JPH03501857A - ブタ赤痢サブユニットワクチンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ブタ赤痢サブユニットワクチンおよびその製造方法発明の背景 本発明は一般にブタ赤痢ワクチンの製造方法に関する。

特に詳しくは、本発明はトレポネーマ・ヒオジセンテリタ赤痢に関連した病因を 防御することが判明しているブタ赤痢サブユニットワクチンに関する０て有害で はないブタ赤痢ワクチンが切望されている。現在、これらの特徴の全てを合せて 提供する、入手可能なワクチンは存在しない。本発明は、Ｔ、ヒオジセンテリ周 知である。ワクチンと種々な全細胞ワクチン製剤の使用方法との例は全てデルバ ート　エル、ノルリス（ＤｅｌｂｅｒｔＬ、　Ｈａｒｒｉｓ）に付与された米国 特許第４．４６９，６７２号、第４，２０３，９６８号、第４．１５２，４１４ 号および第４，１５２．４１５号；ロバート　エイ、グツドナラＣＲｏｂａｒｔ Ａ、Ｇｏｏｄｎｏｖ）に１９７９年５月１日発行された米国特許第４，１５２， ４１３号；出願人：ナショナル　リサーチデイペロツブバンド　コーポレーショ ン（ＮａｔｉｏｎａｌＲｅｓａａｒｃんＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ　）のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢＢ５１０ＯＯ８７号、国際公開第Ｗ Ｏ３５特表千３−５０１８５７　（２） １０３８７５号、および出願人：モベイ　コーポレーション（Ｍｏｂａｙ　Ｃｏ ｒｐｏｒａ百Ｏ？Ｌ）、１９８６年４月２８日出願のヨーロッパ特許出願第８６ １０５８６０．０号に見られる。先行技術の全細胞製剤とは対照的に、本発明は 抗原活性を有することが実証されているトレポネーマーヒオジステリエの外層膜 エンベロープＣｏ５ｒｔｔｒ　ａｎｖｅｔｏｐｇ）部分からのサブユニット製剤 を提供する。このサブユニとの蛋白質富化炭水化物混合物から成ることを示唆す る。

発明の要約 ブタ赤痢に関して経験される問題点を解決するために、新しい改良されたブタ赤 痢ワクチンを提供することが本発明の目的である。

ワクチン投与ブタをトレポネーマ・ヒオジセンテリエによる感染から防御し、ブ タ肉を摂取する人々にとって有害でないようなブタ赤痢サブユニットワクチンの 製造方法を提供することが本発明の他の目的である。細菌トレポネーマ・ヒオジ センテリエの外層膜エンベロープから回収した抗原物質を用いることが本発明の さらに他の目的である。この抗原物質は２段階方法で得られる。最初に、細菌細 胞を第１遠心分離によって回収する。この細菌細胞をリン酸緩衝生理的食塩水（ ｐｈｏｓｐｈαｔ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ　５ａｔｉｎｓ　）　（１８００ｍｌ／回 収物４１）によって再懸濁し、第２遠心分離によって全細胞の外層膜エンベロー プ部分を細胞質物質から分離する。抗原物質を得るために用いるのは、外層膜部 分のみである。このようにして得られたこの抗原物質を「塩抽出物（ｓｃＬｌｔ ａｚｔｒａｃＯＪと呼ぶことにする。塩抽出物は回収した後に、１００Ｘに濃縮 する。

本発明の上記その他の目的、特徴および利点は、添付の表および図に説明した、 本発明の組成物および好ましい実施態様についての下記のさらに詳しい説明から 明らかになると思われる。

図面の簡単な説明 第１図（ンー７１と２）は７−マシーブルーで染色した後のトレポネーマ・ヒオ ジセンテリエ菌株Ｂ２３４の全細胞溶解物（レーン１）と塩抽出物（レーン２） からのサルコシル袖山ＯＭＦのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である。キロダルトンでの分子サイズマーカー を左側に示す。

第１図（レーン３と４）はＴ、ヒオジセンテリエ菌株Ｂ２０４の全細胞溶解物（ レーン３）と塩抽出物（レーン４）からの外層膜抗原のウェスターンプロットで ある。

トランスプロットした外層膜抗原を回復期ブタ血清（第１抗体）とペルオキシダ ーゼ標陳ビオチンーアビジン抗ブタＩりＧ（第２抗体）で染色した。基質４−ク ロロ−１−す７トールを加えることによって、バンドを可視化した。キロダルト ンでの分子サイズマーカーを左側に示す。

