JPH02501801A - 一般的マイコプラズマと特に尿生殖器のマイコプラズマの計数、検出および同定の方法ならびにこれらの方法に特に適した生物学的媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 一般的マイコプラズマと特に尿生殖器のマイコプラズマの計数、検出および同定 の方法ならびにこれらの方法に特に適した生物学的媒体この発明は、一般的マイ コプラズマと特に尿生殖器のマイコプラズマの計数、検出および同定の方法に関 する。またこの発明の目的は、これらの方法に特に適した生物学的媒体である。

マイコプラズマは、細胞壁がなく、酵素特性〔ウレアプラズマ・ウレアリチカム （Ｕｒｅａｐｌａａｍａ　ｕｒ＊ａｌｙｔｉｃｕｍ　）のウレアーゼ、およびマ イコプラズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａａｍａｈｏｍｉｎｉｓ　）とマイコプ ラズマ・ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａａ隠ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ　）のア ルギニンデカルボキシラーゼ）ｔ−Ｗｆる細菌である。

これらの酵素特性が、尿生殖器の試料中の該菌株の同定と計数に利用される。

実際に、これらの微生物は偏共性細菌であり〔完全に健康な個体の粘膜に、１Ｏ ｓＣＣＵ／ｌｎＩ！（−当シの変色の単位〕よシわずかに低いかまたは等しい比 率で存在している〕。

感染が起こったシまたは粘膜がもろくなった時（ウイ〃ス感染、細菌、ホルモン の不均衡など〕、これら微生物は増殖することができ、慢性の重感染状態となシ 、その結果法のような症状を呈する。すなわち、尿細管不妊症、男性不妊症、急 性および慢性の卵管炎、尿道前立腺症候群、または子宮頚管形成異常症である（ その時、前記微生物は、乳頭挿ウィルス、ヘルペス、ＯＭＶなどのようなウィル ス感染症と重感染している〕。

問題の患者のすべてに、前記微生物は、ｌ　Ｏ’ＣＯＵ／−よシ高いか等しいス ブラ・バソロジカル比率（５ｕｐｒａ　−ｐａｋｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒａｔｅ 　）で存在している。

従来、尿生殖器マイコプラズマを計数するのに次のような２方法を用いてきた。

すなわち、 １、顕微鏡視野当りのコロニーの数を分離グロース上で計数した。

この方法は、泌尿器感染症の細菌計数に利用するのと同等の方法である〔カス（ Ｍａｓｓ）］。

しかしこの形式の計数法は、固体のゲロースを規則正しく使うという不便な点が おシしかもこのゲロースは高価であるから、尿生殖器マイコブフズマの系統的な 試験には余シ適していない。その上この方法は嫌気ジャー培養を行う必要がある 。

２、液体媒体（Ｕ：ウレアプラズマ・ウレアリチカム用媒体；Ｍ：マイコプラズ マ・ホミニス用媒体〕内の被検試料を連続的に希釈し、希釈媒体が含有している フェノ−μレッドタイプの適当な色指示薬の終点によって計数を行ったＯ しかし、尿生殖器マイコプラズマの酵素特性を利用するこの方法は、いくつかの 不便な点がある。

尿素は、複雑な液体媒体内では不安定である。このため１その濃度（酵素の基質 を示す〕が、あるシリーズの試験から別のシリーズになると、使化することがら シ、再現性がなくなる危険がある。

指示薬の変色が、少なくとも２４時間安定化するまで読み取ることができず、し 友がって応答待ち時間が最低７２時間要する。

連続希釈法は、やっかいな方法であシ、さらに、手による操作が原因の誤差によ って損われる。

必要な試薬全部と他の材料が入った市販のキットはない。

この発明は、上記の不便な点ｔ″回避し、酵素の動力学を用いるマイコプラズマ の計数法と検出法を提供するものである。

上記の最後の方法は、実際には、酵素活性を検定するのに、生化学に用いられる ことは知られているが、この発明の方法の場合のように細菌の検定に用いること は、示唆も針面もなされたことはない。

