JPH0738797B2 - 一般的マイコプラズマと特に尿生殖器のマイコプラズマの計数、検出および同定の方法ならびにこれらの方法に特に適した生物学的媒体 - Google Patents
一般的マイコプラズマと特に尿生殖器のマイコプラズマの計数、検出および同定の方法ならびにこれらの方法に特に適した生物学的媒体Info
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- JPH0738797B2 JPH0738797B2 JP63507863A JP50786388A JPH0738797B2 JP H0738797 B2 JPH0738797 B2 JP H0738797B2 JP 63507863 A JP63507863 A JP 63507863A JP 50786388 A JP50786388 A JP 50786388A JP H0738797 B2 JPH0738797 B2 JP H0738797B2
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、一般的マイコプラズマと特に尿生殖器のマ
イコプラズマの計数、検出および同定の方法に関する。
またこの発明の目的は、これらの方法に特に適した生物
学的媒体である。
イコプラズマの計数、検出および同定の方法に関する。
またこの発明の目的は、これらの方法に特に適した生物
学的媒体である。
マイコプラズマは、細胞壁がなく、酵素特性〔ウレアプ
ラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）の
ウレアーゼ、およびマイコプラズマ・ホミニス（Mycopl
asma hominis）とマイコプラズマ・フアーメンタンス
（Mycoplasma fermentans）のアルギニンデカルボキシ
ラーゼ〕を有する細菌である。
ラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum）の
ウレアーゼ、およびマイコプラズマ・ホミニス（Mycopl
asma hominis）とマイコプラズマ・フアーメンタンス
（Mycoplasma fermentans）のアルギニンデカルボキシ
ラーゼ〕を有する細菌である。
これらの酵素特性が、尿生殖器の試料中の該菌株の同定
と計数に利用される。
と計数に利用される。
実際に、これらの微生物が偏共性細菌である〔完全に健
康な個体の粘膜に、103CCU/ml（ml当りの変色の単位）
よりわずかに低いかまたは等しい比率で存在してい
る〕。感染が起こつたりまたは粘膜がもろくなつた時
（ウイルス感染、細菌、ホルモンの不均衡など）、これ
ら微生物は増殖することができ、慢性の重感染状態とな
り、その結果次のような症状を呈する。すなわち、尿細
管不妊症、男性不妊症、急性および慢性の卵管炎、尿道
前立腺症候群、または子宮頚管形成異常症である（その
時、前記微生物は、乳頭腫ウイルス、ヘルペス、CMVな
どのようなウイルス感染症と重感染している）。
康な個体の粘膜に、103CCU/ml（ml当りの変色の単位）
よりわずかに低いかまたは等しい比率で存在してい
る〕。感染が起こつたりまたは粘膜がもろくなつた時
（ウイルス感染、細菌、ホルモンの不均衡など）、これ
ら微生物は増殖することができ、慢性の重感染状態とな
り、その結果次のような症状を呈する。すなわち、尿細
管不妊症、男性不妊症、急性および慢性の卵管炎、尿道
前立腺症候群、または子宮頚管形成異常症である（その
時、前記微生物は、乳頭腫ウイルス、ヘルペス、CMVな
どのようなウイルス感染症と重感染している）。
問題の患者のすべてに、前記微生物は、104CCU/mlより
高いか等しいスプラ・パソロジカル比率（supra−patho
logical rate）で存在している。
高いか等しいスプラ・パソロジカル比率（supra−patho
logical rate）で存在している。
従来、尿生殖器マイコプラズマを計数するのに次のよう
な２方法を用いてきた。すなわち、 1.顕微鏡視野当りのコロニーの数を分離ゲロース上で計
数した。
な２方法を用いてきた。すなわち、 1.顕微鏡視野当りのコロニーの数を分離ゲロース上で計
数した。
この方法は、泌尿器感染症の細菌計数に利用するのと同
等の方法である〔カス（Kass）〕。
等の方法である〔カス（Kass）〕。
しかしこの形式の計数法は、固体のゲロースを規則正し
く使うという不便な点がありしかもこのゲロースは高価
であるから、尿生殖器マイコプラズマの系統的な試験に
は余り適していない。その上この方法は嫌気ジヤー培養
を行う必要がある。
く使うという不便な点がありしかもこのゲロースは高価
であるから、尿生殖器マイコプラズマの系統的な試験に
は余り適していない。その上この方法は嫌気ジヤー培養
を行う必要がある。
2.液体媒体（U:ウレアプラズマ・ウレアリチカム用媒
体;M:マイコプラズマ・ホミニス用媒体）内の被検試料
を連続的に希釈し、希釈媒体が含有しているフエノール
レツドタイプの適当な色指示薬の終点によつて計数を行
つた。
体;M:マイコプラズマ・ホミニス用媒体）内の被検試料
を連続的に希釈し、希釈媒体が含有しているフエノール
レツドタイプの適当な色指示薬の終点によつて計数を行
つた。
しかし、尿生殖器マイコプラズマの酵素特性を利用する
この方法は、いくつかの不便な点がある。
この方法は、いくつかの不便な点がある。
尿素は、複雑な液体媒体内では不安定である。このた
め、その濃度（酵素の基質を示す）が、あるシリーズの
試験から別のシリーズになると、変化することがあり、
再現性がなくなる危険がある。
め、その濃度（酵素の基質を示す）が、あるシリーズの
試験から別のシリーズになると、変化することがあり、
再現性がなくなる危険がある。
指示薬の変色が、少なくとも24時間安定化するまで読み
取ることができず、したがつて応答待ち時間が最低72時
間要する。
取ることができず、したがつて応答待ち時間が最低72時
間要する。
連続希釈法は、やつかいな方法であり、さらに、手によ
る操作が原因の誤差によつて損われる。
る操作が原因の誤差によつて損われる。
必要な試薬全部と他の材料が入つた市販のキツトはな
い。
い。
この発明は、上記の不便な点を回避し、酵素の動力学を
用いるマイコプラズマの計数法と検出法を提供するもの
である。
用いるマイコプラズマの計数法と検出法を提供するもの
である。
上記の最後の方法は、実際には、酵素活性を検定するの
に、生化学に用いられることは知られているが、この発
