JPH02501749A - 電気化学的ルミネッセンス性レニウム モイエティ及びそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 電気化学的ルミネッセンス性レニウムモイエティ及びそれらの使用方法 本願は、１９８６年４月３０日に出願された係属中の米国特許出願Ｓ　ｅｒｉａ ｌ　Ｎ　ｏ、８５８，３５４のＣＩＰ及び１９８７年４月３０日に出願されたＰ ＣＴ出願５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、Ｕ、Ｓ、８７１００９８７であり、それら出願の 内容は本願中に参考のためここに入れである。

本発明は、金属レニウムを含む電気化学的ルミネッセンス性（ｅｌｅｃｔｒｏｃ ｈｅｍｉｌｕ＋ｅｉｎｅｓｃｅｎｔ）化学的モイエテイに関する０本願に記載さ れるレニウム含有化学的モイエティ及びその錯体は、分析試験で使用されるよう に提案されてきたトリス−２，２′−ビピリジンルテニウム（ＩＩ）及び関連す る錯体よりも幾つかの利点を有する。これらの利点には：（ｉ）発光量子効率（ φｒ）がトリス−２，２６ととリジンルテニウム（ｎ）誘導体で認められている ものよりも一般に一層良くなっていること：（ｉｉ）金属からりガントへの電荷 移動（ＭＬＣＴ）励起状態の性質を、トリス−２、２’ビピリジンルテニウム（ Ｉ［）誘導体で利用される値よりも一層広い範囲の値内で選択することができる こと；及び（ｉｉ）ビピリジル及び非ビピリジル誘導体は両方共検査したいアナ ライトを錯体へ接合するのに用いることができるので、合成方法が簡単で一層経 済的なこと；が含まれる。

〔本発明の背景〕

本願中、幾つかの刊行物が（）の中に入れたアラビア数字により引用されている 。これらの引用の完全な文献名は、請求の範囲の前の本明細書本文の終わりに記 載しである。これらの刊行物の記載は、本発明が関与する技術の状態を一層完全 に記述するために、本願中に参考のため入れである。

化学的、生化学的及び生物学的物質を検出し且つ定量する迅速で極めて特殊な方 法に対する要求が依然として大きくなりつつある。医薬、代謝物質、微生物及び 他の診断上の価値がある物質の少量を測定する方法は特に価値がある。そのよう な物質の例には、麻酔薬及び毒物、治療のなめ投与される薬剤、ホルモン、病原 性細菌及びウィルス、抗体、代謝物質、酵素及び核酸が含まれる。

これらの物質の存在は、多くの生化学的及び生物学的系を特徴づける高度の特異 性を利用した結合方法によって屡々決定することができる０例えば、屡々用いら れている方法は、抗原・抗体系、核酸交雑法及び蛋白質・リガンド系に基づいて いる。これらの方法では、診断上の価値がある錯体の存在は、典型的には、一種 類以上の錯化用物質に結合された観察可能な「標識（ｌａｂｅｌ）」が存在する かしないかによって示される０選択された特別な標識法は、屡々検査したい物質 を検出するための特別な系の有用性及び融通性を示している。好ましい標識は、 安価で安全であり、種々の化学的、生化学的及び生物学的物質に、それらの物質 の重要な結合特性を変えることなく、効果的に結合することができるのがよい、 標識は、極めて特徴的な信号を与え、自然界では鍼灸に見出されず、好ましくは 決して見出されないものであるのがよい。

標識は、何カ月にも達する時間に亙って水性系で安定で且つ検圧できるものであ るべきである。標識の検圧は、高価な専門的な設備或は人を必要とすることなく 迅速で、敏感で再現性のあるものであるべきである。標識の定量化は、分析され る混合物の温度及び組成の如き変数には比較的左右されないのがよい、均質な系 、即ち、錯化された標識物質と錯化されていないものとの分離を必要としない系 中で用いることができる標識が最も有利である。

これは、その標識の検出性が、標識が付けられた物質が特定の複合体中へ組込ま れた時変化するならば可能である。

夫々特別な利点及び欠点を持つ種々の標識が開発されている０例えば、放射性標 識は極めて用途の広いものであり、非常に低い濃度で検出することができる。し かし、それらは高価で危険であり、それらの使用には専門的な設備及び熟練した 人が必要である。更に、放射性標識の感度は、検出事項がその本質的な性質とし て標識付けされた物質中の放射性原子−個当たり唯一回しか起きないことのため に限界がある。更に、放射性標識は均質な方法では用いることができない、従っ て、非放射性標識には大きな関心がもたれている。これらには、分光光度計、ス ピン共鳴、及びルミネッセンス法によって観察できる分子の外、そのような分子 を生ずる酵素によって観察できる分子が含まれる。有用な非放射性標識物質の中 には有機金属化合物がある。生物学的系では成る金属は希であるため、その有機 金属化合物の金属成分を特別に分析できる方法を成功裡に用いることができる０ 例えば、カイス（Ｃａｉｓ）による米国特許第４，２０５，９５２号明細書（１ ９８０）には、特異抗原を定量化するのに用いられる成る有機金属化合物で標識 付けした免疫化学的に活性な物質を使用することが記載されている。これらの標 識と共に、発酵、吸収及び蛍光分光学、原子吸収及び中性子活性化を含めた、選 択された金属を検出するどんな一般な方法をでも用いることができる。それらの 方法は屡々感度が欠如している欠点を持ち、均質系に対しては鍼灸に用いること ができず、原子吸収の場合のように、試料の破壊をもたらすことが時々ある。

特に関心が持たれているものは、光化学的、化学的及び電気化学的手段によって 発光させることができる標識である。「光ルミネツセンス」は、成る物質が電磁 気的輻射線を吸収した時発光を惹き起こさせる方法である。

蛍光及び燐光は光ルミネツセンスの中に入る。「化学的ルミネッセンスＪ法は、 エネルギーの化学的転移による発光物質の生成を伴なう、「電気化学的ルミネッ センス」は、発光物質の電気化学的生成を伴う。

これらの発光系は益々重要になって来ている０例えば、マンドレ（Ｈａｎｄｌｅ ）による米国特許第４，３７２，７４５号明細書（１９８３）には、免疫化学的 用途で化学的ルミネッセンス標識を用いることが記載されている。記載された系 では、標識は、Ｈ２Ｏよ及びオキサレートとその標識との反応による如き化学的 手段によって発光状態へ励起される。これらの系では、Ｈ２Ｏ２がオキサレート を酸化して高エネルギー誘導体へ変換させ、それが次に標識を励起する。

この系は、原理的には分析の酸化条件で安定で、高エネルギーオキサレート誘導 体によって励起することができるどのようなルミネッセンス性（ｌｕｍｉｎｅｓ ｃｅｎｔ）物質を用いても有効であろう、残念ながら、この大きな融通生がその 技術の主な制約原因になっている。検査したいアナライトを含む喚型的な生物学 的流体は、多量の潜在的にルミネッセンス性の物質を含み、それがルミネッセン スの高い水準のバックグランド発光を惹き起こすことがある。

同じ欠点を有する化学的ルミネッセンスの免疫化学的用法の別の例は、オーベル ハルトその他による米国特許第４，２８０，８１５号明細書（１９８１）にあり 、そこには化学的ルミネッセンス性物質で標識付けされた免疫反応物質に非常に 鰺近して酸化剤（例えば、ＨｘＯ２）がその場で電気化学的に発生することが記 載されている。電気的に発生した酸化剤は化学的ルミネッセンス性物質の方へ拡 散し、それを化学的に酸化し、電気的に発生した酸化剤へ正味一つ以上の電子を 移動させる結果になる。酸化すると化学的ルミネッセンス性物質はフォトンを放 出する。これに対し、本発明は、電気化学的エネルギー源からの電子を、繰り返 しフォトンを放出することができる化学的ルミネッセンス性物質へ直接移動させ ることを必要とする。

本発明は、電気化学的ルミネッセンス性標識に関する。

適切な標識は、有機化合物及び有機金属化合物を含めた電気化学的ルミネッセン ス性化合物からなる。標識付けされた物質の存在を決定する電気化学的ルミネッ センス法は、多くの理由から他の方法よりも好ましい、それらは、特別な標識の 存在の診断に極めて役に立ち、感度が高く、危険がなく、安価であり、極めて広 い用途に利用することができる。適切な電気化学的標識になる有機化合物には、 例えばルブレン及び９．１０−ジフェニルアントラセンが含まれる。多くの有機 金属化合物が適切な電気化学的標識になるが、特に有用なのは、Ｒｕ含有及びＯ ３含有化合物である。

Ｒｕ含有及びＯ５含有有機金属化合物はは文献に論じられている。カイスは、Ｒ ｕの如き第１族の貴金属を含めたどのような金属元素又は金属元素の組合せでも 、原子吸収法により検出可能な有機金属標識の適切な成分になるであろうと言う ことを開示している（カイスの特許の第１１ｉ第２０行）、シかし、ルテニウム はカイスの好ましい金属ではなくオスミウムは特に言及されておらず、記載され た方法のいずれについてもＲｕ又は○Ｓを用いた効いズ 率につややは何のデーターも与えられておらず、好ましい検出法、原子吸収では 試料の破壊を伴っている。

電気化学的標識としてＲｕ含有又はＯｓ含有錯体を使用することが記載されてい る。記載された錯体は、結合によってアナライトのアミノ基に結合される。ウェ ーバ−は、それら標識と他のアナライトのヒドロキシ基とからカルボン酸エステ ルが形成される可能性を示唆している。

標識付けされた物質の存在は、ウェーバ−によれば、光学膜を持つ電気化学的流 動電池及び消光剤を含む方法及び装置で決定することができる。光電気化学的に 活、性な標識は、光励起により、電子を消光分子へ移動させ、次に酸化された分 子は、適当な電位に保たれた流動電池の電極からの電子によって還元される。こ の電子が光電流として測定される。その系中の遊離の標識付けされたアナライト の量は、その光電流信号によって決定される。

この方法は発光物質の電気化学的ルミネッセンス検出法の逆である。

後の報告で、ウェーバ−その他は、Ｒｕ含有標識を検出するのにこの方法を用い ることに伴われる問題を論じている。′１ゝ　ウェーバ−その他１）の表２には 、トリス（ビピリジル）ルテニウム（ｎ）の外挿検出限界は最適条件下で１．ｌ Ｘｌｏｏｌｏモル／Ｌであることが示されている。これらの標識を実際に用いる ことは錯体混合物の存在下での測定を伴うであろうと言うことを予想して、ウェ ーバ−その他は、彼らの系での電位干渉物に付いて試験した。

ウェーバ−その他の表３には、恐らく実際的検出限界を実質的に１．ｌＸ１０− ”モル／Ｌより高く上昇させるであろう干渉物として、ジメチルアルキルアミン 、ＥＤＴＡ、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ、Ｎ’−ジメチルピペラジン、ヒ化合物 で行われた。ウェーバ−又はウェーバ−その他による報告には、Ｒｕ含有標識で 標識付けされた錯体物質を検出する限界、或は標識付けされた物質と標識との間 の千オ尿素結合が検査条件で安定であるか否かに付いての研究は報告されていな い。

本発明が関与する特別な標識は電気化学的ルミネッセンス性である。それらは屡 々、それら化合物を電磁波又は典型的なオキサレート−Ｈ２０２系によって生ず るようできる。更に、これらの化合物のルミネッセンスは、それらの酸化及び還 元を伴う電気化学的方法によって惹き起こすことができる。

光ルミネツセンス、化学的ルミネッセンス及び電気化学的ルミネッセンス手段を 用いてＲｕ（２，２’−ビピリジン）、２゛を検出する方法について多くの研究 が報告されている。（２，，３）この研究は、明るいオレンジ色の化学的ルミネ ッセンスは、化学的に発生した又は電気的に生じたＲｕ（ｂｐｙ）３”（式中、 “ｂｐｙ”はビピリジルリガンドを表す）と、オキサレートイオン又は他の有機 酸の酸化で中間体として生じた強い還元剤との水性反応に基づいていることを示 している。ルミネッセンスは、電気的に発生した、又は化学的に生じたＲ　ｕ　 （ｂｐｙ）　３　’　”と、ベルオキシジサルフェートの還元中に生じた強い酸 化剤との反応により有機溶媒−Ｈ，Ｏ溶液中で達成することも８来る。

Ｒｕ（ｂｐｙ）ｓ”から電気化学的ルミネッセンスが生ずる第三の機構には、Ｒ ｕ（ｂｐｙ）：＋’＋を生ずるのに充分な負の電位とＲ’（ｂｐｙ）ｓ”を生ず るのに充分な正の電位との間の電極電位の振動が含まれる。これらの三つの方法 は、夫々“酸化的還元（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）”、゛還元 的酸化（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ　ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）”及び”　Ｒｕ（ｂｐｙ） ｚコ゛′９再生方式”と呼ばれている。

酸化的還元法は水中で行なうことができ、酸素又は不純物の存在に比較的不怒性 で、強く効率的で安定なルミネッセンスを生ずる。　Ｒｕ（ｂｐｙ）ｚ”からの このルミネッセンスは、オキサレート又は、ピルベート、ラクテート、マロネー ト、タートレート及びシトレートの如き他の有機酸の存在及びＲｕ（ｂｐｙ）３ ”を酸化的に生ずる手段に依存する。この酸化は、ＰｂＯ２又はＣｅ（ＩＶ）塩 の如き強い酸化剤によって化学的に達成することができる。それは、連続的に又 は間欠的に適用される充分に正の電位によって電気化学的に達成することができ る。　Ｒｕ（ｂｐｙ）ｓ”の電気化学的酸化に適した電極は、例えば、ｐｔ、熱 分解黒鉛及びガラス状炭素である。オキサレート又は他の有機酸は化学的ルミネ ッセンス中消費されるが、反応室中で消費される物質を過剰存在させることによ り何時間も強く一定の化学的ルミネッセンスを得ることができる。

還元的酸化法は、例えば、アセトニトリルの如き有機共溶媒を含む部分的に水性 の溶液中で行なうことができる。このルミネッセンスはベルオキシジサルフエー トの存在及びＲｕ　（ｂｐｙ）３’　”物質を還元的に生ずる手段に依存する。

還元は、例えば、マグネシウム又は他の金属の如き強い還元剤によって化学的に 行なうことができる。それは、連続的又は間欠的に適用される充分に負の電位に よって電気化学的に行なうことができる−　Ｒｕ（ｂｐｙ）ｚ”の電気化学的還 元に適した電極は、例えば、研磨したガラス状炭素電極である。゛酸化的還元法 の場合のように、過剰の反応物を含有させるか、反応混合物へ消費される反応物 を連続的に添加することにより連続的で強いルミネッセンスを何時間も得ること ができる。

Ｒｕ（ｂｐｙ）３””再生方式は、アセトニトリルの如き有機溶媒中又は部分的 に水性の系中で、Ｒｕ（ｂｐｙ）３”°を還元するのに充分な負の電位とＲｕ（ ｂｐｙ）ｓ”を酸化するのに充分な正の電位との間の電極でをパルス化すること により行なうことができる。そのような再生方式に適した電極は、例えばｐｔｔ 極である。この方式は化学的反応物を消費せず、原理的に際限なく進行させるこ とができる。

ルミネッセンス性Ｒｕ含有化合物を生成させるこれら三つの方法では、共通して Ｒｕ含有化合物の酸化的還元又は還元的酸化が反復して行なわれる。従って、こ れら化合物を含有する溶液のルミネッセンスは、適用されるエネルギー源の電位 に高度に依存し、従って、Ｒｕ含有化合物の存在の診断に極めて役立つものであ る。

マントルはカーチス（Ｃｕｒｔｉｓ）その他１４１を化学的ルミネッセンス用の 可能な標識として引用している。カーチスその他は、Ｒｕ錯体を、オキサレート ／　Ｈ２０２系によって化学的に励起された時、光を発するように誘導すること ができると言う未公表の観察だけを報告している（力−チスその他、ｐ、３５０ ）、マントルもカーチスも、化学的ルミネッセンスの用途或は電気化学的ルミネ ッセンス方式の利用で、ルテニウム及びオスミウムの錯体が異常な有用性を持つ ことに気が付いていない。

ステル化されたトリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（Ｉｔ）の錯体を記 述し、これら表面活性剤錯体の単分子層膜を創っている。これら錯体は光ルミネ ツセンス性である。

エステル基の光加水分解に起因する。

親出願の米国特許出ｉｌｌ　Ｓ　ｅｒｉａｌ　Ｎ　ｏ、８５８．３５４及びｐｃ Ｔ　８７／　００９８７に記載されているように、検査したい種々のアナライト 及びそれら検査したいアナライトに結合する化学的物質は、アミド又はアミン結 合によってＲｕ含有又はＯｓ含有標識に都合よく付けることができるであろう０ 次にそれら標識付けさハ、た物質を、種々の手段のいずれかによって検出するこ とができるが、今までの所最も効率的で信頼性のある怒度の高い手段は、光ルミ ネツセンス、化学的ルミネッセンス及び電気化学的ルミネッセンスによる手段で ある。Ｒｕ含有及びＯ８含有標識を含む電気化学的ルミネッセンス性標識は特に 融通性があり、有利である。

〔本発明の要約〕

本発明は、次の式を有する化学的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）にある： ［Ｒｅ（Ｐ　）ｍ（Ｌ　’　）ｎ（Ｌ　”）ｏ（Ｌ　３）ｐ（Ｌ　鴫）ｑ（Ｌ　 ５）ｒ（Ｌ　’）ｓコ　ｔ＜Ｂ　）ｕ　（１）〔式中、ＰはＲｅのポリデンテー ト（ｐｏｌｙｄｅｎｔａｔｅ）リガンドであり、Ｌｌ、Ｌｌ、Ｌ３、し４、ＬＳ 及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ＜： Ｂ！、ｔＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ’、Ｌｌ、Ｌ３、Ｌ４、Ｌｌ又は Ｌ６の一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか又はそれより大き い整数であり；ｎ、　ｏ、　ｐ、ｑ、　ｒ及びＳの各々は０又は整数であり；ｔ は１に等しいか又はそれより大きい整数であり；Ｕは１に等しいか又はそれより 大きい整数であり、Ｐ、Ｌｌ、Ｌｌ、１、ｆｆ、Ｌ４、ｌｓ、ｌ、＠及びＢは、 前記化学的モイエティが電磁波を放出するように誘導することができ、Ｒｅのリ ガンドによって与えられるＲｅへの全結合数がＲｅの配位数に等しいくなるよう な組成及び数を有する〕。

この化学的モイエテイの特に好ましい例は、次のものからなる： 〔式中、ＸとＹ′及びＹとＹ′は同じでも異なっていてもよく、Ｘ及びＹ′はＮ 　（ＣＨ２Ｈ％）！、ＣＨＩ、ＣＨ，○、Ｃｓ　Ｈｓ、Ｃ１、ＣＯ２ＣＨ２、Ｃ Ｎ、又はＮ　Ｏｘ　テよく、Ｙ及びＹ′はＨ又はＣＨ３でよく、もしＸとＹ′及 びＹとＹ′が同じで、ＸがＣＯ，ＣＨｓであるならば、ＹはＨではなく、更にも しＸとＹ′及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及びＹがＨではなく；そしてＲ は陰イオンである〕。

金属レニウムを含有する電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティの主な利 点の第一は、これらのモイエティの製造が容易なことである。ビピリジル及び非 ビビのモイエティの最終的機能のために用いることができる。

同様なＲｕ（ＩＩ）錯体に対し、Ｒｅ（１）錯体によって与えられる更に重要な 利点は、Ｒｅへ結合するリガンドの一つ以上の置換基を選択することにより、可 視スペクトル領域（即ち、５００ｎｌＩ〜８００ｎＩ＋１）の殆どに亙ってＲｅ （１）錯体による発光波長（即ち色）を調節することができることである。この 性質の原因は、それら錯体の量子力学的性質に存在する。これらの錯体の量子効 率もＲｕ（ＩＩ　）のものより優れている。

Ｒｅ錯体は、式ｌを有する化学的モイエテイの存在を適当な条件下で形成し；（ ｂ）前記試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は電磁波エネ ルギーに曝すことにより前記モイエティが電磁波を発するように誘導し：そして （ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによって前記化学的モイエティの存 在を決定することからなる。

本発明のこれらの方法には、化学的モイエティが化学物質と結合し、即ち、化学 物質と特別な複合体を形成することができる場合のそのそイエティを検出するこ とが含まれる。

式Ｉを有する化学的モイエティに結合する検査したいアナライトの存在を決定す るための方法も、アナライトと化学的モイエティが競争的に相補的物質に結合す る場合に、検査したいアナライトの存在を決定する方法と同様に記述される。

本発明は、検査したいアナライトの存在又はその量を、多成分液体試料の予め定 められた体積中で検出する方法にもあり、それは：　（ａ）レニウム含有化合物 を含む電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティを有する試薬と試料とを接 触させ、然も、前記化合物は＜ｉ）前記試薬が繰り返し輻射線を発するように誘 導するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁気的エネル ギーに曝すことによって繰り返し電磁波を発するように誘導することができ、そ して（ｉｉ）検査したいアナライトと前記試薬とを結合するような適当な条件で 接触を行なうことにより、前記アナライトと結合することができ；（ｂ）得られ た試料を、前記試薬が輻射線を繰り返し発するように誘導するのに有効な量の、 適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁気的エネルギーに露出し、然もその 露出を、前記試薬が電磁波を繰り返し発するように誘導するのに適切な条件下で 行い；そして（ｃ）そのようにして放出された電磁波の量を検出又は定量的に測 定し、それによって試料中の検査したいアナライトの存在を検出し、或は定量す ることからなる。

