【発明の詳細な説明】
発明の名称
ヒト・インターロイキン−４ ミューティン発明の背景
本発明は、一般にリンホカインならびに、特に活性化されたＢ細胞のクローンの
増大および成熟や細胞障害性Ｔ細胞の増殖を誘発する、組換え体インターロイキ
ンー４ミューティンあるいは類似のタンパク質に関連したものである。
Ｂリンパ球、あるいはＢ細胞は、抗体−分泌形質細胞の前駆体である。Ｂ細胞は
、前Ｂ細胞として知られる中間的な細胞クラスを経て、骨髄に局在する造血幹細
胞から由来したものであ′る。Ｂ細胞は、特異的な抗原に結合可能な、表面結合
免疫グロブリンの発現によって前Ｂ細胞と区別することができる。Ｂ細胞は膜の
りセブターへの抗原の結合によって活性化されるが、但しＢ細胞は特定のヘルパ
ーＴ細胞と相互作用したり、あるいはある種の可溶性の増殖もしくは分化因子と
相互作用したりもする。Ｂ細胞の活性化は、増殖および分化期を含む逐次的過程
である。増殖期には、活性化されたＢ細胞クローンは増加して、活性化に関与す
る抗原と反応することができる多数の細胞を供給する。分化期には、活性化され
たＢ細胞の一部が成熟し、血液循環中の血漿細胞として免疫グロブリンを分泌す
る。初め、「Ｂ細胞成長因子Ｊ （ＢＣＧＦ）および「Ｂ細胞分化因子Ｊ （Ｂ
ＣＤＦ）と名付けられたＴ細胞由来の異なるサイトカンは、増殖および分化期の
制御に関わっている。ＢＣＧＦに対して当てられている別の用語は、「Ｂ細胞刺
激因子Ｉ Ｊ （ＢＳＦ−１）および「インターロイキン−４Ｊ （ＩＬ−４）
であるが、現在は後者が好まれている。
ハウワード（Ｈｏｗａｒｄ）ら、Ｌｌ咀Ｊ何エユＪ ： ９１４（１９８２）
、およびファーラー（Ｆａｒｒａｒ）ら、Ｊ、Ｉａ＋ｍｕｎｏ１．１３１ ＝
１８３８（１９８３）は、Ｂ細胞の増殖を促進する、分裂促進剤によって刺激し
たネズミＴ細胞由来のＢ細胞刺激因子について記述している。この開示に続き、
多数の研究室がＴ細胞ハイブリドーマ、クローン化したＴ細胞および正常のＴ細
胞によって馴化した培地中の同様なネズミ由来の活性を報告した０例えば、レー
ム（Ｒｏｅｈｍ ）ら、ムｈム基疫Ｊ競： ６７９ （１９８４） 、ノニル（
Ｎｏｅｌｌｅ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 ｔｌｓＡ ８ ： ６１４９（１９８４）、オリバー（Ｏ
ｌｉｖｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ ８２ ： ２４６５（１９８５）、ラ
ビン（Ｒａｂｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８２ ： ２９３５（１９８５）、ヴイ
テッタ（Ｖｉｔｅｔｔａ）ら、４Ｌシ卯」ゆ几−月瀘： １７２６（１９８５）
を参照されたい。ネズミＢＳＦ−１／ＩＬ４種の均質標品までの精製は、グラブ
シュタイン（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ）ら１．Ｌｉ印」（九−」は： １４０５（１
９８６）によって報告された。
ネズミＢＳＦ−１／ＩＬ−４活性を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡの単
離は、最近ツマ（Ｎｏｍａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１９ ： ６４０（１９８６
）およびリー（Ｌｅｅ ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
８３ ： ２０６１（１９８６）によって報告された。ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ
）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ蔓： ５８９４（１
９８６）は、ネズミＩＬ−４に相同性を有する、ヒトｃＤＮＡクローンを単離し
た。このヒトｃＤＮＡは、シグナル・ペプチドの可能性がある部分を含む、１５
３アミノ酸からなるタンパク質をコードしている。このｃＤＮＡで形質移入した
サルＣＯ５−１細胞の上滑は、抗−１ｇ１’ｌにさらしたヒトＢ細胞の増殖を誘
導することができた。この活性は、ネズミＢ細胞と関連したネズミＩＬ−４の既
知の性質に類似している。
ＩＬ〜４はまた、因子−依存性Ｔ細胞および骨髄細胞クラスの増殖および分化を
刺激する。グラブシュタインら（前述）は、ネズミＩＬ−４が、ネズミＩＬ−２
依存性およびＩＬ−３依存性子細胞系列の増殖を誘導することを報告した。他の
研究は、ＩＬ−４が肥満細胞の増殖と、大食細胞（マクロファージ）の分化を刺
激することを報告している。
相当量の精製されたＩＬ−４が得られることは、Ｂ細胞の個体発生および機能に
関する研究を促進し、このリンホカインの治療への利用可能性を明らかにしてき
た。現在組換え体ヒ）ＩＬ−４に対して意図されている用法には、Ｂ細胞減少症
によって特徴付けられる免疫不全症の治療および、特定のＢ細胞関連リンパ球性
白血病の治療法としてのＢ細胞分化の誘導がある。ＩＬ−４はまた、免疫グロブ
リン−分泌Ｂ細胞の連続培養に、ヒト・モノクローナル抗体源を供給し、維持す
るためにも用いられるかも知れない０本出願人は、ＩＬ−４が、あらかじめ分裂