明の方法の場合のように細菌の検定に用いることは、示
唆も計画もなされたことはない。
に、生化学に用いられることは知られているが、この発
明の方法の場合のように細菌の検定に用いることは、示
唆も計画もなされたことはない。
本願出願人は、酵素の応答速度が、被検試料中に存在す
るプラズマの量に比例するということを見出した。
るプラズマの量に比例するということを見出した。
この発明の方法の特に特徴とすることは、酵素反応が、
嫌気性条件下で、一方で、被検液体を含む、希釈媒体と
して働くマイコプラズマ用液体増殖媒体と、脱水された
尿素からなる第１基質とで脱水形態のカラーpH指示薬の
存在下で行われ、他方では、前記の液体増殖媒体と、脱
水形態のアルギニンからなる第２基質とで、脱水形態の
カラーpH指示薬の存在下で行われることである。この酵
素反応の速度は、指示薬が変色する時間を記録すること
によつて追跡され、一方では尿素とアルギニンそれぞれ
の量、他方では増殖と希釈の媒体の濃度と栄養成分が、
スプラ・パソロジカル比率もしくはサブ・パソロジカル
比率（sub−pathological rate）で存在するウレアプラ
ズマ・ウレアリチカムに対して、カラー指示薬が、所定
時間が経過後に、転移点に到達するかまたは到達しない
ように選択され標準化される。
嫌気性条件下で、一方で、被検液体を含む、希釈媒体と
して働くマイコプラズマ用液体増殖媒体と、脱水された
尿素からなる第１基質とで脱水形態のカラーpH指示薬の
存在下で行われ、他方では、前記の液体増殖媒体と、脱
水形態のアルギニンからなる第２基質とで、脱水形態の
カラーpH指示薬の存在下で行われることである。この酵
素反応の速度は、指示薬が変色する時間を記録すること
によつて追跡され、一方では尿素とアルギニンそれぞれ
の量、他方では増殖と希釈の媒体の濃度と栄養成分が、
スプラ・パソロジカル比率もしくはサブ・パソロジカル
比率（sub−pathological rate）で存在するウレアプラ
ズマ・ウレアリチカムに対して、カラー指示薬が、所定
時間が経過後に、転移点に到達するかまたは到達しない
ように選択され標準化される。
他の特徴は次のとおりである。
pH指示薬は、pHが6.4〜８で変色するものが選択され
る。
る。
好ましいpH指示薬はフエノールレツドである。
脱水尿素とpH指示薬の濃度、増殖と希釈の液体媒体の濃
度、およびこの媒体中の被検流体の量は、ウレアプラズ
マ・ウレアリチカムがスプラ・パソロジカル比率（104C
CU/mlより高いか同等）で、24時間経過後、指示薬が転
移し、ウレアプラズマ・ウレアリチカムがサブ・パソロ
ジカル比率（103CCU/mlより低いか同等）で、48時間経
過後、指示薬が転移するように選択される。
度、およびこの媒体中の被検流体の量は、ウレアプラズ
マ・ウレアリチカムがスプラ・パソロジカル比率（104C
CU/mlより高いか同等）で、24時間経過後、指示薬が転
移し、ウレアプラズマ・ウレアリチカムがサブ・パソロ
ジカル比率（103CCU/mlより低いか同等）で、48時間経
過後、指示薬が転移するように選択される。
脱水アルギニンとpH指示薬の濃度、増殖と希釈の液体媒
体の濃度、およびこの媒体中の被検流体の量は、マイコ
プラズマ・ホミニスおよびマイコプラズマ・フアーメン
タンスがスプラ・パソロジカル比率（103CCU/mlより高
いか同等）が24時間もしくは48時間経過後に指示薬が転
移し、また両菌株がサブ・パソロジカル比率（103CCU/m
lより低いか同等）で48時間経過しても変色しないよう
に選択される。
体の濃度、およびこの媒体中の被検流体の量は、マイコ
プラズマ・ホミニスおよびマイコプラズマ・フアーメン
タンスがスプラ・パソロジカル比率（103CCU/mlより高
いか同等）が24時間もしくは48時間経過後に指示薬が転
移し、また両菌株がサブ・パソロジカル比率（103CCU/m
lより低いか同等）で48時間経過しても変色しないよう
に選択される。
被検試料の希釈媒体は、本来、適当な栄養要素を添加し
た、マイコプラズマ用の増殖ブロスに基づいたものであ
る。
た、マイコプラズマ用の増殖ブロスに基づいたものであ
る。
被検試料の希釈媒体は、マイコプラズマブロス、子ウマ
血清、アンピシリンのような抗生物質、チオグリコール
酸ナトリウム形の還元剤、酵母およびシステインで構成
されているものが好ましい。
血清、アンピシリンのような抗生物質、チオグリコール
酸ナトリウム形の還元剤、酵母およびシステインで構成
されているものが好ましい。
この発明の方法は、次のように実施するのが好ましい。
すなわち小形のウエルを用い、そのいくつかには脱水尿
素を入れ、いくつかには脱水アルギニンを入れ、被検液
をウエルに入れた後、各ウエルをパラフイン油のような
不活性な油状物質で覆つて嫌気性条件を生成させて実施
する。
すなわち小形のウエルを用い、そのいくつかには脱水尿
素を入れ、いくつかには脱水アルギニンを入れ、被検液
をウエルに入れた後、各ウエルをパラフイン油のような
不活性な油状物質で覆つて嫌気性条件を生成させて実施
する。
この発明を実施するための試薬の、濃度の選択と標準化
は、前記の二つの従来法による計数結果から得た検量線
を用いることによつて行う。
は、前記の二つの従来法による計数結果から得た検量線
を用いることによつて行う。
さらに詳しくは、この発明の目的は、前記の方法を、簡
単に、ごく限られた数の操作しか必要とせず、しかも次
の三つの基準： 安定で実験室に貯蔵可能で輸送できること； マイコプラズマを、その増殖媒体に入れるまでの時間、
生きたまま保持できること； 定量計数結果に影響しないこと； を満たす独得の媒体を得ることにある。
単に、ごく限られた数の操作しか必要とせず、しかも次
の三つの基準： 安定で実験室に貯蔵可能で輸送できること； マイコプラズマを、その増殖媒体に入れるまでの時間、
生きたまま保持できること； 定量計数結果に影響しないこと； を満たす独得の媒体を得ることにある。
これら三つの要件を満たすために、凍結乾燥再生媒体が
被検試料の輸送媒体として、この発明では用いられる。
実際に、マイコプラズマは壁のない細菌であるので、浸
透圧の変動には極めて敏感であり、増殖媒体もしくは保
存媒体には迅速に導入しなければならない。増殖媒体の
欠点は、安定性に劣るということであり、ユーザが試料
センターで厳重な貯蔵管理を行う必要がある。輸送媒体
の欠点は、試料を増殖媒体に入れる前に輸送媒体に入れ
る時の希釈効果であり、そのため定量計数値を全く変え
てしまうのでその結果について計算する必要がある。
