JPH02501768A - ブタ赤痢診断試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタ赤痢診断試験 この発明は、例えばブタをあらかじめ感染源に暴露した結果またはワクチン注射 後の、ブタ赤痢に対するブタの免疫度の測定に使用され得る診断試験キットおよ び方法に関するものである。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエは、ブタ赤痢の主たる病原体として同定されて いる。ブタ赤痢から回復したブタがこの病気に対する免疫度を高めていることは 、獣医の間で認められている。しかしながら、この病気の経過中、動物を抗生物 質で処置すると、その後の感染に対するブタの抵抗力は低下する。このことは、 感染に対する充分な抵抗力を発現させるためには、動物を病原体であるトレポネ ーマ・ヒョジセンテリエに長期間強く暴露しなければならないことを示唆してい る。トレポネーマ・ヒョジセンテリエは大腸の粘膜表面においてその病的作用を 示すことから、免疫性を高めるためには、能動的な臨床的感染が行なわれなけれ ばならないことが判る。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエ感染に対するブタの免疫反応のタイプについて はあまり知られておらず、トレポネーマ・ヒョジセンテリエに対する暴露により 産生される抗体応答のタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭＳ　ＩｇＡ）に関して 利用可能なデータは無い。

ヒトおよび動物における多くの感染症に関する固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ ）は開発されているが、ブタにおけるブタ赤痢の信頼性の高い検出に関するＥＬ 　Ｉ　ＳＡまたは他の血清学的試験は現在のところまだ開発されていない。ファ ーニー等、リサーチ・イン・ベトレポネーマ・ヒョジセンテリエ感染に対する抗 体応答測定用微細凝集試験が報告されているが、それらは、それらが測定した力 価の大きさおよび実験的攻撃に対する防御程度の間の相関関係を測定することは できない。グロック等、アメリカ合衆国特許第４１００２７２号は、間接蛍光抗 体技術を用いてトレポネーマ・ヒョジセンテリエに対する抗体力価を測定したが 、商業的に利用可能な試験法はこの技術からは得られなかった。

この発明は、例えば試験の遂行を可能にする診断試験キットと組み合わせてＥＬ 　Ｉ　ＳＡ技術を用いることによる、ブタ赤痢に関する効果的で信頼性の高い血 清学的試験方法を提供する。

この発明の一態様によると、ブタから採取した試料中のトレポネーマ・ヒョジセ ンテリエに対する抗体検出用診断試験方法であり、前記試料を固体支持体上のト レポネーマ・ヒョジセンテリエ抗原と接触させ、前記抗原と前記試料中のトレポ ネーマ・ヒョジセンテリエに対する抗体との結合を検出する段階を含んで成る方 法であって、固体支持体上の抗原をカゼインまたは他の乳蛋白質溶液で処理する ことにより、試料を抗原と接触させる前の非特異結合を阻止することを特徴とす る方法が提供される。

別の態様において、この発明は、ブタから採取した試料中のトレポネーマ・ヒョ ジセンテリエに対する抗体検出用診断試験キットであって、 （ｉ）固体支持体上のトレポネーマ・ヒョジセンテリエ抗原、（ｉｉ）カゼイン または他の乳蛋白質溶液、および（ｉｉｉ）試料中のトレポネーマ・ヒョジセン テリエに対する抗体と抗原との結合を検出する手段 を含んで成るキットを提供する。

好ましくは、非特異結合を阻止する「ブロッキング」段階は、燐酸緩衝液に脱脂 スキムミルクを溶かした溶液を用いて行なわれる。この試験方法で使用される他 の溶液、例えば酵素／抗体コンジュゲート溶液および洗浄液はまた、好ましくは 燐酸緩衝液中脱脂スキムミルクを含む。

