JPH02501352A - 親水性隔膜と疎水性隔膜とで形成した区画室を備える細胞成長リアクタ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 親水性隔膜と疎水性隔膜とて形成した区画室を備える細胞成長リアクタ 本発明は細胞に生成物を生じさせる。特に、バイブリド−マスにモノクローン抗 体を生じさせるのに使用てきるバイオリアクタに関する。バイオリアクタ・シス テムというのは、多くの場合、生体の器官に似ている。それは中で細胞が生き、 繁殖し、産出できる容器と、水と栄養物を供給し、また、細胞からの廃棄物を除 去する循環系と、酸素を与え、二酸化炭素を取り出す呼吸系と、システムから細 胞生成物および老廃物を取り出す手段とを有する。システム全体の首尾は各構成 要素をいかにうまく設計するかということばかりでなく、細胞生成物の産生にと って有効な条件を維持するようにこれらの構成要素かいかにうまく互いに作用し 、調和するかによつても左右される。

背景技術 生物医学的テクノロジーの進歩が哺乳類の細胞生成物についての需要を惹起した 。これら細胞生を物についての診断、予防、治療上の応用は膨大な数にのぼり、 可能性か広かり続けるにつれて将来の新しい市場を期待させている。哺乳類細胞 生成物についての爆発的な需要が大量細胞培養技術やバイオリアクタにつぃての 研究に拍車をかけている。

現在のところ、哺乳類細胞培養の領域て使用するための現存の装置を適応させる ことによっていくつかの種類のバイオリアクタか開発され、使用され、市販され ている。このように開発された最も普及している２種類の技術としては、バクテ リア発酵器（ハツチ培養）の技術と、固定細胞培養のための中空繊維透析装置に ついての技術がある。

バッチ作業における大量発酵には、細胞生成物、特に細胞の新陳代謝あるいは成 る種の細胞生成物の産生を抑止する有毒物質素の他の物質の除去に困難かあるた めに制限がある。加えて、大量発酵の条件は、一般に、細胞の酸素需要に応える べく空気または酸素の散布器に基づくものてあり、これはりアクタ内に過剰に乱 れた条件を与える。大型の発酵タンクの殺菌は難しく、汚染が発生したときには かなりの労力および生産時間を無駄にし、そのバッチ分を廃棄する場合には高価 な物質はかなり大きなものとなる。

種々考慮した上て、固定化細胞バイオリアクタが好ましいということになった。

特に、固定化バイブリド−マス細胞は生成物の収穫に関連した変動なしにバイオ リアクタ内で実質的に無期限に生成物を産生ずることかてきる。しかしながら、 培養されている細胞への適切な酸素供給や二酸化炭素の取り出しか効率の良い、 経済的な設計を開発する際の制限要因となりていた。

従来のたいていの固定化細胞バイオリアクタ設計ては、栄養媒質に溶解させた形 で酸素を供給し、同じ媒質に溶解させて二酸化炭素を取り出す、酸素の放出が急 速なので、細胞のニーズに合わせて大量の栄養媒質をバイオリアクタを通して循 環させなければならない、酸素消費量に基礎を置く流量は普通は老廃物除去に合 わせである。この種のスケールアップされた生産用バイオリアクタにとって必要 な大量の循環栄養媒質には大型のポンプが必要てあり、これは高価であるし、バ イオリアクタ・ユニットのサイズをかなり大型のものとする。栄養媒質の流量か 大きいということは、流体の圧力もシステム内の乱れも大きくし、それによって 与えられる物理的なストレス、特に、高い剪断状態による生産用細胞と比較的高 価な栄養成分の両方をかなり失うというリスクを同時に惹起することになる。

隔膜式細胞バイオリアクタの開発ては種々の方法か使用されてきた。たとえば、 米国特許第３，９９７゜３９６号、同第４．０８７，３２７号、同第４゜２０１ ．８４５号ならびに同第４，５３７，８６０号に示される種々の方法を参照され たい。

３．９９７，３９６では、アタッチメント依存形の細胞が中空繊維隔膜の外面に 取り付けられ、繊維の内部を流れる空気その他の酸素搬送物から酸素供給を受け ている。この方法ては、細胞の数か利用する隔膜面上の単層に限られ、細胞密度 を低レベルに制限している。加えて、純粋酸素の場合には、たいていの細胞は高 酸素圧力を生き延びる能力で制限を受ける。もし与えられる気体圧力が高すぎる 場合には、気泡が生じる可能性かあり、これらの気泡は細胞あるいはそれらのア タッチメントを損なうおそれかある。一方、細胞を表面に取り付ける必要あるた め、隔膜が親木性でなければならず、そうすると、栄養物で湿潤されやすく、物 質か気孔に侵入したり、そこを通過すらし、目詰まりや流れの乱れを生しやすく なる。これらの現象を制限するべく気体圧力を高めざるを得す、そうすると。

必然的に細胞に損傷を与えることになる。

４．０８７，３２７には別の方法か教示されている。この特許ては、中空繊維隔 膜あるいは中実繊維の外面をアタッチメント依存形細胞のためのアタッチメント として用いているか、中空繊維を用いる場合にはＭｉｔｔの内部は用いられない ように思える。酸素は、明らかに、栄養物に溶解した細胞に搬送される。栄養物 は細胞室を横切ってポンプで圧力を加えられるのて。

細胞には望ましくない圧力や乱れた流れ状態を受け、これが細胞に損傷を与える 可能性がある。

米国特許第４，２０１，８４５号は４，０８７゜３２７の部分継ａ　（ｓ　ｕ　 ｐ　ｒ　ａ　）である、この方法では、中空！＆雄隔膜の内部が細胞反応域また はりアクタ域に酸素を移送するのに用いられている。ここても、栄養物は細胞室 を通して横方向に圧送され、同し問題な８起する。この教示に伴なう困難性は３ ，９９７゜３９６に関して上述したと同しである。

米国特許第４，５３７，８６０号は、細胞を納め。

細胞室を通して栄養物を圧送する（すべで貫通流作業に伴なう困難性を持っ）ポ リマーあるいはセラミック材料て作った多孔性シリンダと、気体を細胞室に搬送 し、細胞室内へ散布するための半透性シリコーンゴム製チューブとからなる環状 構造を使用する細胞リアクタを教示している。細胞の酸素供給チューブからの距 離は１〜２ｃｍもの大きさとなり、これは、シリコーンゴム製チューブの性質と 相まって、酸素供給チューブか反応域またはリアクタ城に気体相を通して細胞室 へ酸素を適切に供給するような圧力の下に酸素を送られなければならないという 要件を招き、それに伴なって流れの乱れ、高内部圧力、細胞の損傷を招く、この 「散布器」方法は細胞の生産性を確保し、かつ、容器のかなりの部分ての生活力 さえ確保するための酸素の取り込みを不適切なものとする。

発明の開示 本発明のバイオリアクタ・コアては、細胞は細胞室を形成する２つの隔膜の間に 閉じ込められる。これらの隔膜の少なくとも一方は微孔性でありかつ親木性てあ り、すべての栄養物と共にモノクローン抗体その他の細胞生成物を自由に通過さ せるようになっている。

栄養媒質は溶解した気体を運ばず、溜めに戻った栄養媒質は別体の外部気体交換 器に通すことなくそのままバイオリアクタに戻される。栄養媒質はシステムに絶 えず加えられており、生成物および老廃物も同じ率で絶えず引き出される。

本発明はいくつかの実施例を包含し、これらの実施例は固定化細胞バイオリアク タに別体の気体交換区画室を組み込み、バイオリアクタ・コアの外に気体交換器 を設ける必要をなくしたことによりて酸素供給および二酸化炭素素の他の老廃物 の気体の除去に伴なう問題を解決している。これらの実施例の設計の背後にある 主要概念は、酸素を栄養媒質に溶解させずに、むしろ、空気その他の気体混合物 として酸素をバイオリアクタに通すということにある。酸素は細胞スペースに直 接拡散する。栄養媒質に溶解させるのに比べて空気（その他の適当な気体混合物 ）内の酸素濃度か比較的高く、そして、液体に比べて気体の粘性が低いというこ とによって、細胞へ豊富な酸素を供給するのに低い流速、低い圧力ての空気の供 給が可能となる。同様にして、栄養媒質に溶解した場合よりも過剰な二酸化炭素 を迅速に除去することができる。こうして、栄養媒質はかなりゆっくりと循環さ せることができ、バイオリアクタをより小型に、そして、より効率の良い、経済 的なものにすることがてきる。

最も単純な実施例では、層状隔膜式バイオリアクタにおいて２つの細胞室の間に 親木性、微孔性隔膜境界式空気室を介在させている。細胞は循環する栄養媒質か ら細胞を隔離する微孔性親水性隔膜と、適当な気体の流れから細胞を隔離する別 の超微孔性隔膜（これは疎水性である）との間に置かれる。約５％の二酸化炭素 と空気の混合物がたいていの哺乳類細胞ラインにとって望ましいように思える。

適切な疎水性隔膜としてはポリスルフォン、デフロン、ボリフ゛口ビレンて作っ たものか市販されている。

別の実施例（最も単純な実施例の変形例）ては、スペーサ・スクリーンかアタッ チメント依存式細胞のための粒子支持物質と組合わせられるか、あるいは、それ の代りに用いられている。

これらの実施例は、いずれも、扁平な隔膜の積重体にも、螺旋捲回式隔膜２オー マツトにも組み込むことか゛できる。螺旋体は端部捲回フォーマット、中央捲回 フォーマットのいずれても形成できる。いずれの形態も、構造が簡単、簡潔とな り、細胞や隔膜に加わるストレスを低くし、材料コスト、製造コストを低くする という利点を持つ。いずれの形態ても、リアクタ構成要素はすべて予め包装して おいて利便性や易使用性を向上させることがてきる。

本発明のバイオリアクタはパイプリド−マスまたは哺乳類細胞の栄養的ニーズ、 物質的ニーズを満たし。

生成物の収穫を考慮し、個別の機能を１つの機能ユニットに統合したいくつかの 個別の装置を組合わせることによってシステムの殺菌保全性を維持する。

バイオリアクタの供給源はすべての細胞の栄養的ニーズを満たすと共に、ブリー ド・システムすなわち取り出しシステムは培養に適した望ましい速度で破棄物、 生成物を取り出す。循環からブリートされた栄養媒質は種々の段階を経て抗体生 成物を純化する。本発明のバイオリアクタの細胞は固定しており、したかって、 栄養媒質と一緒に取り出されることがないのて、細胞の成長速度に応じて栄養媒 質の取り出しを制限する必要はない。したかりて、生成物の回収で生産が中断す ることはない。