被検試料の輸送媒体として、この発明では用いられる。
実際に、マイコプラズマは壁のない細菌であるので、浸
透圧の変動には極めて敏感であり、増殖媒体もしくは保
存媒体には迅速に導入しなければならない。増殖媒体の
欠点は、安定性に劣るということであり、ユーザが試料
センターで厳重な貯蔵管理を行う必要がある。輸送媒体
の欠点は、試料を増殖媒体に入れる前に輸送媒体に入れ
る時の希釈効果であり、そのため定量計数値を全く変え
てしまうのでその結果について計算する必要がある。
本願における独得の媒体は、実際には凍結乾燥された形
態の反応性媒体と解される。この媒体は、すでに再生さ
れているか、または希釈媒体で再生される。その希釈剤
の存在下で安定化された前記反応性媒体は同様に理解さ
れる。
態の反応性媒体と解される。この媒体は、すでに再生さ
れているか、または希釈媒体で再生される。その希釈剤
の存在下で安定化された前記反応性媒体は同様に理解さ
れる。
この発明の独得の媒体は、以下のもので構成されてい
る。すなわち、 コレステロールタイプのマイコプラズマの培養に必要な
公知の要素、酵母エキス、子ウマ血清、 尿素、アルギニンもしくはグルコースのタイプのマイコ
プラズマの代謝の視覚化要素、カラー指示薬（フエノー
ルレツドが好ましい）、および少なくとも一つの抗生物
質、が構成された、いわゆる第１反応性相；ならびに、
被分析試料のビヒクルとして役立つ希釈媒体からなり、
この媒体が、寒天の1g/1000gを添加した、マイコプラズ
マの公知の特異的ブロスと任意に含有する抗生物質とで
構成されてなる第２相とで構成され、 その外の特徴としては、 第１相中に存在する単一もしくは複数の抗生物質が第２
希釈相中にあり、 この抗生物質が、アンピシリン、トリメトプリムおよび
ナイスダチンタイプの抗生物質から選択され、好ましく
は葉酸の合成に作用する抗生物質から選択され、またこ
れらの抗生物質はマイコプラズマには全く効力がなく、 希釈媒体が、不安定成分を含有せず、＋４℃の所定の被
検試料の輸送およぶ保存の媒体として適切なものである
媒体であることである。
る。すなわち、 コレステロールタイプのマイコプラズマの培養に必要な
公知の要素、酵母エキス、子ウマ血清、 尿素、アルギニンもしくはグルコースのタイプのマイコ
プラズマの代謝の視覚化要素、カラー指示薬（フエノー
ルレツドが好ましい）、および少なくとも一つの抗生物
質、が構成された、いわゆる第１反応性相；ならびに、
被分析試料のビヒクルとして役立つ希釈媒体からなり、
この媒体が、寒天の1g/1000gを添加した、マイコプラズ
マの公知の特異的ブロスと任意に含有する抗生物質とで
構成されてなる第２相とで構成され、 その外の特徴としては、 第１相中に存在する単一もしくは複数の抗生物質が第２
希釈相中にあり、 この抗生物質が、アンピシリン、トリメトプリムおよび
ナイスダチンタイプの抗生物質から選択され、好ましく
は葉酸の合成に作用する抗生物質から選択され、またこ
れらの抗生物質はマイコプラズマには全く効力がなく、 希釈媒体が、不安定成分を含有せず、＋４℃の所定の被
検試料の輸送およぶ保存の媒体として適切なものである
媒体であることである。
この発明のその他の特徴と利点は、以下の説明と実施例
でより明確になる。
でより明確になる。
この発明の方法を実施する際には、一般に、直径9mm、
深さ6mmの公知の少なくとも二つのウエルを用いる。
深さ6mmの公知の少なくとも二つのウエルを用いる。
これらのウエルの一方には1mgの脱水尿素を入れ、他方
には1.68mgの脱水アルギニンを入れる。これらの各ウエ
ルに、フエノールレツドとして知られている同じ脱水pH
指示薬6.8μｇずつを入れる。
には1.68mgの脱水アルギニンを入れる。これらの各ウエ
ルに、フエノールレツドとして知られている同じ脱水pH
指示薬6.8μｇずつを入れる。
分析するために患者から採取した試料は、下記組成を有
する媒体（媒体A3）を用いて溶解し、713mlの蒸留水に
溶解した脱水マイクロプラズマブロス（25.5g）から得
た。得られた液体媒体には次の組成のものを添加した。
する媒体（媒体A3）を用いて溶解し、713mlの蒸留水に
溶解した脱水マイクロプラズマブロス（25.5g）から得
た。得られた液体媒体には次の組成のものを添加した。
200mlの子ウマ血清； 0.5gのアンピシリン； 8gのバクトリム（Bactrim）（抗生物質）； 0.5gの還元剤（チオグリコール酸ナトリウム）； 100mlの酵母； 2.5mlのシステイン（４％） 各ウエルを数滴のパラフイン油で覆い、酵素反応のため
に必要な嫌気性条件を作つた。
に必要な嫌気性条件を作つた。
上記の組成物と、尿素、アルギニンおよびpH指示薬の量
は、ユー・ウレアリチカムのスプラ・パソロジカル比率
については、24時間内に変色するように、またエム・ホ
ミニスのスプラ・パソロジカル比率については24〜48時
間で変色するようなしかたで、現在使用されている二つ
の従来法を用いる比較試験を実施するのに適切なもので
ある。
は、ユー・ウレアリチカムのスプラ・パソロジカル比率
については、24時間内に変色するように、またエム・ホ
ミニスのスプラ・パソロジカル比率については24〜48時
間で変色するようなしかたで、現在使用されている二つ
の従来法を用いる比較試験を実施するのに適切なもので
ある。
上記の比較試験について、希釈の前記方法において、尿
素とアルギニンに基づいた従来の液体希釈媒体は、150
μの媒体の比率で用い、この媒体に、採取試料ととも
に培養された媒体A3の15μを導入し、次いで各採取試
料に対して15μの比率で連続して希釈する。
素とアルギニンに基づいた従来の液体希釈媒体は、150
μの媒体の比率で用い、この媒体に、採取試料ととも
に培養された媒体A3の15μを導入し、次いで各採取試
料に対して15μの比率で連続して希釈する。
プレート（ゲロースA7）当りの計数法については、従来
どおりに、顕微鏡視野（100倍）のマイコプラズマのコ
ロニー数の平均値を次の方法で行う。CFU/mlは“コロニ
ー形成ユニツト”を意味する。
どおりに、顕微鏡視野（100倍）のマイコプラズマのコ
ロニー数の平均値を次の方法で行う。CFU/mlは“コロニ
ー形成ユニツト”を意味する。
細菌の濃度 １個に満たないコロニー 103CFU/ml １〜５個のコロニー 104CFU/mlに近い ６〜10個のコロニー 105CFU/mlに近い 11〜20個のコロニー 106CFU/mlに近い 20個以上のコロニー ＞106CFU/ml 男性もしくは女性の患者から採取した尿生殖器の試料に
