JPH02501385A - 金属キレート‐蛋白質複合体を形成するための主鎖多置換キレート - Google Patents

金属キレート‐蛋白質複合体を形成するための主鎖多置換キレート

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 金属キレート蛋白質複合体を形成するための主鎖多置換キレート 背景技術 本発明は金属キレートおよび金属キレート蛋白質複合体の形成に関する。
金属キレートにおける技術および診断および治療の目的に金属キレート−蛋白質 複合体を形成する方法に関心がもたれている。代表的型のキレートおよび複合体 並びに複合体の形成方法は、特に米国特許第４，４５４．１０６号、第４　、４ ７２．５０９号および第４．３３９．４２６号に開示されている。かかる複合体 の一例は金属キレートモノクロナール抗体複合体である。抗体フラグメント、ポ リクロナール抗体、抗原、血液蛋白質、または血液リンパ球若しくは他の細胞に 結合する蛋白質もまた複合体の形成に使用することができる。
蛋白質に複合化する三官能金属キレートの合成方法は、アミノ酸アミドをエチレ ンジアミドに還元して一置換誘導体を形成しこれ等誘導体を八日酢酸でアルキル 化することにより三官能エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）キレートに転換す ることを含む、（イエ等アナル、バイオケム０．川虹：　１５２．１９７９）、 同様に、−置換ジエチレントリアミンはエチレンジアミンのアミノ酸エステルと の反応および生成したアミドカルボニルの還元により合成される。（プレ７チビ ール（Ｂｒｅｃｈｂｉｅｌ）等インオーガ、　１人、、　２５　：　２７７２〜 ２７８１　（１９８６）、ジエチレントリアミンの八日酢酸によるアルキル化に より一置換二官能ジエチレントリアミン−五酢酸（ＤＴＰＡ）キレートが生成す る。
三官能ＤＴＰＡの他の合成法にはＤＴＰＡまたはＥＤＴＡカルボキシレートをク ロロ蟻酸エステルと反応させて反応性無水物を形成することが含まれる。〔タレ ジカーレク（Ｋｒｅｊ　ｃａｒｅｋ）等、バイオ　ム　バイオフイーズ、レス、 コ１上区」江並憇ユｈ肚旦しｈし並悲肚、）＋　７７　：　５８１．１９７７　 ）　。
三官能キレートとして使用するＤＴＰＡの二無水物は、親ＤＴＰＡの脱水により 製造される〔ハナトウインチ（Ｈｎａｔ。
ｗｉｃｈ）等−歪］ニヒ２匹こｚ、−ヱ７”、＋ｂ、−Ｆ、４　”）　）−１（ Ｉｎｔ、Ｊ。
−触且しシ鎮、ｌ５ｏｔ、Ｌ井：　３２７．１９８２　）　、炭素１位で一置換 されたＥＤＴＡキレートを用いて非置換ＥＤＴＡキレートより試験管内でキレー トから金属の遊離を一層よく妨げる実施もまた報告されている。〔ミーレス（Ｍ ｅａｒｅｓ）等、ヱ±）Ｌ／二ｔ＜４　ｉ　ｊ−、（Ａｎａｌ−Ｂｉｏｃｈｅｍ 、）、　１４２　：　６８．１９８４）　。
一般に、従来技術は金属−蛋白質キレート複合体を一置換二官ＦＥＥ　Ｄ　ＴＡ 若しくはＤＴＰＡキレートまたはＤＴＰＡ無水物を蛋白質と混合し次いでキレー トすべき金属と反応させることにより形成した。［クレジカーレク等、バイオケ ム５バイオフイズ、レス、コミュヌ？７　：ｓａｉ、　１９７７；ブレ７チビー ル等インオーガ、ケム（ｆｏｒｇ、ｃｈｅｓ、Ｌ２５　：５７８３、１９８６） 　、これ等の方法により製造された金属キレート複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ）モノクロナール抗体を用い生体内で腫瘍標的の位置を映像することが報告され ている。〔コラ（Ｋｈａｗ）等、サイエンス、　２０９　：　２９５．１９８０ 　）　、（シャインバーブ等、サイエンス、皿：　１５１１．１９８２）　、金 属キレート複合化モノクロナール抗体を用いる生体内人間の癌の診断が報告され ている。（レインズバーグ等、−之！」Ｌヱ］−１２：　６９４．１９８３）、 然し治療の目的で金属キレート共役モノクロナール抗体の腫瘍局限化特性を使用 する試みは部分的には金属が生体内で金属キレート複合体から遊離（しばしば遊 離）する場合があり、特に放射性金属塩の場合には、複合体が偶然に結合した金 属を精確に一掃する場合でも、骨髄等に望ましくない濃度の有毒放射性核種を生 成し得るので、普通用いられなかった。偶然に結合した金属の金属キレート蛋白 質複合体を精製する方法は米国特許第４．４７２．５０９号に開示されている。
モノクロナール抗体に放射性金属を堅固に結合するために極めて強力な金属キレ ートを使用することおよび複合体をきびしく精製して最大腫瘍局限化を行い且つ 標的のない組織に送達するのを最小にすることの重要性はプレッチビール等（− ±２ンＬニ第１工欠Ｊよ、　２５゜１９８６）によって議論されている。マウス において生体内で金属キレート複合化ポリクロナール抗体から遊離される治療の 放射性核種の望ましくない局限化は人間における治療研究を除外した。〔バウグ ーン（Ｖａｕｇｈｎ）等、エヱニニ丘ユ且上　（Ｅｉｒ−Ｂｅｒｉｃｈｔ、）　 ７８１９８６　）　、金属キレート複合化モノクロナール抗体として治療のため 注射される放射性金属の生体内における骨による吸収の増加もまた報告されてい る。〔ハナトウインチ等、ジＪ：工ｊ≦すυムーＬヱ。
（Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、）＋　２６　：　５０３．１９８５　）　、放射 性金属キレート化ポリクロナール抗体の人間における可能的治療投与量は骨髄毒 性により制限された〔オーダー等、インド、ジｘ　−−）’　＋７ｖｔＬｔ　（ Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｒａｄ、　０ｎｃｏ１．）、　１２　：２７７、　１９８６　 ）　。
上述するところから金属を堅固に蛋白質に結合して金属の遊離を最小にし、生体 内で標的位置に金属を選択的に送達し得る更に有効な金属キレート蛋白質複合体 に対する要求が続いていることは明らかである。
発明の開示 従って、本発明の目的は新規な多置換ジエチレントリアミンを提供することにあ る。
本発明の他の目的は新規な多置換二官能ジエチレントリアミン五酢酸キレートを 提供することにある。
本発明の尚他の目的は新規なキレート−蛋白質複合体を提供することにある。