好ましくは、固体支持体上の抗原への抗体の結合検出手段は、コン゛シュゲート した形で酵素、例えば西洋わさびペルオキシダーゼを有する抗ブタＩｇＧまたは ＴｇＭを、この酵素と反応して検出可能なシグナルを提供する色素原基質、例え ばＡＢＴＳと一緒に含む。

以下、この発明の検定方法の段階の詳細な記載を行う。

１、トレポネーマ・ヒョジセンテリエの細胞を発酵槽中または寒天プレートにお いて生長させ、採取し、（ＰＢＳ）燐酸緩衝食塩水で洗浄し、音波処理し、抗原 用として必要になるまで一２０℃で貯蔵する。

２、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ抗原を固体支持体、例えばヌンク・ハイ− ボンド・ポリスチレンＥＬ　Ｉ　ＳＡマイクロタイター・プレートに加え、４℃ で一夜貯蔵して抗原をプラスチック支持体のウェルの表面に結合させる。

３、未結合抗原があればそれらを支持体表面から除去し、脱脂スキムミルクＣＰ ＢＳ中５％）溶液を加えることにより、加えない場合に血清蛋白質と結合し得る 支持体表面の遊離レセプター部位を被覆する。

４、適当な希釈率（例、１／４００〜１１５１２００）に希釈しＴこブタ血清を ウェルに加え、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ抗原と反応させる。

５、反応後、ブタ血清を洗浄し、アフィニティー精製抗ブタＩｇＧまたはアフィ ニティー精製抗ブタＩｇＭ（両方とも指示酵素にコンジュゲートしている）をウ ェルに加える。（コンジュゲート溶液を好ましくは２％脱脂スキムミルク含有Ｐ ＢＳで希釈する）。

６、反応後、再びウェルをＰＢＳ−２％脱脂スキムミルクで洗浄し、次いで酵素 コンジュゲートＩｇＧま１こはＩｇＭと反応する基質をウェルに加える。

７、適当な技術を用いて酵素コンジュゲート抗血清の結合程度を測定する。

８、各検定では、トレポネーマ・ヒョジセンテリエに対する既知抗体力価を有す るブタから得られた血清（陽性対照）および先に暴露しなかったブタから得られ た血清（陰性対照）が含まれる。

この発明により提供されるブタのトレポネーマ・ヒョジセンテリエに関するＥＬ ＩＳＡ検定法を用いることにより、トレポネーマ・ヒョジセンテリエ・ワクチン を接種またはこれに自然感染したブタにおける抗体応答を測定した。ブタをトレ ポネーマ・ヒョジセンテリエのヴイルレント野生型株により攻撃した場合、Ｉｇ Ｇについて１／８００の希釈率で〉１．０の吸光度力価を有するものは、トレポ ネーマ・ヒョジセンテリエによる実験的または自然感染に対して抵抗性を示すが 、１／８００の血清希釈率で１．０未満の吸光度を有するものは、自然または実 験的感染を被りやすいことが見出された。（先にトレポネーマ・ヒョジセンテリ エに暴露されなかったブタは全て１／８００で０．５未満の吸光度レベルを有す ることが見出された）。

以下、実施例によりこの発明の特徴をさらに明らかにする。

実施例１ この発明の検定手順を用いることにより、接種前のブタ血清と比較した１回およ び２回ワクチン投与後のトレポネーマ・ヒョジセンテリエに対する接種ブタの平 均免疫応答を測定し、また非接種ブタの対照群と比較した。結果を添付図面に示 す。これらのブタを全て（接種群および対照群）トレポネーマ・ヒョジセンテリ エのヴイルレント株により攻撃すると、対照ブタは全て゛古典的ブタ赤痢により 死亡したが、ワクチン投与されたブタはブタ赤痢の兆候を一切示さなかった。こ れらの結果から、希釈率１／８００の血清における１゜００）吸光度は、トレポ ネーマ・ヒョジセンテリエ感染からの防御に必要とされる最小抗体力価であると いう結論に達した。