本発明は、多成分液体試料の予め定められた体積中で、その試料中に存在する検 査したいアナライトの存在又はその量を検出する方法にもあり、それは：（ａ） レニウム含有化合物を含む電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティを有す る試薬と試料とを接触させ、然も、前記化合物は（ｉ）前記試薬が繰り返し輻射 線を発するように誘導するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学的 又は電磁気的エネルギーに曝すことによって繰り返し電磁波を放出するように誘 導することができ、そして（ｉｉ）試料中には通常存在しない相補的物質の結合 部位をめて、検査しないアナライトと、その相補的物質と共に、競争することが できるような化合物であり、然も、前記接触は、検査したいアナライトと前記試 薬とを前記相補的物質に競争的に結合するような適当な条件で行ない；（ｂ）得 られた試料を、前記試薬が輻射線を繰り返し発するように誘導するのに有効な量 の、適当な源がらのな条件下で行い；そして（ｃ）そのようにして放出された電 磁波の量を検出又は定量的に測定し、それによって試料中の検査したいアナライ トの存在を検出し、或は定量することからなる。

本発明は、液体食物又は食物ホモジェネート中の種々の検査したいアナライトの 存在又はその旦を検出し、同定する方法にもある。その方法は：（ａ）液体食物 又は食物ホモジェネート中に、液体又は固体懸濁物中へ浸漬するのに適した診断 薬保持体で、複数の試薬がそれに固定されている診断薬保持体の一部を浸漬し、 然も、前記試薬の各々は、前記診断薬保持体に明確に区別できる領域に固定され ており、検査したい唯一っのアナライトと複合体を形成し、固体された試薬−検 査したいアナライト複合体を形成することができ；（ｂ）前記液体食物又は食物 ホモジェネートから前記診断薬保持体を取り出し；（ｅ）前記診断薬保持体を適 当な濯ぎ溶液で濯ぎ；（ｄ）前記固定試薬−検査したいアナライト複合体を含む 前記診断薬保持体の一部を検出溶液へ浸漬し、然も、その溶液は前記固定試薬− 検査したいアナライト複合体との複合体を形成することができる少なくとも一つ の検出試薬を含み、固定試薬−検査したいアナライト−検出試薬複合体を形成す ることができ；（ｅ）診断薬保持体の前記区別可能な領域上の、固定試薬−検査 したいアナライト−検出試薬複合体の存在を検出し、それによって前記液体食物 又は食物ホモジェネート中の複数の検査しないアナライトの存在又は量を検出し 且つ同定することからなる。

〔図面の簡単な説明〕

第１図は、本発明のＲｅ含有モイエティを製造するための方法の概略的工程図で ある。

第２図は、オスミウム含有内部標準物質の電気化学的ルミネッセンス強度に与え るレニウム含有キャリプラント（ｃａｌｉｂｒａｎｔ）の濃度の影響を示す補正 グラフである。

第３図は、レニウム含有キャリプラントの電気化学的ルミネッセンスに与えるオ スミウム含有内部標準物質の影響を示す曲線を示す図である。

Ｃ本発明の詳細な記述〕 」１ｒ達瀘ｊ化学的モイエテイ 本発明は、次の式を有する化学的モイエティにある；［Ｒｅ（Ｐ　）ｍ（Ｌ　’ 　）ｎ（Ｌ　”）ｏ（Ｌ　’）ｐ（Ｌ　’）ｑ（Ｌ　’）ｒ（Ｌ　’）ｓｌ　ｔ （Ｂ　）ｕ　（１）〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり；Ｌｌ、 Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、し５及びＬ６はＲｅのリガンドでその各々は違いに同じでも 異なっていてもよく；ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌｌ、Ｌ”、Ｌ３ 、Ｌ４、Ｌ５又はＬ６の一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか 又はそれより大きい整数であり；　ｎ、　ｏ、ｐ、　ｑ、ｒ及びＳの各々は０又 は整数であり；ｔは１に等しいか又はそれより大きい整数であり；Ｕは１に等し いか又はそれより大きい整数であり、Ｐ、Ｌ’、Ｌ２、Ｌコ、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６ 及びＢは、前記化学的モイエティが電磁波を放出するよう↓こ誘導することがで き、Ｒｅのリガンドによって与えられるＲｅへの全結合数がＲｅの配位数に等し 〆くなるような組成及び数を有する〕。

この化学的モイエティは、Ｒｅの少なくとも一つのポリデンテート　リガンドを もたなければならない、もしそのモイエティが一つより多くのポリデンテート　 リガンドを有するならば、それらポリデンテート　リガンドは同じでも異なって いてもよい、ポリデンテート　リガンドには芳香族及び脂肪族リガンドが含まれ る。適当な芳香族ポリデンテート　リガンドには、芳香族複素環リガンドが含ま れる。好ましい芳香族複素環リガンドは、例えば、ビピリジル、ビピリジル、チ ルピリジル、フエナントロイル及びポルフィリンの如く窒素を含有する。

適当なポリデンテート　リガンドは、・当分野で知られている多くの置換基のい ずれかによって置換されてぃてもいなくてもよい、）ｉ！当な置換基には、例え ば、アルキル、置換アルキル、アリール、ｔＸアリール、アラルキル、置換アラ ルキル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアン、 アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミ ジン、グアニジウム、ウレイド、マレイミド、硫黄含有基、燐含有基及びＮ−ヒ ドロキシスクシンイミドのカルボキシレートエステルが含まれる。

更ニ、Ｌｌ、１！、Ｌ３、Ｌ４、Ｌｓ及びＬ’の少なくトモ一つは、ポリデンテ ート芳香族複素環リガンドであってもよい、更に、これらポリデンテート芳香族 複素環リガンドの少なくとも一つは窒素を含んでいてもよい、適当なポリデンテ ート　リガンドには、ビピリジル、ビピリジル、チルピリジル、フエナントロイ ル、ポルフィリン、置換ビピリジル、１換ビビラジル、置換チルピリジル、置換 フエナントロイル又は置換ポルフィリンが含まれるがそれに限定されるものでは ない、これらの置換ポリデンテート　リガンドは、アルキル、置換アルキル、ア リール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、力！レボキシレート、カ ルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、 ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイ ド、マレイミド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカ ルボキシレートエステルで置換されてもよい。

本発明の一つ１１として、化学的モイエテイは二つのビデンテー）　（ｂｉｄｅ ｎｔａｔｅ）リガンドを含み、その各々はビピリジル、ビピリジル、チルピリジ ル、フエナントロイル、置換ビピリジル、置換ビピリジル、置換チルピリジル、 又は置換フエナントロイルである。

本発明の別な態様として、化学的モイエテイは三つのビデンテートリガンドを含 み、その各々はビピリジル、ビピリジル、チルピリジル、フエナントロイル、置 換ビピリジル、置換ビピリジル、置換チルピリジル、又は置換フエナントロイル である０本発明の更に別なり様として、二つのビデンテート　ビピリジルリガン ド、及び一つ置換ビデンテート　ビピリジルリガンドを用いてもよい。

本発明の更に別のＷ５様として、化学的モイエティはポルフィリンスは置換ポル フィリンの如きテトラデンテート　リガンドを含んでいる。

この化学的モイエティは一つ以上のモノデンテートリガンドを持っていてもよく 、その種々のものが当分野で知られている。適当なモノデンテート　リガンドに は、例えば、−酸化炭素、シアン化物、イソシアン化物、ハロゲン化物、及び脂 肪族、芳香族及び複素環ホスフィン、アミン、スチルビン及びアルシンが含まれ る。

適当なリガンドには、次の構造を持つ化合物が含まれる： （式中、ｎはり数である）、好ましい態様として、ｎは２で別の適当なリガンド は次の構造を持つ化合物である：（式中、ｎは整数である）、好ましい態様とし て、ｎは３である。

別なリガンドは次の構造を持つ化合物である：（Ｙは結合腕である）、一つの態 様として、Ｙは次の構造（式中、鶴及びｎは、同じでも異なっていてもよく、１ に等しいか又はそれより大きな整数である）０本発明の一つＲ様として、請は３ であり、ｎは２である。

更に別なリガンドは次の構造を持つ化合物である：（式中、毘及びｎは整数であ り、同じでも異なっていてもよい）０本発明の一つ態様として、輸及びｎは共に １である。

ま　いレニウム　モイエーイ 本発明の好ましいレニウム含有モイエティは、次の式： 〔式中、ＸとＸ′及びＹとＹ′は同じでも異なっていてもよ＜、Ｘ及びＸ′はＮ 　（ＣＨ２Ｈｓ　）　２、ＣＨ，、ＣＨ，Ｏ１Ｃ６Ｈｓ、ＣＩ、ＣＯ，ＣＨ，、 ＣＮ　、−又はＮＯｚでよく、Ｙ及びＹ′はＨ又はＣＨ，でよく、もしＸとＹ′ 及びＹとＹ′が同じで、ＸがＣ０２ＣＨ，であるならば、ＹはＨではなく、更に もしＸとＹ′及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及びＹがＨではなく；そして Ｒは陰イオンである〕。

有利に用いられる化合物は、Ｘ及びＹが下の表１に示されているような化合物で ある。製造方法、収率及びλ（ＣＨ，ＣＮ）も示されている。

表１ ｘ　ｙ’　収率％　λ　ＣＨ，ＣＮ”、”Ｎ（ＣｚＨｓ）２Ｈ酸　５８　５０９ ｎ＋。

ＣＨ，ＣＨ，銀　３３　５２６ ＣＨ３Ｈ銀　８０　５２６ ＨＨ酸　９０　５６７ ＣＨ３Ｈ銀　７４　５６９ Ｐｈ　Ｈ酸　２５　５７９ 引　Ｈ銀　２４　６０３ ＣＯ，ＣＨコ　Ｈ銀　１８　６２５ ＣＮ　Ｈ Ｎｏ、　Ｈ酸　５６　６７５ 分上ＪＬユ ＣＨ，ＣＮ　□水□ 化合物　最大発　Ｏｒ　ｔ　発光（脱ガ空気’ｆｕｌｌ　ｎｒａ’　ス　ｆ Ａ（ＮＥｔ）２５２８　０．１１０２　８０　５３０　４９２３　７１１（ｄｇ ）３３９８ Ｂ　（Ｍｅ）、　５６５　０．０９０７　１９０　５４５　８（１６８５６（ｈ ）１５００ Ｃ（ＯＣＨコ）ｚ　５８４　０．０１９５　７１　５９０　９３　６６（ｄｇ） １５５ Ｄ’（Ｍｅ）２　５８２　０．０３５２　１０９　５７５　１４２　１４０（ｄ ｇ）２８２ Ｅ　（０）２　６０２　０．０５６６　１８４　５９０　１４３　１４０（ｄｇ ）３５１ Ｆ’（ＣＩ）２　６３６　０．００６４　３１　６２５　２５　２３（ｄｇ）３ ６ Ｇ（ＣＯ□Ｍｅ）、６６０　０．０１２２　６１　６４０　７４　４０’　−３ ５５での励起 ２−Ｎ２ガスレーザー励起３３７ ３−これらの化合物は、脱イオン水で８倍に希釈した１゜Ｘ連続緩衝溶液（ｐＨ ７，５に、０．１ＭＭｇＣｌ、、０．５Ｍ　ＮａＣｌで緩衝された０、１Ｍ　ト リス−ＨＣＩ）中で６５℃で１５分開放熱すると安定になることが見出された。

他の化合物は試験されなかったが、同様に挙動するものと思われる。

本発明の適切な化合物は次の構造を持つ（式中、ｎは整数であり、好ましくは２ 又は３であり、ｍはｌ、２又は３であり、好ましくはｌであり、ＷはＣＨＯｌＣ ＯＯＨ、Ｎ　Ｈ２又はＢｒであり、Ｒは陰イオンである）。

ビビルジル基は上で述べた如く、Ｗ換されていてもいなく一つの化合物は次の通 りである： （式中、Ｒは陰イオンであり、ｎは好ましくは２又は３である）。

別の化合物は次の通りである： （式中、ｎは２又は３である）。

更に、別の化合物は次の通りである： （式中、ｎは２又は３である）、′ 更に、別の化合物は次の通りである： （式中、ｎは２又は３である）。

これらの化合物は次の構造を有する組成物からなって（式中、Ｘは、一つ以上の 同じか又は異なるヌクレオチド、一つ以上の同じ又は異なるアミノ酸、抗体、検 査したいアナライト又は検査したいアナライトのアナローブを表し、ＹはＺに結 合する結合基を表し、ｎは整数を表し、Ｚは本発明によって与えられる化合物を 表す）、Ｘは、例えば、テオフィリン、ジゴキシゲニン、又はｈｃＧから誘導さ れたペプチドでもよい。

本発明によって次の構造を有する組成物も与えられる。

Ｘ−ＣＨ”ＣＨ−ＣＯ−Ｎ　Ｈ（ＣＨｚ）ｎ−Ｎ　Ｈ−ＣＯ−ＣＣＨ＊）＋＊− Ｚ （式中、Ｘは一つ以上の同じか又は異なるヌクレオチドを表し、 Ｚは電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティを表し、 ｎは１に等しいか又はそれより大きな整数を表し、そして 蒙は１に等しいか又はそれより大きな整数を表す）。

本発明の一つ態様として、Ｚはビス（２，２’−ビピリジン）［４−（ブタン− １−アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジンコレニウムである。

本発明の更に別のＢ様として、チミジンヌクレオチドは、ヌクレオチド配列 ＴＣＡＣＣ＾＾Ｔ＾＾ＡＣＯＧＣ＾＾＾ＣＡＣＣＡＴＣＣＯＧＴＣＣＴＧＣＣＡ Ｇに結合した３′末端ヌクレオチドである。

次の構造を有する組成物も与えられる：［Ｔ−Ｙ−Ｚコレ（Ｒ） （式中、Ｔはテオフィリンを表し、ＹはＺに結合する結合基を表し、Ｚはビス− （２，２’−ビピリジン）［４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル］ （Ｉ）を表し、Ｒは陰イオンを表す）。

本発明の一つｓ様として、ＹはＴの８位置の炭素に結合している０本発明の更に 別のＢ様として、Ｙは次の構造を有する： （ＣＨｔ）ｍ−ＣＯ−Ｎ　Ｈ−（ＣＨｚ）ｎ（式中、−及びｎは同じか又は異な る１に等しいか又はそれより大きな整数を表す）０本発明の別の態様として、鴎 は３であり、ｎは４である０本発明の別の態様として、−及びｎは両方共゛３で ある。

本発明の更に別の態様として、Ｙは次の構造を有する（式中、鵬、ｎ及びｒは、 同じか又は異なる１に等しいか又はそれより大きな整数を表す）０本発明の一つ の態様として、顔は１であり、ｎは１であり、ｒは４である。

本発明の更に別のＢ様として、ＹはＴの７の位置の窒素に結合している０本発明 の一つの態様として、Ｙは次の構造を有する： （ＣＨｚ）ｎ （式中、ｎは１に等しいか又はそれより大きな整数を表す）。

本発明の更に別の！ｌ！１ｍとして、ｎは４である。

次の構造を有する組成物も本発明に含まれる。

χ−２ （式中、Ｘは、システィン又はメチオニンである少なくとも一種類のアミノ酸を 含み、同じか又は異なる一つ以上の％アミノ酸を表し、Ｚは、システィン又はメ チオニンの硫黄置換基へマレイミドの３又は４位置の炭素によって結合したビス （２，２’−ビピリジン）マレイミドヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピ リジン−４′−ブチルアミドレニウムである。

Ｒｅのリガンドの一つ以上が、例えば、放射性アイソトープ、蛍光成分、又は付 加的ルミネッセンス性ルテニウム含有又はオスミウム含有中心の如き付加的な化 学的標識に結合される場合も本発明の範囲に入る。

標識付けされた物質（Ｂ）が、一つより多くの、例えば、二つ、三つ、四つ又は それ以上の電気化学的ルミネッセンス中心によって標識付けされる場合も本発明 の範囲に入る。

適当な物質（Ｂ）には、多くの生物学的物質、例えば、全細胞、ウィルス、細胞 内粒子、蛋白質、脂質蛋白質。

糖質蛋白質、ペプチド、核酸、多糖類、リボ多糖類、薬理学的薬剤、トランキラ イザー、パルピッレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及び 砂糖が含まれる。全細胞は動物、植物又は細菌のものでもよく、生きてるもので も死んでいるものでもよい１例として菌類及び線虫類の如き植物病原菌が含まれ る０本明細書中、用語「細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）粒子」とは、細胞内 の細胞器官、破壊した細胞からの膜粒子、細胞壁断片、リポソーム、多酵素複合 体、及び生きている有機体から導くことができる他の粒子を意味する。また本明 細書中、「核酸」とは染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ、及び 種々の源から誘導された組替えＤＮＡを意味する。また核酸には、ＲＮＡ−例え ば、メツセンジャーＲＮＡ、リポソームＲＮＡ及びトランスファーＲＮＡが含ま れる。ポリペプチドには１例えば、酵素、輸送蛋白質、レセプター蛋白質、及び ウィルス外皮蛋白質の如き構造蛋白質が含まれる。好ましいポリペプチドは酵素 及び血清から誘導された抗体である。特に好ましいポリペプチドはモノクローナ ル抗体である。ホルモンには、例ペプチド、合成核酸、及び合成の膜、小胞及び リポソームの如き生物学的物質に化学的に類似した合成物質を含めることも本発 明の範囲に入る。上述したことは、本発明で用いるのに適した生物学的物質の包 括的リストにすることを窓口しているのではなく、本発明の広い範囲を単に例示 しているだけである。

重合体材料を含めた標識付けした非生物学的物質を含むことも本発明の範囲内に 入る。これらの物質は可溶性重合体分子の形でもよく、或は、例えばビーズ、或 は試験管、瓶、試験容器等のよ°うな容器の如き種々の既知の巨大な形をしたも ののいずれかの形をしていてもよい。

生物学的及び非生物学的物質（Ｂ）はＲｅのリガンドに共役していてもよい、そ の共役はアミド又はアミン結合による。それら結合は、物質（Ｂ）がアミド結合 のカルボニル又は窒素に直接結合するように配向していてもよい。

これらの化学的モイエティはイオン化していてもよい。

そのような場合には、その化学的モイエティの形成電荷を中和するのに多くの異 なった反対イオンを有するものが役立つことは当業者には分かるであろう、適当 な陽イオンには、例えば、Ｈ゛、ＮＨ，”、グアニジニウム、Ａｇ”、Ｌｉｏ、 Ｎａ”、Ｋ”、Ｍｇ　２　’″、Ｍ　ｎ”及びＣｄ２°が含ま一層及びテトラフ ルオロボレートが含まれる。

Ｒｅ　モイエーイの杉、 金属レニウムを含む電気化学的ルミネ・ンセンス性化学的モイエテイの主な利点 は、それらモイエテイを製造しやすいことにある。ビピリジル及び非ビピリジル 誘導体の両方共、それらモイエテイの合成、及び検査したいアナライトに共役す るそれらモイエテイの最終的機能で用いることができる。

レニウムモイエテイは、３．４又は５工程を必要とするオスミウム及びルテニウ ム錯体とは対照的に２工程法で合成することができる。第１図は本発明のレニウ ム含有モイエティを製造するのに用いられる二つの方法工程を概略的に示してい る。

第１図に関し、ルミネッセンス性Ｒｅ（１）錯体を製造するための出発材料はＲ ｅ（Ｃｏ）ｓｃｌである。希望のＲｅ（１）錯体の合成には二つの工程が含まれ ている。第一の工程では、キレート性２，２′−ビピリジン　リガンドによって ＣＯを置換して平面異性体（ｆａｃｉａｌ　ｉｓｏｍｅｒ）、ｆａｃ−（Ｌ）Ｒ ｅ（Ｃｏ）３ＣＩを生成させる。Ｌはキレート性２，２′−ビピリジン　リガン ドで、例えば、１）ｐｙ、　Ｃ１２ｂｐｙ、（ＣＯ２ＣＨ５）ｚｂｌ））’、（ Ｎ　Ｏｚ）ｚｂｐｙ、　Ｍｅ２ｂｐｙ、　Ｐ　ｈｚｂｐｙ。

（ＣＨｓｏ　）ｚｂｐｙ、　Ｍ　ｅａｂｐｙ、或は（Ｎ　Ｅ　ｔ２）ｚｋｌｌ） ｙである。

ｆａｃ−（Ｌ　）Ｒｅ（ＣＯ）ｓの対応するｆａｃ−（Ｌ　）Ｒｅ（ＣＯ）２（ Ｅ　ｔｐｙ）　（ＲＫ　（式中、ＲはＣＦ３ＣＯ３−１ＰＦ、−１ＣＩＯ，−で ある）への転化は、酸性か又は銀法によって達成することができる。

酸性は、強い酸性媒体に対し不怒性、即ち安定なビピリジル　リガンドにとって 有用である。それには、中間体Ｒｅ（１））リフレート物質を製造し、分離し、 次に４−ピリジルエタン誘導体に転化することが含まれる。

銀法は極めて酸性の環境中で分解を受けやすいビピリジルリガンドを含む錯体、 例えば、Ｌ　＝　（ＣＨ３０Ｌｂｐｙ又は（ＣＯＯＣＨｓ＞２ｂｐＶの場合に用 いられる。この方法では、可溶性銀トリフルオロメタンスルホネート塩をｆａｃ −（Ｌ　）Ｒｅ（ＣＯ））ＣＩ物質と反応させ、ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（Ｃ０）３ （０３Ｓ　ＣＦ　３）モイエティ及び不溶性ＡｇＣ＋を形成させる。？過により ＡｇＣｌ沈澱物を除去した後、溶液をその場で４−ピリジルエタンと反応させ、 希望の生成物を生成させる。