本願出！＠人は、酵素の応答速度が、被検試料中に存在する１ラズマの量に比例 するということを見出した。

この発明の方法の特に特徴とすることは、酵素反応が、嫌気性条件下で、一方で 、被検液体を含む、希釈媒体として働くマイコプラズマ用液体増殖媒体と、脱水 された尿素からなる第１基質とで脱水形態のカラーｐＨ指示薬の存在下で行われ 、他方では、前記の液体増殖媒体と、脱水形態のアルギニンからなる第２基質と で、カラーｐＨ指示薬の存在下で行われることである。この酵素反応の速度は、 指示薬が変色する時間を記録することによって追跡され、一方では尿素とアルギ ニンそれぞれの墓、他方では増殖と希釈の媒体の濃度と栄養成分が、スブラーパ ソロジカル比率もしくはサブ争パソロジカル比率（ｓｕｂ　−ｐａｔｈｏｌｏｇ ｉｃａｌ　ｒａｔｅ）で存在するウレアプラズマ・ウレアリチカムに対して、色 指示薬が、所定時間が経過後に、転移点に到達するかまたは到達しないように選 択され標準化される。

他の特徴は次のとおシである。

ｐＨ指示薬は、ｐｇが６．４〜８で変色するものが選択される。

好ましいｐＨ指示薬はフェノ−！レッドである。

脱水尿素ｐＨ指示薬の濃度、増殖と希釈の液体媒体の濃度、およびこの媒体中の 被検流体の量は、ウレアプラズマ・ウレアリチカムがス１う・バソロジカル比率 （１０’ａｃｔｒ　／　ｔｌよシ高いか同等〕で、２４時間経過後、指示薬が転 移し、ウレアプラズマ・ウレアリチカムがサグ・パソロジカ〜比率（ｌ　Ｏ”ｃ ｃｖ　７ｔｒｉよシ低いか同等〕で、４８時間経過後、指示薬が転移するように 選択される。

脱水アルギニンとｐＨ指示薬の濃度、増殖と希釈の液体媒体の濃度、およびこの 媒体中の被検流体の愈は、マイコプラズマ・ホミニスおよびマイコプラズマ・フ ァーメンタンスがスブラ・バソロジカル比率（ｌ　Ｏ”ｃｃｔｒ　７，１よシ高 いか同等）が２４時間もしくは４８時間経過後に指示薬が転移し、また両歯株が サブ・バソロジカル比率（１０３ａａｒｙ　７．１よシ低いか向等〕で４８時間 経過しても変色しないように選択される〇 被検試料の希釈媒体は、本来、適当な栄養要素を添加した、マイコプラズマ用の 増殖グロスに基づいたものである。

被検試料の希釈媒体は、マイコプラズマプロス、子ウマ血清、アンピシリンのよ うな抗生物質、チオグリコ−ｆｉ／酸ナトリウム形の還元剤、酵母およびシステ ィンで構成されているものが好ましい。

この発明の方法は、次のように実施するのが好ましい。

すなわち小形のウニμを用い、そのいくつかには脱水尿素を入れ、いくつかには 脱水アルギニンを入れ、被検液をウェルに入れた後、各ウニ／Ｌ／ｌ−バフフィ ン油のような不活性な油状物質で覆って嫌気性条件を生成させて実施する。

この発明１＆：実施するための試薬の、濃度の選択と標準化は、前記の二つの従 来法による計数結果から得た検量線を用いることによって行う。

さらに詳しくは、この発明の目的は、前記の方法を１簡単に、ごく限られた数の 操作しか必要とせず、しかも次の三つの基準： 安定で芙験室に貯蔵可能で輸送できること；マイコプラズマを、その増殖媒体に 入れるまでの時間、生きたまま保持できること； 定量計数結果に影響しないとと； を満たす独得の媒地を得ることにおる。

これら三つの要件を満たすために、凍結乾燥再生媒体が被検試料の輸送媒体とし て、この発明では用いられる。実際に、マイコプラズマは壁のない細菌であるの で、浸透圧の腎動には極めて敏感であシ、増殖媒体もしくは保存媒体には迅速に 導入しなければならない。増殖媒体の欠点は、安定性に劣るということであシ、 ユーザが試料センターで厳重な貯蔵管理を行う必要がある。輸送媒体の欠点は、 試料を増殖媒体に入れる前に輸送媒体に入れる時の希釈効果であシ、そのため定 員計数値を全く変えてしまうのでその結果について計算する必要がある。

本願における独得の媒体は、実際には凍結乾燥された形態の反応性媒体と解され る。この媒体は、すでに再生されているか、または希釈媒体で再生される。その 希釈剤の存在下で安定化された前記反応性媒体は同様に理解される。