本発明のバイオリアクタには作業の経済性か考慮されている。この考慮の中心と なるものは、層状の隔膜設計によって達成される高細胞密度にょつて可能となっ た細胞容器のコンパクトなサイズであり、また、バイオリアクタ内の栄養ｔＩＸ 質体積を最小限に抑える連続的なフィート・ブリート栄養媒質システムである６ 単位体積あたりの生成物産生高を最大とすることによってバイオリアクタを収容 するのに必要なスペースを最小にすることがてきる。

栄養ｆｉ質の連続供給システムはほんの少しの殺菌液を扱えばよいことを意味す る。同様にして、生成物の連続的な取り出しと濃縮か体積を小さく保つことがて きる、このことかコストと汚染の可能性を最小限に保ち、易作業性を最大にする 。栄養媒質流の無菌ブレイクか殺菌を維持し、汚染を防ぐ。

培養中の細胞ラインに応じて、栄養媒質に高価な成分を含宥させてもよい、これ らの成分は、本発明のバイオリアクタにおいては、適当な分離、純化技術を使用 して、たとえば、ブリート・システムに超濾過モジュールを設けるなどして保護 され、再循環させられ得る。このモジュールは収穫前に栄養媒質内の生成物を濃 縮するのにも使用できる。細胞は、微孔性隔膜によって細胞室内に保持されてい るのて、生成物の収集と干渉することはない。

インライン栄養媒質加熱を行えば、密閉環境室の必要性がなくなるか、あるいは 、少なくとも、メインテナンス要件やコストを低くしながら環境室についての要 求を減らすことができる。

労力は特にバイオリアクタかひとたび機能したならば非常に少なくて済み、設備 コストも大量発酵バッチ装置に比べて非常に低くなる。これらはすべて経済的な バイオリアクタ設計の特徴となる。

本発明のバイオリアクタはあらゆるあ種類の生成物を産生ずるあらゆる種類の細 胞を支持する非常に融通性のある設計である。アタッチメント独立型、アタッチ メント依存型の両方の細胞ラインか層状隔膜設計、特に、バイブリド−マスに適 している。栄養物、生成物、細胞老廃物（蛋白質、脂質、糖質、塩類、有機、無 機成分を含む）を含む、このようなリアクタて用いられるすべての物質ならびに 単純生成物、複雑な生成物（特にモノクローン抗体）はこのバイオリアクタ設計 にすべて適合てきる。

生成物の滞留時間は可変であり、特定の細胞ラインのニーズに合わせて調節する ことがてきる。有毒生成物、抑制生成物、不安定生成物は迅速に除去され得る。

安定した非干渉性の生成物は成る時間システム内に留まり、取出前に濃縮され得 る。

各バイオリアクタのモジュール式構造や１つの栄養媒質調製センタて多くのバイ オリアクタへの供給を行う能力により１本発明のバイオリアクタはいかなる設備 の生産ニーズにも合わせることがてきる。

本バイオリアクタは全体的にコンパクトである。

多くのバイオリアクタ設計か独特の利点を持っているが、本発明のバイオリアク タはあらゆるバイブリド−マスまたは哺乳類の細胞培養にとって有利な設計特徴 を単一の統合したバイオリアクタ・ユニットに統合する。このユニットは経済的 に作動し、あらゆる細胞ライン、生成物仕様にも容易に合わせることかでき、生 産性を最高にすることができる。

区画窒化した気体交換室を備えた本発明の実施例の単一ユニットを利用した初期 の実験では、栄養媒質を通して酸素供給を受けた同じ細胞で得られる七ツクロー ン抗体産生率の３倍にモノクローン抗体産生率が高まった。これにより１区画窒 化した気体型式バイオリアクタの実施例が媒質溶解式気体バイオリアクタの実施 例よりも効率が高く、細胞に最大限の酸素を与えると共に細胞との二酸化炭素交 換を最大限に行えるということか確認された。酸素の供給および区画窒化気体交 換室を通しての余分な二酸化炭素の除去により。

栄養媒質循環量を減らし、利用可能な酸素量を増大させ、バイオリアクタにおけ る細胞生成物の生産を経済的に行うという意味のある利点を与えることかできる 。

図面の簡単な説明 第１図は本発明のバイオリアクタ・システムを示すフローダイアグラムであり、 種々の構成要素の形態、動作を示す図である。

第２図は栄養媒質循環システムで用いられる無菌ブレイクを示す横断面図である 。

第３図は本発明の一実施例のためのバイオリアクタ・コアの隔膜・スペーサ・室 装置を示す展開概略図である。

第４図はバイオリアクタ・コアの隔膜・室装置の別の実施例を示す展開概略図て あり、細胞室内の中実繊維スペーサ・スクリーンの代りに中空繊維スペーサ・ス クリーンを用いていることを示す図である。

第５図はバイオリアクタ・コアの隔膜・室装置の別の実施例を示す横断面図であ り、細胞室内の中実繊維スペーサ・スクリーンに粒状支持物質を加えた状態を示 す図である。

第６図はバイオリアクタ・コアの一部として気体交換用直接供給式中空繊維を有 するバイオリアクタ・コアの隔膜・室装置の別の実施例を示す胴視図である。

第７図は角隅に細胞室ぼおとを有するバイオリアクタ用の＠層成バイオリアクタ ・コアの斜視図である。

第８図は角隅に細胞室ボートを有するバイオリアクタ用の積層式バイオリアクタ ・コアの頂面図である。

第９図は気体交換室を備えた螺旋捲回式バイオリアクタの横断面図てあり、端部 捲回構造を示すが簡略化のために各室のスペーサ・スクリーンは省略した図であ る。第９ａ図は螺旋体の各層の隔膜、スペーサの独特の配置を詳細に示す図であ る。

第１０図は気体交換室を備えた螺旋捲回式バイオリアクタの横断面図てあり、中 央捲回構造を示すが簡略化のために各室のスペーサ・スクリーンは省略した図で ある。第１０ａ図は螺旋体の各層の隔膜、スペーサの独特の配置を詳細に示す図 である。

発明を実施する態様 本発明のバイオリアクタ内の細胞のための物理的支持構造は種々の層状の隔膜囲 いのいずれかであり、これらの隔膜囲いが組み合ってバイオリアクタ・コアまた は細胞囲いを形成する。種々のタイプのバイオリアフタ・コア構造を以下にさら に詳しく説明する。バイオリアクタ・コアの基本的設計は細胞囲いリアクタ域と 同じ構造に気体交換器を構成している。この設計を、ここては、以後１区画窒化 気体交換室あるいは直接通気バイオリアクタと呼ぶ。このシステムは、細胞と空 気を隔離している隔膜を横切って気体か直接的に拡散するため、昆虫の気管組織 に類似している。細胞を取り囲んでいる液体は疎水性隔膜を通って気体室へ流れ ることはできず、気体混合物の圧力は栄養媒質の圧力もやや低くて細胞室ての気 泡形成を防がなければならない。

最も一般的な形態ては１本発明のバイオリアクタは少なくとも１つのりアクタ域 からなり、このリアクタ域は縁のところで結合された多孔性シート状隔膜て形成 されており、細胞を収容する。

隔膜の１つは親木性であり、栄養物かりアクタ域内へ移動したり、栄養物、細胞 生成物および老廃物かりアクタ域から外へ移動したりするに適した多孔性を有す る。栄養物はこの疎水性隔膜を通しての拡散によってリアクタ域に供給され、そ の供給速度は細胞の新陳代謝に合わせてあり、好ましくはそれほど大きくない。

他方の隔膜は疎水性で、超多孔性である。この疎水性隔膜の気孔サイズは約０． ００５〜０．１ｐｍ、好ましくは、０．０１〜０．０５μｍである。酸素（もっ と普通には空気である）と、おそらくは他の添加物（たとえば、少量の二酸化炭 素を含む）かこの隔膜を通してリアクタ域に供給される。ここで、酸素は栄養物 内へ、そして、この栄養物を通して隣接の細胞に拡散する。気孔が上記範囲の下 限よりも小さい場合には、気体移動をかなり制限される。一方、気孔が上記範囲 の上限よりも大きい場合には、栄養媒質の蛋白質析出物と湿潤剤成分が気孔内に 徐々にＭ積し、最終的には、水や栄養媒質が気体交換室内に通るのを許してしま うことになる。上記の気孔サイズ範囲内では、栄養物の独特の成分に依存して、 蛋白質等が湿潤を生じさせることはなく、長期間にわたる疎水性を達成てきる。

この実施例のバイオリアクタ・コアは、栄養媒質室、細胞室、気体交換室、細胞 室、栄養媒質室等々を形成する隔膜層からなる。隔膜層間にはスペーサ・スクリ ーンが設置してあり、これらのスペーサ・スクリーンは隔膜の間隔を適切に維持 するのに役立つ。

最も単純な実施例の変形例である別の実施例では。

細胞室スペーサ・スクリーンの代りにテフロンやポリプロピレン等のような疎水 性物質て作った非常に細い中空ｍ維が用いられており、これらの中空ｉ維の両端 はシールしである。これら中空繊維は隔膜の間隔を適切に維持すると共に気体拡 散のための表面積を増大させるという二重機能を果たす。これは、気体が細胞室 内の栄養媒質を直接通るよりもかなり迅速に隣接空気室から繊維ルミナの内外へ 拡散するためである。気体拡散の効率が高いため、より広い細胞室により多くの 細胞を収容し、単位サイズあたりの生産性を高めることができる。

別の実施例は疎水性、微孔性の隔膜によって囲まれた交互の細胞室と栄養媒質室 を利用しているか、細胞室スペーサ・スクリーンの代りに親水性、微孔性の中空 繊維の層を使用している。これらの繊維は細胞室を完全に貫通しており、マニフ オルドに集められており、細胞室に直接空気の流れを運ぶようになっている。