ここに記載するＲｅ（Ｉ）錯体によって与えられる、同様なＲｕ（ＩＩ）錯体に 勝る他の重要な利点は、Ｒｅ（１＞８体の発光波長（即ち色）を可視スペクトル 範囲の殆ど（即ち、５００ｎ−〜８００ｎｍ）に互って調節することができるそ れらの能力に関する。この性質の原因は、それら錯体の発光機構の量子力学的特 性にある。

Ｒｕ（ＩＩ　）錯体のルミネッセンス機構の量子力学的分析では、０）僅かな例 外を除いて、流体溶液中で室温ルミネッセンスが観察されるためには、Ｒｕ（Ｉ ｆ）へ三つのキレート性ビピリジル又はフエナントロイル型リガンドを配位させ ることが必要であり；（２）発光状態に近いエネルギーで存在する量子状態は、 Ｒｕ（ＩＩ）錯体かち得られるルミネッセンス強度を制限し；（３）キレート性 ビピリジル又はフエナントロイルリガンドに置換基を入れても、Ｒｕ（Ｉ［）錯 体の発光エネルギーにほんの僅かな変化しか与えず；　（４）Ｒｕ（Ｉ［）錯体 では最大発光波長が増大すると、一般に発光効率が低下する；ことが示されてい る。これらの因子は流体溶液中室温で利用可能な波長範囲を５８０ｎｍ〜７５（ ｌｎｍへ制限している。

レニウム錯体の発光機構についての同様な分析では、（１）室温流体溶液中での 発光には、Ｒｅ（１）中心に僅か一つの配位ビピリジル又はフエナントロイルリ ガンドが存在しさえすればよいことが示されている。三つのＣ○リガンドも必要 であるが最終的モノデンテート配位リガンド（例えば、ＣＩ、ピリジン、ＣＨ， ＣＮ等）の選択にはかなりの余裕がある。最大発光波長は、このモノデンテート 　リガンドの種類及びキレート性ビピリジル又はフエナントロイルモイエティの 置換模様によって調節される。このことが一つには、ＲＬＩ（ＩＩ）錯体よりも これらの錯体の場合に一層広い範囲の発光波長を利用できる結果を与えている。

Ｒｅ（１）錯体の場合には、発光を妨げることがある発光状態に近いエネルギー を持つ量子状態は存在しない。

これに対しＲｕ（ＩＩ）錯体の場合には、最大発光波長が増大するに従って一般 に発光効率は低下する。

即ち、Ｒｅ（Ｉ）錯体の利用可能な発光波長範囲は約５００ｎ　ｍ　〜８００　 ｎ　ｍである。Ｒｕ（ＩＩ）錯体よりもＲｅ（１）錯体のほうが赤色応答が信か に増大しているのは、主にＲｕ（ＩＩ　）発光スペクトルよりもＲｅ（１）発光 スペクトルのほうが幾らか増大した広さをもつことに起因する。

このように、Ｒｅ（１）錯体はＲｕ（ＩＩ　）化合物に比較して広い範囲の利用 可能な発光波長を有する。Ｒｅ（Ｉ）錯体の独特な構造によって、Ｒｕ（Ｉｆ　 ）錯体で可能になるよりも、一層大きな融通性が得られ、且つ錯体の精造的変更 による希望の最大発光波長を一層選択し易くなっている。

Ｒｕ（ＩＩ　＞よりもＲｅ（Ｉ）の方が利用できる発光波長の範囲が広くなって いることにより、幾つかのルミネッセンス性Ｒｅ（Ｉ）物質の溶液中の一つのＲ ｅ（Ｉ）錯体による発光を、競合するＲｅ（Ｉ）ルミネッセンス発光体による干 渉及び誤差を最小にして測定することができる。

Ｒｅ　モイエーイ　いた　れた　′ モイエティを含む１ｍ”　ｌ　参咎参適当な条件下で形成し；（ｂ）試薬混合物 を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は電磁波エネルギーに曝すことに より前記部分が電磁波を発するように誘導し；そして（ｃ）その放出された電磁 波を検出し、それによって前記化学的モイエティの存在を決定することからなる 。

試薬混合物を形成するのに適切な条件は、当業者に知られおり、含まれる試薬混 合物の種類に依存するであろう０例えば、水性試薬混合物に適した条件には、化 学的モイエティ、酸化剤の如き他の試薬の適切な濃度、ｐＨ１塩濃度等が含まれ るであろう。固体試料の場合、試薬混合物を形成するために適した条件には、伝 導性液体の添加が含まれるであろう６本発明の方法には、化学的モイ出する方法 が含まれる。適当な化学物質には、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖 類、蛋白質、糖質蛋白質、脂質蛋白質、リボ多糖類、脂質、脂肪酸、ペプチド、 細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、パルピッレート、 アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸及び砂糖或は非生物学的重合体 が含まれる。本発明の一つの態様として、化学物質は検査容器の表面に固定され ていてもよい、別のＢ様として、化学物質は血清から誘導された抗体又はモノク ローナル抗４混合物の如き複雑な混合物中のジゴキシン又はジギトキシンの如き 標識付けされた抗原の存在を、先ずその混合物を、検査したい抗原に対し特異性 の固定された抗体に曝し、次にその固定された抗体に結合した標識付けされた物 質の量を測定することにより決定するのに用いることができる： 本発明には、式Ｉを有する化学的モイエテイに結合す含む梓讐÷会尋ミ適当な条 件下で形成し；（ｂ）試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又 は電磁波エネルギーに曝すことにより前記モイエテイが電磁波を発するように誘 導し；そして（ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによって検査したいア ナライトの存在を決定することからなる。　アナライト及び、式Ｉを有する化学 的モイエティが競争的に相補的物質に結合する場合に検査したいアナライトの存 在を決定する方法も与えられる。“相補的物質”とは、検査したいアナライトと 検査したい標識付けされたアナライト又は検査したいアナライトの標識付けされ たアナローブの両方と複合体を形成することができる物質を意味する。その方法 は：（ａ）相補的物質、Ｒｅ含含有化学モモイエティ含む化学的モイエティ、及 びアナライトを試薬混合物を形成するような適当な条件下で接触させ；（ｂ）試 薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は電磁波エネルギーに曝 すことにより前記化学的モイエティが電磁波を発するようにさぜ；そして（ｃ） その放出された電磁波を検出し、それによって検査したいアナライトを決定する ことからなる。

“電磁波を発生するよう誘導し”と言う言葉は、外囲温度で２００ナノメーター （ｎ−）〜９００ｎｍの波長で発光する化学的モイエティの励起状態を創りだす ことを意味する。

リガンドの化学的構造の変化は、発光励起状態を創りだすのに必要な入力エネル ギーの値を変化させる。同様に、放出される電磁波の波長は、レニウム含有物質 の性質及び環境に依存する。

一般に光ルミネツセンス励起及び発光は、約２００ｎｍ〜約９０Ｏｎ−の波長の 電磁波で起きる。同様に、化学的ルミネッセンス及び電気化学的ルミネッセンス 発光は、−ｉに約２００ｎｍ〜９００ｎｍの波長の放出電磁波で起きる。化学的 モイエティの還元又は酸化が起きる電位は、その正確な化学的構造の外、溶液の ｐＨ及び用いられる電極の性質の如き因子に依存する。光ルミネツセンス系中の 最適発光及び励起波長及び、電気化学的ルミネッセンス及び化学的ルミネッセン ス系の最適電位及び発光波長の決定の仕方は良く知られている。

存在するルミネッセンス性物質の量を定量する多くの方法がある。系へのエネル ギー人力率はルミネッセンス物質の尺度を与える０例えば、適当な測定方法には ルミ波エネルギーの吸収が含まれる。更に、ルミネッセンス性物質は、放出され た電磁波を測定することによって検出することができる。これらの測定方法は、 全て連続的レート依存（ｒａｔｅ−ｂａｓｅｃｌ）測定、或は長い時間に亙って 信号を追加する累積法として行うことができる。レート依存測定は、光電子増倍 管、光ダイオード、光トランジスターを用いて、入射光強度に大きさが比例した ｔ流を生ずるように行なわれるか、又は電荷結合装置を用いて行うことができる 。累積法の例は、レート依存データーの積分及び累積データーを直接与える写真 フィルムの使用がある。

これらのルミネッセンスに基づく方法は、全てレニウム含有化合物によって繰り 返えされるルミネッセンスを用いている。検出可能な事項のこの反復性により、 これらの標識を、放射性アイソトープ又はルミノールの如き結合化学的ルミネッ センス性分子から区別することができる。後者の標識は、標識分子（又は原子） 一つ当たり唯一回しか検出可能な事項を生ぜず、そのためそれらの検出性が制約 されている。

これらの方法に有用な化学的モイエティ中に生物学的及び非生物学的物質Ｂを、 Ｒｅに直接配位させるか、又はＲｅのリガンドに結合することによりそれらの部 分中に組み込むことができる。結合は共有結合、又は静電気的又は水素結合によ り行われてもよい、物質ＢをＲｅのリガンドに共有結合させる多くの手段が利用 できる０例知られている多くの結合のいずれかでよい、結合の種類は、リガンド の置換基、及び標識付けされる物質のリガンドと結合するのに用いられる適当な 化学基によって決定されるであろう。

検査したいアナライトと化学的モイエティは、特別な仕方で一緒に結合すること ができるどのような対になった物質でもしよい、そのような物質には、例えば、 全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白質、糖質蛋白質、脂質蛋白 質、リボ多Ｎ類、脂質、脂肪酸、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的 薬剤、トランキライザー、パルピッレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミ ン、アミノ酸、砂糖及び非生物学的重合体が含まれる。特に重要なものは抗体− 抗原対である０本発明の一つの態様として、細胞表面抗原の存在を決定するため 、或は細胞分類法によって検出するのに特別の細胞に標識付けするために、標識 付けされた抗体を使用することが含まれる０例えば、固定された標識のない抗体 に取り付けることにより固定された抗原は、「はさみけされた抗体によって検出 することができる。

本発明の一つの態様として、Ｂはヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。他 の態様として、Ｂは血清から誘導された抗体又はモノクローナル抗体である。

競争結合検査方法では、Ｂは検査したいアナライト又はアナライトのアナローブ と同じ物質で、相補的物質と特異性複合体を形成するのに関与することができる ものでよい、そのようなアナライト及相補的な物質には、全細胞、ビールス、細 胞内粒子、核酸、多Ｉ！顕、蛋白質、糖質蛋白質、脂質蛋白質、リボ多糖類、脂 質、脂肪酸、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライ ザー、パルピッレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖 及び非生物学的重合体が含まれる。そのようなアナライト及び相補的物質の又は モノクローナル抗体、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片が含まれる。特に重要なものは 抗体−抗原に基づく方法である。これらの方法は当分野でよく知られているラジ オイムノアッセイに似ており、原理的に放射性標識付けされた化合物の代わりに 、本発明による標識付けされたモイエティを用いることにより有利に用いること ができる。

本発明は、更にここで与える化学的モイエテイを用いた不均質又は均質結合方法 にある。不均質結合方法では、結合された標識付けされた物質は、標識の存在を 測定する前に、結合されていない標識付けされた物質から物理的に分離されなけ ればならない、これは屡々、一つの成分、例えば、抗体をフィルターの如き不溶 性マトリックス又はビーズ試験管の如き反応容器の表面に付着させて固定するこ とにより抗体−抗原系で達成することができる。抗原含有溶液をフィルターを通 し、又は反応容器中へ注ぎ、次にフィルター又は反応容器の側から洗浄除去する 。抗体に特異的に結合した抗原だけが残り、決定される。

これに対し均質方法では、結合及び結合されていない標識付けされた物質が、標 識の存在を測定する時、同じ反応混合物中に存在する。これは、結合が、標識か ら検出可能な信号の性質を変化するときに可能である。均質系でルミネッセンス 性標識を用いる多くの方法が存在する０例えば、化学的モイエティにアナライト を結合することは、標識から検出できる信号に直接影響を与えることがある。更 に、ルミネッセンス消光物質を抗体に配置し、標識付けされた抗原がその抗体に 結合すると、抗体のルミネッセンス消光物質により標識のルミネッセンスが抑制 されるようにしてもよい、ルミネッセンス性標識のための多くの均質方法が当分 野で知られており、その幾希ボグスラスキー及びＬｉによる「均質免疫検査ｊ＾ ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ、Ｚ：４０１−４１４（１９８２）に再掲されている。

本発明の一つの態様として、アナライトは不溶性マトリックスに固定される。そ のような方法は、はさみ検査として行われてもよい、即ち、化学的モイエテイが 固定されたアナライトに結合し、結合していない部分がマトリックスから洗浄除 去される。他の態様として、化学的モイエティが結合することのできる化学物質 を不溶性マトリックスに固定し、化学的モイエテオを生物学的流体又は反応混合 物の一成分とする。相補的物質は不溶性マトリックスに固定してもよい０本発明 の不均質又は競争。

法の両方で、相補的物質はモノクローナル抗体で、不溶性マトリックスが検ｉ容 器の表面でもよい。

本発明の方法は、試薬混合物を化学的、電気化学的、又は電磁気的エネルギーに 曝すことにより行なってもよく、或は試薬混合物を化学的、電気化学的、又は電 磁気的エネルギーの組合せに曝してもよい。

化されもよい、そのような源の一つは酸化剤である。そのような酸化剤の例には 、Ｃｅ（ＩＶ）塩又はｐｂｏ、が含まれる。化学的モイエティはエネルギー源に 曝すことにより還元されてもよい、一つのそのような源は化学的還元剤である。

適当な還元剤の例はマグネシウムである０本発明の方法には、化学的モイエティ が一回より多く電磁波を発するように誘導することが含まれる。

試薬混合物は、オキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネート、シトレー ト、タートレート、ベルオキシジサルフェートを含んでいてもよい、更に、化学 的モイエティは、エネルギー源に曝すことによって還元されてもよく、試薬混合 物はベルオキシジサルフェートを含んでいてもよい、化学的モイエティは、エネ ルギー源に曝すことによって酸化されてもよく、試薬混合物は、オキサレート、 ピルベート、ラクテート、マロネート、シトレート又はタートレート、を含んで いてもよい。

化学的モイエティを検出する種々の方法が与えれ、そ位は、前記化学的モイエテ ィの還元を行なうのに充分な電位と、化学的モイエティの酸化を行なうのに充分 な電位との間で振動する。

化学的モイエティは、電位が化学的モイエティの酸化を行なうのに充分な電位の 上下で振動する電極に曝されることによって酸化されてもよく、試薬混合物は、 オキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネート、シトレート、タートレー ト、ベルオキシジサルフェートを含んでいてもよい、更に、化学的モイエティは 、エネルギー源に曝すことによって酸化されてもよく、試薬混合物は、オキサレ ート、ピルベート、ラクテート、マロネート、シトレート又はタートレート、を 含んでいてもよい。

化学的モイエティは、電位がそれを還元するのに充分な電位の上下で振動する電 極に曝されることによって還元されてもよく、試薬混合物は、ベルオキシジサル フェートを含んでいてもよい、そのような試薬混合物は更にアセトニトリルを含 んでいてもよい、更に、化学的モイエティは、電位がそれを還元するのに充分で 一定な電極に曝されることによって還元されてもよく、試薬混合物は、ベルオキ シジサルフェートを含んでいてもよい、そのような試薬混合物はアセトニトリル を含んでいてもよい。

化学的モイエティが電気化学的又は化学的エネルギーに曝されると、放出された 電磁波が連続的に検出される。

そのような電磁波は目で見て又は光ダイオードを用いて検出してもよい、更に、 化学的モイエテイが電気化学的又は化学的エネルギーに曝された時、放出された 電磁波を累積的に、例えば、写真フィルムを用いて検圧してもよい。

本発明は、式Ｉを有するレニウム含有化学的モイエテイの存在の検出又はその量 を測定するための装置にも関する。その装置は：（ａ）レニウム含有化学的モイ エティを含む試薬混合物；（ｂ）化学的モイエティが電磁波を発するようにさせ るための手段；及び（ｃ）放出された電磁波を検出する手段を有する。

本発明は、式Ｉを有するレニウム含有化学的モイエティに結合する検査したいア ナライトの存在の検出又はその量を測定するための装置にも関する。その装置は ：（ａ）レニウム含有化学的モイエティ；（ｂ）化学的モイエティを検査したい アナライトと接触させ、試薬混合物を形成するための手段；（Ｃ）化学的モイエ ティが電磁波を発するようにさせるための手段；及び（ｄ）放出された電磁波を 検出する手段を有する。

特に有用で独特な種類の均質結合検査方法が本発明によって与えられる。前に述 べた如く、これらの標識は、検査したい標識付けされた物質の溶液を電極に曝す 手段により電気化学的に測定することができる。溶液中に存在するが、電極の表 面に達することができない標識付けされた物質は検出されないであろう、これは 、例えば、標識付けされた物質が電極の入った反応容器の表面に直接又は間接的 に結合されているか、又は標識が、抗原−抗体複合体内部の如く、特殊な複合体 の内部に深く埋め込まれるか、又は電極自身が、標識付けされた物質が通過する ことができるが複合体化した標識付けされた物質は通過することができない層に よって被覆されている場合に起きる。更にｌ、電極の表面を抗体で被覆し、固定 された抗体に結合した標識付けされた抗原だけが電極に接近することができ、そ れによって検出されるようにすることができる。この特別な均質方法は、必要な 電極電位を短いパルスとして印加する場合に最も有効であろう。

標識付けされた化合物の存在を決定するための手段の組合せを用いることも本発 明の範囲に入る０例えば、光ルミネツセンス又は化学的ルミネッセンスの如き、 結合された標識付は物質と結合されていない標識付は物質とを区別しない手段に よって標識付けされた物質の全量を測定し、例えば、電気化学的ルミネッセンス の如き、結合された標識付は物質と結合されたていない標識付は物質とを区別す る手段によって結合された標識付は物質の量を測定することが望ましいであろう 、そのような方法の組合せは、同じ試料で行なうことができ、それによって個々 に用いられた方法で得られるよりも豊富な情報源を試料について与えることがで きるであろう、同じ反応混合物中に存在する二つ以上の異なる標識付けをされた 化合物を決定することも本発明の範囲に入る。これは、もし標識が異なった波長 の電磁波を発生するならば、或はもし標識が異なった値又は源のエネルギーに曝 されることによって電磁波を発生するようにさせることができるならば可能であ る。

喪！去韮 本発明は、多成分液体試料の予め定められた体積中で、約１０−コモルより低い 濃度でその試料中に存在する検査したいアナライトを検出する改良された方法に もあり、それは：（ａ）レニウム含有有機化合物を含む電気化学的ルミネッセン ス性化学的モイエティを有する試薬と試料とを接触させ、然も、前記試薬は（ｉ ）前記試薬が繰り返し輻射線を放出できるように誘導するのに有効な量の、適当 な源からの化学的、電気化学的又は電磁気的エネルギーに曝すことによって繰り 返し電磁波を放出するように誘導することができ、そして（ｉｉ＞検査したいア ナライトと一緒にすることができ、然も前記接触は、アナライトと前記試薬とを 結合するような適当な条件で行なわせ；（ｂ）得られた試料を、前記試薬が繰り 返し輻射線を発することができるように誘導するのに有効な量の、適当な呂でき るように誘導するのに適切な条件下で行い；そして（ｃ）そのようにして放出さ れた電磁波を検出し、それによって試料中の検査したいアナライトの存在を検出 することからなる。

「モル」とは、１１当たりのう８液中のアナライトのモル濃度、又は１１当たり の液体試料中に存在する粒子又は構成単位（Ｂｉｔ）の数を意味する０例えば、 ＩＩ！当たり１×１０２３個の粒子は１モルとして表してもよい。

不均質検査、即ち、非結合標識対は試薬が結合標識性は試薬から、結合標識性は 試薬が電気化学的エネルギーに曝す前に分離される検査、及び均質検査、即ち、 非結合標識対は試薬と結合標識性は試薬が電気化学的エネルギーに一緒に曝され る検査として行なうことができる。

本発明の均質検査では、結合標識性は試薬によって放出された電磁波は、非結合 標識対は試薬によって放出された電磁波から、非結合標識対は試薬と比較して結 合標識性は試薬によって放出された電磁波の量が多いか又は少ないか、又は異な った波長の電磁波であるかないかによって区別することができる。

料を電気化学的エネルギーに曝す前に分離される１本発明の別の態様として、試 料と試薬とを接触させる前に、試料を、検査したいアナライトを固定するように 処理する。

検査したいアナライトを固定する種々の方法が当分野でよく知られており、それ には、試料を、ポリスチレン、ニトロセルロース又はナイロン表面、又は全細胞 、細胞内粒子、ウィルス、プリオン（ｐｒｉｏｎ）、ピロイド（ｖｉｒｏｉｃｌ ）、脂質、脂肪酸、核酸、多糖類、蛋白質、脂質蛋白質、リボ多糖類、糖質蛋白 質、ペプチド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、パ ルピッレート、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖、非生物 学的重合体、合成有機分子、有機金属分子、又は無機分子で被覆された表面と接 触させることが含まれる。検査したいアナライトは、これらの物質のいずれでも よく、或は検査したいアナライトは、試料中に約ＩＱ−１２モルより低い濃度で 存在する全細胞、細胞内粒子、ウィルス、プリオン、ピロイド、核酸、蛋白質、 脂質蛋白質、リボ多糖類、糖質皺白質、ペプチド、ホルモン、薬理学的薬剤、非 生物学的重合体、合成有機分子、有機金属分子、又は無機分子でもよい、検査し たいアナライトは、試料中に約１０１モルより低い濃度で存在する全細胞、細胞 内粒子、ウィルス、プリオン、ピロイド又はルス、プリオン、ピロイド、脂質、 脂肪酸、核酸、多糖類、蛋白質、脂質蛋白質、リボ多糖類、糖質蛋白質、ペプチ ド、細胞代謝物質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、パルピッレー ト、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖、非生物学的重合体 、化学的ルミネッセンス性化学的モイエティである１本発明の一つの態様として 、試薬は、抗体、抗原、核酸、ノ１性モイエテイである。