この発明の独得の媒体は、以下のもので構成されている。

すなわち、 コレステロールタイプのマイコプラズマの培養に必要な公知の要素、酵母エキス 、子ウマ血清、尿素、アルギニンもしくはグルコースのタイプのマイコプラズマ の代謝の視覚化要素、カラー指示薬（フェノ−μレッドが好ましい〕、および少 なくとも一つの抗生物質１、が構成された、いわゆる典１反応性相；ならびに、 被分析試料のビヒクμとして役立つ希釈媒体からなシ、この媒体が、寒天の１ｆ ７１０００１に添加した、マイコプラズマの公知の特異的グロスと任意に含有す る抗生物質とで構成されてなる第２相とで構成され、 その外の特徴としては、 第１相中に存在する単一もしくは複数の抗生物質が第２希釈相中にあシ、 この抗生物質が、アンピシリン、トリメトプリムおよびナイスダナンタイプの抗 生物質から選択され、好ましくは葉酸の合成に作用する抗生物質から選択され、 またこれらの抗生物質はマイコプラズマには全く効力がなく、希釈媒体が、不安 定成分を含有せず、十文４℃の所定の被検試料の輸送および保存の媒体として適 切なものである媒体であることである。

この発明のその他の特徴と利点は、以下の説明と実施例でよシ明確になる。

この発明の方法ｔ−実施する際には、一般に、直径？　１１１１％深さ６閣の公 知の少なくとも二つのウニ〃を用いる。

これらのウェルの一方にＦｉｌｌｖの脱水尿素を入れ、他方には１．６８■の脱 水アルギニンを入れる。これらの各ウニμに、フェノ−！レッドとして知られて いる同じ脱水ｐｌｉ指示薬６．１９ｆずつを入ｎる。

分析するために患者から採取した試料は、下記組成を有する媒体（媒体Ａ３）を 用いて溶解し、７１３−の蒸留水に溶解した脱水マイクロプラズマプロス（２５ ，５Ｆ）から得た。得られた液体媒体には次の組成のものを添加した。

２００ｔｎｌの子ｔ−ｒ血ｍ； ０．５ｔのアンビンリン； ８ｆのバクトリム（Ｂａｃｔｒｉｍ　）　（抗生物質）；０．５ｆの還元剤（チ オグリコ−μ酬ナトリウム〕；１００ｄの酵母； ２．５−のシスティン（４％〕 各ウニｌＶｆ数滴のパラフィン油で覆い、醇翼反応のために必要な嫌気性条件を 作った。

上記の組成物と、尿素、アルギニンおよびｐＨ指示薬の量は、ニー〇ウレアリチ カムのスグラ・パソロジカル比寓については、２４時間内に変色するように、ま たエム・ホミニスのスグフ・バツロジカ〃比率については２４〜４８時間で変色 するようなしかたで、現在使用されている二つの従来法を用いる比較試験を実施 するのに適切なものである。

上記の比較試験について、希釈の前記方法において、尿素とアルギニンに基づい た従来の液体希釈媒体は、１５０／ｌの媒体の比率で用い、この媒体に、採取試 料とともに培養された媒体Ａ３の１５ｆｉｔｔ−導入し、次いで各採取試料に対 して１５ｐＡの比率で連続して希釈される。

プレート（ゲロースＡ７）当シの計数法については、従来どおシに、顕微鏡視野 （１００倍〕のマイコプラズマのコロニー数の平均値を次のようなしたで行う。

Ｃ！ＦＵ　／　ｍｌは１コロニー形成ユニット’′ｔ−意味する。

細菌の濃度 １個に満たないコロニー　≦１０”　ＣＰＵ／　ｍＺ１〜５個のコロニー　１０ ’　ＯＦＵ　／　ｔｌに近い６〜１０個のコロニー　１０’　ＯＦＵ／ｍｆｆＫ ：近い１１〜２０個のコ’　ニー１０’　ＯＦＵ　／　ｍｌに近い２０６以上の コロニー　＞ｌｏ’ＯＦＵ／ｆｎＩ！男性もしくは女性の患者から採取した尿生 殖器の試料について、異なる方法で得た結果を以下の表に示す。