２つの隔Ｍ間のスパンは小さい、好ましくは均一な寸法に保たれ、疎水性隔膜か ら最も遠い細胞に酸素を移動させるのに必要とされる距離を制限する。このスパ ンは好ましくはセパレータによって維持される。好ましいＮ境ては、システムの 寸法は、すべての細胞が酸素源、すなわち、酸素移動隔膜の表面の２００ＪＬｍ 以内、好ましくは、約１００ｇｍ以内にあるように決めである。

最も単純な形態ては、単一の反応域またはりアクタ域の片側に気体室を、反対側 に栄養物室を備えている。この形態では、積重配置で複数の反応域またはりアク タ域構造を使用し、各反応域またはリアクタ域の隔膜をすぐ隣の対応する隔膜と 対面関係に配置することが望ましいことが多い。こうすれば、対になった親水性 隔膜か対になった疎水性隔膜と交互に位置する。

この積重体は、好ましくは、すべて、適切なセパレータを備え、縁のところで結 合されて「メディア媒質域」を形成する。ここて用いるメディアなる用語は栄養 供給源と酸素供給源の両方を意味している。対面した対の隣合った親水性隔膜に よって形成されかつ境された領域は栄養供給室を形成し、隣あって対面した対の 疎水性隔膜によって形成される領域は酸素供給室を形成する。このような積重体 では、こうして、反復したシーケンスの領域が設けられ、各二番目の領域か細胞 室リアクタ域となり、各細胞室が１つの酸素供給室と１つの栄養供給室とに隣接 している。

本発明のバイオリアクタにおける細胞の生産性は多数の特徴によって最大眼窩め られる。囲んている微孔性隔膜の間に設けられたりアクタ域内の細胞はｍ環する メディアによりて発生する剪断力から保護される。

細胞室は、播種・細胞分割によって、生体組織の細胞相互作用に近い約１０９細 胞／　ｃ　ｍ　３の密度まで充填される。この状態は細胞にとっては快適であり 、バイオリアクタ内に留まって長期間にわたって産生を行う、ハイツリトーマス または他のいわゆる不死細胞の場合には、原則的には、産生は無限に継続し得る 。

細胞室、メディア室を隔離している隔膜表面か非常に大きいことによって産生率 が高められ、これか酸素、栄養物の細胞への移行か非常に効率良くかつ均一とな る。

リアクタ域の外側ては、疎水性隔膜との直接の連絡により、酸素供給手段が隔膜 を通してリアクタ域に酸素を供給し、そこにおいて、酸素は栄養物を通して細胞 に向って拡散する。酸素供給源は空気あるいは二酸化炭素を少量添加した空気で あることが最も多いが、他の酸素含有気体流も同様に用い得る。

栄養物供給源の制御は特に効果的な栄養物供給源、組成、圧送作業によって容易 に行われる。

リアクタ域の外側ては、親水性隔膜との直接連絡によって、栄養物供給室は隔膜 の面を横切って栄養物の流れを与える。栄養物は親木性隔膜を通して反応域また はりアクタ域に拡散し、栄養物、細胞生成物および老廃物は反応域から同じ隔膜 を通して栄養物流に拡散し、バイオリアクタから運び出される。栄養物流は、通 常は、細胞生成物を除去し、回収し、老廃物を除去するように処理することによ って再循環される。

圧送時、リアクタは一対の溜めに接続してあり、これらの溜めは栄養物の供給源 兼レシーバとして作動する。栄養物は供給限からリアクタに送られ、次いて、レ シーバに送られる。供給源が排出され、レシーバが満たされると、動作は逆転さ れ、次いてリアクタは新しい供給源から供給を受ける。逆止弁のシステムか用い られ、２つの溜めのうちの一方の溜め内の媒質の上方で交互に高められる空気圧 力の下に流れる栄養媒質循環を行う、溜め上のセンサが栄養媒質レベルを検出し 、加圧状態を制御する。再循環部には間欠的にあるいは連続的に新しい栄養媒質 が加えられる。全再循環部分が成る特定の量に達してセンサによって検出される と、ブリート・ポンプが作動を開始する。このポンプは、普通は、システムに加 えられる栄養媒質よりやや速い速度て再循環経路から媒質をフリートする。ブリ ード流は意図した細胞生成物と老廃物を除去するように処理され、残りの栄養物 は最終的にシステムに再循環させられる。全再循環部分か別の特定の量に達し、 センサによって検出されると、ブリード・ポンプの動作は停止する。

バイオリアクタのヒータ、気体交換器および細胞囲い（すなわち、バイオリアク タ・コア）を通して栄養媒質を完全に循環させるシステムの設計を考慮するとき 多数のファクタか重要となる。すべての構成要素の信頼性を最大限にしなければ ならず、最小限の物理的ストレスか微妙な栄養媒質に加えられなければならず、 流れは単一方向てなければならず、すべての機能が自動的でなければならない、 構成要素の信頼性は必要な修理を最小限に抑えのに重要なファクタであるが、成 る構成要素の故障が殺菌状態を損なったり、細胞の生産性、生存性にとって有害 な、バイオリアクタ内に環境変動を生じさせたりする可能性かある場合にはもっ と重要である。

栄養媒質が循環しなければならないバイオリアクタにおいて最も故障し易い構成 要素はポンプである。ダイアフラム・ポンプは亀裂を生じ易い、蝿動ポンプは歯 車、配管に故障か生じ易い、これらの問題は空気で加圧てきる２つの栄養媒質溜 めと、栄養媒質の流れを方向付ける逆止弁のシステムとを使用することによって 回避されていた。逆止弁は非常に長い寿命が期待されている。壊れる部品をまっ たく持たず、可動部品はボール弁たけである。逆止弁はポンプ作用の望ましくな い性質、たとえば、キャビテーション、剪断作用。

胆動（媒質や細胞に有害である）も軽減する。栄養媒質溜めを加圧して循環を行 わせるコンプレッサは循環系の外にあり、栄養媒質に接触することはなく、した がって、バイオリアクタを妨害することなく点検、修理を行える手段を採用する ことができる。

第１図は外部気体交換ユニットを備えた細胞囲いを通る単方向流を与える栄養媒 質循環システムを示す図である。このシステムは、もしバイオリアクタ・コアが 内部気体交換室を包含する場合には、外部かす交換ユニットなしに、使用するこ とがてきる。

媒質溜め６または９を加圧する空気は入口１から０．２μｍｉ９菌フィルタ２を 通して弁３に圧送される。この弁は三方向通気式ンレノイトてあり、２つの溜め ６，９のいずれかに空気管路４．７を通して空気を送る。０．２μｍサイズの付 加的なフィルタ５゜８か空気管路４，７内に設けてあって溜めに入る空気を確実 に殺菌するようになっている。循環設計を説明するために、本説明では、適当量 の栄養媒質で満たされ、循環を開始するために加圧された栄養媒質溜め６で説明 を始める。

栄養媒質溜め６内の圧力か高まるにつれて、栄養媒質は２つのチューブ１０．１ １に送られ、逆止弁１３を閉し、逆止弁１２を開く。栄養媒質圧力は次に逆止弁 １４を閉ざし、流れはヒータ１８を通り、入口２７．８口２８を経て細胞囲いす なわちバイオリアクタ・コア２３を通って送られる。細胞囲い２３を出た媒質は 皮下アクセス・ボート３０を備えたサンプソング・サイト２９を通り、次いで温 度モニタ３１を通り、逆止弁１５を経て栄養媒質溜め９に送られる。この流れは 栄養媒質溜め６内の媒質レベルかセンサ３２以下に低下するまて統く。

この時点て、センサ３２は空気弁３に信号を送り、この空気弁は空気流を管路７ を経て栄養媒質溜め９に切り換える。栄養媒質溜め９から押出された栄養媒質は 逆止弁１５を閉ざし、逆止弁１４を開き、逆止弁１２を閉ざし、ヒータ１８およ び細胞囲い２３を通る前に同じルートをたどり、逆止弁１３を開き、栄養媒質溜 め６に入る。この流れパターンはセンサ３３か媒質レベルを検出するまで続き、 この時点て、センサ３３が空気弁３に信号を送り、この空気弁は空気流な栄養媒 質溜め６に切り換え、サイクルか再び繰り返される。

こうして、栄養媒質流は細胞囲いを通る単方向性となる。栄養媒質は栄養媒質レ ベル・センサ３２゜３３を使用して空気圧力弁３の動作を制御するたけて自動的 に再循環もさせられる。

費用および嵩高性を最小限に抑えるために、本発明のバイオリアクタは温度調整 のための細胞培養器内に収容されていない。代わりに、栄養媒質は調節式ヒータ １８を通る。このヒータは栄養媒質を３７°Ｃに維持しなければならない、しか しながら、栄養媒質はその中に熱に敏感な成分を含んでいるのてこの温度よりも もっと高い温度を受けてはいけないし、過剰な熱の結果であり、バイオリアクタ の寿命を短縮する腐蝕ぶろせす、たとえば、糖質カラメル化やミネラル析出も避 けなければならない。

これらの要件を満たすために、ヒータはサーモスタット３１とヒータ制御器１７ によって調整され、このヒータ制御器は非常に精密で短時間の間欠的な、パワー 調整される加熱パルスを与える。これはヒータの壁か過剰に熱くなるのを防ぐ。

栄養媒質は最高の熱移動効率を与える非常に細通路内てヒータを通る。ヒータは 垂直媒質流を与え、生じる可能性のある％泡をヒータに急速に通し、ホットスポ ットを生じる側面に付着しないように設置しである。リアクタ温度をモニタする ためのサーミスタか細胞囲いの栄養媒質出口ボートのところに設けである。

今説明した栄養媒質の連続的な再循環ては、最終的には、栄養物の枯渇と老廃物 の蓄積か生じる。したかって、新しい媒質を加え、古い栄養媒質を取り出してバ イオリアクタを平衡状態に保たなければならない、古い栄養媒質は簡単に排出す ることはてきいないし、最良の人工栄養媒質でも加えたときに強烈なショックを 与えるので細胞に新しい栄養媒質を簡単に加えることばてきない、これは細胞の 健康に悪影響を与え、その多くを殺し、生産性を低下させる。