試料は、固体、エマルジョン、懸濁物、液体又は気体から誘導されたものでよい 、更に、試料は、水、食物、血液、血清、尿、便、組繊、唾液、油、有機溶媒又 は空気から誘導されてもよい、更に、試料は、アセトニトリル、ジメチルスルホ キシド、ジメチルホルムアミド、ｎ−メチルピロリドン又はｔ−ブチルアルコー ルを含んでいてもよい。試料は、還元剤又は酸化剤を含んでいてもよい。

本発明は、多成分液体試料の予め定められた体積中で、約１０１モルより低い濃 度でその試料中に存在する検査したいアナライトを検圧する改良された競争的方 法にもあり、それは：（ａ）レニウム含有有機化合物を含む電気化学的ルミネッ センス性化学的モイエテイを有する試薬と試料とを接触させ、然も、前記試薬は 、（ｉ）前記試薬が繰り返し輻射線を放出できるように誘導するのに有効な量の 、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁気的エネルギーに曝すことによっ て繰り返し電磁波を放出するように誘導することができ、そして（ｉｉ）検査し たいアナライトと、試料中に通常は存在しない相補的物質上の結合部位をめて、 その相補的物質と共に競争することができ、然も、前記接触は、検査したいアナ ライトと前記試薬とが前記相補的物質に競争的に結合するような適当な条件で行 なわせ；（ｂ）得られた試料を、前記試薬が繰り返し輻射線を発することができ るように誘導するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁 波エネルギーに露出し、然も、その露出を前記試薬ガ繰り返し電磁波を放出でき るように誘導するのに適切な条件下で行い：そして（ｃ）そのようにして放出さ れたライトの存在を検出することからなる。

〔実施例〕

１工ｌ 礼且及Ｊユ１ することなく用いた。４．４’−ジメチル−２，２′−ビピリジンることなく用 いた。用いられた他のピリジル及びビピリジルリガンドには次のものが含まれて いた：４．４′−ビス（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）−２，２’−ビピリジン４． ４’−（ジメトキシ）−２，２’−ビピリジン［（ＣＨ３−０）ｔｂｐｙｌ〔ウ ェンケルト　Ｄ、ウッドワード　Ｒ，Ｂ、、　Ｊ、　Ｏｒｇ。

す□５旦＋２８３（１９８３）、ｌ　；以ｄユ蓼１．工■１」ユヨ、工：４６４ ７（１９８５））　；４．４′−ビス（カルボメトキシ）−２，２’−ビピリジ ン［（Ｃ○２１幕 レンス）からのケンピュア（Ｃｈｅ＋５ｐｕｒｅ）級で、受は取ったまま用いた 。ＥＭプサインティフィックにニューシャーシー　チェリーヒル）からのア七ト ン（Ａ、Ｃ，Ｓ、試薬級）及びアセトニトリル（オムニーソルブ）は更に精製す ることなく用いた。ベンゼンはフィッシャー・サイエンティフィック（ニューシ ャーシー　スプリングフィールド）がらのＡ、Ｃ，Ｓ、試薬級であり、受は取っ たまま用いた。

リップスバーグ）からのトルエン（ペンカー・アナライズド試薬、ＨＰＬＣ級） は更に精製することなく用いた。

Ｊ、Ｔ、ベンカー・ケミカルズからのテトラヒドロフランるまでシュア・シール （Ｓｕｒｅ−Ｓｅａｌ）（商標名）（アルドリッヒ）瓶中に保存した。ジメチル ホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）はＡ、Ｃ，Ｓ、試薬級（Ｄ　Ｍ　Ｆ　）で、受は 取ったまま用いた。

水はミリポア・ミリ−Ｑ　（Ｍ　１ｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍ　１ｌｌｉ−Ｑ）装置を 用いて脱イオン化した。

久ユヱ上グユｌ 中性吸収アルミナ（フィッシャー）は受け取ったまま用いた。クロマトグラフ用 オタワサンド及びガラスラー人され、使用直前に１２時間撹拌メタノール中に懸 濁することにより活性化して使用した。ＳＰ−セファデックスＣ−ＺＳ（ミズー リ　セントルイス、シグマ）は、使用直前に２時間沸騰水中で撹拌することによ り活性化しな。

ｉユ夏１ ナトリウム金属、ベンゾフェノン（ゴールドラベル）、トリフルオロメタンスル ホン酸（ＨＯ３ＳＣＦ、、即ち、トリフリＭ（ｔｒｉｆｌｉｃ　ａｃｉｄ））及 びトリフルオロメタンスルホン酸銀（Ａ　ｇＣＦ　３Ｓ　Ｏ２、即ち、トリフリ 酸銀）は全てアルドリッヒから受け取ったまま用いた。トリフルオロメタンスル ホン酸無水物（（ＣＦ３ＳＯ□）２０）（マサチューセッツ　ダンバーズ、アル ファー・ペントロン）は得られたまま用いた。アンモニウムへキサフルオロホス フェート（Ｎ　Ｈ４Ｐ　Ｆ　ｓ）　（アルドリッヒ）は更に精製することなく用 いた。ＮａＣ１及びＮａＣｌＯ４は共にフィッシャー・サイエンティフィックか らのＡ、Ｃ，Ｓ、試薬級で、受は取ったまま用いた。ペンタカルボニルレニウム （Ｉ）クロライド、（ＣＯ）ｓＲｅＣＩ、はプレッシャー・ケミカル社（ペンシ ルバニア　ビッッパーグ）から購入された。無水硫酸ナトリウム及び指示トリエ ライト（商標名）（ＣａＳＯ，、無水物）はアルドリッヒから得られた。

ロバーツ・オキシゲン社（メリーランド　ロックビル）がらのアルゴンガスは、 使用前に指示トリエライトのカラム（内径Ｂ　ｉｎＸ高１２ｉｎ）に通過させる ことにより乾燥した。

シル（Ｄ　Ａ　Ｄ　Ｍ　Ｕ　）は使用前にアルゴン中メタノール／石油エーテル により再結晶した。無水ＬｉＣｌ０．及び塩化インニコチノイル塩酸塩は、アル ドリッヒから受け取ったまま用いた。フィッシャーからのＡ、Ｃ，Ｓ、試薬級（ ケンピュアブランド）は受け取ったまま用いた。

モールＲｅ　Ｐ　の合 ルミネッセンス性Ｒｅ（Ｉ）ｆ１体のための一般的合成方法は第１図に例示され ている。ルミネッセンス性Ｒｅ（１）錯体を製造するための出発材料はＲｅ（Ｃ Ｏ）ｓＣＩであった。乾燥Ｒｅ（１）錯体の合成には二つの工程が含まれている 。第一の工程では、キレート性２，２′−ビピリジンリガンドによってｃｏを置 換して平面異性体、ｆａｃ−（Ｌ）Ｒｅ（Ｃｏ）ＩＣＩを生成させる。Ｌはキレ ート性２，２′−ビピリジン　リガンドで、例えば、ｂｐｙ、ＣＬｂｐｙ、（Ｃ ｏ２ＣＨ５Ｌｂｐｙ、（Ｎ　ＯｚＬｂｐｙ、　Ｍ　ｅｚｌ）Ｉ）Ｆ、　Ｐ　ｈｚ ｂｐｙ、（ＣＨｓｏ　）ｚｂｐｙ、　ＭｅｎｂｐＦ、或は（Ｎ　Ｅ　ｔｚ）ｒｂ ｐｙである。一般的合成法を下に記述する。

還流凝縮器及び撹拌棒を具えた２５０１１１に３６１．７ｚｙ（１ｍＭ　）の（ Ｃｏ）ｓＲｅｃｌ、１．０２ｍＭの希望のビピリジルリガンド、例えば、１８７ ｍｇのＭｅｚｌ）Ｉ）Ｆ及び８０〜１００＋ｊ！のトルエンを添加した。溶液に アルゴンを気泡として通し、１５分間脱ガスし、撹拌しながら９０分開アルゴン 雰囲気中で還流した。この期間中、生成物は通常溶液から沈澱した。フラスコを 室温へ冷却した後、沈澱した生成物を吸引瀘過により収集し、１５１１ずつの冷 却トルエンで二次洗浄し、次に１５ｘｌずつのジエチルエーテルで三日洗浄し、 ３０分間空気吸引乾燥した。乾燥は、−晩Ｃａ５Ｏ，の入った真空乾燥器で完了 した。もし冷却中に生成物の沈澱が起きなかった場合には、撹拌したトルエン溶 液にジエチルエーテルを滴下することにより沈澱とおこさせた。この反応から得 られた生成物は分析的に純粋であった。生成物への転化は次の二つ方法のいずれ かによって達成された。

友≧土二盈１韮 この方法は、強い酸性媒体に対し不感性、即ち安定なビピリジルリガンドに有効 である。それは、中間体のトリフリ酸Ｒｅ（Ｉ）錯体の生成及び分離と、それに 続く４−ピリジルエタン誘導体への転化を含んでいる０次の例はその手順を例す るものである。

ｆａｃ−（Ｎ　Ｅ　ｔｚ＞ｚｂ　Ｒｅ（ＣＯｓＳ　ＣＦ　ｓ　（”製造撹拌棒を 具えた２５０ｚｉ’の丸底フラスコに、４５６ｚｇ（０，７５ｍＭ＞のｆａｃ− ［（Ｎ　Ｅ　ｔｚ）ｔｂｐｙ］Ｒｅ（ＣＯ）ｓｃ　Ｉ及び３０ｘｅの塩化メチレ ンを添加した。その撹拌した懸濁物へ１．３４ｉｆ（必要量の２０倍）のトリフ ルオロメタンスルホンＭ　ＨＯ５ＳＣＦｆｆ及び３〜５滴のトリフルオロメタン スルホン酸無水物（ＣＦ　ｓ　Ｓ　Ｏ２）２０を添加した。固体は直ちに溶解し 、暗黄色の溶液を与えた。フラスコに蓋をし、溶液を室温で３時間撹拌し、その 後で生成物を、撹拌した溶液へ無水ジエチルエーテルを２００ｚｊ’添加するこ とによって分離した。吸引涙過により黄色の生成物ｆａｃ−［（Ｎ　Ｅ　ｔｚ） ｚｂｐｙコＲｅ（Ｃｏ）、（ＯｐＳＣＦｓ）が分離された。沈澱した生成物を３ ０１１１ずつの無水ジエチルエーテルで６回洗浄し、微量のトリフルオロメタン スルホン酸を除去し、空気吸の［（Ｎ　Ｅ　ｔｚ）２ｂｐｙｌＲｅ（ＣＯ）３（ Ｏｓ　Ｓ　ＣＦ　３）　（［（Ｎ　Ｅ　ｔｚ）ｚｂｐｙ］Ｒｅ（Ｃｏ）、ｃｌに 基づき９３％〕を生じた。生成物は応するＥ　ｔｐＦ錯体へ変換することができ る０次にその手順を例示する。

ｆａｃ−（ＮＥｔｚ　□ｂ　Ｒｅ（Ｃｏ　５（Ｅｔ　（ＣＦ　ｔｓＯｓΔＵ 撹拌棒及び還流凝縮器を具えた２５０ｘｌの丸底フラスコに、１５０ｚＦＩ（０ ，２ｍＭ　）のｆａｃ−［（Ｎ　Ｅ　ｔｚ）２ｂｐｙ］Ｒｅ（ＣＯ）！（○ｓ　 Ｓ　ＣＦ　３）及び５０１１のエタノールを添加した。その混合物へ０．２４ｚ ｆ（必要量の１０倍）の４−ピリジルエタンを添加しな、溶液にアルゴンを気泡 として通すことにより１５分間脱ガスし、撹拌しながらアルゴン雰囲気中で２時 間遠去した。粗製生成ｅＪ　ｆａｃ−［（Ｎ　Ｅ　ｔｚＬｂｐｙ］Ｒｅ（ＣＯ） ｔ（Ｅ　ｔｐｙ）　（ＣＦ　ｓ　Ｓ　Ｏｓ）からなる残留試料を過剰の４−ピリ ジルエタン中に溶解した。試料を再少量（５〜１５ｚｆｆ）の１　：　２　（ｖ ／ｖ）　ＣＨ３ＣＮ　／　）ルエン中に溶解し、３０ｃｉＸ　３ｃｚ内径カラム と用いた中性アルミナ（吸着アルミナ、フィッシャー・サイエンティフィック） によりクロマトグラフにかけた。　１　：　２　（ｖ／ｖ）ＣＨ２ＯＮ／　トル エンによる溶離で過剰の４−ピリジルエタンリガンドを除去した。黄色の生成物 帯、ｆａｃ−［（Ｎ　Ｅ　ｔｚ）２ｂｌ）ＦコＲｅ（ＣＯ）３　（Ｅ　ｔｐｙ） （ＣＦ、Ｓｏ、）を１　：　１　（ｖ／ｖ）ＣＨｓＣＮ／）ルエンで溶離した。

幾らかあとを引くのが観察されたが、少量の未同定の紫色物質からの完全な分離 が行われた。生成物を含む溶媒部分を１回転蓋発器で乾燥するまで蒸発した。残 渣を５ｚ（の塩化メチレン中に溶解１〜、再び回転蒸発器を用い溶媒を蒸発した 。淡黄色の１片状のｆａｃ−［（Ｎ　Ｅ　ｔｚｈｂｌ）ＦコＲｅ（ＣＯ）ｘ（Ｅ 　ｔｐｙ）（ＣＦ　３　Ｓ　Ｏｓ＞が出発［（Ｎ　Ｅ　ｔｖ）ｚｂｐｙ］Ｒｅ（ ＣＯ）ｓ　（Ｏｓ　Ｓ　ＣＦ　ｓ’）に基づき５０％の収率で得られた。生成物 は分析的１こ純粋であった。

Ｃ２１Ｇ　３　ｓ　Ｎ　ｓ　Ｏ＊　Ｓ　Ｆ　ｓ　ＲｅＣＨＮＯ 理論　４２．２４　４．２４　８．５０　１１．６４分析値　４２．９４　４． ５１　８．２４　１１．９９Ｌ目ｌ二里ユニ 極めて酸性の環境中で分解を受けやすいビピリジルリガンド、例えば、Ｌ　＝　 （ＣＨ３０）ｚｂｐｙ又は（ＣＯＯＣＨ５）ｚｂｐｙを含む錯体のために銀法を 用いた。この方法（ＣＯ）ｓ（Ｏｓ　Ｓ　ＣＦ　３）モイエティ及び不溶性Ａｇ Ｃ＋を形成した。−過によりＡｇＣｌ沈澱物を除去した後、溶液をその場で４− ピリジルエタンと反応させ、希望の生成物を得た。この手順では中間生成物ｆａ ｃ−（Ｌ　）Ｒｅ（ＣＯ）ｘ（０３Ｓ　ＣＦ　！＞塩を分離する試みは行なわれ なかった０次にその方法を例示する： ｆａｅ−ＣＩ　ｂ　Ｒｅ（Ｃｏ　５（Ｅｔ　ＣＦ　５Ｏ３）の制造銀トリフルオ ロメタンスルホネート、ＡｇＣＦｓ；３０ｚは怒光性なので、全ての操作は赤色 安全光の元で暗室で行なった。

テトラヒドロフラン（Ｔ）（Ｆ）をＮａ／ベンゾフェノンでアルゴン雰囲気中で ９０分間還流することにより乾燥した。溶媒を使用直前に蒸留により収集した。

撹拌棒及び還流凝縮器を具えた乾燥２５０ｚｊｌ’の丸底フラスコ内容物をガラ スフリットロート（微細気孔）を用いて吸引濾過し、ＡｇＣ１沈澱物を除去した 。ＡｇＣ１沈澱物を丸底フラスコに添加した。０．７５２（６，５９＋＋＋Ｍ　 ）の４−ピリジルエタンを添加し、溶液にアルゴンを気泡として通すことにより １５分間脱ガスし、アルゴン雰囲気中で２時間還流した。

橙褐色の溶液を室温に冷却した後、回転蒸発器を用いかで精製した。

五皿ユ ｆａｃ−［（Ｎ　Ｅ　ｔ２）ｚｂｐｙｌＲｅ（ＣＯ））　（Ｅ　ｔｐｙ）　＜ｃ 　Ｆ　）　Ｓ　Ｏ３）を精製するための方法Ｉに記載したように１　＋　２　（ ｖ／ｖ）ｃｏｓｃＮ／トルエンを用いたアルミナカラム（高さ１５ｉｎ×内径２ 　ｉｎ）を調製した。試料を１０〜１５１１の１：２（ｖ／ν）ＣＨ，ＣＮ／ト ルエン中に溶解し、カラムに入れた。

１　：　２　（ｖ／ｖ）ＣＨ，ＣＮ／　）ルエンによる溶離で、（Ｃ１２ｂｐｙ ）　Ｒｅ（ＣＯ）２　ＣＩとして同定された小さい黄色の帯を除去した−　１　 ：　１　（ｖ／ｖ）　ＣＨ３ＣＮ　／　トルエンによる溶離で、狭い橙褐色帯を 除去した。この重複は反応の収率をｆａｃ（Ｃ１ｚｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）３Ｃｌ に基づき１７％に限定した。

黄色の生成物の帯があとを引いたが、それは、カラム上の幾つかの連続した黄色 、紫色及び褐色の帯から明確に分離された。これらの副生成物を分離或は同定す る試みは行われなかった。　ｆａｃ−（Ｃｌ２ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）３（Ｅ　ｔ ｐｙ）（ＣＦ　ｓ　Ｓ　Ｏ３）生成物の分離は、方法１でｆａｃ−［（Ｎ　Ｅ　 ｔ２ｈｂｐｙｌＲｅ（Ｃｏ）３（Ｅ　ｔｐｙ）（ＣＦ　３Ｓ　Ｏ３）について記 述したのと同じであった。

１皿ユ 精製手順としてイオン交換クロマトグラフを用いることによって錯体の収率が改 善された。ＳＰ−セファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）Ｃ−２５イオン交換樹 脂のカラム（内径２ｃ１１×長さ３０ｃｘ）を水中で調製した。生成物調製で得 られたスラリーを約１０ｚｆＨ２０と混合し、アセトンを均質な溶液が観察され るまで滴下した。ＳＰ−セファデックスむ樹脂をカラムへ導入した。Ｈ２Ｏで溶 離し、４−ピリジルエタンを除去し、０．２５Ｍ　ＮａＣＩ水溶液を用いてＣ１ −塩として非荷電ｆａｃ−（Ｃｌ２ｂｌ）Ｆ）Ｒｅ（ＣＯ）３（Ｅ　ｔｐｙ）” 陽イオンを溶離した０反応の副生成物がカラム上に残った。

その生成物を、その生成物を含有する０、２５Ｍ　Ｎ　ａＣｌ溶液へＮＨ，ＰＦ ａ飽和水溶液を滴下することによりＰＦ、−塩として分離した。　ｆａｃ−（Ｃ Ｉ□ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）ｌ　（Ｅ　ｔｐｙ）（Ｐ　Ｆ　ｓ）沈澱物をガラスフ リットフィルター（中程度気孔）で吸引−過により収集した。生成物を、−滴の ＮＨ，ＰＦ６飽和溶液を含む１０ｘｉ’のＨ２Ｏ中に懸濁した。アセトンを固体 が完全に溶解するまで添加した０回転蓋発器でアセトンを室温でゆっくり蒸発さ せることにより、錯体を純粋な形で沈澱させた。錯体をガラスフリットフィルタ ー（中程度気孔）で吸引濾過により収集し、氷で冷却した１０ｗ１のＨｚＯで洗 浄した１次に錯体を１５１１ずつのジエチルエーテルで２回洗浄し、空気吸引で ３０分間乾燥した。

Ｃａ５Ｏ＝を入れた真空乾燥器に一晩入れることにより乾燥を完了した。　（Ｃ Ｌｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）ＩＣＩに基づき２４％の収率が得られた。少量の明るい 黄色の結晶であるｆａｃ−（Ｃ１ｚｂｐｙ）　Ｒｅ（ＣＯ）ｌ　（Ｅ　ｔｐｙ） （Ｐ　Ｆ　ｉ）は分析的に純粋であった。

Ｃｚ。Ｈ、ｓＮ　＊ＯｓＣＬＲｅＰ　Ｆ　ａＣＨＮ 理論値　３２．１４　２．０２　５．６２分析値　３２．８０　２．１２　５． ４９一般に、ＮＥｔ２、ＣＨ２Ｏ、ＣＨ，、等の如き電子放出置換基を有する錯 体はきれいに反応し、手順１を用いて容易に精製された。　２．２’−ビピリジ ンリガンドのＣ１又はＮＯ２の如き電子吸引基を含む錯体は、手順２を用いて最 もよく精製される。そのような錯体中の２．２′−ビピリジン　リガンドの電子 吸引性は、見掛けのＲｅ（１）中心から電子雲を引きつける。その結果起きるＲ ｅ中心での部分的正電荷の増大は、Ｒｅ（１）とＣＩ−との間の静電気的引力を 増大する結果になる。得られたＲｅ−Ｃｌ結合の強化は、銀陽イオンＡｇ”又は ＨＯｌＳＣＦ、の存在で遊離性基としてのＣＩ−の効果を減少する。結局、副生 成物を発生させるＲｅ（１）−ＣＩｎ体内の他の点に対するそれら物質の攻撃は 、単純なＣし置換と競争的になる。明らかに得られる荷電生成物はイオン交換樹 脂を用いて最もよく分離される。

