト化Ｂ７２．３　、を 生産することができる発現ベクターを伴う適当な細胞中でのＴＲ０Ｏ３の発現が 、集成してＦ（ａｂ’　）をもたらしそして生体内又は生体外での適当な翻訳後 変形の後にＦ（ａｂ’　）ｚをもたらすであろう材料を生成せしめる。

■−土 タ　れた８７２．３キメ−Ｉ　Ｇ４　Ｆ（ａｂ’　）　（Ｉ　Ｇ３ヒンジ・Ｉれ たＦ（ａｂ’　言゛パ云の　１ １ｇＧ３ヒンジは、次の式： ％式％） （式中、ｎは通常は３である） の反復配列をコードする再二重化された（ｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ）チェクソ ン構造として通常見出される。この形のヒンジは、ＣＨＩドメインへの下記のオ リゴヌクレオチドの正しい連結により誘導することができる。

１、５’ＴＣＧ＾ＣＡＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＣ２、 ３’ＧＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＣＧＡＧＴＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＡＣＣ３、５’Ｔ ＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＧＧＴＧ４、　３ ’ＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＧＴＧＴＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＧＴ５、５’ ＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧ ＣＣＣＡＣＧＧＴＧ６、３’ＣＴＣＧＧＧＴＴＴＡＧＡＡＣＡＣＴＧＴＧＴＧＧ ＡＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＧＧＴ７、　５’ＣＣＣＡＴＧＡＴ Ｇ ８、　３’ＡＣＴＡＣＴＴＡＡ オリゴヌクレオチドのモル比の適切な操作により、ｎを０から上に変化せしめて 、変化し得るがしかし予測可能な長さ及び配列のヒンジを形成することができる 。

１ｇＧ３ヒンジを作製するため、前の例におけるようにして、キナゼ標識し、そ してアニールすることによりオリゴヌクレオチドを集成し、そして関連するオリ ゴヌクレオチドを連結することにより正しく設計された生成物を生成せしめるこ とができる。中央オリゴヌクレオチド対のコンカタマー（ｃｏｎｃａ−ｔａ＋＋ ＋ｅｒ）の生成の可能性のため、連結生成物をｐＳＰ６４のＥｃｏＲ１部位及び ５ａｌｌ部位にクローン化した。ミニプレツブＤＡＮを調製し、そしてＥｃｏＲ Ｉで切断し、ＥｃｏＲＩ末端をＫｌｅｎｏ−ポリメラーゼを用いて”Ｐ　ｄＡＴ Ｐにより満たすことにより３′−標識し、ＤＮＡを５ａｌｌにより再切断し、そ してクローン化された挿入部の長さをポリアクリルアミドゲル上で試験した＊　 １ｇＧ３ヒンジをコードするために必要な長さの挿入部を含有するクローンを同 定し、クローンを増殖せしめ、そしてヒンジ挿入部を分取規模で単離した。ヒン ジ断片を、上記のようにしてＪＡ１０８から調製した０、　７　ｋｂｐ断片に連 結し、そしてＣＩＰ処理した５′−末端をキナーゼ処理して次の再クローニング が可能なようにした。

ベク　−　′　−の 次に、前記のようにして集成されたキメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮遺伝 子断片をＪＡ９６のＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理されたベクター断片にクローン化し てＴＲ０Ｏ７を得た。有用な軽鎖、例えばキメラ又はヒト化Ｂ７２．３　、を生 産することができる発現ベクターを伴う適当な細胞でのＴＲ０Ｏ７の発現が、集 成してＦ（ａｂ’　）をもたらしそして生体内又は生体外での適当な翻訳後変形 の後にＦ（ａｂ’　）ｚをもたらすであろう材料を生成する。

一ノされたＢ７２．３キメラＩ　Ｇ４　Ｆ（ａｂ’　）２　（Ｉ　Ｇ３２Ｃｓ　 ヒン乏Ｌ Ｆ　（ａｂ　’　業゛パ云の　１ 関連するオリゴヌクレオチドを上記のようにキナーゼ標識しそしてアニールしそ して連結して正しい長さの生成物を生成せしめることにより１ｇＧ３　（２ｃｙ ｓ）ヒンジ長さ変異体を、集成した。連結された生成物をｐＳＰ６４のＥｃｏＲ Ｉ部位及び５ａｌｌ部位にクローン化した。ミニプレツブＤＮＡを調製し、そし てＥｃｏＲＩにより切断し、Ｋｌｅｎｏ−ポリメラーゼを用いて”Ｐ　ｄＡＴＰ によりＥｃｏＲＩ末端を満たし、ＤＮＡを５ａｌｌにより再切断し、そしてクロ ーン化された挿入部の長さをポリアクリルアミドゲル上で試験した。１ｇＧ３　 （２ｃｙｓ）ヒンジをコードするのに必要なサイズの挿入部を含むクローンを同 定し、このクローンを増殖せしめ、そしてヒンジ挿入部を分取規模で単離した。