細胞培養で使用されるいかなる栄養媒質も細胞によって状態調整されて細胞に許 容できるものとなる。

したがって、培養されている特殊な細胞ラインのニーズに依存して、新しい栄養 媒質の流入を漸進的な率に好ましくは連続的に制限する必要かある。媒質は、ま た、連続的かあるいは間欠的のいずれかで、システムから引き出され、適切な比 較的均一な量を維持し、また、バイオリアクタ生成物を収穫しなければならない 、新しい栄養媒質をシステム内へ送り、古い栄養媒質をシステムからブリートす るための可能な手段としては２つあり、２つの別個のポンプを使用するか、単一 の２つロポンプを使用するかすることである。これらはいずれも長期間にわたっ て作動しなければならないハイオワアクタにとっては満足できるものではない、 圧送量の少しの差か常に存在し、時間と共に有害な体積変化が生じるからである 。

本発明のバイオリアクタはこの問題を解決することができ、第３のセンサ３４を 循環系に加えることによって比較的一定の体積を維持できる。センサ３４はセン サ３３の上方で栄養媒質溜め９内に設置してあり、センサ３２と一緒に作動する 。ポンプ３６は新しい栄養媒質を連続的に循環系に送る。センサ３２．３４が共 に溜め内の液体を同時に検知したときに、ブリード・ポンプ３５か付勢される。

ブリード・ポンプ３５は、センサ３２．３４かもはや溜め内の液体を同時に検知 しなくなるまで加えられる率よりも速い速度てシステムから栄養媒質を取り出す 。このとき、ブリード・ポンプ３５は停止させられ、媒質の量か再び増大し始め る。センサの位置は許容限界内に全体積を維持するように決められる。圧送率は １時間あたりの全体積の許容パーセンテージまで新しい栄養媒質の流入量を制限 するように設定され、各細胞ラインのニーズを満たすように調節することもてき る。

これらの構成要素によって構成される圧送システムは本発明のシステム全体に多 数の特別の利点を与えるようのに役立つ。

圧送作用が栄養物に大きな剪断力を与えることはない、これは剪断力によって劣 化させられる可能性のある、栄養物内の高い分子量の蛋白質等を保護するように 機能する。これら高分子量の栄養成分は一般に栄養物内の最も高価な成分である から、変性を加える剪断力の回避は非常の望ましい特徴である。

２つの溜めは充分なサイズに作り、システムに加えられる新鮮な組成の栄養物の 増分かシステム内の全量の比較的穏当な比率となり、かなりの量の未調整の新ｇ 栄養媒質との接触からの細胞へのショックを避けるようにするとよい。

動作の性質により、圧送システムは１本来、生成物回収率、老廃物除去率、栄養 物交換率を決定したり。

システムの動作を安定化させたりするために用いることになフている自動化リア ルタイム測定・計量機能を果たす。こうして、細胞にとって高度に安定した生活 条件か生じる。

ポンプ構造は最も考えられる故障か殺菌状態の破壊にならないようにしである。

可動機械部分はほんの１つ、ソレノイド弁３だけてあり、システムは例外的な信 頼性を持つ。

故障か生じるときは、最も起こりそうなのは圧送システムの動作を行わせる空％ 源である。修理あるいは保守のためにシステムの残部を隔離するのは容易である 。「工場空気」が一般に使用に適しており、圧送システムの一部として殺菌され ることになる。このような空気供給源は特に経済性、信頼性、保守容易性にとっ て特に魅力的であり、たいていのプラント作業員にとっては周知のものである。

その性質によって、ポンプは任意の必要なサイズ。

容量にしてバイオリアクタ・システムの要件を満たすことかてきる。より大きな 構成要素が必要とするすべてである。

システムは非常に低いコストの簡単な構成要素からなり、特に大きなサイズの場 合１本発明のシステムは他のタイプの圧送システム、制御器に比べて非常に経済 性に優れている。

殺菌条件は簡単であり、高い信頼性をもってシステム内に設定し、維持するのに 便利である。小型の場合、システムのための給排水工事は安価てあり、古い物質 を廃棄して清掃作業を不要とするのに実用的である。

こすと効率、利便性、殺菌性の理由のために、同じ細胞ラインあるいは異なった 細胞ラインのいずれかを収容するいくつかのバイオリアクタ・ユニットに供給す る単一の栄養媒質生産ユニットを持つことが好ましい、栄養媒質ユニットに対す るリアクタ・ユニットの追加あるいは除去を容易にするため、そして、なんらか の望ましくない汚染を防ぐため、システムに無菌ブレイクを設けるのも望ましい 。

インライン０．２μｍフィルタ（または対のフィルタ）がこのような無菌ブレイ クを構成するが、フィルタは時に詰まることがあり、周期的な交換が必要である ０本発明のバイオリアクタは液体流に実際の物理的なブレイクを与える交互の装 置を使用する。この装置は本発明てはシステムて使用するすべての液体無菌ブレ イクに対して使用されるものであり、第２図に詳しく示しである。

液体は入口管路４１を経てボトル４０に流れる。管路４１の端は毛管チップ４２ となっている。この毛管チップ４２は片側に湾曲したテフロン・チューブ４３に よって囲まれている。液体流は、個別の液滴４４が毛管チップ４２から解放され 、テフロン・チューブ４３の壁面に落下し、その側面を端まて転り落ち、ボトル 内に入るように調整される。テフロンが湿潤しないので、液滴はチューブの側面 を個別に転り落ち、たとえボトル内への液滴の跳ね掛かりによってテフロン・チ ューブの端に達したとしてもバクテリア汚染はチューブに起こり得ない。

起動時、通気口４７のところの、０．２ｇｍ疎水性フィルタ４６を通すことによ って殺菌された空気源からの空気は液面を低レベルに維持するに充分にボトル４ ０を加圧するのに用いられる。出口チューブ４８はボトル４０の底で始まり、ス トッパ４９から外に出る。液体は空気源４７から最初に与えられる圧力の増大に よって、そして、その後、弁４５を閉ざすことにより液体の流入量によって生じ る増大によって出口チューブ４８を通って排出される。

第１図を再び参照して、バイオリアクタ２３の通気のための所望の気体混合物か 殺菌気体源（図示せず）から入り、入口２４．出口２５を経てバイオリアクタ・ コア２３を通過する。バイオリアクタは以下に説明するように入口２１を経て栄 養媒質内に浮遊する細胞で播種される。

バイオリアクタ内の細胞新陳代謝は栄養物を消費し、所望の生成物を、そして老 廃物も産生ずる。バイオリアクタの動的乎衡状態を維持し、また、営業用の生成 物を収穫するために、栄養媒質をシステムに加え、そこからブリートしなければ ならない。一般的には、フィート・ポンプ３６を作動させることによって図示し ない溜めから無菌ブレイク２０を通して管路２６を経て栄養組成物を加えるのが 好ましい。先に述べたように、ブリート過程はバイオリアクタ媒質量の維持、生 成物の収穫および老廃物の除去の機能を達成する。もし栄養媒質か安価であるか 、あるいは、すべての成分が同時に枯渇したならば、単に冷室内の溜めにブリー トオフして生成物の濃縮、純化行えばよい。

しかしながら、栄養媒質か通常そうであるように若干の高価な成分を含んでいる 場合には、システムは特に高価な成分を保護し、再循環させるように使用てきる 。

このようなシステムの１つは生成物、成長ファクタを保持しなから５〜１００に 分子量、好ましくはてきるだけ大きい分子量カットオフを備えた接線方向流式超 濾過モジュール１６である。栄養媒質供給管路１７か超濾過モジュール１６に入 り、媒質は隔膜を横切って接線方向に流れ、出口ポートから流出し、バイオリア クタ循環系に戻る。このプロセスで、栄養媒質の水や小さい分子、イオン成分は 超濾過隔膜を通って流れ、８透除去管路５０を経て除去され、弁５２、ポンプ３ ５、弁５３を経て、そして、管路５５を経て無菌ブレイク５６．５７を通り放出 管路５８を経て老廃物溜め５９に圧送される。栄養媒質内の蛋白質、たとえば、 漿液アルブミン、成長ファクタおよび抗体は超濾過隔膜を通過できず、循環系に 残留する。この条件の下て、成分追加によって’ａＥｆｒされた栄養媒質成分、 すなわち、有効隔膜カットオフより大きい分子量を持つ栄養媒質成分はもやは流 入する栄養媒質には添加されない。これらの成分はそれらの有効性が衰えるまて 循環させるたけでよい。分泌された細胞蛋白質生成物、たとえば、抗体は絶えず 蓄積する。たいていの細胞老廃物はＢ濾過モジュールによって濾過される。

長寿命の栄養媒質成分ても最終的には補給され、生成物は収穫されなければなら ない。超濾過モジュール１６からの出口管路５１および浸透管路５０（すべて第 １図に示しである）は弁５２によって接続されている。収穫（連続的ても間欠的 てもよい）のためには、弁５２を管路５１に開き、超濾過フィルタ１６をバイバ スさせ、一方、弁５３を管路５４に開き、管路５３に対しては閉ざし、細胞生成 物を含有する栄養媒質を管路５４を通して生成ｅｌ濃縮回路に圧送する。最大許 容量の媒質をシステムからブリートした延び、弁３６を閉ざし、超濾過モジュー ル３７を再び作動させ、適当量の高価な胎児カフ漿液、新鮮な成長ファクタその 他のホルモン等を再び流入栄養媒質に加える。

生成物を含有するバイパス栄養媒質を次に処理して高分子量生成物を濃縮し、そ れらを以下の手順て低分子量老廃物から分離することがてきる。

前述のように管路５４を通してバイオリアクタ・ユニットから取り出した流れは 第１の超濾過ユニット６０に通す、低分子量透過物は管路６４、無菌ブレイク６ ５．６６を経てシステムから取り出され、次いて老廃物溜め５９に送られる。部 分的に濃縮された高分子量物質の残りの流れはサージバッファによって管路６１ を経てサージタンク６２に送られ、そこにおいて、この流れはポンプ６３によっ て管路５４に再注入される。第１の超濾過フィルタ６０からの出口管路は、ポン プ６７によフて、管路６８を経て第２の超濾過フィルタ７０に送られる。第２超 濾過フイルタ７０からの透過物は管路７１を経て無菌ブレイク６５．６６を通し て老廃物溜め５９に流れる。超濾過フィルタ７０を出た生成物は管路７２を経て 第２のサージ管路７３に送られ、そこからサージタンク７４に送られ、そこにお いて、余分な量かポンプ７５によって管路６８に再循環させられる。管路７２内 の濃縮物はポンプ７６によって無菌ブレイク７７．７８を通して濃縮物収集容器 ８０に圧送される。