今日まで合成されたｆａｃ−（Ｌ　）Ｒｅ（ＣＯ）ｓ（Ｅ　ｔｐｙ）（ＣＦ　３ Ｓ　Ｏ））錯体及び精製後の収率及び製造方法（酸一方法Ｉ；銀一方法■）の要 約が表４に示されている。

ＣＨ，ＣＮ中の錯体の最大放射も列挙されている。放射スペクトルはパーキン・ エルマーＬＳ−５型蛍光分光計を用いて得られた。

放射スペクトルは波長による検出器感度の変動に対し補正しておらず、これらの 化合物を用いて得られる放射波長範囲を定性的に示すために与えられているだけ であ−・アナライト複合体モデルとして製造されている。その製造を下に記述す る。

実施例１ テオフィリン−８−ブチル酸、３−プロピルピリジノレアミド（Ｔ８Ｂ　Ａ３Ｐ 　Ｐ　Ａ　：　ム　の憚゛告０．１６３ｇ（１，２ｍＭ　）の３−（４−ピリジ ル）−プロピルアミンを、無水ピリジン１０ｊｉ中に０．７７６ｙ（１＋ｏＭ　 ）のジシクロへキシルカルボジイミドを入れたものと一緒にした。得られた溶液 を一晩撹拌した。沈澱したジシクロヘキシル尿素を濾過して除去し、ヂ液を真空 中で濃縮した。′Ｐｉ留固形物を５０％イソプロパーノール水溶液中で沸騰させ ることにより溶解しな、冷却で少量の固体が沈積し、それを一過して除去した。

Ｐ液を濃縮すると、油が生じ、それは放置するとゆっくり固化した。その固体を １０Ｍ１の０．１ＭＭＣｌに溶解し、再び一過して少量の不溶性物質を除去した ０次にｐＨを炭酸ナトリウム水溶液で７に調節した。

溶液を氷上で冷却し、結晶白色生成物を得た（収４！３９％、０．１４９９）　 、生成物は元素分析及びプロトンＮＭＲにより特徴を調べ次の構造が明らかにさ れた。

実施例２ ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ０）ｓ（Ｔ８Ｂ　Ａ３Ｐ　Ｐ　Ａ）（Ｃ１０−）　 ：ム　の　Ｊ゛告 ｆａｃ−（ｂｐｙ）　Ｒｅ（ＣＯ）ｉ　（Ｏｓ　Ｓ　ＣＦ　３）を酸方法（方法 Ｉ）を用いて上述の如く製造した。

撹拌棒及び凝縮器を具えた１００１の丸底フラスコに、１５５、ｖｇ（０，２７ ｍＭ　）のｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）３（Ｏｓｓ　ＣＦ　３）、１２９ｙ り（０，３７ｎＭ）の化合物１．２０ｘｌのＨ２Ｏ及び２０ｘｌのエタノールを 添加した。溶液にアルゴンを気泡として通すことにより１５分間脱ガスし、アル ゴン雰囲気中で３時開還流した。室温に冷却した後、回転蒸発器を用いて溶媒を 蒸発させた。乾燥固体を１０〜１５１！のメタノールに溶解し、０．２．の無水 Ｌ　ｉＣ＋０４を添加した。そのＬ　ｉＣＩＱ　４が溶解した時、溶液をセファ ディックスＬ　Ｈ−２０カラム（高さ７５ｃｉ　Ｘ内径２　（：Ｉ）へ移し、ク ロマトグラフ精製にかけた。カラムをメタノールで平衡させた。試料を０．１〜 ０，２ｘｉ／分の流量で流した。三つの帯が分離された。最初の帯はＣＨ，ＯＨ 中で５６７ｎｍで蛍光を発し、希望の生成物生成物を分離した。錯体を５１１１ のＣＨ３０Ｈ中に溶解し、フリットフィルター（中程度気孔）で吸引−過により 収集し、１５Ｍ１ずつの無水ジエチルエーテルで２回洗浄した。

空気吸引による乾燥は行なわなかった。　ＣａＳ　Ｏ＜を入れた真空乾燥器に一 晩入れることにより乾燥を完了した。

ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ○）３（０３Ｓ　ＣＦ　ｓ）に基づき４８％の収率 で化合物■が得られた。錯体は分析的に純粋であった。

Ｃ１２ＨｓｚＮ＊Ｏ＋ｏＣＩＲｅ　［９１０，０５ｇｔ／ｍＭコＣＨＮ　ＯＣ１ 理論値　４２．２３　３．５２　１２．３２　１７．５８　３．９０分析値　４ １．７２　４．００　１２．５８　１７．９８　３．７４生成物は次の構造をも っていた。

実施例３ １．３−ジメチル−４−アミノ−５−（イソニコチニルアミド）−一シル：　八 　のｊ゛告 た。

ＣＡＤＭＵは、アルゴン雰囲気中メタノールにより再結晶して精製し、Ｃａ５Ｏ ，を入れた真空乾燥中で一晩乾燥した。淡黄色化合物をアルゴン中に保存した。

ジンを添加し、系をアルゴンで脱気した。１５分後１．０４゜（５，８４ａ＋Ｍ ）の塩化イソニコチノイル塩酸塩を１５分間隔で三つの部分に分けて添加した。

溶解により褐色の溶液が得られた。この溶液に０．９８１Ｆ（５，７６ｍＭ　） のＤＡＤＭＬＪをアルゴン雰囲気中撹拌しながら添加した。還流凝縮器をフラス コに取り付け、フラスコを水浴へ移した。フラスコの内容物を、アルゴン中で２ ．５時間撹拌しながら８０℃で還流した。褐色混合物をアルゴン中で一晩室温へ ゆっくり冷却した。黄褐色の沈澱物をガラスフリットフィルター（中程度気孔） で吸引−過により収集した。沈澱物を１５つのジエチルエーテルで３回洗浄し、 ＣａＳ○、を入れた真空乾燥器に一晩入れて乾燥した０次に生成物をＣＨｓ　。

ＯＨ／ジエチルエーテルによりアルゴン雰囲気中で再結晶し、黄色の生成物ｍを ０．５２１？（最初のＩＮＣに基づき３８％）を得た。生成物は次の精造をもっ ていた。

実施例４ ８−４−と１ジル）−一オライ１ン：イム　■の創造化合物■は、次の方法によ り、対応するテオフィリン物質（化合物■）へ容易に環化された。

撹拌棒を具えた３００＋ｉ）のエーレンメイヤーフラスコに、６．７５ｙ（２４ ｍＭ　）の化合物■及び化合物■を溶解するのに充分な２．５ＭのＮａＯＨ水溶 液（、約１００ｘ１）を添加した。黄わ色の溶液を沸騰が始まるまで穏やかに撹 拌しながら加熱した。穏やかな沸騰を３０分間持続し、その間に沈澱物が物が溶 解してオレンジ色の溶液になった。中和が完結に濾過により収集した。沈澱物を ２０１１ずつのジエチルエーテルで３回洗浄した。粗製生成物をＣａ５Ｏ，を入 れた真空乾燥器中で乾燥した。生成物をジメチルホルムアミド＜ＤＭＦ）により 再結晶して精製した。結晶を上述の如く、吸引濾過により収集し、２０ｖｌずつ の水冷却イソプロパツールで２回洗浄し、次に３０１１ずつのジエチルエーテル で３回洗浄した。真空乾燥器中に一晩入れることにより乾燥を完了した。化合物 ■の金属的白色結晶１．８７１１（化合物■の最初の量に基づき３０％）が得ら れた。化合物■は３３７．９〜３３９．５°Ｃで溶融し、透明な橙色の液体にな った。

化合物■は分析的に純粋であった。

Ｃ，２Ｈ，□Ｎ　、０２　［２５７，１７ｙ／ＭコＣＨＮ　Ｏ 理論値　５６．０４　４．２８　２７．２４　１２．４４分析値　５６．０８　 ４．３８　２７．１７１２．５３生成物は次の構造をもっていた。

実施例５ ｆａｃ−（ｂｐ）’）Ｒｅ（ＣＯ）’３　［８−（４−ピリジル）テオフィリン ］ＣＦＳＯ：　ム　Ｖの制′告 撹拌棒を具えた１００ｚ１の丸底フラスコに、１５０肩ｇ（０，２６１ｍＭ）の ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ○）３　（０２Ｓ　ＣＦ　３）、２５０ｍｇ（１， ０４１Ｍ）の８−（４−ピリジル）−テオフィリン及び４０１１の２−メトキシ エタノールを添加した。２−メトキシエタノールは、８−（４−ピリジル）−テ オフィリンがエタノール及び水に不溶性であるため溶媒として用いた。アルゴン で１５分間脱気した後、アルゴン雰囲気中で４時間溶液を還流した。

冷却した後、回転蒸発器で溶媒を蒸発することにより除去した。固体を２０′Ｉ １１のメタノールで抽出し、ガラスウールプラグを通して不溶性の８−（４−ピ リジル）−テオフィリン　リガンドを除去しな、Ｐ液をセファディックスＬＨ− ２０カラム（高さ７５ｃｘ　Ｘ内径２　ｃｍ＞により溶離剤としてメタノールを 用いクロマトグラフにがけな、二つの帯が観察された。最初の帯はく主生成物） 化合物■で、少量の同定されない不純物帯から分離された（溶離速度０，１〜０ ．２ｗ１Ｚ分）０回転蓋発器で、化合物■を含有する部分を５ｉｘｌメタノール 体積まで濃縮し、次に１００ｚｊ！の撹拌したジエチルエーテル中で再沈澱させ ることにより淡いライムグリーン色の粉末として得られた。化合物■をガラスフ リットフィルター（中程度気孔）で吸引濾過により収集し、Ｃｎ５Ｏ，を入れた 真空乾燥器に一晩入れて乾燥した。収量＝　１２０ｚｙ　（ｆａｃ−（ｂｐｙ） 　Ｒｅ（Ｃ○）ａ（０３Ｓ　ＣＦ　３）に基づき４２％〕、生成物は分析的に純 粋であった。

Ｃ２＠Ｈ＋ｓＯｓＦ　＊ＲｅＳ　［８３２，６ＦＩ／Ｍ　］ＣＨＮＯ 理論値　３７．５０　２．２８　１１．１７８　１５．３７分析値　３８．１９ 　２．５３　１１．７７　１５．７８生成物は次の構造をもっていた。

実施例６ ｆａｅ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（Ｃ○）、　［３−（４−ピリジル）−プロピオン酸コ ＣＩＯ，・　ＨＯ：　ム　の制゛告 撹拌棒を具えた２５０ｚｆの丸底フラスコに、３００１１ｇ（０，５２２ｍＭ） のｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）３ＣＦ　３ＳＯｓ、７９．２ｉｔ９＜０．５ ２４ｍＭ）の３−（４−ピリジル）−プロピオン酸、７０１１のエタノール（無 水）及び３０１１の水を添加した。混合物をアルゴンで１５分間膜気した後、ア ルゴン雰囲気中で４時間を還流し。

た、溶液を冷却し、溶媒を追い出した。残渣を少量の水に溶解し、Ｓ　Ｐ−２５ セノアデツクス力ラムに入れ、水で洗浄し、０．２５Ｍ　Ｎ　ａＣＩで溶離した 。第一の黄緑色の部分を収集し、回転蒸発器により約２５ｗ１へ体積を減少させ た。フラスコの内容物を加熱銃で暖め、１１１の濃過塩素酸を滴下した。ライム グリーン色の結晶が形成された。

これらを１５１１の中程度気孔のフリットロートで吸引−過により分離し、非常 に少量の氷水で洗浄し、３０分間空気乾燥した。結晶を更にトリエライト（Ｄ　 ｒｉｅｒｉｔｅ商標名）を入れた真空乾燥で更に乾燥した Ｃ、Ｈ＋ｔＯｓＮ、ＲｅＣｌ−Ｈ，Ｏ［６９５，０４ｇ／Ｍ］ＣＨＮ 理論値　３６．２９　２．７６　６．０５分析値　３６．１９　２，４９　５． ８６生成物は次の精造をもっていた。

実施例７ 、々のレニウムイ合　の４″へ！白ルミネッセンス種々のレニウム化合物の電気 化学的性質を、０．ＩＭのテトラブチルアンモニウムテトラフルオロボレートを 支持電解質として菫素脱気したアセトニトリル１（ｈｌ中に入れた！輸Ｍ溶液と して測定した０作用電極は、インディアナ州ウェストラフアイエツトのバイオア ナリテカル・システムズ社から得られた白金円盤であった。白金線を対電極とし て用い、１．ＯＩ銀線を参照を極として用いた。

測定は１００輪■／秒の走査速度で−２，２■から＋２．２Ｖ　（対５ＣＥ）ま で走査することにより行なった。各電気化学的測定後、飽和カロメル参照電極（ ＳＣＥ）と銀線との間の電位差を測定した。これにより報告された値をＳＣＥに 対する電位に補正した。

電気化学的ルミネッセンス（ＥＣＬ）測定を、０．１Ｍホスフェート−シトレー トＩＮ街液（ｐＨ４，２）、２５ｍＭ蓚酸及び１％トリトンＸ’−１００を含む 水溶液中で行なった。用いたｔ８ｉ系は、０．１ｉｎの白金線によって無Ｉｉｉ ！信室トランジスターソケット（＃２７６−５４８）に接続した２枚の白金（５ ２ゲージ）電極からなっていた。電極を、酢酸セルロースプラスチックの６０輸 １厚片の外側に取り付けた。このプラスチックに、溶液が作用電極と対−参照！ 極との間に容易に流れるように１７４ｉｎ直径の穴をあけた。電極を電位計に接 続し、一つのｔｉが作用電極（光電子増倍管に近い方）として働かせ、一つの電 極を対−参照電極とじて働かせるようにした。測定は、５０ａ＋Ｖ／秒の走査速 度で１．５ｖから２．５Ｖ　（バイアス電位）まで走査することにより行なった 。ＥＣＬ測定値は、与えられた化合物濃度につ加されていない緩衝液で観察され たルミネッセンスカウントとして定義される。ルミネッセンス測定値は、第−又 は第二線状走査中に観察された最大光出力である。

各溶液の電気化学的ルミネッセンス（ＥＣＬ）及び循環サイエンティフック・イ ンストルメンツ）を用いて行なった。各ＥＣＬ測定のフォトンフラックスは、二 つ又は三つの電極系を０．５ｚ１測定溶液中に入れることができるように修正し たベルソルド（Ｂ　ｅｒｔｈｏ　ｌｄ）発光計で検査した。

電気化学的測定値及び電気化学的ルミネッセンス測定値の両方は、キツス・アン ド・ゾネン（Ｋ　ｉｐｐ　＆　Ｚｏｎｅｎ）ＢＤ９１型Ｘ、Ｙ、Ｙ’記録計に記 録された夛。

蛍光測定は、前に記述したＥＣＬ緩衝液３．０ｗｌ中に、又はその緩衝液に不溶 性の時にはアセトニトリルに、希望の化合物を入れた５０ＭＭ溶液で行われた。

測定はパーキン・エルマーＬＳ−５蛍光分光光度計で行われた。溶液の励起発光 スペクトルの前走査は、励起及び発光スペクトルを記録する前に行ない、発光ス ペクトルを最大励起波長で照射しながら測定し、逆に励起スペクトルを最スデー ターが要約されている。

表２ ム　Ｅｏｘ　Ｅｒｅｄ　−」ＬｊＬＬ−」工ｋＧ１慢−Ｒｅ（ｂｐｙ）（ＣＯ） ｓ　１．７２Ｖ　−１，１８Ｖ　（１）　４００ｎｍ　２．０ｘｌＯ−’Ｍ（４ −Ｅｔｐｙ）　（２）　５６５ｎｍ　（３０，０）Ｒｅ（ｂｐｙ）（ＣＯ）ｓ（ ｐｙ−Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｄ、　（１）　４２１ｎ＋ｅ　２．２ｘｌＯ−’ＭＣ，Ｈｓ ＮＨＣＯ−Ｃ，Ｈａ　（２）　５６７ｎｍ　（８，２）−Ｃ６−チオフィール） Ｒｅ（４，４’−［ＣＩコ２−　１．７９Ｖ　Ｎ、Ｄ、（１）　３７１ｎｏ＋　 １．１６ｘｌＯ−’Ｍ−ｂｐｙ）（ＣＯ）ｓ　（２）　６１０ｎｍ　（７１，９ ）Ｒｅ（４，４’−［メチルコ２−　１．７２Ｖ　Ｎ、Ｄ、（１）　４０４ｎｍ 　９．１５ｘｌＯ−”Ｍｂｐｙ）（Ｃｏ）＊（４−Ｅｔｐｙ）　（２）　５５６ ｎｍ　（５，５）Ｒｅ（４，４’−［メトキシ：１２−　１．７４Ｖ　Ｎ、Ｄ、 （１）　３９５ｒ＋ｍ　１．０８ｘｌＯ−’Ｍ−ｂｐｙ）（ＣＯ）ｓ（４−Ｅｔ ｐｙ）　（２）　５６８ｎｍ　（５，９）Ｒｅ（４，４’−［（Ｅｔ）Ｊｌｚ　 １．６３Ｖ　（不可（１）　４１４ｎｍ　ｌＸｌ０−’Ｍ−ｂｐｙ）（Ｃｏ）３ （４−Ｅｔｐｙ）　逆＞　（２）　５０５ｎ＋ｗ　（２，０＞Ｒｅ（４，４’、 ５．５’−［Ｍｅ］４１．７７Ｖ　Ｎ、Ｄ、＜１）　３９３ｎｏ＋　１．００ｘ ｌＯ−フＨ−ｂｐｙ）（Ｃｏ）３（４−Ｅｔｐｙ）　（２）　５３０ｎａ＋　（ ２，６）★（１）　ｗＪ起、　（２）発光 電気化学的ルミネッセンスを、示した濃度で測定し、結果をバックグランドに対 する信号の比として表しである。

実施例８ ＥＣＬ基　のための　部標準の 電気化学的ルミネッセンス（ＥＣＬ）のために内部標準を使用することについて 研究するため幾つかの実験を行なった。ＥＣＬ測定のために内部標準を使用する には、試料溶液中に第二のルモフォール（ｌｕ＋ｎｏｐｈｏｒ）即ち、”ＴＡＧ ”を添加する必要がある。一つのＴＡＧはキャリプラント又はアナライトであり 、第二のものは内部標準である。各ＴＡＧからの発光は独立に同時に測定されな ければならない、これを行なう一つの方法は、二つのＴＡＧが異なった波長で発 光するので、光学的フィルターを用いることによって行なう。

１粍１旦１１ 内部標準とキャリプラントの両方からのＥＣＬは、“フロ・スルー（Ｆ　Ｉｏ− Ｔ　ｈｒｕ）’”室中で測定された。その室は光遮断囲いからなり、その中で流 体及び電気的接続が電気化学的セルに対して行なわれ、そのセルが正面の光電子 増倍管と並べられている。光の強度は浜松光電子増倍管（ＰＭＴ）及びオリエル （Ｏｒ　ｉｅ　Ｉ　＞７０７０型ＰＭＴ検出装置を用いて測定された。電位計は プリンストン・アプライド・リサーチ（ＰＡＲ）１７３型で、Ｐ　Ａ　Ｒ１７５ 型でプログラムされていた（１００ｍＶ／ｓ″Ｃ″Ａ　ｇ／Ａ　ｇＣｌに対し１ ．８〜１．０■で走査された）、電気化学的セルは、セルブｌロック中の溶液出 入口にはまるように修正されたバイオアナリテカル・システムズのセルであった ０作用電極材料は、ブーロックの中に埋め込まれた金であった。対電極として、 Ｐ　Ｍ　Ｔをセルへ入れるための窓のついたステンレス鋼の前面板を用いた。参 照電極（Ａｇ／ＡｇＣ１＞はセルブク度グラフは、キツス・アンド・ゾネンのＸ 　−Ｙ−Ｙ記録装置で記録された。ＴＡＧの保存溶液は、緩衝液中に溶解するこ とにより調製された。緩衝液は０．１５Ｍのホスフェート、０．１０Ｍのトリプ ロピルアミン及び０．０５％のトライ（Ｔｗｅｅｎ）２０からなり、ｐ）（７， ０であった。

１工旦ヌ ０５（ｂｐｙ）＊”、０ｓＴＡＧのＥＣＬを研究しな、陽極方向に電位を走査し ７て、二つの発光グラフを観察した。

Ｏ５（ｂｐｙ）３”””（’Ａ　ｇ／Ａ　ｇＣＩに対し０．８Ｖ　）の見掛は電 位近くにプラトーの形の発光が観察された。第二の発光はピーク状の形で１．４ ６Ｖで一層顕著に起きた。この第二発光は遥かに強く、トリプロピルアミン酸化 の近くにあった。この外挿検出限界は１１００ｐ　（浜松Ｒ３７４ＰＭＴを用い て）であった。