本発明の更に他の目的は新規な金属キレート蓋白質複合体を提供することにある 。
本発明の他の目的および利点は発明の詳細な記載が進むにつれて明らかになるで あろう。
図面の簡単な説明 本発明のこれ等の目的、特徴および付随する利点の多くは第１図の化合物の製造 に対する添付図面に関連して考慮する場合以下の詳細な記載を読むと一層よく理 解される：第１図はＲ３がバラ−ニトロベンジルであり、Ｒ３，４が以下に記載 するような了り−ル／アルキル蟇である多置換ジエチレントリアミンの製造の反 応経過を示す＠　Ｒｓ＋４がメチル基である場合、第１図の式で得られるジエチ レントリアミン生成物は第１表の化合物（ｄ）である。
第２図はＰＧが保護基（後記）、ＲおよびＲ′がそれぞれ以下に記載するように バラ−ニトロベンジル基またはアリール／アルキル基である多置換ジエチレント リアミンの製造の反応過程を示す、Ｒがバラ−ニトロベンジルでＲ′がメチルで ある場合、生成物ジエチレントリアミンは第１表の化合物（ａ）である、Ｒがメ チルＲ′がバラ−ニトロベンジルである場合には生成物ジエチレントリアミンは 第１表の化合物（ｃ）である。
第３図はＰＧが保護基（後記）、Ｒがバラ−ニトロベンジルＲｒ、Ｒ１１がそれ ぞれ以下に記載するようにアルキル／アリール基または水素原子である多置換ジ エチレントリアミンの製造の反応経過を示す　ＲｒがＨでＲ″がメチルである場 合、生成物ジエチレントリアミンは第１表の化合物（ｂ）である。
Ｌ−Ｌ パー−Ｌ パー−亀 発明の詳細な記載 ここで使用するすべての技術的または化学的用語は、特記せぬ限り、本発明が属 する技術の分野における通常の知識を有するもにより普通理解されると同じ意味 を有する。
ここに記載する方法および材料と同様または均等のすべての方法および材料は本 発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を記 載する。以下に挙げるすべての文献は参考のために記載する。
本発明の第１の観点は炭素主鎖が多置換ではあるが、少なくとも２個の置換基を 有するジエチレントリアミンの合成を意図する。この合成は適切な置換アルファ ーアミノ酸アミドを置換アミノ酸とカルボジイミドカップリングし次いで生成し たアミドをトリアミンに還元することにより行う。
本発明の他の観点は適当に置換したアルファーアミノ酸を置換アルファーアミノ オキシムと縮合させ次いで所望のトリアミンに還元せんとする。
本発明の他の観点は炭素主鎖上で少くとも２個の側鎖（多置換）、その一つがニ トロ置換基を有する側鎖により置換されるジエチレントリアミン五酢酸を含む特 に有用な系列の三官能キレートを意図する。これ等のキレートは適当に多置換し たジエチレントリアミンのハロ酸アルキル化により製造することができる。
他の観点で、本発明は炭素主鎖上で少くとも２個の置換基でその一つの置換基は ニトロ、アミノ基を有するかまたはインチオシアネート若しくはＮ−ヒドロキシ サクシンイミドエステル置換基である置換基で置換された一連のジエチレントリ アミン五酢酸キレートを意図する。
同地の観点で、本発明は炭素主鎖上で少くとも２個の置換基により置換された一 連のジエチレントリアミン五酢酸キレートの蛋白質複合体を意図する。
本発明の同地の観点は炭素主鎖上で水素原子ではない少くとも２個の置換基によ り置換された一連のジエチレントリアミン五酢酸キレートまたは金属キレートを 蛋白質に複合化することにより形成される金属キレート複合化蛋白質を意図する 。
更に特に、本発明は生物学的活性および特異性を保持し、偶然に結合した金属を 実質的に有さす、且つ従来技術で知られている複合体より生体内で一層よく蛋白 質に結合する金属を保持する金属キレート複合化蛋白質、特に金属キレート複合 化モノクロナール抗体または抗体フラグメントを提供する。生体内で遊離される 金属を血液中に存在するトランスフェリン、メタロチオネンまたは他の金属結合 性蛋白質（例えばフェリチン）により結合することができる。
かかる金属はしばしば長時間血液循環系に保持され網内系（ＲＥＳ）の種々の器 官に、骨、骨髄または肝臓に向って離れる。かかるくクリアラスの結果、肝臓、 肺臓、腎臓、骨または骨髄における金属が一定の濃度となる。肝臓、肺臓、骨、 骨髄または腎臓の如き標的とされない器官における放射性金属の無作為の長時間 循環または放射性物質の濃度は極めて望ましくないことは明らかである。本発明 の目的はかかる重要な問題を軽減することにある。
金属、特に放射性金属を蛋白質に複合化するのに有用であることが示された多数 の三官能キレートは診断に用いるため生体内において金属を適当に保持するのに は十分強くない、従ってインジウムの三官能Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　ｌｉｔ体は試験動 物マウスにおいてインジウムの無水物結合ＤＴＰＡ錯体の如く、脱金属する（ブ レッチビール等インオーガ、ケム、。
２５．１９８６）　。
先行技術のＤＴＰＡ含有蛋白質複合体はＤＴＰＡのカルボキシレート基を介して またはＤＴＰＡの窒素に結合する側鎖上の官能基を介してＤＴＰＡを結合した。
これ等のキレートは本発明における主鎖多置換キレートの如く安定でない。主鎖 −置換ＤＴＰＡもまた蛋白質に結合されたがこのキレートのイツトリウムおよび ビスマス錯体は本発明におけるキレートの錯体の如く安定でない。
本発明の好適例および詳細な説明を次に記載し、利用を実施例により更に記述す る。
発明の好適例 本発明において、三官能キレートは、その構造の一部分として、キレート主鎖の 炭素原子に結合する側鎖を有しこれがキレートから金属を遊離するのに必要とさ れるキレート構造の配座開放（ｏｐｅｎｉｎｇ）を立体的に妨害するのに役立つ 。種々の側鎖の任意のものを使用することができ、選択はこの技術の分野におけ る通常の知識を有するものの範囲にある。側鎖は炭素に対する炭素またはエーテ ル結合等を含むことができる。炭化水素側鎖が好ましい０例えばエーテル結合に 存在する異原子がある場合には、これ等は鎖長の決定の目的に炭素原子として教 えることができる。かかる構造は、制限なく１〜約１５個の炭素原子を有する直 鎖または分岐鎖アルキル基例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、 イソプロピレン等；エテン、プロペン、プラン等を含む１〜約１５個の炭素原子 を有する直鎖または分岐鎖アルケン基およびそのアイソマー；フェニル、ジフェ ニル、ナフチル等を含むアリール基；および１個以上の分岐または直鎖アルキル 基における１〜約１５個の炭素原子ヲ有スるベンジル、フェニルエチレン、フェ ニルプロピレン等を含むアルキルアリール基を含む、側鎖は活性基、特に水素お よび水素化物試薬により容易に還元されるものを実質的に有するべきではない、 好ましくは側鎖には５個以下の炭素を有する直鎖または分岐鎖アルカン、ベンジ ルおよびフェニルエチレンが含まれる。最も好ましいかかる側鎖は第２表および 式２，３に示すようにメチル基である。