患　者　計　数　値　媒　体　Ａ　７　尿素ウェル液体媒体中　コロニー数　計 数値 Ａ　９５ｈで１０’　＞２０　１０＠　陽性２４ｈＥ　７２ｈテｌＯ８＜１　（ １０”　陽性４８ｈａ　ｇ６ｈで０　０　０　− Ｄ　７２ｈで１０４　１２　１０’　陽性２４ｈｌ　ｇ６ｈで０　０　０　− １　７２ｈで１０１　０　０　− Ｇ　汚染　１０Ｕ　１０’　＠性２４ｈ陽性２４ｈ ＞２０Ｍ　１０’　（不明瞭〕 （不明瞭） Ｈ７２ｈで１０’　３　１０’　陽性２４ｈ工　４８ｈで４０’　７　１０’　 陽性２４ｈ添付した曲線を参照する。

上記表と添付した比較曲線を考察すると、１０’ｃａυ／−よシ墨いかまたは等 しい比率でニー・ウレアリチカムが存在する場合、尿素のウェルは、２４時間で 変色する（指示薬転移点〕ことが分かる。同じ尿素ウェルが４８時間で変色する 場合は、ニー・クレアリチカムがｌ　Ｏ”ＯＯＵ　／　ｔｎｅよシ低いかもしく は等しい比率で存在している（ヒトの病因としては有意でない〕か、または化学 薬品もしくは細菌によって妨害されていることを示す。尿素のウェルは感度が非 常に大きいので、尿素のウニμが４８時間で変色しないことは、低比率（１０” 〜１０”Ｃ！ＯＵ　／　ｒｒｌ　）　テも、ニー　＊　ｆ）　Ｖ　７リチカムが 全く存在しないことを確認している。

さらに、いかなる妨害（細菌もしくは化学薬品〕も２４時間の応答を変えること ができないことは明らかであシ、検出の完全な信頼性が得られ、その信頼性は（ 選別にウニｌｖを使いながら）Ａ３媒体を固体ゲロースム７上に移すことによっ ていつでも確かめることができる。

エム・ホミニスとエム・ファーメンタンスについては、酵素活性が弱いので、ア ルギニン（ＡＲＧ　）ウェルの４８時間での変色だけが、サグ・パソロジカμ比 率（１０”ＯＯＵ　７ｄよシ低いか等しく、４８時間でウニμは変色しない〕と １スプラ・パソロジカμ比率（１０’ａｃｔｙ　／　ｔｒｉよ＃）高いか等しく 、２４時間もしくは４８時間でウニμが変色するンとを検出することができる。

したがって、尿素ウェルの１２時間での変色と、７μギニンウエ〜の２４時間も しくは４８時間での変色は重要である。それ故、微生物学者は、上記の時間経過 で、粘膜がマイコプラズマに感染もしくは重感染しているのか否かを確認するこ とができる。

上記の表によれば、アの患者については、測定結果が、本願発明の方法では検出 されないような濃度でおることが分かる。これは、ウニ〜の感度のしきい値が任 意に１０１００１Ｊ　／　ｄに固定されているからである。低濃度は、マイコプ ラズマ金集症の診断には重要でない。媒体Ａ７上にコロニーが見られないのが正 常である。なぜなら、直接接種する方法は、希釈ファクターを誘発するからであ る。

Ｇの患者については、プレート当シの計数だけが説明で′きることが分かる。

問題の三つの方法によって実施される計数値は、ゲロース人７法と希釈注量の直 線上にう）、それに対応して変化する動的曲線にしである（　Ｉ　Ｏ’ＣＣＵ　 ／　ｍｅよシ高いか等しい濃度については２４時間、およびＩ　Ｏ”ｃｃａ　／ −よシ低いか等しい濃度については４８時間〕。

すでに示したように、添付したグフフには、アの患者だけがこの直線からはずれ ていることは明らかでちる。

この発明によれば、スプラ・バソロジカ／Ｌ／濃度については、希釈法で値が得 られる時間の限度は７２時間であシ、計数グレートの場合は４８時間、ウニ〃で の計数では２４時間であることは明らかである。

さらに出願人は、この発明の新しい方法で脱水された基質の入った支持体上での 酵素反応を用いれば、使用した他の二つの方法と比べて、試験したケースの９５ ％に極めて良好な相関関係があることを知っている。

いくつかの実験に見られる５％の誤差は、固体グロース上での計数法が間違って 用いられる場合のように、菌株が液体媒体中で優先的に増殖するか、またはプレ ート上での計数値だけが低い値を与える場合のように、菌株の酵素活性が弱いこ とで説明できる。