プロセス流の成分はその当初の濃度から約１００倍のレベルまで濃縮され、低分 子量成分は超濾過操作てほぼ完全に除去される。当業者には明らかなように、生 成物は栄養物の高分子量成分の残りの増分分と混ぜ合わされる。純化された生成 物を回収するには付加的な隔離と純化が必要となる。このような操作は当業者に は周知てあり、特定の生成物に適した任意公知の手順を使用てきる。

栄養物の供給は間欠的ても連続的でもよい、連続操作かサージ中に大量の未調整 栄養物の添加によって細胞に与えるショックを最小限に抑えるのに一般的に好ま しい、ブリート操作は間欠的でも連続的てもよいか、生成物回収のために流れ全 体の増分の除去のためにこの部分ブリート操作のバイパスの代わりに１！！過フ イルタ１６のパートタイムでの使用を伴なってもよい。供給操作とブリート操作 を釣り合わせ、栄養の組成を管理することによって、システムを釣り合わせて細 胞の連続的な生活力および生産性にとって最も有効な状態を得ることかてきる。

培養にとって最も採用可能な特別の条件はりアクタ内の特定の細胞ラインの特別 の振る舞いに照らして容易に決定される。最も急速に枯渇するのが栄養物の低分 子量成分であり、もっと高い分子量の成分は一般的に高価であるから、供給操作 とブリート操作の釣り合いは高価てゆっくりと消費される成分をシステム内に保 存し、低分子量の老廃物を比較的急速にあるいは連続的に除去するように作用す る。操作の考慮てきる経済性はこのようにして達成される。

本発明は第３，４．５．６図に概略的に示す４つの実施例を含み、これらの実施 例は栄養媒質とは別の酸素交換システムな微孔性あるいは超濾過またはこれら両 方の隔膜からなるバイオリアクタ・コアに組み込むことを考慮している。直接的 な区画窒化した気体交換室の使用の背後にある概念は空気その他の酸素豊富な気 体混合物の穏やかな低圧流が細胞に最大限の酸素供給を与えると共に、栄養媒質 のかなり遅い流れを許すということにある。その結果、高価な栄養媒質の効率の 良い、経済的な使用、バイオリアクタの全体的なサイズの縮小、媒質流量の低減 、殺菌状態のより容易な維持となる。これら気体交換区画室設計は積重配置にも 螺旋捲回式隔膜配置にも組み込むことかできる。

別体の空気室をバイオリアクタに組み込むことによっていかなる利益を得られる について考えることは役に立つ、ハイブリドーマ細胞ラインはそれらのモノクロ ーン抗体産生率かかなり変化する。しかしなから、現在の知識に基づけば、１日 あたりｉ、Ｏｇの抗体を産生ずるバイオリアクタは約１０口個の細胞を含む必要 があると考えられる。普通の培養条件の下では、単一のエネルギ源としてグルコ ースを用いた場合、ハイツリドーマ細胞はこのグルコースの約半分をラクターゼ にに変換する。プロセスは無酸素である。

ハイブリドーマ細胞におけるこの無敢素新陳代謝経過を最小限に抑える多くの試 みがなされ、その結果、細胞酸素要求が高まった。

データおよび論文の数値に基づいて正当に見積ったところ、培養されているハイ ブリトーマ細胞は１日あたり約２．５ピコモル（ｐｍｏ　１　）のグルコースを 消費する。この値を用いれば、１０目個の細胞は１日あたり２５０ミリモル（ｍ ｍｏ　１　）のグルコースを消費することになる。はんの半分が無酸素的に新陳 代謝を行って、グルコース１分子あたり酸素６分子を必要とするならば、１０１ 】個の細胞の酸素要求量は１日あたり１５００ｍｍｏｌとなる。

空気で飽和させた栄養媒質によって酸素を供給するバイオリアクタては、３７℃ での溶解酸素の濃度は約０．２ミリモラー（ｍＭ）である、培養細胞における酸 素結合の生化学は溶解酸素のほんの約５０％か利用てきるだけであることを示し ている。これは３７℃での栄養媒質の酸素濃度がほんの０．１ｍＭであることを 意味している。この濃度ては、毎日循環させて１日あたり１．０ｇの抗体の酸素 要求量を満たすには１５０００９つとるの栄養媒質か必要となる。これはｌＯ口 個の細胞を支持するにはｌＯリットル／分の流量を必要とすることを示している 。

栄養媒質流量要件を、今、１０１′個の細胞のグルコース要求量を満たすという 観点から考えると、異なった値が得られる。栄養媒質内の２０ｍＭの濃度で供給 されるグルコースは細胞のニーズを満たすには充分なものである。グルコースが 細胞によって５０％消費されると仮定すると、その有効濃度は１０ｍＭである。

先の計算においては、１０１個の細胞か１日あたり２５０ｍｍｏｌのグルコース を必要とすると見積った（ここでは通気、無酸素要件の全体を考慮しなければな らない）、有効濃度１０ｍＭのグルコースては、１日あたり循環させるのには２ ５リツトルの栄養媒質か必要である。すなわち、０．０２リットル／分の栄養媒 質か循環に必要である。

この例では、栄養媒質によって酸素を供給するバイオリアクタにおいては、１０ ０倍を充分に超える媒質か循環して栄養物、すなわち、グルコース要求量を満た すに必要とするのと同様に細胞の酸素要求量を満たさなければならない、栄養媒 質を飽和させるのに純粋酸素を使用した場合、理論的には、溶解酸素濃度が５倍 に増大し、したがって、栄養媒質流要求が５分の１に低下する。しかしながら、 この目的ての純粋酸素の使用は別の問題を提起し、その使用には賛成できない。

気体混合物、たとえば約２０％の酸素を含む空気が最も効果的で経済的であるよ うに思える。別のエネルギ代替物を使用した場合、高生産性および他の精製のた めに選んだ細胞ラインが栄養媒質供給に対する酸素の需要を高めることになる０ 区画窒化気体交換室を備えたバイオリアクタては、溶解気体式バイオリアクタに 比べて栄養媒質流量を２段階より大きい程度に低下させるという利点を与えると 予想され得る。別体の空気室をバイオリアクタに組み込むことについての経済的 な価値は明らかである。構造上では、いくつかのオプションを利用できる。

４つの実施例のうち、第３図に示す最初の実施例は多層積重式隔膜設計である。

この基本的なバイオリアクタ・コアは多数層に重ねた交互の細胞室、栄養媒質流 室、気体交換室からなる。気体交換室は２つの細胞室の間に挿設してあり、栄養 媒質流室は第３図に示すように設置しである。空気その他の適当な気体混合物は 気体交換室の隔膜間スペースを通して直接通される。これを達成すべく、細胞室 と気体交換室の間の境界を形成している隔膜は超多孔性の疎水性隔膜てなければ ならない。このタイプの隔膜は栄養媒質は通過させないが、細胞への酸素の優れ た拡散を許すと共にＣＯ□の細胞から離れるような拡散も許すようになっている 。

細胞室と栄養媒質流室の境界を形成している隔膜は１通常はスペーサ・スクリー ンて分離されている微孔性親水性隔膜である。

したかって、内部気体交換室を備えるこの最も単純なバイオリアクターコアは第 ３図に示すように以下の順序で材料を層状に並べることによって構成されること になる。すなわち、親水性隔膜２、スペーサ・スクリーン４、親水性隔膜２、ス ペーサ・スクリーン４、疎水性隔膜５、スペーサ・スクリーン４、疎水性隔膜５ 、スペーサ・スクリーン４の順序である。この順序は所望数の層を得るまて繰り 返される。その結果、バイオリアクタ・コアを通して以下の順序て室か設けられ ることになる。すなわち、栄養媒質室３、細胞室１、気体室６、細胞室１、栄養 媒質室３、細胞室１、気体室６、細胞室１．栄養媒質室３等々の順序である。こ うして、各細胞室１は片側（３）で栄養物を受け取り、生成物および水溶性老廃 物を放出し、反対側（６）で酸素を受け取り、二酸化炭素を放出する。各栄養媒 質流室３および各気体交換室６は２つの細胞室１に供給を行うことになる。

バイオリアクタ・コアのこの最も単純な実施例の変形例か第４図に示しである。

この第２実施例は第１実施例と同し隔膜・室構成を保持しているか、気体交換を 向上させるべく細胞室スペーサ・スクリーンを改造している。この第２実旌例て は、中実繊維のスペーサ・スクリーンの代わりに両端をシールされた超多孔性、 疎水性の中空繊維からなるスクリーンを用いている。このバイオリアクタ・コア は次の順序で材料を層状に重ねて構成しである。すなわち、親水性隔膜２゜中実 繊維スペーサ・スクリーン４、親水性隔膜２、中空ｍ維スペーサ・スクリーン７ 、疎水性隔膜５、中実ｍ維スペーサ・スクリーン４、疎水性隔膜５、中実繊維ス ペーサ・スクリーン４の順序である。この順序は所望数の層が得られるまて繰り 返される。その結果、以下の順序で室が生じることになる。すなわち、栄養媒質 室３．細胞室１、気体室６、細胞室１、栄養媒質室３、細胞室１、気体室６、細 胞室１．栄養媒質室３等々の順序である。この新しい中空繊維スペーサ・スクリ ーン７は適当な寸法のＨｈ雌を用いて隔膜の適正な間隔を保っており、室内の各 細胞を酸素移動面に適切な接近距離に置き、気体交換のための表面積をかなり大 きくしている。この表面積か大きいということは中空ｍ維スクリーン７が気体交 換室６の疎水性隔膜５と接触しており、中空１８８７のルミナへの酸素の急速な 拡散、そして、中空ＦｉＡ維７のルミナを通過して外への二酸化炭素の急速な拡 散を許すことによる。第１．第２の量実施例において疎水性隔膜シートを通して 気体交換に利用できる表面積は同しであるか、第２実施例では、気体交換用の表 面積はスペーサ・スクリーンの表面積分だけ第１実施例よりも大きくなっている 。したかって、この気体交換室設計についてのこの変更は気体交換のための表面 積をかなり増大させ、細胞反応域の深さ内で気体交換領域を増大させ、その結果 、より広い細胞室を使用できる。広い細胞室はより多くの細胞を保持し、バイオ リアクタのサイズを縮小する。これは付加的な栄養媒質層および気体交換室が付 加的な細胞を支えるのに必要ないからである。