本発明における三官能キレートはその分子構造の他の部分にキレート主鎖の炭素 原子に結合し且つ蛋白質のアミノ酸残基と直接反応して共有結合を形成する反応 性官能基を持つ置換基を存する。かかる反応性官能基にはイソチオシアネート、 Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルおよびハロアセトアミドが含まれる０本 発明の実施によると反応性官能基はキレート主鎖に直接結合するかまたは広範囲 の側鎖を介して結合することができる。広範囲の側鎖の任意のものを用いること ができ特定なものの選定は当業者が選定し得る範囲内にある。炭化水素側鎖が好 ましい、異原子が、例えばエーテル結合に存在し炭素主鎖を中断する場合、異原 子は鎖長の決定の目的のため炭素原子として数える。
かかる構造は、制限なしに、１〜約１５個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐 鎖アルキル基例えばメチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、イソプロピレ ン等；エテン、プロペン、ブテン等を含む１〜約１５個の炭素原子を有する直鎖 若しくは分岐鎖アルケン基およびそのアイソマー；フェニル、ジフェニル、ナフ チル等を含む了り−ル基；および１個以上の分岐鎖または直鎖アルキル基におけ るベンジル、フェニルエチレン、フェニルプロピレン等を含む１〜約１５個の炭 素原子を有するアルキルアリール基を含む、この側鎖の本質的目的はキレートと 官能基との間の安定な結合として役立つだけである。側鎖は上記の所望の官能基 以外の活性基を本質的に含むべきではない、好ましい側鎖には置換直鎖アルカン 、ベンジルおよびフェニルエチレンが含まれる。
本発明の好ましい観点において、式２．３の多置換ＤＴＰＡ誘導体の製造に際し 中間体として第１表の置換基を有する、式（１）に示す構造のジエチレントリア ミンが望ましい。
好ましいキレートは式２で表わされる。
式２において、Ｘは好ましくはハロアセトアミド、イソチオシアネートまたはＮ −ヒドロキシサクシンイミドでＲ８〜Ｒ，、Ｒ，’〜Ｒａ’は水素原子、または ５個以下の炭素原子を有するアルキル基で、アイソマー構造に関係なく任意のも のでよくｎ−５である。
本発明の他の好ましい観点において、式３に示す構造のキレートが好ましく、こ の場合Ｘ、Ｒ，〜Ｒ４＋　Ｒ１′〜Ｒ−およびｎは式２のものと同じである。
本発明を実施するのに最も好ましいものは、置換基が第２表に示すもである式２ および３の化合物で化合物２（ａ）、（ｂ）、２（Ｃ）および２（ロ）として示 す。
第１表 式１の置換基 ＲＩＲＩ’　ＲＺ＋Ｒ２’　Ｒ１Ｊ３’　Ｒｎ、Ｒａ′１（ａ）　５ＣＮＢ、、 　）Ｉ　Ｈ，ＨＣＨｆｆ、ＨＨ，Ｈｌ（ｂ）　５ＣＮＢ、、　ＨＨ，ＨＨ，ＨＣ ）１３．Ｈｌ（ｃ）　ＨｌＨＳＣＮＢｇ、ＨＨ９ＨＣ）ＩｆｆｌＨｌ（ｄ）　５ ＣＮＢ□ＨＨ，ＨＣ）Ｉｓ、ＨＣＨ３，）１表中の５ＣＮＢ、はバラ−イソチオ シアナトベンジル基を示す。
第２表 ＲＩ　Ｉ　ＲＩ　’　Ｒ２＋　Ｒ２’　Ｒ３１Ｒ３’　ＲＪ　ＨＲＪ′２（ａ） 　５ＣＮＢ、、　ＨＨ，ＨＣＨ：＋、ＨＩＩ、　Ｈ２（ｂ）　ＳＣＮＢｇ、　Ｈ Ｈ，ＨＨ，ＨＣＨ２，Ｈ２（ｃ）　Ｈ，Ｈ５ＣＮＢ−、ＨＨ，ＨＣ）！３．Ｈ２ （切　５ＣＮＢ□ＨＨ，ＨＣＨｆｆ、ＨＣＨ２，Ｈ表中の５ＣＮＢ、はバラ−イ ソチオシアナトベンジル基を示す。
活性側鎖のキレート炭素主鎖への導入は先行技術に記載されている（ミーレス等 、ブチル・バイオケム、　１４２．６８゜１９８４）　。
ＤＴＰＡの殆ど全部の合成は終りから２番目の反応工程として親ジエチレントリ アミンのアルキル化を有する。従つて炭素主鎖多置換ＤＴＰＡの製造方法は親ジ エチレントリアミンの製造に帰する。
置換ジエチレントリアミンの従来の製造方法は第１図に示しである。この方法は アミノ酸エステルとエチレンジアミンを反応させ次いでジエチレンジアミンに還 元する。
第１図の反応を使用してＲがバラ−ニトロベンジルでＲ１＋Ｒ４がメチルである 第１表の新規な化合物１（ｄ）を得ることができる。この反応系に従って、２， ３−ジアミノブタンをｐ−ニトロベンジルアラニン　メチルエステルと反応させ 生成物をジポランで還元して２（ｄ）の親ジエチレントリアミンを得る。２（ｄ ）を製造するため、親ジエチレントリアミンの窒素をブロモ酢酸でアルキル化し 、次いでニトロ基を水素で接触還元し、生成したアミンをチオホスゲンと反応さ せる。
然し第１図の方法を使用して第２表の化合物２（ａ）および／または２（ｂ）を 製造する場合は、１．２−ジアミノプロパンとｐ−ニトロフェニルアラニン　メ チルエステルとの反応、続く上記の還元、アルキル化、還元およびチオカルボキ シル化工程の結果、幾何異性体である化合物２（ａ）および２　（ｂ）の混合物 が得られる。異性体の分離は現在有効な方法により実施されない、第１図の方法 を改良しても単離した２（ａ）および２ら）の純粋な試料を製造するのに用いる ことはできない。
２（ａ）および２　（ｂ）の純粋な試料が製薬用に必要である場合に、多置換Ｄ ＴＰＡの親ジエチレントリアミンを製造するため第２図、第３図に示す新規な方 法が考え出された。