物からのＬＰＳ抽出抗厖（レーンｌ）とサルコンル抽出抗原（レーン２）のウェ スターンプロットである。このトランスプロットした外層膜抗原は回復期ブタ赤 痢血清（第１抗体）とペルオキシダーゼ標識ピオチン−アビジン抗ブタＩりＧ（ 第２抗体〕によって染色した。バンドに基質４−クロロ−１−ナフトールを加え ることによって、バンドを可視化した。キロダルトンでの分子サイズマーカーを 左側に示す。

第３図は銀染色によって可視化した塩抽出物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ　パターンであ る。レーン１と２はＣＦ−１マウスにおいて保護的であった血清型１と２Ｔ、ヒ オジセンテリエからの塩抽出物であり、レーン３と４はマウスにおいて保護的で なかった両血清星からの塩抽出物であから回収される抗原物質から成るブタ赤痢 サブユニットワクチンを提供する。この抗原物質はスピロヘータの細胞壁の外層 膜部分からの蛋白質とリボ多穏（ＬＰＳ）の両グラム陰性菌に対する宿主の免疫 反応の発生に関係するヒオジセンテリエの外層膜抗原がブタ赤痢に対する抗原で あり、ブタ赤痢に対する宿主の免疫反応に関係することは明らかにされていなか った。

トレホネーマ・ヒオジセンテリエのエンペローフ”ｔＨｔ分の抗原活性は、塩抽 出物を外層膜蛋白質（ＯＭＦ）とリポ多’ｌ！ｌ、（ＬＰＳ）とにさらに分画し 、蛋白質を回復期抗血清に対して反応させることによって測定した。一般に、細 菌を嫌気性東件下での発酵によって増殖させ、遠心分離によって回収し、リン酸 緩衝生理的食４水中で洗浄し、第２遠心分離によって回収する。エンベロープ分 画（塩抽出物）が第２遠心分離工程中に細胞壁から取出され、超遠心分離によっ てペレット化される。ペレットを２部分に分割した。第１部分はＮ−ラウロイル サルコシン酸ナトリウム（サルコシル）と、超遠心分離によって回収されたＯＭ Ｆとによって処理した。第２部分はフェノール−水によって抽出して、エンベロ ープのＬＰＳ部分を得た。エンベロープの画部分と、トレポネーマ・ヒオジセン テリエのサルコシル抽出全細胞とに対して不連硯ＳＤＳスラブゲル電気泳動法を 用いて、５ＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。抗原のゲルから紙への電気泳動移動はウ ェスターンプロット法によって実施した。第１図と第２図に示したような、トラ ンスプロットした蛋白質と炭水化物に回復期ブタ血清を反応させることによって 、抗原を確認した。

下記の例によって説明するような好ましい実施態様に従って、Ｔ、ヒオジセンテ リエの全細胞からの塩抽出物の分離方法を示す。下記の例が本発明の範囲の限定 を意図するものではなく、抗原性塩を製造・単離する代替方法が考えられ、この ような方法が本発明の意図された範囲内に入ることは当業者によって理解される であろう。

ヒオジセンテリエの使用を含む。

Ｂ２１０％、ＣＯ２１０％、Ｎ２８０％から成る雰囲気下で、ウシ胎仔血清約２ ．５％〜５％とブタ糞便抽出物２〜５％を補充したトリブチカーゼ大豆ブロス（ ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅｓｏｙ　ｂデｏｔｈ）を含むベンチ−トップ発酵器内で増 殖させる。３７℃での４２時間インキュベーション後に、細菌細胞を遠心分離（ ６５００デｐｔｘ、３０分間）によって回収し、リン酸緩衝生理的食塩水中で強 度に洗浄する。

サブユニットワクチンに用いる抗原物質を得るために、工程ｌで説明した方法に よって得た細菌細胞を第２遠心分離（６５００ｒｐｍ、３０分間）によって取出 し、上清を保留した。この上清はワクチンに用いる抗原物質を含む。回収した後 に、塩抽出物をアミコン限外濾過装置（Ａｍ１ｃｏｎ　Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａ ｔｉｏｎ　Ｕｎｉｔ　）内でＹＭＩＱ膜を用いて１００ｘに濃縮し、無菌０，４ ５μ想膜に通して濾過し、アリコートに等分し、分析し、液体窒素中に凛結貯蔵 する。