ついて、異なる方法で得た結果を以下の表に示す。
ついて、異なる方法で得た結果を以下の表に示す。
添付した曲線を参照する。
上記表と添付した比較曲線を考察すると、104CCU/mlよ
り高いかまたは等しい比率でユー・ウレアリチカムが存
在する場合、尿素のウエルは、24時間で変色する（指示
薬転移点）ことが分かる。同じ尿素ウエルが48時間で変
色する場合は、ユー・ウレアリチカムが103CCU/mlより
低いかもしくは等しい比率で存在している（ヒトの病因
としては有意でない）か、または化学薬品もしくは細菌
によつて妨害されていることを示す。尿素のウエルは感
度が非常に大きいので、尿素のウエルが48時間で変色し
ないことは、低比率（102〜103CCU/ml）でも、ユー・ウ
レアリチカムが全く存在しないことを確認している。
り高いかまたは等しい比率でユー・ウレアリチカムが存
在する場合、尿素のウエルは、24時間で変色する（指示
薬転移点）ことが分かる。同じ尿素ウエルが48時間で変
色する場合は、ユー・ウレアリチカムが103CCU/mlより
低いかもしくは等しい比率で存在している（ヒトの病因
としては有意でない）か、または化学薬品もしくは細菌
によつて妨害されていることを示す。尿素のウエルは感
度が非常に大きいので、尿素のウエルが48時間で変色し
ないことは、低比率（102〜103CCU/ml）でも、ユー・ウ
レアリチカムが全く存在しないことを確認している。
さらに、いかなる妨害（細菌もしくは化学薬品）も24時
間の応答を変えることができないことは明らかであり、
検出の完全な信頼性が得られ、その信頼性は（選別にウ
エルを使いながら）A3媒体を固体ゲロースA7上に移すこ
とによつていつでも確かめることができる。
間の応答を変えることができないことは明らかであり、
検出の完全な信頼性が得られ、その信頼性は（選別にウ
エルを使いながら）A3媒体を固体ゲロースA7上に移すこ
とによつていつでも確かめることができる。
エム・ホミニスとエム・フアーメンタンスについては、
酵素活性が弱いので、アルギニン（ARG）ウエルの48時
間での変色だけが、サブ・パソロジカル比率（103CCU/m
lより低いか等しく、48時間でウエルは変色しない）
と、スプラ・パソロジカル比率（104CCU/mlより高いか
等しく、24時間もしくは48時間でウエルが変色する）と
を検出することができる。
酵素活性が弱いので、アルギニン（ARG）ウエルの48時
間での変色だけが、サブ・パソロジカル比率（103CCU/m
lより低いか等しく、48時間でウエルは変色しない）
と、スプラ・パソロジカル比率（104CCU/mlより高いか
等しく、24時間もしくは48時間でウエルが変色する）と
を検出することができる。
したがつて、尿素ウエルの24時間での変色と、アルギニ
ンウエルの24時間もしくは48時間での変色は重要であ
る。それ故、微生物学者は、上記の時間経過で、粘膜が
マイコプラズマに感染もしくは重感染しているのか否か
を確認することができる。
ンウエルの24時間もしくは48時間での変色は重要であ
る。それ故、微生物学者は、上記の時間経過で、粘膜が
マイコプラズマに感染もしくは重感染しているのか否か
を確認することができる。
上記の表によれば、Ｆの患者については、測定結果が、
本願発明の方法では検出されないような濃度であること
が分かる。これは、ウエルの感度がしきい値が任意に10
3CCU/mlに固定されているからである。低濃度は、マイ
コプラズマ感染症の診断には重要でない。媒体A7上にコ
ロニーから見られないのが正常である。なぜなら、直接
接種する方法は、希釈フアクターを誘発するからであ
る。
本願発明の方法では検出されないような濃度であること
が分かる。これは、ウエルの感度がしきい値が任意に10
3CCU/mlに固定されているからである。低濃度は、マイ
コプラズマ感染症の診断には重要でない。媒体A7上にコ
ロニーから見られないのが正常である。なぜなら、直接
接種する方法は、希釈フアクターを誘発するからであ
る。
Ｇの患者については、プレート当りの計数だけが説明で
きることが分かる。
きることが分かる。
問題の三つの方法によつて実施される計数値は、ゲロー
スA7法と希釈法間の直線上にあり、それに対応して変化
する動的曲線にしてある（104CCU/mlより高いか等しい
濃度については24時間、および103CCU/mlより低いか等
しい濃度については48時間）。
スA7法と希釈法間の直線上にあり、それに対応して変化
する動的曲線にしてある（104CCU/mlより高いか等しい
濃度については24時間、および103CCU/mlより低いか等
しい濃度については48時間）。
すでに示したように、添付したグラフには、Ｆの患者だ
けがこの直線からはずれていることは明らかである。
けがこの直線からはずれていることは明らかである。
この発明によれば、スプラ・パソロジカル濃度について
は、希釈法で値が得られる時間の限度は72時間であり、
計数プレートの場合は48時間、ウエルでの計数では24時
間であることは明らかである。
は、希釈法で値が得られる時間の限度は72時間であり、
計数プレートの場合は48時間、ウエルでの計数では24時
間であることは明らかである。
さらに出願人は、この発明の新しい方法で脱水された基
質の入つた支持体上での酵素反応を用いれば、使用した
他の二つの方法と比べて、試験したケースの95％に極め
て良好な相関関係があることを知つている。
質の入つた支持体上での酵素反応を用いれば、使用した
他の二つの方法と比べて、試験したケースの95％に極め
て良好な相関関係があることを知つている。
いくつかの実験に見られる５％の誤差は、固体ゲロース
上での計数法が間違つて用いられる場合のように、菌株
が液体媒体中で優先的に増殖するか、またはプレート上
での計数値だけが低い値を与える場合のように、菌株の
酵素活性が弱いことで説明できる。
上での計数法が間違つて用いられる場合のように、菌株
が液体媒体中で優先的に増殖するか、またはプレート上
での計数値だけが低い値を与える場合のように、菌株の
酵素活性が弱いことで説明できる。
それ故に、この５％の誤差の検出は、二つの計数法、す
なわち一方は本願発明の方法と他方は固体ゲロースを使
う方法を同時に利用することによつて行うことができ
る。
なわち一方は本願発明の方法と他方は固体ゲロースを使
う方法を同時に利用することによつて行うことができ
る。
さらに、この発明によるウエル内での酵素の反応では、
基質が脱水された形態で存在するが、この反応は連続希