化合物（ａ）を製造するため第２図の方法に従って、アミノ−保護α−アミノ酸 、この場合はｔ−ブチルオキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニンをアミ ノ酸アミド、この場合は、アラニン　アミドに、カルボキシレートを適当な試薬 によって活性化することにより、カップリングする。かかる試薬は業界で知られ ており特に好ましくは１．３−ジシクロへキシルカルボジイミド若しくは他のカ ルボジイミド、カルボキシカルボン酸エステル、混合無水物等が含まれる参カッ プリングした生成物は次いでトリフルオロ酢酸若しくは他の脱保護用試薬により 脱保護し、次いでジボランで還元して２（ａ）の親ジエチレントリアミンを生成 する。標準のアルキル化、還元およびチオカルボニル化工程により幾何学的に純 粋な２（ａ）が得られる。化合物２（Ｃ）を類似する過程により製造することが できる。
２（ｂ）の親ジエチレントリアミンを製造するため、第３図の新規な合成方法が 考え出された。第３図に示す方法に従って、アミノ保護α−アミノ酸、ｔ−ブチ ルオキシカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニン、をα−アミノケトンに、こ の場合アミノアセトンに、カルボキシレートを適当な試薬で活性化することによ りカップリングする。有用なカップリング試薬は業界で知られており特に好まし くはｌ、３−ジシクロへキシルカルボジイミドまたは他のカルボジイミド、カル ボキシカルボン酸エステル、混合無水物等が含まれる０次いでケトン生成物をメ トキシルアミンとの反応により対応するメチルオキシムエーテルに転化する。生 成したオキシムを脱保護し還元して２（ｂ）の親ジエチレントリアミンを得る。
アルキル化、還元およびチオカルボキシル化の標準反応過程により幾何学的に純 粋な２Ｑ））が得られる。
また３−アミノ−２−ブタンがアミノアセトンとおきかわる場合第３図に示す反 応および連続工程を使用して化合物２＠を製造することができることは勿論であ る０便宜のため、α−アミノケトンをそれらのアルキルオキシムエーテル、好ま しくはメチルエーテルに、第３図におけるカップリング工程前に、メトキシルア ミン等で処理することにより、転化することができる。
弐（２）および（３）のチオシアネートキレートおよび第２表のキレートを複合 化する方法は、業界でよく知られており、文献に記載されている〔プレッチビー ル等スプレム皿ｎ））金属キレート蛋白質複合体に用いるための蛋白質の選定は 絶対的なものでない。任意の望ましい蛋白質を複合体を形成するために用いるこ とができる。モノクロナール抗体が診断用および治療の目的に金属キレート蛋白 質複合体の形成用の好ましい蛋白質としてしばしば選定されることは勿論である 。だの適当な蛋白質にはポリクロナール抗体、抗原、血液蛋白質等が含まれる。
一般にキレートおよび蛋白質は蛋白質の濃度により決定さるが１：１より大で約 １００：　１より小であるモル比で混合する。約２：１〜約４：１の比が好まし いが、反応条件の選定は当業者の選定しうる範囲内である。
本発明を実施するに当たって蛋白質と結合させるのに好ましい金属はキレートを 蛋白質に結合する前または後でキレートすることができる。方法の選定は使用す る特定金属の加水分解性向により、当業者には充分選定される。
本発明を実施する際、即ち、蛋白質複合体を形成するためハロアセトアミド、Ｎ −ヒドロキシサクシンイミド　エステルまたはイソチオシアネートを使用する場 合には、複合体の形成に触媒は必要でなく、反応のｐＨは約６〜９．５が望まし い、触媒は必要でないが、使用すると３〜４倍またはそれ以上複合化反応の速度 を増すことができる。適当な触媒は一般の塩基触媒でトリエチルアミン、Ｎ、　 Ｎ−ジメチルアミノピリジン等が含まれる。
任意適当な金属をキレートに用いることができかかる金属には常磁性を示す金属 、蛍光性金属および放射性金属が含まれる０代表的常磁性金属にはガドリニウム および鉄があり、蛍光性金属にはランタニド系の数種の金属例えばテルビウムお よび二一ロビウムがあり：放射性金属には放射性核種のビスマス、インジウム、 イツトリウムおよびスカンジウムが含まれる。
金属キレート化は水溶液、好ましくは約１〜約７のＰＨ１最も好ましくは約４〜 約６のｐＨを有する希酸媒質中で実施される。約２０°Ｃ〜２７℃若しくはそれ 以下（凍結直前まで）の周囲温度を金属キレート化に用いるのが好ましい、固形 または溶液とした任意適当な金属塩を溶液中で遊離のキレートと接触させるかま たはキレート化した金属を形成するために蛋白質に結合させる。金属の使用量は 痕跡量からキレートと等モル以上の分量とすることができる。広範囲の金属塩、 例えば硝酸塩、沃化物、塩化物、クエン酸塩、酢酸塩等を使用することができる 。任意所定の金属に対する適当な金属塩の選定並びに任意所定の金属に対する特 に適するキレートの選定は当業者が選定し得る範囲のものである９本発明の実施 はむしろ少量の金属および蛋白質を処理して金属キレートおよび金属キレート蛋 白質複合体の形成を可能にすることは明らかである。
予め形成した金属キレートを蛋白質と結合しなければならない場合には、この際 キレート化した金属を水溶液中で所望蛋白質と約６〜１１のｐｌ＋、最も好まし くは約７〜約９．５のｐＨで混合する。ｐＨは重炭酸塩緩衝液の如き緩衝液で調 整するのが好ましい。適当な緩衝液の選定も当業者が選定し得る範囲に入る。溶 液の温度は凍結直前からキレートが不安定になるかまたは蛋白質が変性する温度 までの範囲とすることができる。３７°Ｃ以上の温度がしばしば蛋白質を変性す る傾向がある。
本発明における金属キレート蛋白質複合体は、所要に応じて、そのまま適当なｐ ｎに調整して使用することがでる。
或いはまた、複合体を複合化してないキレートまたは任意の副反応による生成物 から精製することが望ましい場合には、生成物を精製することができる。カラム クロマトグラフィおよび高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を含む業界で 知られている種々の標準的精製技術を使用することができる。
本発明は放射性キレート複合化モノクロナール抗体を体内に導入し標的領域にお いて濃厚にすることができる生体内治療法を意図する。安定なりＴＰＡ錯体を形 成し細胞毒性ベーター粒子、陽電子、オーガー電子およびアルファー粒子を放出 する広範囲の放射性アイソトープがある。アイソトープを放出するを用なベータ ー粒子には５ｃ−４６，５ｃ−４７゜５ｃ−４８，Ｇａ−７２およびＧａ　−７ ３並びにＹ−９０が含まれる。　Ｂ１−２１２は有用なアルファー　エミッター である。治療効果は複合体が標的の細胞に近いかまたは接触し結合する場合に起 こる。細胞の死は細胞に接近して位置する放射性金属の放射される場合の直接の または間接の結果とすることができる。