塩抽出物の特性決定には５種類の分析法がルーチンに用いられる。これらを次に 挙げる： （１）酵素結合イムノソルベント分析法（ＥＬＩＳＡ）での種々なポリクローナ ル抗体とモノクローナル抗体に対する抗原反応、 （２）インビトロでのへンル腸上皮（Ｈｅｎｒｙ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌａｐｉ ｔｈｇｌｉａｌ　）　（ＨＩＥ）細胞１’ｌすル）レホネー？ヒオジセンテリエ の付着を阻害する洗浄抗渾の能力、（３）銀染色によって染色した後のブタ赤痢 サブユニット５ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィル、 （Ｊ　ＱＡＥイオン交換クロマトグラフィーによる分離後の蛋白質プロフィル、 および （５Ｊ　ＣＦＩマクスとブタにおける免疫ぶ性。

反応　）　１．０　（０，４（０，４ ＥＬＩＳＡ　に用いる抗体を次に挙げる：回復期Ｂ２０４ブタ血清＃３８（１： ５０希釈）、ウサギＢ２０４高度免疫血清（１：１００希釈）および非暴露ブタ 血清ＰＩＣ（１：５０希釈）。ＥＬＩＳＡでの種々の抗体に対する洗浄抗原の反 応は回復期Ｂ２０４ブタ血清＃３８に対して高い光学濃度（０，Ｄ、）反応（＞ １．０）、他の血清に対しては低い反応（＜０．４）を示す。

インビトロ付着阻害分析法は組織培養プレートへＦＩＩＥ４０７細胞を接種し、 それらをプラスチック表面に付着させることを含む。最小必須培地（ＭＥＮ）　 ｌ、　７　ＷＬｌ中の塩抽出物０．３−量を上皮細胞に加え、インキュベートす る。

インキュベーション後に、上皮細胞をすすぎ洗いし、ＭＥＮ　１．　Ｂ　ｍＪ中 のＴ、ヒオジセンテリエの対数期培養物Ｑ、　７　ｍｌを上皮細胞に加え、イン キュベートする。上皮細胞をもう一度すすぎ洗いし、顕微鏡検査のためにライト ノ染料（ｒｉ’ｒｉｇｈｔｓ　ａｔαｉｎ　）で染色した。結果は、塩抽出物に よって予備処理しない対照上皮細胞に比べて、塩抽出物がＴ、ヒオジセンテリエ の上皮細胞への付着能力を阻害することを示す。

塩抽出物はＣＦＩマウスモデルにおいて免疫原性であることが判明している。生 後２１日間ＣＦＩマウスを、合衆国食品医薬品省によって公認されたＲｉｂｉア ジュバントのような注射可能なアジュバントに混入した塩抽出物Ｑ、１５ｍＪ量 で腹腔内（ＩＦ）高度免疫化する。または、実験のために、フロインドアジュバ ントまたはＭＶＰアジュバントを用いることができる。マウスに１０目と１４日 ０にワクチンを注射し１次にＴ、ヒオジセンテリミｌｏ？〜ｌｏ’細胞により、 第２回予防接種後１０日目と−ジョンした後に、マウスを剖検し、盲腸内の病巣 を調べる。塩抽出物を予防接種したマウスは対照すなわちブタ赤痢に典型的な病 巣を発現する非予防接種マウスに比べて、病巣の発現から保護されている。

この塩抽出物はブタにおいて免疫原活性を示した。生後６週間ブタを７０インド 完全アジユバントまたはＲｉｂｉアジュバントに混入した塩抽出物２，５ｄによ って１白目と１４日日目筋肉内高度免疫化する。次に、ブタを２８Ｍする。３０ 日間インキュベーションし、その間に赤痢の臨床徴候に関してブタを観察した後 に、ブタを剖検し、結腸と盲腸内の病巣を検査する。塩抽出物を予防接種したブ タは予防接種を受けず、ブタ赤痢の典型的な病巣を発現した対照ブタに比べて、 Ｔ、ヒオジステリエによる感染から保護されている。さらに、予防接種を受けた ブタはこの疾患の臨床徴候を示さないが、これらのブタの糞便中にはこの菌が存 在することも存在しないこともある。