このヒンジ断片をＪＡｌｏＢからの０．７　ｋｂｐ断片に連結しそしてＣＩＰ処 理された５′−末端をキナーゼ処理して次の再クローニングを可能にした。

ベタ　−　云　の 前記のようにして集成したキメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮遺伝子断片を 、次に、ＪＡ９６のＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理したベクター断片にクローニングし てＴＲ０Ｏ４を得た。有用な軽鎖例えばキメラ又はヒト化Ｂ７２．３　、を生産 することができる発現ベクターを伴う適当な細胞中でのＴＲ０Ｏ４の発現が、集 成してＦ（ａｂ’　）をもたらしそして生体内又は生体外での適当な翻訳後変形 の後にＦ（ａｂ’　）ｚをもたらすであろう材料を生成する。

■一旦 タ　れた８７２．３キメ−Ｉ　Ｇ４　Ｆ（ａｂ’　）ｚ　（Ｉ　Ｇ３５ｃ　ｓヒ ンジＹ Ｆ（ａｂ’　）ｓ゛°゛云のり 前記のようにして、関連するオリゴヌクレオチドをキナーゼ標識し、アニールし そして連結することにより１ｇＧ３　（５ｃｙｓ）ヒンジ長さ変形体を集成した 。中央オリゴヌクレオチド対のコンカタマーを生成する可能性のため、連結生成 物をｐｓＰ６４のＥｃｏＲＩ部位及び５ａｉｌ部位にクローン化した。ミニプレ ツブＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼを用いて ”Ｐ　ｄＡＴＰによりＥｃｏＲＩ末端を満たするとにより３′−標識し、ＤＮＡ を５ａｌＩにより再切断し、そしてクローン化された挿入部の長さをポリアクリ ルアミドゲル上で試験した。

１ｇＧ３　（５ｃｙｓ）ヒンジ長さ変形体をコードするのに必要なサイズの挿入 部を含有するクローンを同定し、このクローンを増殖せしめ、そしてヒンジ挿入 部を分取用規模で単離した。

連結された生成物をｐｓＰ６４のＥｃｏＲＩ部位及び５ａｉｌ部位にクローン化 した。ヒンジ断片を、前記のようにして調製したＪＡ１０８からの０．７　ｋｂ ｐ断片に連結し、そしてＣＩＰ処理された末端をキナーゼ処理して次の再クロー ニングを可能にした。

ベタ　−　゛　−の 上記のようにして集成されたキメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮遺伝子断片 を、次に、ＪＡ９６のＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理されたベクターにクローン化した 。有用な軽鎖、例えばキメラ又はヒト化Ｂ７２．３、を生産することができる発 現ベクターを伴う適当な細胞中でのＴＲ０Ｏ５の発現が、集成してＦ（ａｂ’　 ）をもたらしそして生体内又は生体外での翻訳後変形の後にＦ（ａｂ’　）をも たらすであろう材料を生成する。

［ Ｊ　れたＢ７３．２キメ−Ｉ　Ｇ４　Ｆ（ａｂ’　Ｌ（Ｉ　Ｇ３８ｃ　ｓヒンジ ）Ｆ（ａｂ’　）　ｆ”云の１ 関連するオリゴヌクレオチドを前記の様にしてキナーゼ標識し、アニールしそし て連結して正しい長さの生成物を生成せしめることにより１ｇＧ３　（８ｃｙｓ ）ヒンジ長さ変形体を集成した。中央オリゴヌクレオチド対のコンカタマーの生 成の可能性のため、連結生成物をｐｓＰ６４のＥｃｏＲＩ部位及び５ａｉｌ部位 にクローニングした。ミニブレツブＤＮＡを調製し、そしてＥｃｏＲＩで切断し 、Ｋｌｅｎｏｈポリメラーゼを用いて”Ｐ　ｄＡＴＰによりＥｃｏＲＩ末端を満 たすことにより３′−標識し、ＤＮＡを５ａｉｌで再切断し、そしてクローン化 された挿入部の長さをポリアクリルアミドゲル上で試験した。１ｇＧ３　（８ｃ ｙｓ）ヒンジ長さ変形体をコードするのに必要なサイズの挿入部を含有するクロ ーンを同定し、このクローンを増殖せしめ、そしてヒンジ挿入部を分取規模で単 離した。連結された生成物をｐｓＰ６４のＥｃｏＲ１部位及び５ａｉｌ部位にク ローン化した。ヒンジ断片を前記のようにして調製したＪＡ１０８からの０．７ ｋｂｐ断片に連結し、そしてＣＩＰ処理された末端をキナーゼ処理して、次の再 クローニングを可能にした。

ベタ　−　の゛　云　の 上記の様にして集成されたキメラＢ７２．３　Ｆ（ａｂ’　）重鎮遺伝子を、次 に、ＪＡ９０６のＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ処理ベクター断片にクローン化することに よりＴＲ０Ｏ９を得た。有用な軽鎖、例えばキメラ又はヒト化Ｂ７２．３　、を 生産することができる発現ベクターを伴う適当な細胞中でのＴＲ０Ｏ６の発現が 、集成してＦ（ａｂ’　）をもたらしそして生体内又は生体外での翻訳後変形の 後にＦ（ａｂ’　）ｚをもたらすであろう材料を生成する。