本発明のこの観点における利点はいくつかある。第一に複合化したモノクロナー ル抗体の高度の特異性は全放射投与量を最小にする。標的細胞に対する十分な放 射を使用する必要がある。更に、一般に放射性金属キレートを人体から速やかに 浄化して複合化した抗体を分裂させる必要がある。アイソトープは短時間存在す ることができアイソトープがキレートに保持される親和性定数は極めて大でこの 結果金属が安定に結合される。さらに、放射性金属の使用量が最小となることに より、放射性金属キレート複合化抗体を製造し投与する人に対する放射の危険が 著しく低減する。
本発明において使用する放射性金属キレート複合化モノクロナール抗体の特性に よって、治療中の組織の損傷または全体の身体への投与量は現在使用されている 放射治療法例えばアイソトープ　インブラント、生体外放射治療、およびヨード −１３１標識付けしたポリクロナール抗体または自己抗体を用いる免疫放射治療 に比べて著しく低い、更に、標的放射生物学の生物学および物理学的の半減期が 制御され、全体の身体への放射の影響が最小になる。放射が特定の細胞型（例え ば、腫瘍性細胞）を標的とするので、治療投与量は局限されるかまたは転移する 悪性細胞に特異的に送達される。特に転移した細胞に治療放射の有効量を供給す る放射性金属キレート複合化モノクロナール抗体の能力ちまた独特で癌の治療に 特に有効である。
他の例において、本発明は生体内診断法を意図しこの方法は金属キレート複合化 モノクロナール抗体を体内に導入し、複合体を十分な時間局限化しその程度およ び局限化の部位を確認する。本発明はまたキレート複合化モノクロナール抗体を 使用する生体内分析法を意図する０本発明における複合化抗体は偶然にまたは弱 くキレートした金属を実質的に有しない０本発明における抗体に複合化するキレ ートはジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体である。
他の診断および治療技術はここに参考のため記載する米国特許第４．４５４．１ ０６号に記載されている。
次の実施例は例示の目的だけに用い本発明を制限せんとするものではない。
１施■ １隻五上 １、（２）−メチル−４−ｐ−イソチオシアナトベンジル）ジエチレントリアミ ン五酢酸の製造。（第１表の化合物２（ａ）。
２（ロ）の幾何異性体の混合物）。
メチル　−ニトロフェニルアラニン　ヒドロクロ１ド乾燥メタノール（２００ｍ ）を−１０℃に冷却した二つロ丸底フラスコ中でＨＣｌ２（ガス）で飽和した。
ｐ−ニトロフェニルアラニン（１０，０ｇ、　４７．６ミリモル）を−回で添加 し約１８時間かきまぜ、溶液を回転蒸発機で乾燥近くまで蒸発させ沈澱した生成 物をプフナ漏斗に収集した。約５０°Ｃで真空下乾燥させた後、収量は１０．９ ７ｇ（８８，３％）であった、遊離アミノエステルのＴＬＣ（ｆｆ層クロマトグ ラフィ）をＣＨＣｊ２ｓ：Ｊ＝１０．０）、　４．５５（ｔ、　１．　Ｊ　−５ ，００）、　３．８４（ｓ、　３）、　３．４３（ｍ。
２）；　ＣＩ−ＭＳ　２２５（ＣＭ＋１）／ｚ）。
Ｃ８゜Ｈ＋３ＮｚＯｎＣ１に対する分析、計算値：Ｃ，４６゜０７；　Ｈ，５， ０３；Ｎ、　１０．７４；　Ｃ１，１３，６０。
実験値：　Ｃ，４５，８７，Ｈ，５，０８ｉ　Ｎ、　１０．４８；　Ｃ１，１３ ，５Ｂ。
Ｎ−（２−アミノ−１２−メチル　エチル）−一ニトロフェニルヱ立三ヱーヱｌ ヱ メチルｐ−ニトロフェニルアラニン　ヒドロクロリド（９，８０ｇ、　３７．６ ３　ミリモル）をトリエチルアミン（６，７８ｍ。
４５．２ミリモル）で処理してアミノエステルを遊離させた。
溶媒を除去した後、残留油状物をメタノール（５ｍｌ　）中１゜２−ジアミノプ ロパン（５０ｄ）に室温（２０’〜２４℃）で激しくかきまぜながら滴下した。
１８時間かきまぜた後、過剰の溶媒を回転蒸発機により５０℃０．０１ｍの真空 下で一定重量（１０，０１ｇ、　９６％）に達するまで除去した。生成物のＴＬ Ｃをシリカ上ＣＨＣｆｓ：ＭｅＯＨ（４：　１　）で行いＲｅ　＝０．１０〜０ ．１２であった。　１）ｌ　ＮＭＲ（２２０ＭＨｚ、　Ｄ）、　ｐＨ１０，０） ８．０６（ｄ、２．　Ｊ−７，５）、　７．４１（ｄ、　２．Ｊ　−７，５）、 　３．７２（ｔ、　１．　Ｊ−８，０）、　３．１８４．７３（ｍ、５）、　０ ．９１８（ｍ、３）；ＣＴ−ＭＳ　２６７（ＣＭ　＋１）／Ｚ）　。
Ｃ＋ｔＨ＋５Ｎ−Ｏｘに対する分析、計算値：Ｃ，５４，５３；　Ｉ（、６，７ ７：　Ｎ。
２１．０５；実験値：　Ｃ，５４，３３；　Ｈ，６，７６；　Ｎ、　２０．９２ 　。
１２−メチル−４−（−二トロベンジル）ジエチレン　ト＋７７ミン　トリヒド ロクロリド Ｎ−（２−アミノ−（１（２）−メチル〕エチル）−ｐ−ニトロフェニルアラニ ン　アミド（９，９０ｇ、　３７．２ミリモル）を１モルのＢＨ３７ＨＦ　（水 素化硼素テトラヒドロフラン）　（２００ｍ）で還元した。１１の三つ日丸底フ ラスコに還流冷却器、隔壁、アルゴン入口およびバブラー出口を取付は火炎で乾 燥した。
アミド（８，１２ｇ、　３８．９ミリモル）を乾燥テトラヒドロフランＴ　ＨＦ 　（１５０ｍ）の入った反応フラスコ中に入れ一１０°Ｃに冷却した。次いで、 １モルのＢ）１３ＴＨＦ溶液（２００ｍｍ）を注射器で添加した。反応溶液を一 １０°Ｃで１時間かきまぜ、次いでおだやかに１８時間還流し、然る後これを一 １０℃に冷却し乾燥メタノール（２５ｄ）を注入した。溶液を室温にしほぼ乾燥 するまで溶媒を除去した。再びメタノール（２５ｄｌ＞を添加し溶液を蒸発させ た。ボラン凝集体の開裂はｔｌｃｊ２飽和エタノール性溶液の激しい還流と濃１ （ＣＩ２水溶液（５−）の添加を必要とした。生成物がきれいに沈澱しＯ″Ｃに ６時間冷却した後収集し真空下乾燥した（１１．６０ｇ、　８６．３％）　、Ｃ Ｉ−？ＩＳ３６２（（Ｍ＋１）／ｚ）　、　Ｃ＋ｚＨｚＪ４Ｃｆ！ｓに対する分 析、計算値：Ｃ，３９，８５；　Ｈ，６，６５，Ｎ、１５．４９．　実験イ直： Ｃ，３９，９９：　Ｃ６，６４；　Ｎ、　１５．１４゜ １２メチル−４（−二トロベンジル）ジエチレント１アミンｍ：親ジエチレント リアミン（１，０ｇ、　２．７７　ミリモル）をブロモ酢酸（５，７６７ｇ、　 ４１．５　ミリモル）および７Ｎ　ＫＯＨ（１３，０４Ｉ１１）で処理した９反 応溶液を室温で７２時間かきまぜた。溶液を濃ＨＢｒでｐＨ１，５の酸性としエ ーテルで抽出した（　３　Ｘ１ｏＯＩ！ｌ）、水溶液を蒸発させ固体とし２．６ 　Ｘ３０ｃ＋ａイオン交換カラムＡＧ５０Ｗ　Ｘ８．２００〜４００　メ７シｓ 、、Ｈ’形〔ビオラド（Ｂｉｏ　Ｒａｄ）社、リッチセントＣＡ）上に負荷し水 洗して未反応物質、加水分解生成物および塩を除去した。