バイオリアクタ・コアの最も単純な実施例の別の変形例か第５図に示しである。

この第３実施例は第１実施例と同じ隔膜・室装置を保っているか、細胞アタッチ メントを向上させるべく細胞室スペーサ・スクリーンに改造を行っている。この 第３実施例はアタッチメント依存型細胞のための適当な粒状支持物質を中実繊維 スペーサ・スクリーンに加えて使用するか、あるいは、それに代えて使用してい る。このバイオリアクタ・コアは次の順序て材料を層状に並べることによって構 成されている。すなわち、親水性隔膜２４中実Ｆｉｈ維スペーサ・スクリーン４ 、親水性隔膜２１粒状支持物質７（スペーサ・スクリーンはあってもなくてもよ い）、疎水性隔膜５、中実繊維スペーサ・スクリーン４の順序である。この順序 は所望数の暦が得られるまて繰り返される。その結果、次の順序て室が生じる。

すなわち、栄養媒質室３．細細胞室ｌ気気室６、細胞室１、栄養媒質室３、細胞 室１、気体室６．細胞室１、栄養媒質室３等々の順序である。この粒状支持物質 は適当量使用することによって隔膜を適正な間隔に保つことになり、また、細胞 アタッチメント用の表面積もかなり増大させることになる。この二番目の機能は 細胞を取り付けることのてきる表面積を与えることによってアタッチメント依存 型細胞を培養するのに特に有用である。

気体交換室設計の別の実施例は先の３つの実施例とかなり異なる。この設計は第 ６図に示すように親水性隔膜によって隔離した交互の細胞室、栄養媒質室を利用 する。最も単純な実施例に見出される細胞室スペーサ・スクリーンの代わりに疎 水性中空繊維５の層を用いており、これは中空繊維の端を閉ざして横たえること ができる。このバイオリアクタ・コアは次の順序で材料を層状に並べることによ って構成される。すなわち、親木性隔Ｍ２、スペーサ・スクリーン４．親水性隔 膜２、中空ｍ維５．親水性隔膜２、スペーサ・スクリーン４．親木性隔膜２．中 空繊維５の順序である。

この順序は所望数の暦を得られるまで繰り返される。

その結果１次の順序て室か形成される。すなわち、栄養媒質室３、細胞室１、栄 養媒質室３、細胞室１等々の順序である。中空＠維５は細胞室１の間隔を維持す るか、隔Ｍ１１重体の両側から突出し、そこにおいて。

マニフオルドに集められる（第６図には示していない）。空気あるいは所望の気 体混合物は中空ｈａのルミナを通して圧送され、繊維の全表面積にわたって気体 交換が行われる。この配置は非常に効果的に作動するか、中空ｗｔｍ隔膜を集め るのがかなり難しく、そのためこの実施例はあまり好ましいとは言えない。

これら区画窒化気体交換室の４つの実施例は、すべて、気体を栄養媒質に溶解さ せる設計の場合よりも酸素の供給、二酸化炭素の除去をかなり迅速に行える。

栄養媒質は細胞の酸素にいすよりもむしろ栄養ニーズを反映するかなり遅い速度 て圧送することかてきる。

ここに記載したこれら４つの実施例は、いずれも、２つのバイオリアクタ・コア 形態、すなわち、積重配置、螺旋捲回配置のいずれにも組み込むことがてきる。

バイオリアクタの構成要素の第１の配置はここてはａ重体と呼ぶ、この特別なア プローチは適当な隔膜の層を利用しており、各隔膜がセパレータによって隣接し た隔膜から隔離してあり、適当な配置でシールしてあってリアクタの種々の領域 、室を構成する。積重体はリアクタ容器（便宜上、「キューブ」と呼ぶか、その 形状が任意の四角形てあり、キューブそのものである必要がないことは了解され たい）内に収容される。

このキューブは受入れると共に、種々のりアクタ室への供給を行うべく入力側を 統合し、産生物を取り出すして集めるようになっている。これらのマニフオルト は以下の様式て配置される。すなわち、播種ボートか好ましくは隔膜シートか位 置する平面に対して直角のキューブの４つの対向した縁に沿って設けられる。

キューブの隔膜に対して平行な２つの対向した面はマニフオルトとしては使用さ れない。残りの面のうち、各対向した対は栄養物、酸素いずれかの流れについて のマニフオルト束として役立つ。１つの面において。

媒質はりアクタに供給され、反対の面では、リアクタからの流れか引き出される 。

栄養剤および空気その他の酸素源をそれぞれの室内、そしてそこを通して、そこ から外へ移動させる手段とするべく、各室は１つのマニフオルドに対して開いて いる。これを行うべく、各室の２つの対向した側面をシールし、他の縁をその室 に適したキューブのマニフオルドに対して開いたままとする。各細胞室は角隅の 播種マニフオルトに通しており、各空気室は栄養物マ二フ才ルトに通している。

隔膜の角隅はキューブの角隅内にシールされる。播種マニフオルトと空気マニフ オルドの境界はキューブの対応した側面に対してシールされる０種々のシールが 種々のマニフオルト、種々の室を異種の室と連絡しないようにしている。リアク タが播種された後、細胞反応域への播種マニフ才ルトおよびそれに対応したボー トをシールすると好まシイ。これは普通は将来使用することかないかうである。

各マニラオルトは８１図に示すようにシステムの適当な入力管路あるいは出力管 路に通じている。

実務においては、積重体を構成してからキューブ内に置き１次いて所定位置てシ ールを行う、これて準備が整ったことになる。

積重体の作成は、一般的には、以下の手順で行われる。この手順は第４図に先に 示した実施例を特に参照しながら説明するが、ここては、個別の空気室と細胞セ パレータとして閉じた中空繊維隔膜とを使用し、播種はキューブの角隅マニラオ ルトを通じて行われる。

まず、親木性隔膜、不活性織成ダクロン・セパレータおよび第２の親水性隔Ｍ（ それぞれキューブの寸法に合っており、ユーザーに便利な長さとなっている）を 中央にセパレータを入れて積み重ね、縁に沿って接着剤でシールする。次にこの 「サンドイッチ」の面を横切って適当な間隔で切断する。この間隔は積重体に必 要な寸法に相当する。こうして作った平らな「管状」構造はキューブ内に嵌合さ せるに適した寸法てあり１両端は開いている。各構成要素の内部は積重体を完全 に組立て、キューブに作動可能にすえ付けたときに媒質室を構成する。

次に１．疎水性隔膜、ダクロン・セパレータおよび第２の疎水性隔膜（それぞれ キューブの寸法に合った幅と、ユーザーにとって便利な長さとなっている）を中 央にセパレータを置いて積み重ね、縁に沿って接着剤でシールする。次に積重体 に必要な寸法に相当する適切な間隔てこの「サンドイッチ」の面を横切って切断 し、キューブに嵌合するに適した寸法の、両端の開いた扁平な「管状」構造を作 る。各構成要素の内部は積重体を完全に組立て、作動可能にキューブ内にすえ付 けたときに気体室を構成する。

ａ重体を完成するには、栄養物室を空気室の間に挿設し、それらの間に中空繊維 隔膜スペーサ要素を配置し、全栄養物室の開いた端を互いに整合させ、交互の空 気室の開いた端に対して９０度に配置し、すべてを整合させる。挿設作業か継続 しているときに、適当な接着剤を角隅に余分に塗布し、すべての媒質ボート、気 体ボートを開いたままとする。こうして、播種ボートを接着領域に充分な深さの 切り込みを設けることによって形成し、各角隅のところにキューブの播種ボート と連絡するのに適した開口を残す、このプロセスはリアクタの細胞リアクタ域を 構成する細胞室を形成する。この手順は適当数の室か形成されてしまうまて統け られる。

隔膜間の開いた流れ室のマニラオルト形成は、積重体を不活性材料て作った四角 形の箱あるいはキューブ内に置く。このキューブは隔膜の縁に面する４つの側面 上に積重体をゆるく収容てきるようにややオーバーサイズとなっている。こうし て、キューブの各側面にマニラオルトを形成する。隔膜積重体は所定位置に保持 され、２組の室の角隅は各マニラオルト境界部のところおよび各頂縁、底縁に沿 って接着剤てシールを行うことによって混ざり合うのを防がれる。４つの側面の 各々に対して供給ボートか設けられる。１組の室の開いた端はマニラオルトのう ち対向した一対のマニラオルトによって結合し、他の交互の室の開いた端は他の マニフオルド次いて結合される。２種の物質、たとえば、栄養媒質と酸素流は隔 膜積重体の適切な交互の暦を通され得る。２ｓの物質の流れは互いに直角となっ ており、久ロボート、マニラオルトから室を通って出口ポート、マニラオルトか ら外に出る。

本発明の構造ては、別体の気体交換室はバイオリアクタ・コア内に組み込むと好 ましく、そうすれば、気体移動システムとして栄養媒質を使用する必要かなくな る。第３．４．５図に示すようにこのバイオリアクタ・コア構造内に別体の気体 交換室を挿設する際の問題は、キューブの４つの側面のすべてならびに隔膜積重 体の４つの側面が３つの流れを利用する必要があり、２つの流れしか利用できな いということにある。

この問題の１つの解決策は２つまたは４つの角隅を除いて４つの側面すべてに沿 って気体交換室隔膜をシールすることである。それによって、角隅に取付けたマ ニラオルトが流れのうちの１つの流れ、好ましくは。

細胞播種流の入出力を許す。この配置によれば、隔膜の１つの寸法、一対の対向 したマニラオルトを栄養媒質流に対して使用し、他の寸法および第１の対のマニ ラオルトに対して直角の他の対のマニラオルトを空気流に対して使用し、角隅な 初期細胞播種に使用することがてきる。播種作業が一般にはリアクタ始動時にの み係り、普通は非常に穏やかな流量、限られた量を使用するので、この方法は均 一な栄養、酸素供給源のための連続作業に対して大きな積重体面マニラオルトを 保持することになる。

積重体リアクタのこの実施例を作るためには、四角形の親水性、疎水性隔膜を第 ３．４．５図に示すように配置することができ、このとき、気体交換室の最初の ３つの実施例において先に説明したように中実繊維あるいは中空繊維のいずれか のスペーサ・スクリーンとオプションとして粒状物質を細胞室内に設置する。