プロテイナーゼＫまたはナトリウム−Ｍ−ベルアイオデート（ｓｏｄｉｕｍ　Ｍ −ｐａｒｉｏｄａｔａ　）による塩抽出物の処理はＣＦＩマウスモデル系によっ て測定されたように免疫原性の低下をもたらし、このことは蛋白質と炭水化物の 両方が抗原の活性部分であることを示唆する。デュボイス（Ｄｕｂｏｉｓ　）の 方法を用いた炭水化物分析は、多量の炭水化物を含む塩抽出物がＣＦＩマウスに おいて最大の免疫原住度を示すことを明らかにしている。５ＤＳ−ＰＡＧＥによ って分離し、銀によって染色した塩抽出物は防御性である抽出物とＣＦ−１マウ スモデルにおいて非防御性である抽出物との区別に用いられている。第３図に説 明するように、防御性抽出物のプロフィルは４７〜４３ＫＤａ間に三重バンドを 示し、３５〜３３　ＫＤａ。

１４〜１２ＫＤαおよび１０〜８ＫＤａには非防御性抽出物を含むゲルには存在 しない３組の二重バンドを含む。

４７〜４３　ＫＤａ、　１４〜］　２　ＫＤａおよび１０〜８　ＫＤａの範囲内 に存在するバンド（ｂａｎｄ　）は４℃で貯蔵した抽出物では不安定である。こ のことはサブユニットワクチンの活性成分（ｖｉａｂｌｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ）としての蛋白質の重要性を実証している。

クエスターンプロット分析法を用いたスピロヘータの個々の表面成分間の比較研 死は、細菌（ｏｒｇａｎｉｓｍ）からの塩抽出物中にリポ多糖（ＬＰＳ）と外層 膜蛋白質（ＯＭＰ）が含まれることを実証している。塩抽出物を予防接種した免 疫ブタからの抗血清は、Ｔ、ヒオジセンテユ五〇〇ＭＦ抗原とＬＰＳ抗原を認識 する。すなわち、菌株Ｂ２０４とＢ２３４のＴ、ヒオジセンテリエのリポ多糖分 子に対して誘導された抗血清は塩抽出物の一部である抗原を認識する。Ｔ、ヒオ ジセンテリエからのサルコシル不溶性ＯＭＦ富化分画を全細胞溶解物と塩抽出物 から調製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、差異に関℃て調べた。第１図（ レーンｌと２）に示すように、４９〜２ＢＫＤα　の範囲内の６〜７蛋白質バン ドをＬヒ　・・°センチ１工の両袖出物に関して分析する。ＯＭＰプロフィルは Ｔ、ヒオジセンテリエの全細胞溶解物と塩抽出物で同じであった。レーン３と４ で検出された外層膜抗原をＴ、ヒオジセンテリエのサルコシル抽出全細胞溶解物 とサルコシル抽出塩抽出物の両方において回復期ブタ血清によって確認した。両 袖出物において、血清によって同様なバンドが確認された。第２図に示すように 、１４ＫＤａ　における塩抽出物のこの拡散染色バンドを、塩抽出物成分のフェ ノール−水抽出物後（レーン１）または塩抽出物成分のサルコシル抽出後（レー ン２）のウエスターンブーットπおいて可視化する。この拡散染色病原性種（ｐ ａｔｈｏｇｅｎｉｃ　５ｐｅｃｉｅｓ　）においてのみ存在した。サルコシル抽 出物中の炭水化物の存在は種に関係すると思われる。それ故、ＯＭＰ分子の炭水 化物部分は活性抗原成分であるように思われる。

塩抽出物のＨＰＬＣＱＡＥイオン交換クロマトグラフィーによる分析は０〜１． 　ＯＭ　ＮａＣｌランプグラジェント分離（デαｍｐ　ｇｒａｄｉａｎｔ　５ｅ ｐａｒａｔｉｏｎ　）内で９種類の蛋白質ピークを示した。これらのピーク内で 回収した４０分画中の９分画はＥＬＩＳＡ　において回復期ブタ血清＃３８に対 して反応性であった。ｐ：ＬＩｓＡにおいて回復期血清に対して高い反応法を示 したこれらの分画の１つ（分画＃１２）はＣＦＩマウスＣ％−５）において免疫 原性であった。分画１２のウェスターンプロット分析は、均質な高度免疫マウス 血清に対して反応した時に９２〜１６ＫＤａ範囲内の１２抗原バンドの存在を実 証した。