釈法に対して次のような利点がある。すなわち、 再現性を保証する基質の安定性； 操作手順が少なく、検定に用いる少量の試料の入つたマ
イクロプレート上で手によつて希釈することから起こる
不正確さがなくなる； 応答の待時間が72時間でなくて24時間；および 使用される全材料を考慮すると最終的に原価が低下す
る。
基質が脱水された形態で存在するが、この反応は連続希
釈法に対して次のような利点がある。すなわち、 再現性を保証する基質の安定性； 操作手順が少なく、検定に用いる少量の試料の入つたマ
イクロプレート上で手によつて希釈することから起こる
不正確さがなくなる； 応答の待時間が72時間でなくて24時間；および 使用される全材料を考慮すると最終的に原価が低下す
る。
特定の操作法によつて、この発明の先に記載した独特の
媒体が用いられる。
媒体が用いられる。
患者由来の被分析試料（尿生殖器の試料を実施例のよう
にして採取した）を、いわゆる希釈媒体の部分としてフ
ラスコに導入され貯蔵される。
にして採取した）を、いわゆる希釈媒体の部分としてフ
ラスコに導入され貯蔵される。
活性相が、凍結乾燥形で存在している場合は、いわゆる
反応性媒体は、希釈媒体を添加することによつて“再生
される”。反応性媒体は、すでに希釈され、それ自体安
定化されている場合には、そのまま使われる。
反応性媒体は、希釈媒体を添加することによつて“再生
される”。反応性媒体は、すでに希釈され、それ自体安
定化されている場合には、そのまま使われる。
試料を含有する媒体の一部を反応性媒体の一部にそそ
ぐ。検出、すなわち試験中の細菌の存在の視覚化は、指
示薬の転移点での変色（黄色から赤色へ）によつて行わ
れる。さらに、尿生殖器のマイコプラズマは、他の細菌
に比べて媒体をくもらせないので、媒体は透明のままで
ある。
ぐ。検出、すなわち試験中の細菌の存在の視覚化は、指
示薬の転移点での変色（黄色から赤色へ）によつて行わ
れる。さらに、尿生殖器のマイコプラズマは、他の細菌
に比べて媒体をくもらせないので、媒体は透明のままで
ある。
マイコプラズマの存在が明らかになる計数法は、上記の
酵素作用によつて実施される。この方法は、この発明で
述べたように、活性媒体（再生された）中で有利に用い
て、スプラ・パソロジカル比率（103CCU/mlより高いか
等しく、24時間で変色）で存在する菌株と、サブ・パソ
ロジカル比率（102CCU/mlより低いか等しく、48時間以
上で変色）で存在する菌株とを識別する診断を確実に行
う。
酵素作用によつて実施される。この方法は、この発明で
述べたように、活性媒体（再生された）中で有利に用い
て、スプラ・パソロジカル比率（103CCU/mlより高いか
等しく、24時間で変色）で存在する菌株と、サブ・パソ
ロジカル比率（102CCU/mlより低いか等しく、48時間以
上で変色）で存在する菌株とを識別する診断を確実に行
う。
実用的に重要性の少ない計数の場合には（極めて低い比
率のマイコプラズマの検査、例えば生体外での受精の管
理、精液の試験、ヘモカルチヤーまたは卵管炎の外科手
術の場合）、媒体の終点の観察は最初の24時間後に行
う。
率のマイコプラズマの検査、例えば生体外での受精の管
理、精液の試験、ヘモカルチヤーまたは卵管炎の外科手
術の場合）、媒体の終点の観察は最初の24時間後に行
う。
その外の問題になつている場合では、計数に利用される
技術、特に酵素作用の技術によつて、医師は、採取試料
中に存在するマイコプラズマのレベルが分かる。
技術、特に酵素作用の技術によつて、医師は、採取試料
中に存在するマイコプラズマのレベルが分かる。
この発明によれば、マイコプラズマの同定が、生物学的
媒体で実施した検出と計数の操作を、マイコプラズマの
抗生物質に対する感受性のプロフイール（アンチビオグ
ラム）を利用してマイコプラズマを同定することによつ
て追跡して行われる。
媒体で実施した検出と計数の操作を、マイコプラズマの
抗生物質に対する感受性のプロフイール（アンチビオグ
ラム）を利用してマイコプラズマを同定することによつ
て追跡して行われる。
実際に、マイコプラズマのかようなアンチビオグラム
は、本願に示す独特の媒体の変色が明らかにマイコプラ
ズマによるものであり、同じ酵素活性を有する他の細菌
によるものではないことを立証するのみならず、見出さ
れた上記プロフイールによつて、存在しているマイコプ
ラズマのタイプ、種および属も確認することができる。
指示薬の変色が認められ、媒体がまだ透明のうちに（例
えば、尿道、膣、エンドコール（endocol）のような通
常の尿生殖器の採集試料については24時間、上記の場合
以外では24時間以上）、同定操作を同じマルチプレート
のウエルで実施し、同定特性値と、使用された前の媒体
が添加された、第１部分と同一の別の反応性媒体の第２
部分で試験される抗体とが再編成される。
は、本願に示す独特の媒体の変色が明らかにマイコプラ
ズマによるものであり、同じ酵素活性を有する他の細菌
によるものではないことを立証するのみならず、見出さ
れた上記プロフイールによつて、存在しているマイコプ
ラズマのタイプ、種および属も確認することができる。
指示薬の変色が認められ、媒体がまだ透明のうちに（例
えば、尿道、膣、エンドコール（endocol）のような通
常の尿生殖器の採集試料については24時間、上記の場合
以外では24時間以上）、同定操作を同じマルチプレート
のウエルで実施し、同定特性値と、使用された前の媒体
が添加された、第１部分と同一の別の反応性媒体の第２
部分で試験される抗体とが再編成される。
上記のように、この種のマルチプルウエルのプロフイー
ルは、上記の技術ではよく知られているが、ウレアプラ
ズマとマイコプラズマ（ホミニスもしくはフアーメンタ
ンス）との識別と、分離された菌株の共存する抗生物質
に対する感受性の評価ができる（24〜48時間の試験結
果）ことが分かる。
ルは、上記の技術ではよく知られているが、ウレアプラ
ズマとマイコプラズマ（ホミニスもしくはフアーメンタ
ンス）との識別と、分離された菌株の共存する抗生物質
に対する感受性の評価ができる（24〜48時間の試験結
果）ことが分かる。
また、特異的なアンチビオグラムのマルチプレートウエ
ルで補足された上記の独特の媒体によつて、48〜72時間
の間に、試料の輸送、詳しく述べれば、感染症に関与し
ている尿生殖器の98％の検出、定量測定、同定および抗
体に対する感受性の試験を行うことができることが分か
る（マイコプラズマ・フアーメンタンスは、この疾病の
２％以下を占めるにすぎず、そのアルギニン陽性特性に