それ故に、この５％の誤差の検出は、二つの計数法、すなわち一方は本願発明の 方法と他方は固体グロースを使うさらに、この発明によるウェル内での酵素の反 応では、基質が脱水された形態で存在するが、この反応は連続希釈法に対して次 のような利点がある。すなわち、再現性を保証する基質の安定性； 操作手順が少なく、検定に用いる少量の試料の入ったマイクロプレート上で手に よって希釈することから起こる不正確さがなくなる； 応答の待時間が７２時間でなくて２４時間；および使用される全材料を考慮する と最終的に原価が低下する。

特定の操作法によって、この発明の先に記載した独特の媒体が用いられる。

患者由来の被分析試料（尿は生殖器の試料を実施例のようにして採取した〕を、 いわゆる希釈媒体の部分としてフラスコに導入され貯蔵される。

活性相が、凍結乾燥形で存在している場合は、いわゆる反応性擲は、希釈媒体を 添加することによって１基生される１゜反応性媒体は、すでに希釈され、それ自 体安定化されている場合には、そのまま使われる。

試料を含有する媒体の−Ｎ５ヲ反応性媒体の一部にそそぐ。

検出、すなわち試験中の細菌の存在の視覚化は、指示薬の転移点での変色（黄色 から赤色へ〕によって行われる。さらに、尿生殖器のマイコプラズマは、他の細 菌に比べて媒体をくもらせないので、媒体は透明のままである。

マイコプラズマの存在が明らかになる計数法は、上記の酵素作用法によって実施 される。この方法は、この発明で述べたように、活性媒体（再生された〕中で有 利に用いて、スプフ・バソロジカル比率（１０’ａａＵ／、１よシ高いか等しく 、２４時間で変色）で存在する菌株と、サブ・パソロジカμ比率（１ｏ”ａａｔ ｙ　／　ｄよシ低いか等しく、４８時間以上で変色）で存在する菌株とを識別す る診断を確実に行う。

笑用的に重要性の少ない計数の場合には（極めて低い比率のマイコプラズマの検 査、例えば生体外での受精の管理、精液の試験、べそカルチャーまたは卵管炎の 外科手術の場合〕、媒体の終点の観察は最初の２４時間後に行う。

その外の問題になっている場合では、計数に利用される技術、特に酵素作用の技 術によって、医師は、採取試料中に存在するマイコプラズマのレベルが分カル。

この発明によれば、マイコプラズマの同定が、生物学的媒体で実施した検出と計 数の操作を、マイコプラズマの抗生物質に対する感受性のプロフィ−１ｖ（アン チビオグフム〕全利用してマイコプラズマを同定することによって追跡して行わ れる。

実際ニ、マイコプラズマのかようなアンチビオグラムは、本願に示す独特の媒体 の変色が明らかにマイコプラズマによるものであシ、同じ酵素活性を有する他の 細菌によるものではないことを立証するのみならず、見出された上記プロフィ− μによって、存在しているマイコプラズマのタイプ、種および属も確認すること ができる。指示薬の変色が認められ、媒体がまだ透明のうちに（例えば、尿道、 膣、エントコ−μ（ｅｎｄｏｃｏｌ　）のような通常の尿生殖器の採集試料につ いては２４時間、上記の場合以外では２４時間以上〕、同定操作を同じマルチプ レートのウニ〃で実施し、同定特性値と、使用された前の媒体が添加された、第 １ｆｌＳ分と同一の別の反応性媒体の第２部分で試験される抗体とが再編成され る。

上記のように、この種のマμチプμウニｙのグロフイールは、上記の技術ではよ く知られているが、ウレアプラズマとマイコプラズマ（ホミニスもしくはファー メンタンス〕との識別と、分離された菌株の共存する抗生物質に対する感受性の 評価ができる（２４〜４８時間の試験結果ンことが分かる。

また、特異的なアンチビオグラムのマルチプレートウニ〜で補足された上記の独 特の媒体によって、４８〜７２時間の間に、試料の輸送、詳しく述べれば、感染 症に関与している尿生殖器の９８％の検出、定量測定、同定および抗体に対する 感受性の試験を行うことができることが分かる（マイコプラズマ−７アーメンタ ンスは、この疾病の２％以下を占めるにすぎず、そのアルギニン陽性特性によっ てホミニス種に同化されるが、検出はされる〕。