実施例２ 二の発明のＥＬＩＳＡ検定をブタ赤痢の様々な状態にある幾つかのブタ群に適用 した。同じ管理下ではあるが独立した飼育場に入れられた３つの各ブタ群におい て、このトレポネーマ・ヒョジセンテリエＥＬＩＳＡ検定を用いることによりブ タ赤痢状態を測定した。

ブタ群１ａ　状態 一最近数週間におけるブタ赤痢の一時的症例。トレポネーマ・ヒョジセンテリエ カ価を有するブタは１６／２０゜ｂ、Ｅ１１ｓＡ結果は、トレポネーマ・ヒョジ センテリエ感染を確認した。

ブタ群２ａ　状態 一ブタ赤痢の証拠は無かったが、ブタ群ｌからの数頭のブタが２箇月早く導入さ れた。

ｂ、ＥＬＩＳＡ結果は、２０％のブタにおいてトレポネーマ・ヒョジセンテリエ 感染の存在を確認し１こ。続いてこの群は、２週間遅れて臨床的ブタ赤痢の症例 との関係を絶った。

−ユニ数年ブタ赤痢の証拠は無く、最近数箇月に新しいブタの導入は無かった。

トレポネーマ・ヒョジセンテリエカ価を有するブタは０／２０゜ ｂ、ＥＬＩＳＡ結果はトレポネーマ・ヒョジセンテリエ感染の証拠を全く示さな かった。群はまだブタ赤痢にり患していない。

７゛７ト苅試醍Ｊρ ７゛う７１；射勺帳支度で゛ある／４カシの１′りＤ・ら成る群国際調査報告

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）ブタから採取した試料中のトレポネーマ・ヒヨジセンテリエに対する抗体 検出用診断試験方法であり、前記試料を固体支持体上のトレポネーマ・ヒヨジセ ンテリエ抗原と接触させ、前記抗原への試料中のトレポネーマ・ヒヨジセンテリ エに対する抗体の結合を検出する段階を含む方法であって、固体支持体上の抗原 をカゼインまたは他の乳蛋白質溶液で処理することにより、試料を前記抗原と接 触させる前の非特異結合を阻止することを特徴とする方法。
2. （２）非特異結合の阻止に使用される溶液が、燐酸緩衝液に脱脂スキムミルクを 溶かした溶液を含むものである、請求項１記載の方法。
3. （３）検出段階が、コンジュゲートした形で酵素を有する抗ブタ抗体、次いで前 記酵素の色素原基質を加えることにより検出可能なシグナルを発生させる段階を 含む、請求項１または請求項２記載の方法。
4. （４）酵素コンジュゲート抗ブタ抗体が西洋わさびペルオキシダーゼ−コンジュ ゲート抗ブタＩｇＧまたはＩｇＭであり、色素原基質がＡＢＴＳである、請求項 ３記載の方法。
5. （５）ブタから採取した試料中のトレポネーマ・ヒヨジセンテリエに対する抗体 の検出用診断試験キットであって、（ｉ）固体支持体上のトレポネーマ・ヒヨジ センテリエ抗原、（ｉｉ）カゼインまたは他の乳蛋白質溶液、および（ｉｉｉ） 抗原への試料中のトレポネーマ・ヒヨジセンテリエに対する抗体の結合検出手段 を含むキット。
6. （６）カゼインまたは他の乳蛋白質溶液が、燐酸緩衝液に脱脂スキムミルクを溶 かした溶液を含むものである、請求項５記載の試験キット。
7. （７）検出手段が、コンジュゲートした形で酵素を有する抗ブタ抗体および前記 酵素の色素原基質を含んで成る、請求項５または請求項６記載の試験キット。
8. （８）酵素コンジュゲート抗ブタ抗体が西洋わさびペルオキシダーゼ−コンジュ ゲート抗ブタＩｇＧまたはＩｇＭであり、色素原基質がＡＢＴＳである、請求項 ７記載の試験キット。