（Ｍ　ｅ＜ｂｐｙ）　Ｒｅ（４−Ｅ　ｔ−ｐｙｒ）（ＣＯ）ｌ　”、ＲｅＴＡＧ のＥＣＬを研究した。酸化のための見掛けの電位はＡｇ／ＡｇＣｌに対し１．７ Ｖ（循環電圧電流法によりアセトニトリル中で測定した）であった、最大ＥＣＬ は、０ｓＴＡＧに対し正の方向に移動しく１．５８Ｖ）、それは酸化のための遥 かに正の見掛けの電位を反映している。この材料は５４５ｎＩＩｌ（水）で発光 するので重要である。ＲｅＴＡＧ発光は、０ｓ（ｂｐｙ）ｓ”の発光（７５０ｎ ｍ）から波長により良く分離されており、従って、簡単なフィルターを用いて光 学的に分離することができる。ＲｅＴＡＧの外挿検出限界は１０１００ｐ浜松Ｒ ２６８ＰＭＴ）であった。

上述の二つの方法によるＥＣＬ性能に基づき、これらの化合物を、ＥＣＬのため の内部標準を用いることができるか否かを試験するために用いた。内部標準（Ｏ ｓＴ　ＡＧ）のための一つの条件は、それがキャリプラントＴＡＧ（ＲｅＴＡＧ ）とは独立に発光すること、即ち、次の消光反応が起きないと言うことである： ○５（ｂｐｙＬ”＋（Ｍ　ｅｎｂｐｙ）　Ｒｅ（４−Ｅ　ｔ−ｐｙｒ）（ＣＯ） ＋”★−−−−−−Ｏ５（ｂｐｙ）＊”＆　＋　（Ｍ　ｅｎｂｐｙ）　Ｒｅ（４ −Ｅ　ｔ−ｐｙｒ）　（Ｃ○）、次の実験を行なった。一定の○５ＴＡＧ濃度（ １μＭ）で、ＲｅＴＡＧｆｉ度を変え（０〜１０１００ｎ、○５ＴＡＧのＥＣＬ をＲ２６８ＰＭＴ及びＬ　Ｐ　７００ロングパス　フィルターを用いて観測した 。第２図参照、実験誤差内で、ＲｅＴＡＧによる０ｓＴＡＧへの影響は観察され なかった。

同じ実験を繰り返した。但しＬＰ７００を、ショートパスフィルター６２０で置 き換え、ＲｅＴＡＧ　ＥＣＬだけが観察されるようにした。ＲｅＴＡＧのための 補正曲線は第３図に示されている。０ｓＴＡＧのないＲｅＴＡＧのための補正曲 線も第３図に示されている。この場合も実験誤差内で、０ｓＴＡＧの添加はＲｅ ＴＡＧ　ＥＣＬに影響を与えていない、データーは、Ｏ５（ｂｐｙ）ｔ２°がＲ ｅＴＡＧをアナライトとした内部標準としてよく適していることを示している。

実施例９ レニウム標識付けされたウサギ−抗マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体の電 気化学的ルミネッセンス検出感度ｆａｃ−（ｂｐｙ）　Ｒｅ（Ｃ○）３　［３− （４−ピリジル）−プロピオン酸］ＣＩＯ，・Ｈ２Ｏ（化合物■）で標識付けし た抗−マウスＩｇＧ抗体（レニウム標識付はウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体）の電 気化学的ルミネッセンスを、下に記述するようにして調製された溶液１０１１１ を含む１５＋ｊ！三ロ丸底フラスコ中で測定した：　１．５１１Ｘ　１０１ｍ磁 気撹拌棒；　１．０１１直径の銀縁擬参照ｉｓ；組み合わせ２８ゲージ白金線対 電極；及び２２ゲージ白金線からなる作用電極を０．１ｉｍ厚高研磨白金箔の１ （ＩＸ　ｌ　ｃｘの四角の片に溶接した。（作用白金箔電極は、２８ゲージ白金 線対電極を３７３２ｉｎ等距離的に取り巻いた３／１６ｉｎ直径の半円形に作用 白金箔電極を成形した）。

銀線はＥ　Ｇ　＆　Ｇ　１７３型ポテンシヨスタツト／検流計のＥ　Ｇ　＆　Ｇ 　１７８型電位計検針に接続した。白金線対電極及び白金作用電極はＥＧ＆Ｇ１ ７３型ボテンショスタ、ットの陽極及び陰極に夫々接続した。装置は接地した。

レニウム標識付はウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体溶液から発した電気化学的ルミネ ッセンスを、コダック＃２３Ａゼフォア・リサーチＰ　Ｒ１４０２ＲＦ光電子増 倍管内に設定された浜松Ｒ９２８光電子増倍管を用いて検出された。光電子増倍 管室をオリエル７０７０型光電子増倍管検呂装置に接続した。

０〜二Ｚ、ＯＶの陰８ｉ電位で１秒間隔でパルスを発生させることにより、電気 化学的ルミネッセンスを誘導した。

電気化学的ルミネッセンスの測定は、ミクロンタ２２１９１でデジタルマルチメ ーターに接続した積分器を用いて、得られた電気化学的ルミネッセンス光電子増 倍管信号を積分することにより行なわれた。電気化学的ルミネッセンス信号は、 パルス発生中１０秒間積分し、ｍＶで記録された。

１．２５Ｘ　１０−’Ｍレニウム標識付はウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体の保存溶 液を標識付けした抗体の濃厚溶液（２ｚｙ／ｘｌ、７．５Ｒｅ／抗体）から、ホ スフェート緩衝塩水（ＰＢＳ）中に希釈することにより調製した。この溶液の一 部分（８０μβずつ）を、反応容器中、０，１Ｍのテトラブチルアンモニウムテ トラフルオロボレート（ＴＢＡＢＦ、）及び１８ｍＭの過硫酸アンモニウムを含 むジメチルスルホキシド（Ｄ　Ｍ　Ｓ　Ｏ）／脱イオン蒸留水（１：　１　）１ ０＋ｆに添加した。

最終レニウム標識付は抗体濃度はｌＸｌ０−’Ｍであった。

上述の如く、電気化学的ルミネッセンスが測定された。

レニウム標識付はウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体保存溶液を種々に薄めた付加的溶 液を作り、それら溶液の一部分ずつ（８０μρずつ）を反応容器中、同じレニウ ム標識付は抗体の溶液へ少しずつ添加し、それによって標識付は抗体の濃Ｋを、 ５　Ｘ　１０−’Ｍ、ＩＸｌｏ−ｅＭ及び５　Ｘ　１０−’Ｍ　４：した。記載 の各溶液について電気化学的ルミネッセンスの測定を行なった。これらの結果は 、標識付は抗体（１ｘｌＯ−’Ｍ＞の電気化学的ルミネッセンス決定の怒度を示 し、レニウム標識付は抗−マウスＩｇＧ抗体の濃度に対する電気化学的ルミネッ センス強度の依存性を示している。

実施例１０ ウシ血清アルブミン抗体についての均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査 ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）３　［３−（４−ピリジル）−プロピオン酸コ ＣｌＯ４・Ｈ，Ｏ（化合物■〕で標識付けされたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） を７．８Ｘ　１０−’Ｍ金含有る溶液を、レニウム標識付けＢＳＡの保存溶液（ ２，５ｍｌ？／ｘ１．６Ｒｅ／ＢＳＡ）をホスフェート緩衝塩水（ＰＢＳ）で希 釈することにより調製しな、この溶液２６μβずつを、反応容器中。

０．１Ｍ　ＴＥＡＢＦ、及び１８＋ｏＭ過硫酸アンモニウムを含む１０１１１の ＤＭＳ○／脱イオン蒸留水（１：１）に添加した。

最終レニウム標識付けＢＳＡ：ａ度は２Ｘ１０−’Ｍであった。

実施例９に記載した如く、電気化学的ルミネッセンスが測定された。

同様なやり方で、７．８Ｘ　１０−’Ｍの無標識ＢＳＡを含有する溶液を調製し 、反応容器へ添加して５　Ｘ　１０−”Ｍの最終的無標識ＢＳＡ濃度を与えた。

この溶液及びＢＳＡを含まない同様な溶液の電気化学的ルミネッセンスを測定ウ サギ抗ＢＳＡ抗体保存溶液（６，（ｈＦＩ／ｉｆ）から、ＰＢＳで希釈すること により調製し、一部分（２６μβずつ）を、反応容器中、レニウム標識付けＢＳ Ａの溶液へ添加し、１　ｘｌＯ−’Ｍの最終ウサギ抗ＢＳＡ抗体濃度を与えた。

得られたレニウム標識付けＢＳＡ抗原と抗体（ウサギ抗ＢＳＡ）との混合物の電 気化学的ルミネッセンスを測定した。それらの結果はウサギ抗ＢＳＡ抗体を添加 することによりレニウム標識付けＢＳＡの電気化学的ルミネッセンスが減少する ことを示し、ＢＳＡに対する抗体の均質電気化学的ルミネッセンス検出を達成す ることができることを示している。これらの結果に基づき、当業者には、他の検 査したいアナライトを検出するための均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査を 開発することができることが分かるであろう。

５（方布　例　１１ マウス抗−レギネラ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体及びレニウム標識付はウサ ギ抗−マウス免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ＞抗体を用いたレギネラのための不均質 電気化学的ルミネッセンス免疫検査 バクテリウム　レギネラｍ１ｅｄａｄｅｉのホルマリン懸濁物を、ＰＢＳ懸濁液 で希釈することにより１．００の光学密度（４２５ｎｍで）に調節した。約３Ｘ １０”個の細胞を円錐状マイクロ遠心分離管に入れた。細胞を遠心分離にかけ（ １０分間膜１０，０００ｒｐｍ）、上澄み液を傾瀉し、８胞を、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（ １ｙｆ）中レギネー　ｍ１ｃｄａｄｅｉに特異性のマウスモノクローナルＩｇＧ 抗体の１：５０希釈液（１，４５ｉｙ／澱りに再懸濁した。

室温で１時間培養した後、細胞を遠心分離にかけ、上澄み液を傾瀉し、細胞を、 ＰＢＳｔｌ衝液中に再懸濁し、再び遠心分離にかけた６上澄み液を傾瀉した後、 細胞を、ｆａｃ−（ｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ））　［３−（４−ピリジル）−プロピ オン酸コＣｌＯ４・Ｈ，Ｏ化合物■で標識付けされたウサギ抗−マウスＩｇＧ抗 体、即ちレニウム標識付はウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体の１＝５０希釈液（ＰＢ Ｓ）中に再懸濁した（２り／１１１．７．５Ｒｅ／抗体）、室温で１時間培養し た後、細胞を遠心分離にかけ、上澄み液を傾瀉し、細胞を、ＰＢＳ中に再懸濁し 、二度洗浄し、前の如く再び遠心分離にかけた。ｉ＆後の洗浄後、細胞を２００ μｒのＰＢＳに再懸濁した。その細胞懸濁物１００μｌを、０．１Ｍ　Ｔ　Ｂ　 Ａ　Ｂ　Ｆ　、及び１８ｍＭ過硫酸アンモニウムを含む１０ｘｌのＤＭＳ○／脱 イオン蒸留水（１：１）の入った反応容器中に添加した。その細胞懸濁物につい て電気化学的ルミネッセンスを測定した。更に１００μ２の細胞懸濁物を反応容 器へ添加し、電気化学的ルミネッセンスを測定した。実施例９に記載した方法に 従い、対照として細胞を含まない溶液について電気化学的ルミネッセンスを測定 した。レニウム標識付けウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用いたレギネラのための不 均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査を成功裡に行なうことができる。

実施例１２ ２−［３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブロビルコー１３′ジ 　ゝ−ンの１゛告 アルゴンの不活性雰囲気中、３０ｄの無水テトラヒドロフラン（Ｔ　ＨＦ　）及 び７．６５ｘｌの無水ジイソプロピルアミン（５４，６ｍＭ）を、６００１１１ の三ロフラスコへ注射器により撹拌しながら入れた。溶液を、深底ビーカー中の ドライアイス・イソプロパツール混合物中にフラスコを浸漬することにより一７ ８℃に冷却した。　２１．６ｚ１の２．５Ｍ　ｎ−ブチルした４、４′−ジメチ ル−２，２′−とピリジン（５２ｍＭ　）９．５８ｇの溶液を、１時間に互って 撹拌しながらカニユーレにより滴下した。

得られた褐色の混合物を一７８℃で２時開更に撹拌し、１０ｇの２−（２−ブロ モエチル）−１，３−ジオキソラン（５５ｏＭ）を注射器により添加し、得られ た混合物を一７８℃で５分間撹拌した０次に反応容器を水浴（１０℃）中に入れ ると、３０分後色が変化し始めた。１時間後色は暗紫色になり、２時間後色は青 くなり、２．５時間後色は緑になり、　３．２５時間後色はレモン黄色になった 。

反応混合物は、３０１１の飽和ＮａＣ１、続いて１０Ｍ１の水及び５０ｘ１エー テルで急冷した。水性相を３００１のエーテルで２度抽比し、−緒にしたエーテ ル相を１００ｉ１の水で逆抽出し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。

反応生成物を精製するため、活性度■中性のアルミナ（メルク）９０で分離した 。用いた溶離剤は、石油エーテル／ジエチルエーテル（１：ｌ）であった〔出発 物質は石油エーテル／ジエチルエーテル（２：１）で完全に溶離し、次に生成物 が溶離した〕。

プロトンＮＭＲ分析により、分離された反応生成物の構造は次の通りであること が確認された。

実施例１３ （４−ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−ビピリジンの制゛告　び 　Ｊ ２ｇの２−　［３−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）−プロ ピル］−１，３ジオキソランを５０肩！のＩＮ　ＭＣＩに溶解し、５０℃で２時 間加熱した。溶液を冷却し、重炭酸ナトリウムでｐＨ７〜８へ調節し、クロロホ ルム１００．ｗｊ！で２度抽出した。

一緒にしたクロロホルム相を少量の水で洗浄し　Ｐ−酸ナトリウム上で乾燥し、 −過し、回転蒸発させて黄色の油を生じた。

黄色の油を、溶離剤として酢酸エチル／トルエン（１：１）を用いたシリカゲル カラムで精製し、不純物をメタノールで溶離した。

プロトンＮＭＲ分析〔１°９６−２°１１（ｍ、２Ｈ）；２°４３（Ｓ、３Ｈ） ；２°４６−２°５０）（ｔ、２Ｈ）、２°５３−２°８０（Ｍ、２Ｈ）、７° １２−７°１４（ｍ、２Ｈ）＋８°”’−ｓ°２１（ｂｒ、　ｓ　、２Ｈ）；　 ８°５２−８°５８（ね、２Ｈ）；９°８９（ｓ、ＩＨ）〕により、反応生成物 が次の構造をもつことが確認された。

実施例１４ ４−（４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−イル）プ　ル　のＪ造 ０．５ｇの４−（ブタン−１−アル）−４′−メチル−２，２′−ビビリシフ（ ２，０ｍＭ）を１０ｉｆノ無水アセトンニ溶解しり、　２２５ｕｙノ微粉末過マ ンガン酸カリウム（Ｋ　Ｍ　ｎｏ　４；　１．４２ｍＭ　）を溶液に撹拌しなが ら少しずつ添加した０反応物を薄層クロマトグラフ（シリカ；酢酸二チル／トル エン５０：５０）にかけ、それによりアルデヒドが徐々に消えるに従って、低Ｒ ｆのビピリジンが形成されたことが示された。

反応が完結した後、水を添加し、Ｍｎ−を−過し、少量ずつのＮ　ａ　２　ＣＯ ２（水溶液）で洗浄した。アセトンを回転蒸発させ、残留物をＣＨ２ＣＬで抽出 し、非酸性ビピリジンを除去した。水溶液を１．ＯＮ　ＨＣｌを注意深く添加し て酸性にし、ｐＨを４，８にした。溶液はこのｐＨに達すると少し曇り、懸濁物 はｐＨを低くすると再び溶解した。混合物を同じ量のＣＨ，ＣＩ□で５回抽出し 、Ｎ　ａ　２　Ｓ○、上で乾燥し、回転蒸発させて、油を得、それは真空中です ぐに固化した。粗製固体をクロロホルム二石油エーテルで再結晶し、白色の結晶 を得た。

融点：　１０３．５℃−１０５，５℃；　Ｉ　Ｒ：　１７０４ｃｍ−’、プロト ンＮ　Ｍ　Ｒ分析は次の構造に一致していた。

実施例１５ テオフィリンに特異性の抗体を用いたＲｅ（１）−テオフィリン接合により発生 した電気化学的ルミネッセンス信号の変調 テオフィリンに共有結合（接合）された化合物■を、０．３５Ｍのフッ化ナトリ ウムを含有する０、１Ｍホスフェート緩衝液ｐＨ６，０（Ｐ　Ｂ　Ｆ　緩衝液） ３用いて最終酒度１５０ｎＭの最終濃度へ希釈した。テオフィリンに対し特異性 のモノクローナル抗体（クローン数９−４９、腹水ロット番号Ｗ○３９９、カタ ログ番号０４６）を、カレスタッド・ラボラトリーズ社（Ｋａｌｌｅｓｔａｄ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）（チャスカ、ＭＮ）から得られた。そ のモノクローナル抗体をＰＢＦＮ衡液を用いて種々の濃度に希釈した（蛋白質２ １．９μｇ／真ｌ〜７００μｇ／ｘ１）。

テオフィリンと反応しない別のモノクローナル抗体（対照ＭＡＢ）を、シグマ（ セントルイス、Ｍ）から得、ＰＢＦｖ１！液を用いて蛋白質２１．９μｇ／ｉｆ 　〜７００μｇ／ｉ／！ノ種々の濃度へ希釈した。テオフィリンの標準溶液を、 アルドリッヒ・ケミカル社（ミルウォーキー、Ｗｌ）から得られたテオフィリン （カタログ番号２６−１４０−８、Ｍ　、Ｗ　、１８０．１７）を用いて調製し た。テオフィリンをＰＢＦ緩衝液に溶液溶解し、７５μＭの最終濃度にし、検査 で用いるためＰＢＦｌｊ（衝液で希釈した６μＭにした。電気化学的ルミネッセ ンス測定を行なう前に、２５０ｎ＋　Ｍの蓚酸及び５％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ 　１００（Ｅ　ＣＬ溶液）を含む溶液を反応混合物へ添加しな、測定は、二つの 白金Ｍ４を極を反応溶液の入った試験管中へいれることができるように修正した ベルトホルトルミノメータ−を用いて行なった。電極はポテンショスタットへ接 続し、電気化学的ルミネッセンスの測定は、５０ｍＶ／秒の走査速度で１．５Ｖ がら２．５Ｖまで電極に印加した電位を走査することにより行なった。測定に用 いたベルトホルトルミノメータ−は、高利得の赤メーターの出力は１０’カウン ト／■に調節された。測定値はＸ　−Ｙ　−Ｙ　”記録計に記録され、ピークの 高さが電気化学的ルミネッセンスの測定値として用いられた。を径は測定の間で 、０．１Ｍホスフェート、０．１シトレート、０．０２５Ｍ蓚酸及び１％トリト ンＸ−１００を含有するｐＨ４，２の緩衝液で濯ぎ、電極をこの溶液中で＋０． ２〜−２．２■で６０秒間パルスにかけ、次に−２，２■で１０秒間パルスにか けることにより清浄にした。次に電極をこの溶液から取り出し、蒸留水で濯ぎ、 そして拭いて乾かした。実験は下に概略述べるように行なった。

対照モノクローナル抗体、テオフィリンに対する抗体又はＰＢＦ緩衝液の溶液を 一組の試験管に入れた（工程１）。試験管へテオフィリンスはＰＢＦ緩衝液の溶 液を添加したく工程２）、溶液を、試験管を簡単に振ることに温で１５分間保持 した。ｉ＆後にＥＣＬ溶液を各試験管に１００ｚｆずつ添加し、電気化学的ルミ ネッセンスを上で述べた如く測定した。

抗体−Ｒｅ（１）−テオフィリン接合（接合体）相互作用の電気化学的ルミネッ センスに与える影響を研究するための実験工程 工程１　工程２　工程３ １００μｍ　２００μｍ　１００μｌ Ａ、対照モノクローナル　緩衝液　接合体抗体（２，１９μｇ〜７０μｇ） 又は Ｂ、抗−テオフィリン抗体　緩衝液又は　接合体（２，１９μｇ〜７０μｆＩ） 　テオフィリン又は Ｃ，ＰＢＦＭ衝液　緩衝液　接合体又はＭ衡液 実験は、テオフィリンを特異的に認識するモノクローナル抗体は、レニウム化合 物（化合物６）が結合されたテオフィリン、例えばＲｅ（１）−テオフィリン接 合体、に接触すると、電気化学的ルミネッセンスを減少することを示している。

！気化学的ルミネッセンスの減少は、接合体濃度が一定に保たれた場合、抗体の 濃度に比例する。

テオフィリンと反応しない抗体を用いた時、抗体の最大濃度の所で電気化学的ル ミネッセンスの僅かな減少しか見られない。

データーは、テオフィリンが抗−テオフィリン抗体と接触し、次に接合体が混合 物へ添加された時、電気化学的ルミネッセンスの量が大きくことも示している。

このことは、抗体の結合のためにテオフィリンが競争し、電気化学的ルミネッセ ンスを発生することができる接合の量を一層大きくすることを示している。

実施例１６ 均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査に基づく血清中のテオフィリンについて の検査 実施例１５に記載した結果に基づいて、テオフィリンに対する均質免疫検査法が 、テオフィリンに対する抗体及び実施例１５に記載したＲｅ（１）−テオフィリ ン接合（接合体）を競争結合方式で用いることにより開発された。用いられた材 料は実施例１５に記載されている。但しＰＢＦ緩衝液は０．１Ｍフッ化ナトリウ ムを含有する０、１Ｍホスフェート緩衝液ｐＨ６，０であった。この検査のため 、テオフィリンに対するモノクローナル抗体の特別な濃度が選択された。抗体濃 度は５５μｇ／ｘｌであった。接合体濃度を１７５ｎＭに調節した。テオフィリ ンをヒト血清に添加し、血清に対しテオフィリンの最終濃度を２．５．５．１０ ．２０及び４０μｇ／ｘ１にした。