よつてホミニス種に同化されるが、検出はされる）。
ルで補足された上記の独特の媒体によつて、48〜72時間
の間に、試料の輸送、詳しく述べれば、感染症に関与し
ている尿生殖器の98％の検出、定量測定、同定および抗
体に対する感受性の試験を行うことができることが分か
る（マイコプラズマ・フアーメンタンスは、この疾病の
２％以下を占めるにすぎず、そのアルギニン陽性特性に
よつてホミニス種に同化されるが、検出はされる）。
それ故にこの発明の媒体の重要性は次のとおりである。
1.方法が簡単なこと。
2.偽陽性反応がないこと（汚染物は、24時間内にその酵
素特性を全く示さない）。さらに、半ゲロース媒体に
は、アンピシリン、トリメトロプリムとナイスタチンに
おそらく耐性のある汚染物が存在できるが、このような
汚染物は媒体をにごらせる。
素特性を全く示さない）。さらに、半ゲロース媒体に
は、アンピシリン、トリメトロプリムとナイスタチンに
おそらく耐性のある汚染物が存在できるが、このような
汚染物は媒体をにごらせる。
しかしこの発明の媒体に存在する抗生物質の混合物に感
受性のある種の菌株（液体を透明に保持する）が、その
酵素的な尿素もしくはアルギニン陽性特性（ブロスは透
明な赤色）を示すならば、試験が偽陽性になることは不
可能であろうし、またアンチビオグラム・マルチプレー
ト・ウエルは、異常なプロフイールと、このマルチプレ
ートウエルに存在する“汚染物”を含有する場合のウエ
ルの変色を示すであろう。
受性のある種の菌株（液体を透明に保持する）が、その
酵素的な尿素もしくはアルギニン陽性特性（ブロスは透
明な赤色）を示すならば、試験が偽陽性になることは不
可能であろうし、またアンチビオグラム・マルチプレー
ト・ウエルは、異常なプロフイールと、このマルチプレ
ートウエルに存在する“汚染物”を含有する場合のウエ
ルの変色を示すであろう。
3.安定な輸送媒体があること（凍結乾燥物中に存在する
不安定因子の分離）。
不安定因子の分離）。
4.マイコプラズマの診断に、抗生物質に対する感受性の
試験を系統的に導入できること。このことは、15％の菌
株がテトラサイクリンに耐性で、30％以上のウレアプラ
ズマ・ウレアリチカムと97％のマイコプラズマ・ホミニ
スがエリスロマイシンに耐性であるという点で正しい
（Congress I.C.A.A.C.25ニユーヨーク、1987年）。
試験を系統的に導入できること。このことは、15％の菌
株がテトラサイクリンに耐性で、30％以上のウレアプラ
ズマ・ウレアリチカムと97％のマイコプラズマ・ホミニ
スがエリスロマイシンに耐性であるという点で正しい
（Congress I.C.A.A.C.25ニユーヨーク、1987年）。
5.液体媒体中で優先的に増殖する菌株の10％を正確に診
断できること。今までこの菌株を汚染物から識別できな
かつた〔この汚染物は、尿素もしくはアルギニン陽性で
媒体中に存在する抗生物質に感受性であり、透明な媒体
が赤色に変色した。例えば膣フローラの、カンピロバク
ター（Campylobacter）属のある種の嫌気性もしくは微
好気性細菌がある〕。これら10％の菌株は、固体の分離
ゲロース上では増殖しないので、診断はいつも不安定で
あつた。
断できること。今までこの菌株を汚染物から識別できな
かつた〔この汚染物は、尿素もしくはアルギニン陽性で
媒体中に存在する抗生物質に感受性であり、透明な媒体
が赤色に変色した。例えば膣フローラの、カンピロバク
ター（Campylobacter）属のある種の嫌気性もしくは微
好気性細菌がある〕。これら10％の菌株は、固体の分離
ゲロース上では増殖しないので、診断はいつも不安定で
あつた。
6.嫌気性のジヤーもしくはサシエイ中の嫌気性条件を全
く完全になくすことができること。これを行うことは比
較的費用がかかり、専門でない研究所にとつては、精巧
すぎる場合がある。
く完全になくすことができること。これを行うことは比
較的費用がかかり、専門でない研究所にとつては、精巧
すぎる場合がある。
この発明については、単に例示して説明しただけであつ
て、この発明を限定するものではない。可能な変形はす
べて、この発明の範囲を逸脱することなく均等物とみな
すことができる。
て、この発明を限定するものではない。可能な変形はす
べて、この発明の範囲を逸脱することなく均等物とみな
すことができる。
またこの発明の独特の媒体は、尿素とアルギニンの代わ
りにグルコースを用いるとともに適切な指示薬（チモー
ルブルー）を使つて、肺炎プラズマ（例えば異型肺炎症
のプラズマ）の診断にも利用できる。
りにグルコースを用いるとともに適切な指示薬（チモー
ルブルー）を使つて、肺炎プラズマ（例えば異型肺炎症
のプラズマ）の診断にも利用できる。
Claims (16)
- 【請求項１】酵素反応が、嫌気性条件下で、一方で、被
検液体試料を含む、希釈媒体として働くマイコプラズマ
用液体増殖媒体と、脱水された尿素もしくはグルコース
からなる第１基質とで、脱水形態のカラーpH指示薬の存
在下で行われ、他方では、前記の液体増殖媒体と、脱水
形態のアルギニンもしくはグルコースからなる第２基質
とで、脱水形態のカラーpH指示薬の存在下で行われ；酵
素反応の速度が該指示薬が変色する時間を記録すること
によって追跡され、一方では尿素とアルギニンもしくは
グルコースそれぞれの量が、他方では前記の増殖および
希釈媒体の濃度と栄養成分が、スプラもしくはサブのパ
ソロジカル比率で存在するウレアプラズマ・ウレアリチ
カムに対してカラー指示薬が、所定時間経過後に転移点
に到達するかもしくは到達しないように選択されかつ標
準化されることを特徴とする、マイコプラズマを計数し
検出する方法。 - 【請求項２】pH指示薬として、pH6.4〜８の色転移点を
有するものを選択することを特徴とする請求の範囲第１
項に記載の方法。 - 【請求項３】pH指示薬が、好ましくはフエノールレツド
またはチモールブルーであることを特徴とする請求の範
囲第２項に記載の方法。 - 【請求項４】一方では、脱水された尿素もしくはグルコ
ースおよびpH指示薬の濃度が、他方では増殖および希釈
液体媒体の濃度と、この媒体中の被検液体の量とが、ウ
レアプラズマ・ウレアリチカムがスプラ・パソロジカル
比率（104CCU/mlより高いか等しい）で存在している時
には、指示薬の変色が24時間経過後に起こり、ウレアプ
ラズマ・ウレアリチカムがサブ・パソロジカル比率（10
3CCU/mlより低いか等しい）で存在している時には、指
示薬の変色が48時間後に起こるように選択されることを