それ故にこの発明の媒体の重要性は次のとおシである。

１、方法が簡単なこと。

２、偽陽性反応がないこと（汚染物は、２４時間内にその酵素特性を全く示さな い）。さらに、半ゲロース媒体には、アンピシリン、トリメトログリムとナイス タチンにおそらく耐性のある汚染物が存在できるが、このような汚染物は媒体管 にとらせる。

しかしこの発明の媒体に存在する抗生物質の混合物に感受性のある種の菌株（液 体を透明に保持する）が、その酵素的な尿素もしくは７μギニン陽性特性（グロ スは透明な赤色〕を示すならは、試験が偽陽性になることは不可能であろうし、 またアンチビオグフム・マルチプレート・ウェルは、異常なプロフィ−μと、こ のマルチプレートウニ〃に存在する１汚染物１を含有する場合のウェルの変色を 示すでおろう。

３、安定な輸送媒体があること（凍結乾燥物中に存在する不安定因子の分離）。

４、マイコプラズマの診断に、抗生物質に対する感受性の試験を系統的に導入で きること。このことは、１５％の菌株がテトラサイクリンに耐性で、３０％以上 のウレアプラズマ・ウレアリチカムと９７％のマイコプラズマ・ホミニスがエリ スロマイシンに耐性であるという点で正しい（Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　１．Ｏ，Ａ、 Ａ、０．２５ニユーヨーク、１９８７年〕。

５、液体媒体中で優先的に増殖する菌株の１０％を正確に診断できること。今ま でこの菌株を汚染物から識別できなかった〔この汚染物は、尿素もしくはアルギ ニン陽性で媒体中に存在する抗生物質に感受性でラシ、透明な媒体が赤色に変色 した。例えば膣フローヲの、カンピロバクタ−（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　 ）烏のある種の嫌気性もしくは微好気性細菌がある〕。これら１０％の菌株は、 固体の分離グロース上では増殖しないので、診断はいつも不安定であった。

６、嫌気性のジャーもしくはサシエイ中の嫌気性条件全会く完全になくすことが できること。これを行うことは比較的費用がかかシ、専門でない研究所にとって は、精巧すぎる場合がおる。

この発明については、単に例示して説明しただけであって、この発明を限定する ものではない。可能な変形はすべて、この発明の範囲を逸脱することなく均等物 とみなすことができる。

またこの発明の独特の媒体は、尿素とアルギニンの代わシにグルコースを用いる とともに適切な指示薬（チモーμブルー〕を使って、肺炎プラズマ（例えば異型 肺炎症のプラズマ〕の診断にも利用できる。