栄養媒質室２を囲んている２つの親水性隔膜は片側を全部横切って、そして、対 向した側面てもシールされる。細胞室ｌを囲んでいる疎水性、親水性隔膜は栄養 媒質室シールの角隅のところの小部分５を除いてすべての側面に沿ってシールさ れる。気体交換室４を囲んている疎水性、親水性隔膜は栄養媒質室開口の全側面 に沿って、そして、栄養媒質室シールの側面に沿って細胞室開口５のところまて シールする。

隔膜間の開いた流れ室のマ二フオルト形成は、積重体を、不活性材料て作り、第 ８図に示すように４つの側面に積重体をゆるく収容するようなややオーバーサイ ズとなっている四角形の箱またはキューブ内に置くことによって達成される。隔 膜積重体５は所定位置に保持され、３組の室の角隅はマニフオルト６．７．８を 形成している各層１５に沿って、底に沿って、そして、ユニットを閉ざす蓋に対 して２つの場所てシールすることによりて互いに混ざり合うのを防止される。ボ ート９．１０．１１．１２．１３．１４が積重体の４つの側面、４つの角隅に設 けである。細胞室開口のすべては角隅マニフオルド６によって結合される。２つ の対向した側面にあるマニフオルド８は気体交換室を結合し、他の２つの対向し た側面にあるマニフォルド７は栄養媒質流を分配、収集する。各寸法の室の開口 端が積重体マニフオルドによって結合されたとき、細胞は入口ボー）１３、細胞 室マニフオルト６、隔膜積重体５の細胞室、細胞室マニフオルド６および出口ボ ート１４を経て細胞室内へ播種され得る。

一方、栄養媒質は入口ボート１１、栄養媒質室マニフオルド７、隔膜積重体５の 栄養媒質室、栄養媒質室マニフオルト７および出口ポート１２を経て播種流の方 向に対して直角なスペースを通され得る。気体は入口ボート９、気体交換室マニ フオルド８、隔膜積重体５の気体交換室、気体交換室マニフオルド８、出口ボー ト１０を経て気体交換室を通って流れる。播種が行われたならば、細胞スペース は閉ざされ、栄養媒質は隣り合った栄養媒質流室を通して細胞に連続的に注かれ 、酸素と二酸化炭素は隣り合った気体交換室の間で拡散する。

第６図の実施例において、これは別個の空気室あるいは酸素室を使用しておらず 、中空Ｖ＆維隔膜が酸素源の流れを細胞室に運んでいる。これら中空のＭ７＆維 は空気供給源あるいは酸素供給源に直接通じていなければならない、この実施例 では、中空繊維は端が開いていなければならない、この開口端は細胞室の縁を空 気あるいは酸素のマニフオルドに対して閉ざす接着線を通る。このような配置を 形成するのは難しいため、この実施例は好ましくない。

バイオリアクタ・コアのための第２の配置ては、隔膜と室の暦を正確に同じ相対 形態としているが、物理的には異なった配置としている。ここては、隔膜を積重 するよりもむしろ、隔膜の層を螺旋状に捲回している。これを行うには２つの方 法がある。すなわち。

１）第９．９８図に示すような端部捲回螺旋と、２）第１０．１０ａ図に示すよ うに隔膜の中間部の螺旋で始まり、両端を外周面に置く中央捲回螺旋である。

３つの区画窒化気体交換室実施例は、いずれも、本発明の最も単純な実施例で可 能てあったようにいずれかの方法で螺旋状に捲回てきる。

端部捲回螺旋は各室を中央マニフオルドにシールすることによりて開始される０ 次に、隔膜をこのマニフオルドの中央のまわりに捲回し、最終的には所望のサイ ズまてこれを行う。ここて、外側マニフオルトを所定位置にシールする。第９． ９３図でわかるように、隔膜層は栄養媒質室１０６、細胞室１０４、気体交換室 １０５および別の細胞室１０４を形成する。細胞室１０４は細胞室マニフオルド １０２内ヘシールされ、気体交換室１０５は気体交換室マニフオルド内ヘシール される。もちろん、気体交換室は疎水性隔膜１０８て作られ、細胞室および栄養 媒質室は親水性隔Ｈ１０７て作られている。次いて、螺旋体全体を容器内に置く 、この容器の外％１ｌＯ１か第９図に示しである。

中央捲回螺旋体は第１０、ｌｏａ図に示してあり、これはほぼ二重の涙滴形スピ ンドル２０９を使用している。このスピンドルのまわりに隔膜層が巻き付けられ る。’ｌ！ｇ旋形バイオリアクタの外周面のところには各層の２つの端がある。

これらの端はマニフオルト、すなわち、細胞室マニフオルド２０、気体交換室入 口。

出ロマニフオルド２０３内ヘシールされる。隔膜はスピンドル２０９のまわりに 巻き付ける前に積み重ねられる。その結果、細胞室２０４が気体交換室２０５と 栄養媒質室２０６の間に挟まれる０次いて、螺旋体全体を容器内へ置く、この容 器の外殻か第１Ｏ１１０ａ図に示しである。

第９．１０図に示す螺旋捲回構造は多数の共通要素を有する。それぞれて、隔膜 の反復ユニットがただ１つ用いられている。各隔膜およびスペーサ層、中実ある いは中空の繊維は所望の幅の長いストリップの形をしている。事情が許すならば 、層を螺旋体か捲回され始める部位て縁に沿ってシールする０次いて、縁をシー ルする。好ましくは、層を螺旋状に巻いてい各層で勝手に変化する螺旋体周面に おける連続的な変化を修正したときにこのシールを行う。最初の層の外側隔膜は 次の層の内側隔膜となるというように、所望のバイオリアクタ直径か得られるま てこの作業を続ける。

細胞室および気体交換室は第９，９３図に示す端部捲回構造ては外側から内側へ 螺旋に沿って続き、第１０．１０ａ図に示す中央捲回構造ては外側から内側へ、 そして内側から外側へ戻るように螺旋に沿って続く。

ひとたび隔膜を適切に捲回し、すべてのマニフオルトを所定位置てシールしたな らば、円筒体全体を外殻（第９．１０図に１０１．１０２て示す）内へ滑り込ま せ、所定位置でシールする。次に、端にキャップをかぶせ、栄養媒質を内外へ流 すためのボートを残す。

ここて再び第９．９８図を特に参照して１両螺旋構造で、栄養媒質流室を形成し ている隔膜は長い方の縁に沿ってシールされておらず、栄養媒質流は螺旋体の層 を横切って、すなわち、図の平面に対して直角の方向へ円筒体の頂部蓋に設けた 入口ボートを経て栄養媒質入ロマニフオルド内へ、そして螺旋捲回部、栄養媒質 比ロマニフオルトおよび出口ボートを通して円筒体の一端から反対端まて流れる 。これらの特徴は当業者にとっては周知のものてあり、図には示さない、細胞播 種は入口ボートを通して細胞室マニフオルド１０２へ、そして細胞室へ行われ、 そして、親水性隔膜を通して栄養物出口ポートを経て外へ行われる。隔膜を通過 てきない細胞は細胞室内に保持される。気体は入口ボートを経て螺旋体を通って 気体交換室入ロマニフオルト１０３へ流れ、気体交換室１０４、出ロマニフオル ド１０３および出口ボートを通って流れる。

中央捲回螺旋体と端部捲回螺旋体の主要な差異は、第１０．１０ａ図に明瞭に示 しであるように、中央捲回螺旋体か中心にマニフオルドを設けるよりもむしろ中 央スピンドル２０９を必要とするということにある。端部マニフオルドのすべて は捲回螺旋体の外周まわりに配置され、外殻の端部キャップを通して外部に通じ ている。

螺旋捲回形態の最も魅力的なことの１つは非常に便利にシステムを取扱い、すえ 付けることがてきるということである。螺旋捲回リアクタは、そのカートリッジ ・ハウジング内で、殺菌状態でシールし、使用する前に保管し、カートリッジ式 フィルタの取扱いと同じ容量て容易にすえ付けることかできる。適当な調節、修 正を行うことによって、リアクタをフィルタ・カートリッジ・ハウシング内にす え付け、システムのセットアツプ、すえ付けと使用と同時に行うことによって使 用てき、これは多くのプラント従事者にとって便利である。

螺旋体は、普通は、約１２インチまての直径て、約３フイートの円筒形長さに構 成することがてきる。このような円筒形の全体積は約２１．２リツトルとなり、 これは約５０００ｃｍ３の細胞室容量を意味する。スペース・スクリーンの占め る容積を補正すれば、細胞スペースは約３０００ｃｍ３である。５×１０’細胞 ／　ｃ　ｍ　３では、このようなりアクタは約１．５Ｘ１０”個の細胞を含むこ とになり、１日あたり約１０ｇの抗体を産生ずることになる。これは１０００リ ツトルバツチタイプのリアクタの産生率に匹敵する。これら螺旋状ユニットの多 くは並列て使用して任意所望の能力のバイオリアクタを構成することができる。

結論として、本発明は層状隔膜固定式細胞バイオリアクタと、これに応用できる 区画窒化気体交換室の種々の設計とに関する。区画窒化気体交換室をバイオリア クタに組み込むことにより、細胞に最大限の酸素供給を行って抗体の産生な高め 、栄養媒質の循環を最小限に抑えて効率とコンパクト性を高めることがてきる。

所望の生成物をより多く産生じ、栄養媒質圧送要件を低下させることができる細 胞のより大きい新陳代謝活性から経済的利点も得ることがてきる。

バイオリアクタのころにい形成のプロセスは普通の組織培養設備て充分な数の細 胞を成長させ、それらをバイオリアクタに移すことによって達成され得る。しか しながら、この方法では、大量の殺菌媒質を取扱う必要があり、かつ、細胞の成 長にかなりの培養器スペースを利用しなければならない。これは非常に時間がか かり、バイオリアクタを起動するのに高価な手段である。

より実際的な方法としては、コスト、機能性の両面において、比較的小数の細胞 を成長させ、それをバイオリアクタに播種するとよい。ひとたびコロニーか形成 されたならば、バイオリアクタは続く細胞の分裂によって充満される。細胞の比 較的均一なバッキングはバイオリアクタの効率、生産性を最大限にするためには 絶対必要である０本発明のバイオリアクタ設計によれば細胞の播種が可能であり 、これは自動調整プロセスを用いて細胞室内に細胞を均一に分布させることかで きる。