特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一つ
に記載の方法。 - 【請求項５】一方では、脱水されたアルギニンもしくは
グルコースおよびpH指示薬の濃度が、他方では、液体の
増殖および希釈媒体の濃度と、この媒体中の被検液体の
量とが、マイコプラズマ・ホミニスとマイコプラズマ・
フアーメンタンスが、スプラ・パソロジカル比率（104C
CU/mlより高いか等しい）で存在している時には、24時
間もしくは48時間経過後に指示薬の変色があり、また前
記マイコプラズマが、サブ・パソロジカル比率（103CCU
/mlより低いか等しい）で存在している時には48時間経
過後も指示薬が変色しないように選択されることを特徴
とする請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか一つに記
載の方法。 - 【請求項６】被検試料を含む希釈媒体が、特に、適切な
栄養成分が添加された、マイコプラズマの成長ブロスに
よるものであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至
第５項のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項７】被検試料を含む希釈媒体が、好ましくは、
小ウマ血清アンピシリンのような抗生物質、チオグリコ
ール酸ナトリウムタイプの還元剤、酵母およびシステイ
ンからなるマイコプラズマブロスで構成されていること
を特徴とする請求の範囲第６項に記載の方法。 - 【請求項８】小形のウエルのいくつかに尿素もしくはグ
ルコースを入れ、別のいくつかには脱水アルギニンもし
くはグルコースを入れ、それぞれに被検液体を導入した
後、パラフイン油のような不活性な油状物質で覆うこと
によって嫌気性条件を生じさせて実施することを特徴と
する請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか一つに記載
の方法。 - 【請求項９】前記の方法を実施するための試薬の、濃度
の選択と標準化を、標準法による計数値による検量線を
用いて行うことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８
項のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項１０】コレステロールタイプのマイコプラズマ
の培養に必要な公知の要素；酵母エキス；小ウマ血清；
尿素、アルギニンもしくはグルコースタイプのマイコプ
ラズマ代謝の視覚化要素；カラー指示薬；および少なく
とも一つの抗生物質からなるいわゆる反応性第１相と、 被検試料の輸送媒体としても働く希釈媒体からなり、こ
の媒体が、マイコプラズマの公知の特定のブロスとこれ
に添加された1g/1000g寒天とを含有しまた抗生物質を含
有していてもよい第２相とで、 構成されていることを特徴とする、請求の範囲第１〜９
項のいずれか一つに記載の方法を実施するのに特に適し
た独特の生物学的媒体。 - 【請求項１１】第１相に存在する単一もしくは複数の抗
生物質が、希釈の第２相に見出されることを特徴とする
請求の範囲第10項に記載の生物学的媒体。 - 【請求項１２】前記の単一もしくは複数の抗生物質が、
アンピシリン、トリメトプリムおよびナイスタチンタイ
プの抗生物質から好ましくは、マイコプラズマに対して
全く不活性で、葉酸の合成に作用する抗生物質から選択
されることを特徴とする請求の範囲第10項または第11項
に記載の生物学的媒体。 - 【請求項１３】希釈媒体が不安定要素を全く含有せず、
その結果、＋４℃で分析される試料用の輸送および保存
媒体として使用するのに適していることを特徴とする請
求の範囲第10項乃至第12項のいずれか一つに記載の生物
学的媒体。 - 【請求項１４】分離された菌株のアンチビオグラムのプ
ロフイールを検査して、問題のマイコプラズマを同定す
るための補助同定相からなる請求の範囲第１項のいずれ
か一つに記載の方法を実施するのに用いる請求の範囲第
10項乃至第13項のいずれか一つに記載の生物学的媒体。 - 【請求項１５】そのタイプ、種および属にかかわらず、
すべてのマイコプラズマ、特に尿生殖器のマイコプラズ
マの検出と計数への請求の範囲第１項乃至第９項のいず
れか一つに記載の方法の用途。 - 【請求項１６】そのタイプ、種もしくは属にかかわらず
すべてのマイコプラズマ、特に尿生殖器のマイコプラズ
マの計数、検出および同定への請求の範囲第10項乃至第
14項のいずれか一つに記載の独特の生物学的媒体の用
途。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8713703A FR2621049B1 (fr) | 1987-09-29 | 1987-09-29 | Procede de numeration et de depistage des mycoplasmes urogenitaux |
| FR87/13703 | 1987-09-29 | ||
| FR88/00176 | 1988-01-07 | ||
| FR8800176A FR2625751B1 (fr) | 1988-01-07 | 1988-01-07 | Milieu biologique specialement adapte au domaine des analyses des mycoplasmes en pathologie humaine |
| PCT/FR1988/000464 WO1989002926A1 (fr) | 1987-09-29 | 1988-09-20 | Procede de numeration, de depistage et d'identification des mycoplasmes en general et urogenitaux en particulier et milieu biologique specialement adapte a cet effet |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02501801A JPH02501801A (ja) | 1990-06-21 |
| JPH0738797B2 true JPH0738797B2 (ja) | 1995-05-01 |
Family
ID=26226242