９２と１６ＫＤαにおける２抗原をニトロセルロースからアフイニテイ沈降によ って抽出し、７０インド完全アジＷバントに混入し、抗血清の製造のためにウサ ギに注入した。これらの抗原の両方に対して誘導された抗血清はＥＬＩＳＡでは 塩抽出物に対して反応性であり、ブタ補体（ｓｗｉｎｇ　ｃｏｍｐｘｔｍａｎｔ 　）の存在下でＴ、ヒオジセンテリエに対して殺菌性であることが判明している 。

上記の結果は炭水化物分画が単独でまたは蛋白質分画と組合されて、抗原活性を 示すことを明確に指摘している。このように、本発明の好ましい実施態様によっ て、本発明の方法は主として２工程から成る。第１に、Ｔ。

ヒオジセンテリエの細菌細胞の調製方法、第２に、サブユニットワクチンに用い られる抗原物質のｖ４製方法。

Ｔ、ヒオジセンテリエのある一定の蛋白質／炭水化物サブユニット抗原とそのブ タ赤痢サブユニットワクチンの調製方法に関して、本発明を特に示し、説明して きたが、蛋白質／炭水化物部分画を調製単離する代替方法を含めて、組成と詳細 の上記その他の変化が本発明の本質および範囲から逸脱することなくなされうる ことば当業者によって理解されるであろう。

Ｆｉｇ、１ Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成　２　年　５月７ψ日 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８９１０３９８１ 、発明の名称 ブタ赤痢サブユニットワクチンおよびその製造方法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国アリシナ用８５７１９．タクソン。

ノース・キャンベル・アベニュー　１７４５名　称　アリシナ・テクノロジー・ デベロップバンド・コーポレーション ４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル２０６区 ５、補正書の提出日 浄書（内容に変更なし） 補正した請求の範囲 〔新たに１０〜１２項を追加；１〜９項はそのまま維持原性の炭水化物と薬理学 的に受容されるキャリヤーを含み、蛋白質を実質的に含まないブタ赤痢ワクチン 。

１１、（新）前記炭水化物が約１４ＫＤα〜１６ＫＤａの範囲内の分子サイズを 有する請求項１０記載のブタ赤痢ワクチン。

１２、（新）前記炭水化物がウェスターンプロット分析法における拡散染色バン ドを特徴とする請求項１１記載のブタ赤痢ワクチン。

手続補正書ｃ７Ｆ幻 平成　３年　２月Ｚ日

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．次の工程： トレポネーマ・ヒオジセンテリエを増殖させる工程；Ｔ・ヒオジセンテリエの細 菌細胞を回収する工程，Ｔ・ヒオジセンテリエの前記細菌細胞の外層膜エンベロ ープ部分をＴ・ヒオジセンテリエの前記細菌細胞の細胞質部分から分離する工程 ；および 前記外層膜エンベロープ部分に注射可能なアジユバントを混合する工程； から成るブタ赤痢サブユニットワクチンの製造方法。
2. ２．前記細菌Ｔ・ヒオジセンテリエの前記増殖工程が嫌気性雰囲気下におけるウ シ血清約２．５〜５％とブタ糞便抽出物約２〜５％を補充したトリプチカーゼ大 豆ブロス中での発酵によって前記細菌を増殖させることから成る請求項１記載の 方法。
3. ３．前記細菌Ｔ・ヒオジセンテリエの前記回収工程が約３７〜４２℃における約 ２４〜４２時間のインキュベーション後に遠心分離によつて回収する工程をさら に含む請求項１記載の方法。
4. ４．前記分離工程がＴ．ヒオンセンテリエの前記回収細菌細胞のリン酸緩衝生理 的食塩水による洗浄、前記生成溶液の遠心分離、それによる前記外層膜エンベロ ープ部分の前記細胞質部分からの分離をさらに含む請求項３記載の方法。
5. ５．前記外層膜エンベロープ部分の遠心分離工程をさらに含む請求項４記載の方 法。
6. ６．前記混合工程が前記濃縮外層膜エンベロープ部分とＲｉｂｉアジユバントと の混合をさらに含む請求項５記載の方法。
7. ７．トレポネーマ・ヒオジセンテリエの外層膜エンベロープ部分と注射可能なア ジユバントとを含むブタ赤痢サブユニットワクチン。
8. ８．前記アジユバントがＲｉｂｉである請求項８記載の方法。
9. ９．トレポネーマ・ヒオジセンテリエに対する蛋白質／炭水化物抗原と、注射可 能なアジユバントとを含むコンパウンド。