本発明が上に単に例示により記載されたこと、並びに詳細な事項の変更を本発明 の範囲を逸脱することなく行うことができることが予想されよう。

皇−考一文一献 １、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、　％伺、４９５−４ ９７．　１９７５゜２、Ｅｈｒｌｉｃｈ、　ｐ、ｔ　Ｃｏ１１ｅｃｔｅｄ　５ｔ ｕｄｉｅｓ　ｏｎ　１ｍｍｕｎｉｔｙ＋　２＋Ｊｏｈｎ　ＷｉＬｅｙ　＆　５ｏ ｎｓ＋　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　１９０６゜３、Ｌｅｖｙ　＆　Ｍｉｌｌｅｒ＋　 Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、、　３４．１０７−１１６＋　１９８３゜４、　 ５ｃｈｌｏｎ＋　＆　Ｗｅｅｋｓ、Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉ ｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ。

１７０−１９２＋　Ｗｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９８ ５゜５、Ｃｏ１ｃｈｅｒ等、、　ＰＮＡＳ、　７８．３１９９−３２０３．１９ ８１　。

６、Ｊｏｈｎｓｏｎ等＋ｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　４６．８５０−８９７ ．１９８６　。

７、Ｓｔｒａｍｉｇｎｏｎｉ等、、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　３１． ５４３．５５２．１９８３゜８、Ｎｕｔｉ等、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ 、２９．５３９−５４５．１９８２　。

９、Ｔｈｏｒ等、　Ｊ、　Ｎａｔ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　７６、９９ ５−１００６．１９８６゜１０、　Ｔｈｏｒ等、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　 ４６．３１１８−３１２４．１９８６゜１１、　Ｍａｎｉａｔｉｓ等、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ＋　１９８２゜１２、　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ及びＯｌｄ、　Ｐｒ１ｎｃ ｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ＧｅｎｅＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、 ０ｘｆｏｒｄ＋　１９８０　。

手続補正書（方式） 平成２年１月１２日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８８１００７３０ ２、発明の名称 組換ＤＮＡ産物及び方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　セルチク　リミティド ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話５０４ −０７２１５、補正命令の日付 ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「発明の名称」及び「特 許出願人の代表者」の欄（２）委任状 （３）明細書の「発明の名称」の欄 （４）明細書の翻訳文 （５）請求の範囲の翻訳文 ７、補正の内容 （１）（２）　別紙の通り （３）発明の名称をｒ組換ＤＮＡ産物及び方法ｊに補正する。

（４）明細書の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（５）請求の範囲の翻訳文の浄 書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５ 第１項の規定による書面　１通 （２）委任状及びその翻訳文　各１通 （３）明細書の翻訳文　１通 （４）請求の範囲の翻訳文　１通 国際調査報告 国際調査報告

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．抗体分子のＣＨ１ドメインと通常関連するヒンジ領域中に存在するそれと異 る数のシステイン残基を有するヒンジ領域を有する変更されたモノクローナル抗 体（ＡＡＭ）。
2. ２．組換ＤＮＡ技法により製造される請求項１に記載のＡＡＭ。
3. ３．完全な抗体分子又はＦ（ａｂ′）２断片である、請求項１又は２に記載のＡ ＡＭ。
4. ４．二元特異的である請求項３に記載のＡＡＭ。
5. ５．それに結合したエフェクター又はレポーター分子を有する請求項１〜４のい ずれか１項に記載のＡＡＭ。
6. ６．ヒンジ領域がＣＨ１ドメインのそれとは異るクラス又はサプクラスの抗体に 由来する完全なヒンジ領域を含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の ＡＡＭ。
7. ７．天然ヒンジ領域がシステイン残基の数の増加又は減少により変更されている 、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＭ。
8. ８．請求項２又はそれに従属する請求項に記載のＡＡＭの製造方法であづて、 （ａ）抗体分子のＣＨ１ドメインと通常関連するヒンジ領域中に存在するそれと は異る数のシステイン残基を有するヒンジ領域を有する抗体重鎖をコードするＤ ＮＡ配列を含有するオベロンを発現ベクター中に生成せしめる：ことを含んで成 る方法。
9. ９．ヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列が部位特異的変異誘発により変えられて いる、請求項８に記載の方法。
10. １０．ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列の領域がオリゴヌ クレオチドから作製されたものである、請求項８に記載の方法。
11. １１．（ｂ）前記ベクターによりセルラインをトランスフェクトし；そして（ｃ ）該トランスフェクトされたセルラインを培養してＡＡＭを生産せしめる； 段階をさらに含んで成る、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. １２．前記セルラインがさらに、相補的軽鎖由来のポリペプチドをコードするＤ ＮＡ配列を有するオペ．ロンを含有する第二のベクターによりトランスフェクト されている、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記ベクターがさらに相補的軽鎖由来のポリペプチドをコードするＤＮＡ 配列をさらに含有する、請求項１１に記載の方法。