粗生成物を２Ｎアンモニア水溶液で溶離した。粗生成物を更に１０ｘ２５０１１ １１１．　Ｃ＋＊逆相カラムを使用するＨＰＬＣにより１００％メタノールに対 し０．０５モルのトリエチルアンモニウム　アセテートの２５分変化度で３ｍ１ ／分の流速を用いて精製した。生成物は９．１分の滞留時間を有した。ＨＰＬＣ からの画分を混合し上記のＡＧ５０Ｗ　ＸＢカラムで再びクロマトグラフィーし てトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液を除去した。生成物を収集し溶媒を 蒸発させて固形物（０，６４８ｇ、　４３．２％）を得た。
１２−メチル−４−（−アミノベンジル）ジエチレント１アミーＺｊｊ冒亥　親 ニトロベンジルＤ　Ｔ　Ｐ　Ａ　（１００，０ｇｇ、　０．１８４５ミリモル） をＰｄ／Ｃを用いて水素化した。水ジャケット付三つロフラスコ（５０ｍ）に１ ０％Ｐｄ／Ｃ（４３ｍｇ）、Ｈｌｏ　（５１ｄ）を供給しかきまぜ棒を取付した 。中心の頚部を常圧水素化装置に取付け、−例の頚部に注入弁を取付け、残りの 頚部をしっかり栓をした０組立てた水素化装置を排気し水素でフラッシュしこの 間反応フラスコを４　’Ｃに冷却した。ニトロ化合物を水（１０７１）に溶解し ５モルＮａＯＨを添加してｐ）Ｉを１０．０にした。溶液を反応フラスコに注入 し水素の消費量を監視した０反応後、混合物を微細フリットとセライト５３５（ フルカＡＧ、スイス国）を介して濾過した。溶媒を除去し残留物を真空下１８時 間乾燥し収率はほぼ定量的であった。
１２−メチル−４−（−イソチオシア　トベンジル）ジエチレント１アミン　− （第２表の化合物ａ、ｂの混合物）。
アニリン前駆物質と上記化合物２（ａ）、２ら）の親混合物（０，０９５ｇ、　 ０．１８４５　ミリモル）を水（５ｍｅ）　ｐＨ８，５に溶解し、チオフォスゲ ン（０，２１２ｇ、　１．８４５ミリモル）のＣＨＣｉｉ　３　（１０ｍ）溶液 で処理することにより粗生成物に転換した。この粗生成物をＩ　Ｘ３０ｃｏ＋フ ロリシル（Ｆｌｏｒｉｓｉｌ）　（シグマ、セント。
ルイス、　Ｍｏ）上でカラム　クロマトグラフィしＣＨｓＣＮ：ＨｚＯ（３０： ８）で溶離し生成物が最初に溶離した。溶媒を最小加熱で除去し残留する水溶液 を一夜凍結乾燥した。シリカ上でＣ）ｌｓｃＮ：）ｌｘＯ（３０：　８　）を使 用して得た生成物のＲ，は０．２０でありだ、ＩＲスペクトルはイソチオシアネ ートに対し２１００ｃｍ＋−’に特徴ある吸収を示した。
叉崖旦Ｉ 実施例１の方法において合成の第２段階で１．２−ジアミノ　プロパンの代わり に２．３−ジアミノブタンを用いた以外は同様にして第２表の化合物２（イ）を 製造した。
１益孤主 １　（ｐ−イソチオシアナトベンジル）−３−メチルＤ　Ｔ　Ｐ　Ａ。
（単一幾何異性体として第１表における化合物２（ａ）の合成）１二１上土之左 土±三火ユ虹ｌＬと三上三ヱ土三上ヱ旦三ｌ：ｐ〜ニトロフェニルアラニン＜１ ．９４ｇ、　３７．８ミリモル）を５０％ジオキサン水溶液（６０ｍ）に溶解し 、トリエチルアミン（７，９，ｄ、　５６．７ミリモル）を添加した。　（２− （ｔ−ブトキシカルボニルオキシアミノ）２−フェニルアセトニトリル〕（１０ ，２４ｇ、　４１．６　ミリモル、アルドリンヒ　ケミカル　コンパニー）を添 加し溶液を２時間かきまぜた。酢酸エチル（１００ｍ）および水（５０ｍ）を添 加し内容物を分離漏斗に注入した。水性相を保持し酢酸エチル（１００ｍ）で２ 回抽出した。水性相をｏ　”ｃに冷却し、ｐＨを３ＮＨＣ４で２．０に調整し、 この際形成された沈澱を集め真空下乾燥した。濾液を酢酸エチルで２回（１００ ｍ）抽出し、Ｍｇ５Ｏ□上で乾燥し溶媒を除去し乾燥した。２つの画分は同一で あることが立証され混合した（１１．０ｇ、　９４．０％）。化合物の融点は１ ６５°Ｃであった。
ＩＮ　ＮＭＲ（２２０ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ−ｄｉ）　８．０３６　（ｄ、　２． 　Ｊ−８，００）。
７．２９　（ｄ、　２．　Ｊ−８，００）、　５．３８　（ｄ、　１．　Ｊ＝８ ．００）、　４．４４　（ｍ、１）。
３．２５　（ｄｄ、　１．　Ｊ・１３．０．６．００）、　３．０５　（ｄｄ、 　１．　Ｊ・１３．０．６．００）。
１．３９　（ｓ、　９）：　Ｃ１−Ｍ５３１１（（Ｍ＋１）／ｚ）　。
ｔ−ブトキシカルボニル−（ｄｌ−〜ニトロフェニルアーニニルー（１−アラニ ンアミド： ＢＯＣ−（ｄ　ｆ　）−ｐ−二トロフェニルアラニン（１０，０ｇ、　３２．２ ６　ミリモル）、ｌ−アラニンアミド　ヒドロプロミド（５，４５ｇ、　３２． ２６ミリモル）、トリエチルアミン（４，４８７ｄ、　３２．３６　ミリモル） および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３，８４ｇ、　２８．４ミリモル） を酢酸エチル（４００ｄ）に溶解した。ジシクロへキシルカルボジイミド（７， ３０ｇ、　３５．４４　ミリモル）の酢酸エチル（２５１ｄｌ＞溶液を添加し反 応混合物を１８時間かきまぜ然る後３滴（約０．１５Ｍ１）の濃酢酸を添加した 。ジシクロヘキシル尿素を濾別し濾液を飽和塩化ナトリウム溶液（１００ｄ）、 　ｌＮＨＣｌ　（３Ｘ１００　ｄ）　、飽和塩溶液（１００ｍ）、５％ＮａＨＣ Ｏｓ（３ｘｌＯＯｄ）および飽和塩溶液（１００ｄ）で順次抽出した。
有機溶液をＭｇ５Ｏ，上で乾燥し、濾過し、５０Ｊｄに滅した０石油エーテル（ ５０ｄ）を添加しフラスコの内容物を０℃に１２時間冷却した。沈澱をブフナ漏 斗上に集めて真空下乾燥した　（１０，５５ｇ、８６．１％）。
７．９１　（ｍ、　１）　７．４５　（ｄ、　２．　Ｊ−９，０）、’　７．１ ４　（ｄ、　１．　Ｊ・１２．０）。