検査は次のようにして行われた。１０Ａｌｆずつの血清を。

２９０μｐずつの抗−テオフィリンモノクローナル抗体へ添加し、その溶液を室 温で２５分間保持する１次に接合体１００μｌを各試験管に添加し、３５ｎ　Ｍ の最終濃度にし、この溶液を室温で１５分間保持した。実施例３４に記述したＥ ＣＬ溶液１００μｌを次に各試験管に添加し、それら溶液の電気化学的ルミネッ センス性を、前に記述した如く、５０ｍＶ／秒で１．５■から２．５〜７へ走査 するやり方を用いて測定した。結果は、血清試料中のテオフィリンの濃度と、反 応混合物によって放出された電気化学的ルミネッセンスの量との間に相関関係が あることを示している。この観察は、テオフィリンのための検査方法を開発する ことができることを示している。

これらの結果に基づいて、当業者は、生物学的マトリックス中の検査したいアナ ライトを検出し、定量化する均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査を開発する ことができるであろう。

実施例１７ 均質電気化学的ルミネッセンス魚皮検査に基づく溶血、脂肪血、黄痘及び正常血 清試料中のテオフィリンについての検査及び蛍光分極検査との比較均質電気化学 的ルミネッセンス免疫検査法を用いて決定した。検査方式は、テオフィリンに対 する特異性モノクローナル抗体及び実施例１５に記載した接合体を用いた競争結 合検査法である。電気化学的ルミネッセンスのための試薬及び方法は前の実施例 に記載されている。

異なった血清試料中のテオフィリンの濃度を測定するのに用いた蛍光分極試験は 、アボット・ラボラトリーズ（＾ｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（イ リノイ州ノースジカゴ）からの自動ＴＤＸ装置を用いて行われた。溶血、脂肪血 、黄痘及び正常血清を検査で用い、異常血清についてのデーターを下に列挙する 。

汗　白・に間顧の−る血清の７′−オフイリン検査特忙ｍｊｊｉ　１五１１Ｌ！ 且１ 溶血　ヘモグロビン　１２．４ｚｙ／ｄＩ！Ｏ〜３．２ｉｇ／ｄｆｆ脂肪血　ト リグリセリド４０５ｖｙ／ｄｆ　１０〜１９０Ｈ／ｄｉコレステロール１９６ｙ ／　ｄｌ　１２０〜２００ｚｇ／ｄ１黄痘　ビリルビン　１０ｘｇ／ｄｉ　Ｏ〜 １．５ｍ９／ｃｌｊ！種々の量のテオフィリンを血清試料へ添加し、テオフィリ ン２．５μｇ／ロ〜テオフィリン４０μｇ／ａｌｌの最終濃度にした。均質電気 化学的ルミネッセンス免疫検査についてのデーターを獲た。

各血清試料を、同じく蛍光分極検査によりテオフィリンの濃度について分析した 。均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査及び蛍光分極検査により測定されたテ オフィリンの濃度を比較した。データーを点点図＜ｓｃａｔｔｅｒｇｒａｎ）と してプロットした。データ一点を直線回帰により分析し、相関係数を計算した０ 分析値は二つの検査の間の優れた相関関係を示していた。相関係数（ｒ）は大き かった。正常、溶血、及び脂肪血血清試料についての直線の勾配は０．８〜１． ２であり、これら血清試料からのテオフィリンの優れた回収３示していた。

テオフィリンを含有する黄瘍血清試料によって放出された電気化学的ルミネッセ ンスは、他の血清試料のものより高かったが、それは各テオフィリン濃度で比例 して高かった。相関係数は、電気化学的ルミネッセンスと蛍光分極とを比較した データ一点について高かったが、勾配は黄痘血清試料中のテオフィリンに対し一 層高回収を示していた。

これらの結果に基づいて、黄痘試料中のテオフィリンの濃度を、黄痘血清の各部 分に既知の量の接合体を添加することにより、試料についての標準直線を確立す ることにより決定することができるであろう、これらのデーターは、均質電気化 学的ルミネッセンス免疫検査を、ヘモグロビン、脂質及びビリルビンを異常な量 で含有する血清試料中に存在するテオフィリンの濃度を測定するのに用いてもよ いことを示している。

均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査は、蛍光分極方法よりも幾つかの利点を 有する。なぜなら、ＥＣＬ検出の融通性、即ち生物学的分子の一層高い濃度では 一層敏悉な検出が行えるからである。

均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査は、蛍光分極方法よりも更に幾つかの利 点を有する。なぜなら、入射光源は不必要であり、電気的励起は充分な光発生の 場合だけ必要になるからである。従って、複雑な光学的装置は不必要になる。測 定原理は電気化学的励起によって起こされる純粋に特性フォトン発光であるので 、系の感度は蛍光分極より潜在的に遥かに大きく一層広いダイナミック範囲を達 成することができるであろう、また、均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査と 用いることにより、蛍光分極によって与えられるよりも遥かに多種類のアナライ トの測定が可能であり、一層広いダイナミック範囲が達成されるであろう、また 、生物学的分子認識事項、例えば抗体・抗原相互作用による。電気的に励起され た化学的ルミネッセンスの選択的変調により、均質電気化学的ルミネッセンス免 疫検査を用いた場合には、蛍光分極によって与えられるよりも遥かに多種類のア ナライトを測定することが可能である。

これらの結果に基づいて、当業者には異常血清試料中の他の検査したいアナライ トを検出するための均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査法を開発することが できることが分かるでであろう。

実施例１８ 不均質電気化学的ルミネッセンス検査に基づく血清中のテオフィリンについての 検査 免疫検査方式を用いて、テオフィリンの為の不均質検査法を、化合物■標識性は 抗−テオフィリン抗体及びバイオマグ磁気粒子に固定したテオフィリンＢＳＡを 用いて開発した。抗体濃度は、２０μｇ／ｘｉであった。磁気粒子濃度は囲体１ ％（重量／体積）であった、テオフィリンは、最終濃度１０及び４０μ９／１の 血清へ添加した一テオフィリン血清標準物は、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＦ緩 衝液（０，１Ｍフッ化ナトリウム含有燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，０）で１ ０００倍に希釈した。

検査は次のようにして行われた。化合物■へ接合した抗体の７５μｐへ希釈血清 標準物７５μｌを添加し、その溶液を室温で２０分間培養した。次にテオフィリ ン−ＢＳＡ−バイオマグ粒子５０μｌを添加し、懸濁物を５分間放置した０粒子 を磁気的に分離し、上澄み液１００μｌを電気化学的ルミネッセンスについて測 定した。

結果に基づき、当業者は、生物学的マトリックス中に検査したい他のアナライト についての不均質電気化学的ルミネッセンス免疫検査法を開発することができる であろう。

実施例１９ 電気化学的ルミネッセンスモイエティを持つ標識付は用ＤＮＡ 次の方法は電気化学的ルミネッセンスモイエティを有する標ｍＤＮＡに対して用 いられた。

１．０Ａｚｓ。の慣用的合成３８ｍｅｒ（Ｍ　Ｂ　Ｉ　３８）−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ ｏ−ＮＨ（ＣＨ２）ｔ−ＮＨｚにより修飾されたチミジンである） をｐＨ８，７の０．０１Ｍホスフェート緩衝液１００μ！中に溶解した。　ｆａ ｃｉｂｐｙ）Ｒｅ（ＣＯ）３［３−（４−ビピリジル）−プロピオンＰｉ　］　 ＣＩＱ　−・Ｈｓｏ　（化合ｅｌ　Ｖｉ　）ノ溶液（ｐＨ８，７）ｇ酸力！ｊ　 ’７　ム０．ＯＩＭ［ｆＴｒｆｉ３００μＲ中ニ２．３ｍｇ入れたも））１０（ ｌμｉ’を添加した。内容物を撹拌し、室温で一晩放置した。

硼水素化ナトリウムの標準水溶液１００μ！を混合物へ添加し、可逆性イミンシ ッフ塩基結合を非可逆性アミン結合へ転化した０反応を室温で２時間行わせた０ 次に溶液を数滴の希釈酢酸で注意深く処理し、硼水素化ナトリウムの過剰を消失 させた０反応溶液をＰ−２ゲル−過カラム（１８ｉｎＸ　１／２ｉｎ）中へ導入 した。そのカラムは予めｐＨ６，７７の０．１Ｍ　）リエチルアンモニウムアセ テートで平衡状態にさせてあった。カラムを同じ緩衝液で溶離し、２０ｘ１／時 の流量で２１ずつの分画部分を収集した１分画９及び１０で溶離されたＤＮＡは 未反応レニウム錯体とよく分離された。収ｔ　Ｄ　Ｎ　Ａ試料は典型的なＵＶ吸 収を示し、更に、励起した時蛍光発光スペクトルを示した。蛍光発光は、ＤＮＡ 試料中にレニウムモイエティが存在していたことを示している。生成物は、ポリ アクリルアミドゲル電気泳動で一本の蛍光帯として移動する。標識付けしたＤＮ Ａ（ＭＢＩ　３８−化合物■接合体）の電気泳動易動度は、無標ｍＤＮＡとほぼ 同じであった。

実施例２０ 標識付けされたＤＮＡの電気的に発生させた化学的ルミネッセンス性 ＢＩ３８−化合物■）をその電気化学的ルミネッセンス性を研究するために用い た０種々の濃度の標識付けＤＮＡを、０．１Ｍ’のシトレート、２５＋＋＋Ｍの オキサレート及び１．０％のトリトンｘ−ｉｏｏを含むｐＨ４，２の０．１Ｍホ スフェート緩衝液０．５ｉｌ中に溶解し、修正ベルトホルトルミノメータ−で測 定した。電気的ルミネッセンス信号は種々のＤＮＡ濃度に応答していた。

実施例２１ 化合物■−標識付けされたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション　石片 穴 実施例２０に記載した３８ｍａｒに対する相補的鎖を、ＡＢＩ３８０Ｂ型ＤＮＡ 合成器を用いて合成し、Ｍ　Ｇ　Ｅ　Ｎ　−３８の記号を付けた。

化合物Ｉのオリゴヌクレオチドへの供給結合がＭＢＩ３８オリゴヌクレオチドハ イブリダイゼーション性に影響を与えるかどうかを決定するため、次の実験が考 えられた０種々の濃度の標的断片（Ｍ　Ｇ　Ｅ　Ｎ−３８）を、一枚のゲルラム （Ｇ　ｅｌｍｉｎ）ＲＰナイロン膜にスポットし、固定し、ＭＢＩ３８又はＭＢ Ｉ３８−化合物■でプローブした０両方の断片は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー ゼ及びγ”Ｐ［ＡＴＰ］で処理し、３２ｐで５′端に標識付けした０次にＤＮＡ 及び化合物■標識付けＤＮＡのハイブリダイゼーション怒度を比較した。

ＭＧＥＮ−３８ＤＮＡの濃度は、５０ｎ９〜０．０５ｎｆＩの範囲であり、ナイ ロン膜にスポットし、空気乾燥した。二枚の膜を作った。プロット（ｂｌｏｔ） を夫々２分ずつ次のように処理した：　ＤＮＡを完全に変性するため１．５Ｍ　 ＮａＣ１０，５Ｎ　ａｏ　Ｈ；プロットを中和するため１．５Ｍ　ＮａＣ１−０ ，５Ｍ　ＴｌＲ５，及び最後に２Ｘ　ＳＳＣ，プロットを真空炉中で８０℃で２ 時間加熱した。

ハイブリダイゼーション　プローブは次のようにして調製された１３８ｇずつの ＭＢＩ３Ｂ及びＭＢＩ３８−化合物Ｉを、１０単位ずつのＴ４キナーゼ及び１２ ５μキユーリーのγ”Ｐ　−Ａ　Ｔ　Ｐでキナーゼ化した。ＤＮＡへのアイソト ープ組込み％を決定した。

プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼー各プローブを含むハイブリダ イゼーション溶液中に入れ、５３℃で一晩（１２時間）バイブリド化した０次の 日プロット−（上述と同じ＜）０．２Ｘ　ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで２回、−（ 上述と同じ＜　）０．１６Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ＋　０．１％ＳＤＳで２回。

次にプロットを空気乾燥し、コダックＸ−オマト　フィルムへ一７０℃で露出し た。

Ｘ線分析により、ＭＢＩ３８及びＭＢｒ３訃化合物■プローブで非常に似たハイ ブリダイゼーション模様が観察されることが示された０両方の場合とも、０．５ ｎｇの標的へのプローブのハイブリダイゼーションが観察され、０．０５ｎｇま での低い標的ＤＮＡへのがすかな微Ｉのハイブリダイゼーションが観察された。

負制御Ｄ　Ｎ　Ａ　（５０ｎＩ？でスポットされたファージλＤＮＡ）について はプローブによるハイブリダイゼーション活性は検出されなかった。

実施例２２ 実施例２１に記載した如く、 で標識付けされた３８ｍｅｒ　Ｅ、ｃｏｌｉプローブを、マニアラスによるＥ、 ｃｏｌｉ核酸の試料でバイブリド化した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、　＆　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃ１ｏｎｉｎＦＩ：＾１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　ｐ、１５０− １６０．Ｃｏ１ｄ　ＰｒｅｓｓＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　（１９８２）（二 、：Ｌ−ヨーク州コールド・スプリング・ハーバ−）〕８次にバイブリド化複合 体を、信号プローブに隣接したＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡの別の配列に相補的な別の 固体支持体結合プローブにより捕捉させた。捕捉手順は、このプロトコルの最初 の部分について用いられたのと同じハイブリダイゼーション条件を用いた。バイ ブリド化された複合体を遠心分離により単一鎖核酸から分離し、繰り返し洗浄し た１次に分離された複合体を５分間水中で１００℃で加熱し、複合体を解離した 。今度は溶液中へ放出された標識付けされたプローブを、電気化学的ルミネッセ ンス信号を測定するため適当なカクテル（ｃｏｃｋｔａ　ｉ　Ｉ　）中へ移行さ せた。信号の強度は標的ＤＮＡの量に直線的に相当していた。

アミノ結合Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｅ　、ｃｏｌｉからの１５ヌクレオチド一致配列を含 む３８−ｍｅｒ）の試料を、ｐＨ８，７の０．０１Ｍホスフェート緩衝液１００ μβ中に溶解した。オスミウム錯体０−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨＯ ■ （Ｍｅｚｂｐｙ）２０ｓ（φ２Ｐ　ＣＨ２−ＣＨ−ＣＨ２−Ｐφ２）（Ｃｌ○、 〉。

の溶液（ｐＨ８，７の０．０１Ｍ憐酸カリウム緩衝液３００μｐ中２．３ｘｙ） １００μｌを添加した。内容物を撹拌し、室温で一晩放置した。

硼水素化ナトリウムの標準水溶液１００μｌを混合物へ添加し、可逆性イミンシ ッフ塩基結合を非可逆性アミン結合へ転化した。反応を室温で２時間行わせた。

標識利けされたプローブをゲル濾過クロマトグラフにより精製した。標識付けさ れたＤＮＡプローブはオスミウム錯体の結合と一致した分光性を示した。

オスミウム錯体で標識付けされたプローブを、上記マニアラスによるＥ、ｃｏｌ ｉ核酸の試料でバイブリド化した。

次にバイブリド化複合体を、信号プローブに隣接したＥ。

ｃｏｌｉＤＮＡの別の配列に相補的な別の固体支持体結合プローブにより捕捉さ せた。捕捉手順は、このプロトコルの最初の部分について用いられたのと同じハ イブリダイゼーション条件を用いた。バイブリド化された複合体を遠心分離によ り単一鎖核酸から分離し、繰り返し洗浄した０次に分離された複合体を５分間水 中で１００℃で加熱し、複合体を解離した。今度は溶液中へ放出された標識付け されたプローブを、電気化学的ルミネッセンス信号を測定するため適当なカクテ ル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）中へ移行させた。信号の強度は標的ＤＮＡの量に直線的 に相当してレニウム錯体 を、先ず無水ジメチルホルムアミド６０μ！中に３ｘｉ溶解し、それを、９４ｍ ｇのジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で無水Ｄ　Ｍ　Ｆ　２ ００μ！中に入れたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５２ｉｙ）の溶液で処理す ることにより、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体へ転化した０反応は０℃で ４時間進行させた。沈澱したジシクロヘキシル尿素を遠心分離により除去し、上 澄み液（２００μりを、ｐＨ８，７７の０．０１Ｍホスフェートｆ！衝液中にア ミン結合ＤＮ　Ａ　（Ｅ　、ｃｏｌ　ｉからの１５ヌクレオチド一致配列を含む ３８−ｍａｒ）を入れた溶液へ添加したく緩衝液１００μβ中２Ａ２ｓｏ）−反 応は室温で一晩進行させた。かなりの量の固体が反応中に現れ、それをガラスウ ールで濾過することにより除去した。デ液３濃縮し、ＩＭのトリエチルアンモニ ウムアセテート（ｐＨ６，８）０．５ｚｆ中に溶解し、た１次に反応混合物をゲ ルＰ通力ラムでクロマトグラフにかけた。標識付けされたＤＮＡ１０−ブはレニ ウム錯体の結合と一致した分光性を示した（ｅｍ　５９４ｎｍ）。

次にレニウムで標識付けされたプローブを、上記マニアラスによるＥ、ｃｏｌｉ 核酸の試料でバイブリド化した。

次にバイブリド化複合体を、信号プローブに隣接したＥ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡの別の配列に相補的な別の固体支持体結合プローブにより捕捉 させた。捕捉手順は、このプロトコルの最初の部分について用いられたのと同じ ハイブリダイゼーション条件を用いた。バイブリド化された複合体を遠心分離に より単一鎖核酸から分離し、繰り返し洗浄した０次に分離された複合体を５分間 水中で１００℃で加熱し、複合体を解離した。今度は溶液中へ放出された標識付 けされたプローブを、電気化学的ルミネッセンス信号を測定するため適当なカク テル中へ移行させた。信号の強度は標的ＤＮＡの量に直線的に相当していた。

ルテニウム、レニウム及びオスミウム錯体で独立に標識付けされたＥ、ｃｏｌｉ からの３８−ｍａｒＤ　Ｎ　Ａプローブを別々の実験で用いて、それらの相補的 配列とバイブリド化した。デュプレックスの電気化学的ルミネッセンス信号を、 対応する標識付けした単一鎖プローブの電気化学的ルミネッセンス信号と比較し た。電気化学的ルミネッセンス信号の変調が各デュプレックスについて観察され た。

１＜ｅＴＡＣｒの漂１ｉ　、ｎＭ ＦＩＧＵＲＥ　２ ＝寥：　を至１　ラボ　−−１：　鳴ｌ閣１Ａヤリブ゛ラント１−−＞乏る Ｆ′Ｉσ）ε　３ 、え１ｑ１ｏｎ　’？　Ｂ叫