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63507863A Expired - Lifetime JPH0738797B2 (ja) | 1987-09-29 | 1988-09-20 | 一般的マイコプラズマと特に尿生殖器のマイコプラズマの計数、検出および同定の方法ならびにこれらの方法に特に適した生物学的媒体 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5091307A (ja) |
| EP (1) | EP0311541B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0738797B2 (ja) |
| AU (1) | AU616915B2 (ja) |
| BR (1) | BR8807223A (ja) |
| CA (1) | CA1335704C (ja) |
| DE (1) | DE3864789D1 (ja) |
| DK (1) | DK257589D0 (ja) |
| ES (1) | ES2024687B3 (ja) |
| FI (1) | FI91888C (ja) |
| WO (1) | WO1989002926A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5498527A (en) * | 1994-02-18 | 1996-03-12 | Ube Industries, Ltd. | Phosphorylcholine-containing glyceroglycolipid |
| US5885791A (en) * | 1995-11-16 | 1999-03-23 | The Research And Development Institute, Inc. | Antifungal and antibacterial susceptibility assay |
| CN1095500C (zh) * | 2000-03-15 | 2002-12-04 | 黄威权 | 联合型支原体检测试剂及制备方法 |
| BRPI0417461A (pt) * | 2003-12-11 | 2007-03-13 | Wyeth Corp | testes de suscetibilidade estabilizados de patógenos aeróbicos |
| RU2261903C1 (ru) * | 2004-03-22 | 2005-10-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" | ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ Mycoplasma hominis И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ МИКОПЛАЗМОЗОВ |
| RU2265656C1 (ru) * | 2004-03-22 | 2005-12-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ИнтерЛабСервис" | Питательная среда для выявления ureaplasma urealyticum и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов |
| ITBO20060531A1 (it) * | 2006-07-11 | 2008-01-12 | Univ Degli Studi Roma Tre | Metodo colorimetrico e relativo dispositivo per la rilevazione della carica batterica |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA998632A (en) * | 1972-03-18 | 1976-10-19 | Rudolf Mauler | Medium for the cultivation of mycoplasms |
| US4208480A (en) * | 1978-08-23 | 1980-06-17 | American Home Products Corporation | Method, reagents and apparatus for the rapid identification of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis |
| US4335205A (en) * | 1979-04-06 | 1982-06-15 | Greenwood James R | Low protein degradation product basal medium for identification of non-fermentative gram-negative bacilli and other microorganisms |
| US4245043A (en) * | 1979-06-29 | 1981-01-13 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Negative control media device and method for microbiologic biochemical tests |
| DK377983A (da) * | 1982-08-25 | 1984-02-26 | Hana Biolog Inc | Trefaset mycoplasmatales kulturapparat og fremgangsmaade |
| US4598045A (en) * | 1982-08-25 | 1986-07-01 | Hana Biologics, Inc. | Triphasic mycoplasmatales detection method |
| US4721678A (en) * | 1982-08-25 | 1988-01-26 | Hana Biologics, Inc. | Triphasic mycoplasmatales culture device |
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1988
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