国際調査報告 ″ｖ′″ｍ　ａｕ＃“Ｈａ、　ＰＣ’ｒ／ＦＲ８８１００４６４

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素反応が、嫌気性条件下で、一方で、被検液体試料を含む、希釈媒体とし て働くマイコプラズマ用液体増殖媒体と、脱水された尿素もしくはグルコースか らなる第１基質とで、脱水形態のカラーｐＨ指示薬の存在下で行われ、他方では 、前記の液体増殖媒体と、脱水形態のアルギニンもしくはグルコースとで、カラ ーｐＨ指示薬の存在下で行われ酵素反応の速度が該指示薬が変色する時間を記録 することによつて追跡され、一方では尿素とアルギニンもしくはグルコースそれ ぞれの量が、他方では前記の増殖および希釈媒体の濃度と栄養成分が、スプラも しくはサプのパソロジカル比率で存在するウレアプラズマ・ウレアリチカムに対 してカラー指示薬が、所定時間経過後に転移点に到達するかもしくは到達しない ように選択されかつ標準化されることを特徴とする、マイコプラズマを計数し検 出する方法。
2. ２．ｐＨ指示薬として、ｐＨ６．４〜８の色転移点を有するものを選択すること を特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．ｐＨ指示薬が、好ましくはフェノールレッドまたはチモールプルーであるこ とを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．一方では、脱水された尿素もしくはグルコースおよびｐＨ指示薬の濃度が、 他方では増殖および希釈液体媒体の濃度と、この媒体中の被検液体の量とが、ウ レァプラズマ・ウレアリチカムがスプラ・パソロジカル比率（１０４ＣＣＵ／ｍ ｌより高いか等しい）で存在している時には、指示薬の変色が２４時間経過後に 起こり、ウレアプラズマ・ウレアリチカムがサプ・パソロジカル比率（１０３Ｃ ＣＵ／ｍｌより低いか等しい）で存在している時には、指示薬の変色が４８時間 後に起こるように選択されることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のい ずれか一つに記載の方法。
5. ５．一方では、脱水されたアルギニンもしくはグルコースおよびＰＨ指示薬の濃 度が、他方では、液体の増殖および希釈媒体の濃度と、この媒体中の被検液体の 量とが、マイコプラズマ・ホミニスとマイコプラズマ・ファーメンタンスが、メ プラ・パソロジカル比率（１０４ＣＣＵ／ｍｌより高いか等しい）で存在してい る時には、２４時間もしくは４８時間経過後に指示薬の変色があり、また前記マ イコプラズマが、サプ・パソロジカル比率（１０３ＣＣＵ／ｍｌより低いか等し い）で存在している時には４８時間経過後も指示薬が変色しないように選択され ることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一つに記載の方法。
6. ６．被検試料を含む希釈媒体が、特に、適切な栄養成分が添加された、マイコプ ラズマの成長プロスによるものであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第 ５項のいずれか一つに記載の方法。
7. ７．被検試料を含む希釈媒体が、好ましくは、小ウマ血清アンピシリンのような 抗生物質、チオグリコール酸ナトリウムタイプの還元剤、酵母およびシステイン からなるマイコプラズマプロスで構成されていることを特徴とする請求の範囲第 ６項に記載の方法。
8. ８．小形のウエルのいくつかに尿素もしくはグルコースを入れ、別のいくつかに は脱水アルギニンもしくはグルコースを入れ、それぞれに被検液体を導入した後 、パラフィン油のような不活性な油状物質で覆りことによつて媒気性条件を生じ させて実施することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか一つに 記載の方法。
9. ９．前記の方法を実施するための試薬の、濃度の選択と標準化を、標準法による 計数値による検量線を用いて行うことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８項 のいずれか一つに記載の方法。
10. １０．コレステロールタイプのマイコプラズマの培養に必要な公知の要素；酵母 エキス；小ウマ血清；尿素、アルギニンもしくはグルコースタイプのマイコプラ ズマ代謝の視覚化要素；カラー指示薬；および少なくとも一つの抗生物質からな るいわゆる反応性第１相と、 被検試料のビヒクルとしても働く希釈媒体からなり、この媒体が、マイコプラズ マの公知の特定のブロスとこれに添加された１ｇ／１０００寒天とを含有しまた 抗生物質を含有していてもよい第２相とで、 構成されていることを特徴とする、請求の範囲第１〜９項のいずれか一つに記載 の方法を実施するのに特に適した独特の生物学的媒体。
11. １１．第１相に存在する単一もしくは複数の抗生物質が、希釈の第２相に見出さ れることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の生物学的媒体。
12. １２．前記の単一もしくは複数の抗生物質が、アンビシリン、トリメトプリムお よびナイスタチンタイプの抗生物質から好ましくは、マイコプラズマに対して全 く不活性で、葉酸の合成に作用する抗生物質から選択されることを特徴とする請 求の範囲第１０項または第１１項に記載の生物学的媒体。
13. １３．希釈媒体が不安定要素を全く含有せず、その結果、十４℃で分析される試 料用の輸送および保存媒体として使用するのに適していることを特徴とする請求 の範囲第１０項乃至第１２項のいずれか一つに記載の生物学的媒体。
14. １４．分離された菌株のアンチビオグラムのプロフィールを検査して、問題のマ イコプラズマを同定するための補助同定相からなる請求の範囲第１項のいずれか 一つに記載の方法を異施するのに用いる請求の範囲第１０項乃至第１３項のいず れか一つに記載の生物学的媒体。
15. １５．そのタイプ、種および属にかかわらず、すべてのマイコプラズマ、特に尿 生殖器のマイコプラズマの検出と計数への請求の範囲第１項乃至第９項のいずれ か一つに記載の方法の用途。
16. １６．そのタイプ、種もしくは属にかかわらずすべてのマイコプラズマ、特に尿 生殖器のマイコプラズマの計数、検出および同定への請求の範囲第１０項乃至第 １４項のいずれか一つに記載の独特の生物学的媒体の用途。