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次の式を有する化学的モイエティ：［Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ （Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、 Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ く；ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５又は Ｌ６の一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか又はそれより大き い整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数であり；ｔは１に 等しいか又はそれより大きい整数であり；ｕは１に等しいか又はそれより大きい 整数であり；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは、前記化学的モ イエティが電磁波を放出するように誘導することができ、Ｒｅのリガンドによっ て与えられるＲｅへの全結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組成及び数を 有する〕。 （２）Ｐが芳香族複素環リガンドである請求項１に記載の化学的モイエティ （３）Ｐが窒素を含む請求項２に記載の化学的モイエティ （４）Ｐが、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジル、フェナントロイル、ポル フィリン、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジル、置換フェナン トロイル又は置換ポルフィリンである請求項３に記載の化学的モイエティ （５）Ｐが、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、 置換アラルキル、カルボキシレート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、 シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニ ル、アミジン、グアニジン、ウレイド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒドロキ シスクシンイミドのカルボキシレートエステルで置換されている請求項４に記載 の化学的モイエティ （６）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも一つがポリデンテー ト芳香族複素環リガンドである請求項１に記載の化学的モイエティ。 （７）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも一つが窒素を含んで いる請求項６に記載の化学的モイエティ （８）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、し４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも一つがビピリジル、 ビピラジル、テルピリジル、フェナントロイル、ポルフィリン、置換ビピリジル 、置換ビピラジル、置換テルピリジル、置換フェナントロイル又は置換ポルフィ リンである請求項７に記載の化学的モイエティ （９）Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも一つがアルキル、置 換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキ シレート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキ シ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジニ ウム、ウレイド、硫黄含有基、燐含有基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカ ルボキシレートエステルで置換されている請求項８に記載の化学的モイエティ （１０）各々のビデンテートリガンドが、ビピリジル、ビピラジル、テルピリジ ル、フェナントロイル、置換ビピリジル、置換ビピラジル、置換テルピリジル又 は置換フェナントロイルである二つのビデンテートリガンドを含む請求項１に記 載の化学的モイエティ（１１）各々のビデンテートリガンドが、ビピリジル、ビ ピラジル、テルピリジル、フェナントロイル、置換ビピリジル、置換ビピラジル 、置換テルピリジルヌは置換フェナントロイルである三つのビデンテートリガン ドを含む請求項１に記載の化学的モイエティ（１２）二つのビデンテートビピリ ジルリガンドと一つの置換ビデンテートビピリジルリガンドを含む請求項１１に 記載の化学的モイェテイ （１３）Ｂが、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、蛋白質、脂質蛋白質、糖質蛋白 質、ペプチド、核酸、多糖類、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、細胞代謝物質、ホル モン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイド、ステ ロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖又は非生物学的重合体である請求項１に記載 の化学的モイエティ （１４）Ｂが、血清由来抗体又はモノクローナル抗体である請求項１３に記載の 化学的モイエティ（１５）Ｂが、一つ以上の直接アミド結合を通して、Ｌ１、Ｌ ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６の少なくとも一つ以上に結合している請求項１に 記載の化学的モイエティ（１６）次の構造を有する化学的モイエティ：▲数式、 化学式、表等があります▼ （式中、ｎは１、２又は３である） （１７）次の構造を有する化学的モイエティ：▲数式、化学式、表等があります ▼ （式中、ｎは１、２又は３である） （１８）請求項１６又は１７に記載の化学的モイエティと反対イオンとからなる 塩。 （１９）反対イオンが、ＮＨ４＋、グアニジニウム、Ａｇ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、 Ｋ＋、Ｃａ＋２、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋及びＣｄ２＋からなる群から選択された陽 イオン、又はＳＯ４２−、ハロゲン化物、炭酸塩ヘキサフルオロホスフェート及 びテトラフルオロボレート過塩素酸塩からなる群から選択された陰イオンである 請求項１８に記載の塩。 （２０）請求項１に記載の化学的モイエティの存在を決定する方法において、前 記化学的モイエティを含む試薬混合物を形成し、該モイエティの存在を決定する ことからなる、化学的モイエティ存在の決定方法。 （２１）化学的モイエティ存在の決定が、放射又は吸収分光分析、原子吸収、電 気化学的、化学的、化学的ルミネッセンス、光ルミネッセンス又は電気化学的ル ミネッセンス法により行われる請求項２０に記載の方法。 （２２）化学的モイエティ存在の決定が、該化学的モイエティを電磁波を発する ように誘導し、放出された電磁波を検出することからなる請求項２０に記載の方 法。 （２３）次の式： ［Ｒｅ（Ｐ）ｍ［（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６ ）ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり：Ｌ１、し２、し３、Ｌ４、 Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ く；ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５又は Ｌ６の一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか又はそれより大き い整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びＳの各々は０又は整数であり；ｔは１に 等しいか又はそれより大きい整数であり；ｕは１に等しいか又はそれより大きい 整数であり；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは、前記化学的モ イエティが電磁波を放出するように誘導することができ、Ｒｅのリガンドによっ て与えられるＲｅへの全結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組成及び数を 有する〕 を有する化学的モイエティの存在を決定する方法において、 （ａ）試薬混合物を化学的モイエティを含む適当な条件下で形成し； （ｂ）試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネルギー又は電磁波エネル ギーに曝すことにより前記部分が電磁波を発するよう誘導し；そして （ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによって前記化学的モイエティの存 在を決定する、ことからなる決定方法。 （２４）モイエティが化学物質に結合することができる請求項２３に記載の方法 。 （２５）次の式： ［Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６） ｓ］ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、 Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ く；ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５又は Ｌ６の一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか又はそれより大き い整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数であり；ｔは１に 等しいか又はそれより大きい整数であり；ｕは１に等しいか又はそれより大きい 整数であり；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは、前記化学的モ イエティが電磁波を放出するように誘導することができ、Ｒｅのリガンドによっ て与えられるＲｅへの全結合数が Ｒｅの配位数に等しくなるような組成及び数を有する〕を有する化学的モイエテ ィに結合する検査したいアナライトの存在を決定する方法において、 （ａ）前記アナライトを前記化学的モイエティと、試薬混合物を形成するような 適当な条件下で接触させ；（ｂ）前記試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学 的エネルギー又は電磁波エネルギーに曝すことにより前記モイエティが電磁波を 発するように誘導し；そして（ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによっ て前記検査したいアナライトの存在を決定する、ことからなる決定方法。 （２６）アナライト及び、式Ｉを有する化学的モイエティが競争的に相補的物質 に結合する場合に、検査したいアナライトの存在を決定するための競争的結合方 法において、前記化学的モイエティが式： ［Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６） ｓ〕ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、 Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ く；ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、し５又は Ｌ６の一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか又はそれより大き い整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びｓの各々は０又は整数であり；ｔは１に 等しいか又はそれより大きい整数であり；ｕは１に等しいか又はそれより大きい 整数であり；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは、前記化学的モ イエティが電磁波を放出するように誘導することができ、Ｒｅのリガンドによっ て与えられるＲｅへの全結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組成及び数を 有する〕 を有し、 前記方法が、 （ａ）相補的物質、前記化学的モイエティ、及びアナライトを、試薬混合物を形 成するような適当な条件下で接触させ； （ｂ）試薬混合物を化学的エネルギー、電気化学的エネルギースは電磁波エネル ギーに曝すことにより前記化学的モイエティが電磁波を発するように誘導し；そ して（ｃ）その放出された電磁波を検出し、それによって検査したいアナライト の存在を決定することからなる、競争的結合方法。 （２７）Ｂが、一つ以上のアミド又はアミン結合を通して、Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ ３、Ｌ４、Ｌ５、又はＬ６の少なくとも一つ以上と共有結合している物質である 請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （２８）Ｂが、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白質、糖質蛋 白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、ペプチド、細胞代謝物質、ホル モン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビツレート、アルカロイド、ステ ロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖又は非生物学的重合体である請求項２３〜２ ６のいずれか１項に記載の方法。 （２９）Ｂが、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドである請求項２８に記載の方 法。 （３０）Ｂが、血清由来抗体又はモノクローナル抗体である請求項２８に記載の 方法。 （３１）化学物質が、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白質、 糖質蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、ペプチド、細胞代謝物質 、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビッレート、アルカロイド 、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖又は非生物学的重合体である請求項２ ４に記載の方法。 （３２）化学物質が、検査容器の表面に固定されている請求項２４に記載の方法 。 （３３）化学物質が、血清由来抗体又はモノクローナル抗体である請求項２４に 記載の方法。 （３４）Ｂがアナライトと同じ物質である請求項２６に記載の方法。 （３５）アナライトが、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白質 、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、糖質蛋白質、ペプチド、細胞代謝物 質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビッレート、アルカロイ ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖又は非生物学的重合体である請求項 ２５又は２６に記載の方法。 （３６）相補的物質が、全細胞、ウィルス、細胞内粒子、核酸、多糖類、蛋白質 、糖質蛋白質、脂質蛋白質、リポ多糖類、脂質、脂肪酸、ペプチド、細胞代謝物 質、ホルモン、薬理学的薬剤、トランキライザー、バルビッレート、アルカロイ ド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、砂糖又は非生物学的重合体である請求項 ２６に記載の方法。 （３７）化学物質が、血清由来抗体又はモノクローナル抗体である請求項３６に 記載の方法。 （３８）化学物質が、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片である請求項３６に記載の方法 。 （３９）方法が均質方法で、適切な条件が、結合化学的モイエティと非結合化学 的モイエティが試薬混合物をエネルギー源に曝す前に分離されていない条件であ る請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （４０）方法が不均質方法で、適切な条件が、結合化学的モイエティと非結合化 学的モイエティとを、試薬混合物をエネルギー源に曝す前に分離することを含む 請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （４１）アナライトが不溶性マトリックスに固定されている請求項２５又は２６ に記載の方法。 （４２）方法がはさみ法である請求項４１に記載の方法。 （４３）化学物質が不溶性マトリックスに固定されており、化学的モイエティが 生物学的流体又は合成反応混合物の一成分である請求項２４に記載の方法。 （４４）方法が、相補的物質が不溶性マトリックスに固定されている競争的結合 方法である請求項２６に記載の方法。 （４５）相補的物質がモノクローナル抗体であり、不溶性マトリックスが検査容 器の表面である請求項４４に記載の不均質方法。 （４６）相補的物質がモノクローナル抗体であり、不溶性マトリックスが検査容 器の表面である請求項４４に記載の均質方法。 （４７）試薬混合物が電磁波、化学的エネルギー及び電気化学的エネルギーの組 み合わせに曝される請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （４８）化学的モイエティがエネルギー源に曝されることによって酸化される請 求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （４９）化学的モイエティがエネルギー源に曝されることによって還元される請 求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （５０）試薬混合物が、オキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネート、 シトレート、タートレート又はペルオキシジサルフェートを含んでいる請求項２ ３〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （５１）エネルギー源が化学的還元剤である請求項４９に記載の方法。 （５２）化学的還元剤がマグネシウムである請求項５１に記載の方法。 （５３）エネルギー源が化学的酸化剤である請求項４８に記載の方法。 （５４）化学的酸化剤がＣｅ（ＩＶ）塩、又はＰｂＯ２である請求項５３に記載 の方法。 （５５）試薬混合物がペルオキシジサルフェートを含有する請求項４９に記載の 方法。 （５６）試薬混合物が、オキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネート、 シトレート又はタートレートを含んでいる請求項４８に記載の方法。 （５７）試薬混合物が、化学的モイエティの還元を行うのに充分な電位と、前記 化学的モイエティの酸化を行うのに充分な電位との間で振動する電位をもつ電極 に、試薬混合物を連続的に曝す請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の方法。 （５８）エネルギー源が、化学的モイエティを酸化するのに充分な電位の上下で 振動する電位をもつ電極であり、試薬混合物がオキサレート、ピルベート、ラク テート、マロネート、タートレート又はシトレートを含む請求項４８に記載の方 法。 （５９）エネルギー源が、化学的モイエティを酸化するのに充分な一定の電位を もつ電極であり、試薬混合物がオキサレート、ピルベート、ラクテート、マロネ ート、タートレート又はシトレートを含む請求項４８に記載の方法。 （６０）エネルギー源が、化学的モイエティを還元するのに充分な電位の上下で 振動する電位をもつ電極であり、試薬混合物がペルオキシジサルフェートを含む 請求項４９に記載の方法。 （６１）エネルギー源が、化学的モイエティを還元するのに充分な一定の電位を もつ電極であり、試薬混合物がペルオキシジサルフェートを含む請求項４９に記 載の方法。 （６２）式： ［Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（し３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６） ｓ］ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、 し５及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ く；ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５又は Ｌ６の一つ以上に共役している物質であり；ｍは１に等しいか又はそれより大き い整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びＳの各々は０又は整数であり；ｔは１に 等しいか又はそれより大きい整数であり；ｕは１に等しいか又はそれより大きい 整数であり；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは、前記化学的モ イエティが電磁波を放出するように誘導することができ、Ｒｅのリガンドによっ て与えられるＲｅへの全結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組成及び数を 有する〕 を有する化物モイエテイの存在を決定するためのシステムにおいて、 （ａ）レニウム含有化学的モイエティを含む試薬混合物；（ｂ）化学的モイエテ ィが電磁波を発するように誘導するための手段；及び （ｃ）放出された電磁波を検出する手段；を有するシステム。 （６３）式： 〔Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ６） ｓ］ｔ（Ｂ）ｕ 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、 Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ く；ＢはＲｅのリガンドであるか、又はＰ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５又は Ｌ６の一つ以上に、一つ以上のアミド又はアミン結合により共役している物質で あり；ｍは１に等しいか又はそれより大きい整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及 びＳの各々は０又は整数であり；ｔは１に等しいか又はそれより大きい整数であ り；ｕは１に等しいか又はそれより大きい整数であり；Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、 Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６及びＢは、前記化学的モイエティが電磁波を放出するように誘 導することができ、Ｒｅのリガンドによって与えられるＲｅへの全結合数がＲｅ の配位数に等しくなるような組成及び数を有する〕 を有する化学的モイエティに結合する検査したいアナライトの存在を決定するた めのシステムにおいて、（ａ）化学的モイエテイ； （ｂ）化学的モイエティを検査したいアナライトと接触させ、試薬混合物を形成 するための手段；（ｃ）化学的モイエティが電磁波を発するように誘導するため の手段；及び （ｄ）放出された電磁波を検出する手段；を有するシステム。 （６４）請求項１に記載の化学的モイエティ及び異なった波長の電磁波を発する ように夫々誘導することができる一種類以上の異なった化学的モイエティを含む 組成物。 （６５）化学的モイエティが夫々異なった検査したいアナライトに結合されてい る請求項６４に記載の組成物。 （６６）（ａ）試薬混合物を化学的モイエティを含む適当な条件下で形成し； （ｂ）前記試薬混合物を電磁波エネルギー、化学的エネルギー又は電気化学的エ ネルギーに曝すことにより前記モイエティが電磁波を発するよう誘導し；そして （ｃ）その放出された異なった電磁波を検出し、それによって前記化学的モイエ ティの存在を決定する、ことからなる請求項６４に記載の化学的モイエティの存 在を決定する方法。 （６７）（ａ）アナライトと化学的モイエティとを、試薬混合物を形成するよう な適当な条件下で接触させ；（ｂ）前記試薬混合物を電磁波エネルギー、化学的 エネルギー、電気化学的エネルギーに曝すことにより前記化学的モイエティが電 磁波を発するように誘導し；そして（ｃ）その放出された異なった波長の電磁波 を検出し、それによって検査したいアナライトの各々の存在を決定する； ことからなる請求項６４に記載の異なった化学的モイエティに選択的に結合する 一種類以上の検査したいアナライトの存在を決定する方法。 （６８）試薬混合物が、異なった波長の電磁波を夫々発するよう誘導することが できる一種類以上の異なった化学的モイエティを含有する請求項２３に記載の方 法。 （６９）試薬混合物が、異なった波長の電磁波を夫々発するよう誘導することが できる一種類以上の異なった化学的モイエティを含有し、各モイエティが検査し たい異なったアナライトに結合されている請求項２５に記載の方法。 （７０）試薬混合物も、異なった波長の電磁波を夫々発するよう誘導することが できる一種類以上の異なった化学的モイエティを含有する請求項２５に記載の方 法。 （７１）試薬混合物が、異なった波長の電磁波を夫々発するよう誘導することが できる一種類以上の異なった化学的モイエティを含有し、各モイエティが検査し たい異なったアナライトに結合されている請求項６３に記載の装置。 （７２）異なった化学的モイエティが、異なった源からの異なった値のエネルギ ーに曝すことにより電磁波を発するよう誘導される請求項６４に記載の組成物。 （７３）化学的モイエティが夫々異なった物質に結合している請求項７２に記載 の組成物。 （７４）（ａ）試薬混合物を化学的モイエティを含有する適当な条件下で接触さ せ； （ｂ）前記試薬混合物を異なった値のエネルギー又は異なった源からのエネルギ ーに異なった時間に曝すことにより、異なった時間に前記化学的モイエティが電 磁波を発するように誘導し；そして （ｃ）その放出された電磁波を、前記試薬混合物を異なった値又は異なった源の エネルギーの各々に曝した後検出し、それによって化学的モイエティの各々の存 在を決定する； ことからなる請求項７２に記載の化学的モイエティの存在を決定する方法。 （７５）試薬混合物が、異なった値のエネルギー又は異なった源のエネルギーに 曝されることによって電磁波を夫々発するよう誘導することができる一種類以上 の異なった化学的モイエティを含有する請求項２３に記載の方法。 （７６）試薬混合物が、異なった源のエネルギーに曝すされることによって電磁 波を夫々発するよう誘導することができる一種類以上の異なった化学的モイエテ ィを含有し、各モイエティが検査したい異なったアナライトに結合されている請 求項２５に記載の方法。 （７７）試薬混合物も、異なった値のエネルギー又は異なった源のエネルギーに 曝されることによって電磁波を夫々発するよう誘導することができる一種類以上 の異なった化学的モイエティを含有する請求項６２に記載のシステム。 （７８）試薬混合物が、異なった値のエネルギー又は異なった源からのエネルギ ーに曝されることによって電磁波を夫々発するよう誘導することができる一種類 以上の異なった化学的モイエティを含有し、各モイエティが検査したい異なった アナライトに結合されている請求項６３に記載のシステム。 （７９）次の構造を有する化学的モイエティ：▲数式、化学式、表等があります ▼ 〔式中、ＸとＸ′及びＹとＹ′は同じでも異なっていてもよく、Ｘ及びＸ′はＮ （ＣＨ２Ｈ５）２、ＣＨ３、ＣＨ３Ｏ、Ｃ６Ｈ５、Ｃｌ、ＣＯ２ＣＨ３、ＣＮ、 又はＮＯ２でよく、Ｙ及びＹ′はＨ又はＣＨ３でよく、もしＸとＸ′及びＹとＹ ′が同じで、ＸがＣＯ２ＣＨ３であるならば、ＹはＨではなく、更にもしＸとＸ ′及びＹとＹ′が同じであるならば、Ｘ及びＹはＨではなく；そしてＲは陰イオ ンである〕。 （８０）多成分液体試料の予め定められた体積中で、約１０−３モルより低い濃 度でその試料中に存在する検査したいアナライトを検出する方法において、（ａ ）レニウム含有有機化合物を含む電気化学的ルミネッセンス性化学的モイエティ を有する試薬と試料とを接触させ、然も、前記試薬は（ｉ）繰り返し輻射線を放 出するように前記試薬を誘導するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電気 化学的又は電磁気的エネルギーに曝すことによって繰り返し電磁波を放出するよ うに誘導することができ、そして（ｉｉ）検査したいアナライトと一緒にするこ とができ、然も、前記接触を、アナライトと前記試薬とを結合するような適当な 条件で行ない；（ｂ）得られた試料を、繰り返し輻射線を発するように前記試薬 を誘導するのに有効な量の、適当な源からの化学的、電気化学的又は電磁波エネ ルギーに露出し、然も、その露出を、繰り返し電磁波を放出するように前記試薬 を誘導するのに適切な条件下で行い；そして（ｃ）そのようにして放出された電 磁波を検出し、それによって試料中の検査したいアナライトの存在を検出する； ことからなる：検出方法。 （８１）電気化学的ルミネッセンス検査系のための内部標準を確立するための方 法において、 （ｉ）（ａ）第一電気化学的ルミネッセンスモイエティを含むアナライト、及び （ｂ）第二電気化学的ルミネッセンスモイエティを含む内部標準、 を含む溶液を形成し、然も、前記第一及び第二モイエティは、それらの間で重要 な相互作用が起きない実質的に互いに独立した電気化学的ルミネッセンスを示し 、夫々互いに独立に見ることができる充分異なった波長の電気化学的ルミネッセ ンス発光を示し、 （ｉｉ）アナライト及び内部標準の電気化学的ルミネッセンスを独立に測定する 、 諸工程からなる内部標準確立法。 （８２）アナライトがレニウム含有モイエティ及び内部標準がオスミウム含有モ イエティである請求項８１に記載の方法。 （８３）次の式を有する電気化学的ルミネッセンス性レニウム含有モイエティ： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、ＷはＣＨＯ、ＣＯＯＨ、ＮＨ２及びＢｒからなる群から選択されたもの であり、Ｒは陰イオンであり、ｎは整数であり、ｍは１、２又は３であり、ビピ リジル基は置換されていてもいなくてもよい）。 （８４）複数のアナライトが多成分混合物中にあり、検査が、 （ｉ）ルテニウム及びレニウム （ｉｉ）オスミウム及びレニウム、又は（ｉｉｉ）ルテニウム、オスミウム及び レニウムを含む電気化学的ルミネッセンス性モイエティの組み合わせを用いて前 記複数のアナライトに関し同時に行なわれる請求項２３、２６又は８０のいずれ か１項に記載の方法。 （８５）次の式を有する組成物： ［Ｘ−（Ｙ）ｕ−Ｚ］ｖ＋（Ｒ）ｗ （式中、Ｘは、一つ以上の同じか又は異なるヌクレオチド、一つ以上の同じ又は 異なるアミノ酸、抗体、検査したいアナライト又は検査したいアナライトのアナ ローダであり； Ｙは結合基であり、 Ｚは［Ｒｅ（Ｐ）ｍ（Ｌ１）ｎ（Ｌ２）ｏ（Ｌ３）ｐ（Ｌ４）ｑ（Ｌ５）ｒ（Ｌ ６）３］ｔ 〔式中、ＰはＲｅのポリデンテートリガンドであり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、 Ｌ５及びＬ６はＲｅのリガンドで、その各々は互いに同じでも異なっていてもよ く；Ｒは陰イオンであり、 ｍは１に等しいか又はそれより大きい整数であり；ｎ、ｏ、ｐ、ｑ、ｒ及びＳの 各々は０又は整数であり；ｔは１に等しいか又はそれより大きい整数であり；そ して ｕは０又は整数であり； ｖは０．１，２又は３であり、 ｗは０又は１であり、 Ｐ、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、及びＬ６は、前記化学的モイエティが電磁 波を放出するように誘導することができ、Ｒｅのリガンドによって与えられるＲ ｅへの全結合数がＲｅの配位数に等しくなるような組成及び数を有し、但しｗは ｖが０の時０である〕。 （８６）Ｙが、−（ＣＨ２）ｎ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ− ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−、 又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（ＣＨ３）２（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ −であり、ｍ、ｎ及びｒは全て同じか又は必ずしも同じではなく、各々が１に等 しいか又はそれより大きな整数である請求項８５に記載の組成物。 （８７）Ｚが、ビス（２，２′−ビピリジン）［４−ブタン−１−アル）−４′ メチル−２，２′ビピリジン］レニウム、（２，２′−ビピリジン）マレイミド ヘキサン酸、４−メチル−２，２′−ビピリジン−４′−ブチルアミドレニウム 、又はビス（２，２′−ビピリジン）［４−メチル−２，２′−ビピリジン−４ ′−イル〕レニウムである請求項８５に記載の組成物。 （８８）Ｘがテオフィリンであり、ｕ、ｖ及びｗが１である請求項８５に記載の 組成物。