６．６８（ｍ、２）＋　４．３５（ｍ、２）、　３．１７　（ｄｄ、　１．　Ｊ ＝１５．０．６．０）、　２．９８（ｄｄ、　１．　Ｊ−１５，０，８，０）、 　１．３８　（ｓ、　９）；　Ｃ１−？ｌＳ　３８Ｈ（Ｍ＋１）／ｚ）。
Ｃ＋　７）＋２−Ｎ４０６に対する分析、計算値：　Ｃ，５３，６８；　）！、 　６．３１；Ｎ、　１４．７３゜実験値：　Ｃ，５３，９２；　Ｈ，６，５９； 　Ｎ、　１４．８４　。
２−メチル−４−（−二トロベンジル　ジエチレントｌアミントユ竺ヱ三り旦悲 ヱ 上記ジペプチド　アミド（５，１０ｇ、　１３．４２　ミリモル）をトリフルオ ロ酢酸（５０ｄ＞で１時間処理することにより脱保護し然る後溶液を回転蒸発機 でほぼ乾燥するまで蒸発させた。メタノール（５０１ｒｌ）　を添加し溶液を取 出し乾燥させた。
生成した固体をＯ，Ｏｌｖｍ　５０℃に８時間保持して残留する酸の除去を確保 した。
生成したアンモニウム塩（５，１０ｇ、　１３．４２　ミリモル）のＴＨＦ（５ ０ｄ）　ｆｉＪ液をコンデンサを取付けた２５０　ｔｄの火炎乾燥した三つロフ ラスコにアルゴン雰囲気下で添加した。フラスコを０℃に冷却し１モルのＢＥ３ ＴＨＦ　（３０，８ｍ）を注射器により添加した０反応溶液を２時間加熱し激し く還流させ次いで室温で更に２時間かきまぜた６反応フラスコをｏ′ｃに冷却し メタノール（２５ｄ）　（緩徐に注入して過剰の水素化物を分解した。溶液を乾 燥するまで減らし、無水エタノール（５０ｍ）　ニ供給し、濃ＨＣｊ！　（５０ ｍ）を添加した。溶液を２時間激しく還流させ次いで乾燥させた。残留物を水に 溶解し、１．５　Ｘ２０ｃｍＡＧ５０Ｗ　Ｘ８．　Ｈ”形、イオン交換カラムに 負荷し、溶離剤が中性になるまで水洗した。生成物を濃塩化水素酸（１２５ｄ） を用いてカラムから溶離し、１０−まで濃縮し、−夜凍結乾燥した。残留する固 体はほぼ純粋であることを確かめた（１．８２３ｇ、　６６．２％）。
ＩＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、　ＤｚＯｌｐＨ１，０）　８．２６８　（ｄ、　２ ．　Ｊ・８．０）。
７ｔ６］４　（ｄ、　２．　Ｊ・８．０）、　４．１０６　（ｓａ、　１）　３ ．７７３　（躊、　１）、　３．６８０−３．４５０　（Ｌ　３）、　３．３９ ３　（ＩＩ、　１）、　３．３１２　（ＩＩ、　１）、　３．２１２　（ｓ。
１）、１．４９３　（ｂｒ、　ｔ、　３）；　（５００ＭＨｚ、　Ｄ、０．　ｐ ）Ｉ　１１．０）　８．０９１　（ｄ。
２、Ｊ・８．０）、７．４３８（ｄ、２．　Ｊ・８．０）、３．１６７　（ｍ、 １）、２．９１０　（釦。
１）　２．７５−２．４５　（極めて複雑な多重線、　６）、　１．０３１　（ ｂｒ、ｓ＋　３）；Ｃ１−Ｍ５２５３（（Ｍ＋１）／ｚ）。
Ｃ＋　ＪｚＪ４０ｚＣ１２ｓに対する分析、計算値：　Ｃ，’　３９．８５；　 ）ｌ。
６．３６；　Ｎ、　１５．４９．実験値：　Ｃ，３９，８８；　）１．６．３６ ．　Ｎ、　１５．２８　。
このジエチレントリアミンの化合物２（ａ）への転化は実施例１に記載した方法 により達成した。
裏施Ｍ土 １−Ｐ−イソチオシアナトベンジル−４−メチルＤＴＰＡ　Ｃ第３図に示す反応 経過に従って純粋な幾何異性体として製造される化合物２（ｂ）） ＢＯＣ−一二トロフェニルアーニン２−オキソプロピル　アミドｔ−ブチルオキ シカルボニル−ｐ−ニトロフェニルアラニン（４，４２ｇ、　１４．２６　ミリ モル）、　アミノアセトン　ヒドロフリド（１，５６ｇ、　１４．２６　ミリモ ル）、トリエチルアミン（１，４４ｇ。
１４．２６　ミリモル）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１，６９ｇ、　 １２．５５ミリモル）を、酢酸エチル（４００ｄ）に溶解した。
１．３−ジシクロへキシルカポジイミド（３，２３ｇ、　１５．６８　ミリモル ）の酢酸エチル（２５ｄ）溶液を添加し溶液を１８時間かきまぜた。氷酢酸（０ ，２ｍ）を添加し溶液を濾過した。濾液を飽和塩溶液（１００ｉＩ１１り　、Ｉ ＮＩＩＩ溶液（３Ｘ１００　ｔｄ＞　、飽和塩溶液（１００，ｄ）　、５％重炭 酸塩溶液（３Ｘ１００ｍ）および飽和塩溶液（１００ｄ）で抽出した。有機層を Ｍｇ５Ｏａ上で乾燥し、濾過し５０ｍに濃縮した０石油エーテル（５０ｒｄ）を 添加し溶液を１２時間Ｏ℃に冷却した。沈澱した生成物を集め真空下で乾燥した 。
ＢＯＣ−−ニトロフェニルアラニン−２−（オキシムメチルエーテル　プロピル アミド ケトン（２００ｇ、　５．４７　ミリモル）をピリジン（１０ｒａｉｌ）　に溶 解しメトキシルアミン　ヒドロクロリド（０，９１４ｇ、　１０．９５ミリモル ）を添加した。溶液を１２時間かきまぜ然る後溶媒を除去した。残留物を最少量 の酢酸エチルに溶解し石油エーテルを添加することにより晶出しオキシムエーテ ルアミドを得た。
ｌ−メチル−４−（−二トロベンジル）ジエチレンドリアミント１ヒドロクロ１ 　ド 上記オキシム　エーテル（３，ＯＯｇ、　７．６１ミリモル）を適当なトリフル オロ酢！（１０ｍ）を用いかきまぜて脱保護した。
溶媒を高真空回転蒸発により除去した。
残留物をテトラヒドロフラン（５０ｘｄｌ＞　に溶解し還流冷却器、アルゴン入 口およびバブラー出口および注入口を取付けた火炎乾燥したフラスコに添加した 。溶液をＯ″Ｃに冷却し１モルＢＨ，ＴＩＩＦ　（２００ｘｉりを注射器により 添加した。６時間還流して反応を行いＯ″Ｃに冷却し、メタノール（２５ｍ）を 添加しすべての過剰水素化物を分解した。溶液を回転蒸中に供給した。エタノー ル溶液をＨｉ（ガス）で飽和させ４時間還流し、然る後溶液をＯ″Ｃで１８時間 冷却した。沈澱を集め、ジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。
このジエチレントリアミドの化合物２（ｂ）への添加を実施例１に記載した方法 により達成した。
１施ｆｌ ロウシャー・ロイケミア・ウィルス（Ｒａｕｓｃｈｅｒ　ｆ２　ｅｕｋｅｍｉａ ν１ｒｕｓ）に対し特有のモノクロナール抗体に以下の如く第２表のキレートａ およびｂの混合物を用いて標識付けした。