本発明のバイオリアクタ設計の微孔性隔膜によれば、細胞を保持しながら栄養媒 質を通過させることができる。細胞室を形成する２つの隔膜はスペーサ・スクリ ーンによって均一な間隔に保持される。したがって、培養した種かバイオリアク タの細胞室に圧送されるとき、圧力は微孔性隔膜を通して栄養媒質流室内へ媒質 部分を圧送する。細胞は隔膜を通過てきないのて、種培養媒質から濾過され、播 種入口ボートの前面にそのまま付着する。これらの細胞は隔膜を通る媒質流を減 らす。今や細胞室に入った培養器は付着した細胞の上を通って開いた隔膜まで流 れ、そこにおいて、媒質か通過して浮遊細胞を固化することができる。こうして 、細胞は隔膜か覆われるまて広がり続ける単層の周囲に絶えず付着する。

細胞に散布される種培養媒質の流れが遅くなり始めると、栄養媒質循環システム を始動して細胞に栄養物と酸素を与えなければならない。細胞室に完全にコロニ ーが形成されたとき、栄養物は栄養媒質室から細胞室に拡散する。適正な条件下 て、細胞は分裂してリアクタ域をほぼ満たし、高個体群布度、したがって、高い 産生能力を得ることかてきる。

本発明のコンテキストにおいて、ここで使用される隔膜は市販されているものか ら選ばれるのが一般的である。気体移動に適した種々の超多孔性の疎水性隔膜と 栄養物拡散に適した種々の微孔性の親水性隔膜か多数の製造元から入手すること ができる。

本発明で使用されることになっているスペーサ・スクリーンはこの分野ては周知 であり、種々の材質、特殊な形態１寸法で市販されている０便利には、適切な寸 法の織成ダクロン・ポリエステル材料を使用してもよい、中空の超多孔性隔膜と 中空ｍ維スペーサを使用したいときには、これらの材料も多数の製造元から入手 できる。

アタッチメント依存型細胞と一緒に細胞リアクタで使用するに適した粒状物質も この分野ては周知てあり、一般的に入手できる。

細胞、特にハイブリドーマ細胞の培養に適した栄養物は１本発明のコンテキスト では、周知である。成る特定の細胞ラインに適した栄養物としてはいかなるもの も使用できる。

ＦＩＧ、９ａ ＦＩＧ、９ｂ 平成元年１２月　４日 特許庁長官　古　１）　文　毅　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＬＩＳ　８８１０２２０９ ２、発明の名称 ５、補正日の提出年月日 １９８９年　７月１８日 ｌ）引用書類は （１）米国特許第４，２２５，６７１号（２）米国特許第４，６６１，４５８号 装置（すなわち、リアクタ）の新規性または進歩性に関して言えば、この装置が どのやり方で使用されているか（すなわち、成る種の細胞について使用されてい る方法）は焦関係である。事実、引用例２は引用例１に記載された、本願に記載 されたりアクタに類似したりアクタに言及し、このリアクタに伴なう主たる問題 の１つを指摘している（引用例２の第１欄第５５行〜第２欄第２行参照）、シた がって、引用例１に記載されているリアクタの欠点、すなわち、過剰量の栄養物 を必要とする隔膜の広い間隔をひとたび認識したならば、隔膜間の距離を短縮す ることは前記欠点を克服するための容易な解決策であると考えざるを得ない。

したがって、引用例１に記載されているリアクタに類似しているか、隔膜間の距 離が小さくなっている、請求の範囲の請求項１に記載のりアクタは引用例２の開 示を考慮して発明性があるとは考えられない（ＰＣＴ第３３．３条）。

さらに、ｉ盈ス装置の進歩性を考えるとき、この装置（すなわち、リアクタ）が 新しい用途（すなわち。

固定細胞あるいは「密度の詰まった細胞」の培養）にとって適しているかどうか を考えることは筋違いである。

請求項２〜８の付加的な特徴は、細胞リアクタにとって通常の設計手順の一部を なすものと考えざるえない技術的な詳細に言及している。したがって、これらの 選択が発明力のある技術を必要とするとは考えられない（ＰＣＴ第３３．３条） 。

２）一方、請求項９による方法に関しては、ハイブリドーマ細胞の培養のための 本願によるリアクタの使用を妨げる成る種の侵害があるということを考慮するこ とかてきる。

したがって、請求項９に記載の方法についての進歩性はそれか「容易な」装置の 容易でない使用を成立させるので認められ得る（ＰＣＴ第３３．３条）。

３）請求項１の表現は不明瞭である（ＰＣＴ第６条）０本実、請求項１は「リア クタにおける・・・・改良」としているが、出願人によれば、前記（申し立てら れた）改良は（申し立てられた）改良製品（すなわち、リアクタ）を生ぜしめ、 したがって、請求の範囲を作成することが可能であるはすである。いずれにして も、請求の範囲の新規性および進歩性を審査するためには前記表現は絶対に不適 当であり、前記請求の範囲の表現を明瞭にするために削除すべきである。

補正後の請求の範囲 １、　間隔を置いた可撓性隔膜をシールし、マニフオルト取付けを行い、少なく とも、外部細胞生成物の分泌のために生きている細胞を閉じこめるための１つの 細胞区画室と、この細胞区画室に液状栄養物を供給し、そこから外部細胞生成物 を取り出すための１つの９、置物区画室と、細胞区画室へ遊離酸素含有気体を供 給するための１つの気体区画室とを形成している固定細胞リアクタにおいて、 前記細胞区画室を微孔性親水性隔膜と疎水性隔膜の対向面によって形成し、これ らの隔膜をスペーサ手段によって臨界的な間隔に維持し、細胞区画室内の細胞が 疎水性気体区画室隔膜から２００ミクロン以下の酸素拡散距離内にある ことを特徴とするりアクタ。

２、　請求項１記載のリアクタにおいて、少なくとも５つの区画室が２つの細胞 区画室間に挟まれた気体区画室を包含し、これらの細胞区画室がさらに２つの栄 養物区画室の間に挟まれており、 それによって、気体区画室が２つの疎水性隔膜の内面によって形成され、２つの 境を接する細胞区画室か一方の疎水性隔膜の外面と親水性隔膜の内面とによって 形成され、前記親水性隔膜の外面が各栄養物区画室の表面を形成していることを 特徴とするりアクタ。

３、　請求項１記載のりアクタにおいて、疎水性隔膜が多孔性であり、ｏ、ｏｏ ｓ〜０．１ミクロンの気孔サイズを有することを特徴とするリアクタ。

４、　請求項２記載のリアクタにおいて、前記スペーサ手段が複数の中空繊維多 孔性隔膜であることを特徴とするリアクタ。

５、　請求項１記載のリアクタにおいて、前記区画室のすべてがスペーサ手段に よって前記離間状態に維持されていることを特徴とするりアクタ。

６、　請求項４記載のりアクタにおいて、前記区画室が螺旋捲回形態に配置しで あることを特徴とするリアクタ。

７、　請求項５記載のりアクタにおいて、細胞区画室を形成している親木性、疎 水性隔膜が離間しており、その中の細胞が疎水性の気体区画室隔膜の１００〜２ ００ミクロンの距離内にあることを特徴とするりアクタ。

８、　請求項３記載のりアクタにおいて、前記気孔さいずが０．０１〜０．０５ ミクロンであることを特徴とするリアクタ。

９、　ハイブリドーマ細胞を培養して外部細胞生成物を産生させ、それを回収す るバイオリアクタの使用において、 請求項１記載のバイオリアクタを利用し、その細胞区画室にハイブリトーマを播 種し、それぞれ栄養物区画室、気体区画室から必要な栄養物および＃素を供給し て細胞区画室内で高い細胞密度までハイブリトーマを複製できるようにすると共 に前記多孔性隔膜を通して栄養物区画室内へ拡散する外部細胞生成物を産生させ 、栄養物区画室を出た液体から外部細胞生成物を回収することからなることを特 徴とする特許国際調査報告 ｍｌ嘲か９１−−１−１−−か−−−■−−＾ａｍ喝！＆１−・−−一曙ｔ、Ｐ ＣＴ／ＩＪｓεＢ１０２２０５国１′査”＠ＰＣＴ／ＵＳａａ／。２．。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．３つの個別の区画室、すなわち、（ｉ）細胞の成長のための細胞区画室、（ ｉｉ）液状栄養物を細胞区画室に供給する栄養物区画室および（ｉｉｉ）遊離酸 素含有気体を細胞区画室に供給するための気体区画室を包含する周定式細胞リア クタであって、前記細胞区画室内で５ｘ１０６／ｃｍ３より大きい細胞密度を達 成すべく、細胞区画室を栄養、気体区画室の隔膜面によって形成し、栄養区画室 の隔膜面を親水性多孔性隔膜とし、気体区画室の隔膜面を、０．０１〜１．０μ ｍの平均気孔サイズを有し、また、細胞区画室から気体区画室への液体の移動を 防ぐに充分な漏出圧力を有する疎水性多孔性隔膜で形成し、細胞、気体区画室を 、細胞区画室内の細胞が気体区画室からの所定の酸素拡散距離を超えないように 配置してあり、この酸素拡散距離が細胞の生活力を維持し、前記細胞密度を達成 する距離よりも大きくないことを特徴とするリアクタ。
2. ２．請求項１記載のリアクタにおいて、前記酸素拡散距離が約２００μｍ以下で あることを特徴とするリアクタ。
3. ３．請求項２記載のリアクタにおいて、３つの区画室が積重体として配置してあ り、栄養、気体区画室の隔膜面が互いに対面していることを特徴とするリアクタ 。
4. ４．請求項３記載のリアクタにおいて、前記積重体を複数個包含することを特徴 とするリアクタ。
5. ５．請求項１記載のリアクタにおいて、細胞区画室が前記所定の酸素拡散距離を 維持するスペーサ手段を包含することを特徴とするリアクタ。
6. ６．請求項５記載のリアクタにおいて、前記スペーサ手段が複数の中空繊維の多 孔性隔膜を包含し、これも前記気体区画室として役立つことを特徴とするリアク タ。
7. ７．請求項２記載のリアクタにおいて、３つの区画室が螺旋捲同形態に配置して あることを特徴とするリアクタ。
8. ８．請求項７記載のリアクタにおいて、細胞区画室が前記所定の酵素拡散距離を 維持するスペーサ手段を包含していることを特徴とするリアクタ。