抗体を約８．５のＰ）Ｉを有する普通の緩衝塩溶液中に懸濁させた。キレートを 水溶液に添加した。この蛋白質溶液を反応−夜後金属を含まない０．０５モルク エン酸塩、０，１５モルＮａＣ１２緩衝液、ｐＨ５，５に対して透析により精製 した。金属で標識付けする前に、蛋白質を０．０２モルのＮ−モルホリノエタン スルホン酸および０．０８モルの酢酸塩を含む溶液、ｐＨ５，９に対して透析し た。イツトリウム−９０で標識付けするため、蛋白質溶液を約４〜５．５のｐＨ のアイソトープ酢酸塩溶液と反応させＴＳＫ　３０００サイズの排除カラム（ベ ックマン社、バークレイ、　ＣＡ）を通すことおよび透析により精製した。この ようにして得た標識付けした抗体を＊臓がロウシャー・ロイケミア・ウィルスに おかされたマウスに注射した場合、抗体が肺臓において局限化され注射薬量の３ ０％が腫瘍状の肺臓に結合しているのが見られ僅か１〜２％の放射性薬量が骨髄 が破壊されることになる骨内に見出された。これに対し、従来のＤＴＰＡの混合 無水物を用いて標識付けした抗体は上述の如＜　Ｙ−９０で標識付けし同じマウ ス腫瘍試験動物に注射した場合もほぼ同じ程度に肺臓において局限化されたが注 射した放射性薬量の約８〜１２％が骨髄に見出され望ましくなかった（データは 示さず）。
別の研究で、アイソトープの沃化物溶液を第２表に記載したようなキレート２ａ 、　２ｂを用いてつくった抗体との反応によりビスマス−２１２若しくはＢ１− ２０６で標識付けした。またこれ等の調剤をマウスに注射したところ組織分布デ ータは薬量の５〜１０％が腎臓中に見出されることを示した。然し従来技術の混 合無水物キレートを用いて標識付けした抗体は同じ時間中に５０％もの多量の薬 量を腎臓において損失し腎臓の損傷をおこした。他の放射性アイソトープを用い て同様に標識付けを行い標的組織または器官に対して同様に試験を行った。
これ等の研究は本発明のキレートが腫瘍に対し治療アイソトープを特異的に送達 するのに使用するために顕著に利用されしかも腎臓および骨の如き標的とされな い器官への化合物の分布が最小化されることを示す、標的組織または器官の撮像 は業界でよく知られている標準の放射線透過写真技術により行うことができる。
ここに記載した実施例は例示の目的にだけ記載したものでその種々な変化または 改変は当業者に示唆され本発明の精神および範囲並びに付加する請求の範囲の範 囲内に含まれるものである。
国際調査報告 ？Ｃ”、　／ＵＳＢ７／　０２２０７

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. １．（ａ）アミノ−保護α−アミノ酸をアミノ酸アミドと反応させ；（ｂ）保護 したアミノ酸を脱保護し；（ｃ）工程（ｂ）で得られた生成物を還元して多置換 ジエチレントリアミンを生成し；（ｄ）上記ジエチレントリアミンをハロ酢酸ま たはハロ酢酸エステルを用いてアルキル化することにより所望の多置換ジエチレ ントリアミン五酢酸またはそのエステルに転換することを特徴とする多置換ジエ チレントリアミン五酢酸キレートの製造方法。
  2. ２．（ａ）アミノ−保護α−アミノ酸をα−アミノケトンと反応させ；（ｂ）生 成したケトンをメトキシアミンと反応させることによりオキシムエーテルに転換 し；（ｃ）生成したオキシムエーテルを脱保護し次いで脱保護したオキシムエー テルを還元してジエチレントリアミンを生成しこれを、ハロ酢酸またはエステル でアルキル化した後所望の多置換ジエチレントリアミン五酢酸またはそのエステ ルを生成することを特徴とする多置換ジエチレントリアミン五酢酸キレートの製 造方法。
  3. ３．炭素主鎖に結合する一つの側鎖を有し且つ１個の官能基を有する次の式２ま たは式３ 式２▲数式、化学式、表等があります▼式３▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる多置換ジエチレントリアミン五酢酵（ＤＴＰＡ）において、約１〜 ７の範囲内のｐＨの水溶液中で安定であり蛋白質のアミノ酸残基と直接反応して 約６〜１１の複合化ｐＨ値で安定な共有結合を形成し且つＤＴＰＡの炭素主鎖に 結合する１〜８個の炭素原子を有する一つ以上の他の側鎖を有することを特徴と する多置換ジエチレントリアミン五酢酸。
  4. ４．官能基がハロアセトアミドであることを特徴とする請求項３記載の多置換Ｄ ＴＰＡ。
  5. ５．官能基がイソチオシアネートであることを特徴とする請求項３記載の多置換 ＤＴＰＡ。
  6. ６．官能基がＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルであることを特徴とする請 求項３記載の多置換ＤＴＰＡ。
  7. ７．Ｒ１〜Ｒ４，Ｒ１′〜Ｒ４′基が次表▲数式、化学式、表等があります▼ 表中のＳＣＮＢ２はｐ−イソチオシアナトベンジル基を示す で表わされるものであることを特徴とする請求項３記載の多置換ＤＴＰＡ。
  8. ８．蛋白質と複合化されることを特徴とする請求項３記載の多置換ＤＴＰＡ。
  9. ９．上記蛋白質がモノクロナールまたはポリクロナール抗体またはそのフラグメ ントであることを特徴とする請求項８記載のＤＴＰＡ。
  10. １０．放射性標識付けされることを特徴とする請求項９記載のＤＴＰＡ。
  11. １１．放射性標識がＩｎ−１１１、Ｙ−９０、Ｂｉ−２１２、Ｇａ−６８および Ｓｃ−４７から成る群から選ばれることを特徴とする請求項１０記載のＤＴＰＡ 。
  12. １２．宿主における標的部位に放射性標識付けした化合物物を送達するに当り、 上記宿主における標的部位に放射治療または放射撮像効果を得るのに効果的であ る請求項１１記載の化合物の一定量を宿主に投与することを特徴とする宿主にお ける標的部位に放射性標識付けした化合物を送達する方法。
  13. １３．トリアミンの炭素主鎖に結合する少くとも２つの側鎖を有し且つニトロ基 を含むことを特徴とする次式▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる多置換ジエチレントリアミン。
  14. １４．Ｒ１〜Ｒ４．Ｒ１′〜Ｒ４′基が次表▲数式、化学式、表等があります▼ 中のＳＣＮＢ２はｐ−イソチオシアナトベンジル基を示す。 で表わされことを特徴とする請求項１３記載の多置換ジエチレントリアミン。
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