促進刺激にさらされた細胞障害性Ｔ細胞の増殖と分化を誘導することを発見した
。この観察は、ＩＬ−４をウィルスの感染および成る腫瘍性状態の治療において
、治療用リンホカインとして用いることができることを示している。
主皿皇監！
本発明は、酵母の発現系を用いて生産される組換え体ヒトルー４タンパクに関す
るものである。例えばｈＩＬ−４（Ａｓｐ”、Ａｓｐ”’）といった、不活性化
されたアスパラギン結合型のグリコジル化部位を持つものを含んだ、類似タンパ
ク質が好ましいものである０本発明は、ミューティンをコードするＤＮＡ配列お
よび、そのＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター、ならびに、その組換え体発
現ベクターによって形質転換された培養微生物に含まれるミューティンを作る方
法にも関連している０本発明は、生理学的に受容可能な担体あるいは希釈物と組
合せ、生物学的に効果を示す量のＩＬ−４を含む組成物とＴ細胞を接触させるこ
とからなる、抗腫瘍性細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）集団の増殖誘導および、溶菌
活性のための方法をも供給するものである。関連する態様において、本発明は、
哺乳類、例えばヒトにおいて、治療効果が現れる量のヒ） ＩＬ−４治療用組成
物を投与することからなる、抗腫瘍あるいは抗ウィルス細胞溶解性Ｔ細胞の増殖
の誘導、および活性化のための方法を供給する。
皿皿坐塾垂星址里
第１図は、天然の野性型ヒトＩＬ−４のヌクレオチド配列と対応するアミノ酸配
列を示している。
第２図は、ｈｌＬ−４ミユーテインＧｌｕＡ１ａＧｌｕＡｌａ−ｈＩＬ−４（Ａ
ｓｐ”。
ＡｓｐＩ ２９）をコードするＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示している。
第３図ないし第５図は、ｈｌＬ−４ミユーテインＧ１ｕＡ１ａＧｌｕＡｌａ−ｈ
ＩＬ−４（Ａｓｐ”、Ａｓｐ”９）の生産のための、酵母発現ベクターの構成を
模式的に描いている。
第６図は、初期混合リンパ球培養（ＭＬＣ）における、ＩＬ−４およびＩＬ−２
による細胞溶解性Ｔ細胞産生の増加率を示すグラフである。
第７図は、長期ＭＬＣにおける、ルー４およびＩＬ−２による細胞溶解活性の誘
導を示すグラフである。
主里坐■組星に里
ここに詳細に述べるように、天然のヒトＩＬ−４をコードするヌクレオチド配列
を含むｃＤＮＡが、ヒト抹消血Ｔ細胞から単離されたポリアデニル化されたＲＮ
Ａの、逆転写によって調製されたｃＤＮＡライブラリーから単離された。天然の
ヒト配列のＮ−末端およびＣ−末端に相同な配列を持つ合成オリゴヌクレオチド
ブローフカ、慣用のＤＮＡハイブリダイゼーション技術によって、ライブラリー
の検索に用いられた。そのプローブにハイブリダイズするプラスミドＤＮＡを含
むライブラリーからクローンが単離され、制限酵素分解、アガロースゲル電気泳
動および、電気泳動された断片を用いた更なるハイブリダイゼーション実験（「
サザン・プロット（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）」）によって分析された。
Ｎ−末端およびＣ−末端のオリゴヌクレオチドプローブの両者にハイブリダイズ
する単一のクローンを単離した後、ハイブリダイズした断片はｈｌＬ−４遺伝子
を担った、より小さな制限酵素断片を与えるために切断され、これは、次いでサ
ブクローニングされ、慣用の技術で配列決定がなされた。成熟型ｈｌＬ−４をコ
ードするｃＤＮＡは、次に選ばれた制限酵素によって消化され、予定されたコド
ンの変換をもたらすように、合成オリゴヌクレオチドを用いて再構成した。この
結果生じた変異体ｃＤＮＡ配列は、特定のプロモーターの調節下で、酵母の発現
ベクターに挿入された。このベクターは、適当な酵母発現株を形質転換するため
に用いられ、この株は、この酵母プロモーターの脱抑制を促進する条件下で培養
された。その結果生ずる酵母調整培養液上滑は、ｈｌＬ−４の生物活性を持つタ
ンパクを与え、これは以下に述べるように精製された。
定−且
「ヒトインターロイキン−４」およびｒｈｌＬ−４Ｊの語は、ヒトＢ細胞の成熟
および増殖を誘導可能な、ヒト内因性分泌タンパク質を意味し、これは、第１図
に示した配列の全体、あるいは重要な部分に実質的に相同なアミノ酸配列を含ん
でいる。この分子に対するその他の名称は、「Ｂ細胞刺激因子」および「Ｂ細胞
成長因子」を含んでいる。
ｒ ＤＮＡ配列」は、分離した断片状あるいは大きなりＮＡ構造の構成要素とし
てのＤＮＡポリマーを表わし、これは、少なくとも１回は実質的に純粋な形、す
なわち、同定、操作および標準的な生化学的手法、例えばクローニングベクター
を用いることにより、断片あるいはその構成要素であるヌクレオチド配列が回収
できる量あるいは濃度で単離されたＤＮＡ由来のものである。
「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを表わし
ている。「組換え体発現ベクター」は、（１）遺伝子発現において制御的役割を
持つ、例えばプロモーターあるいはエンハンサ−といった単数もしくは複数の遺
伝的要素、および（２）ｗａ ＲＮ Ａに転写され、タンパク質に翻訳される構
造あるいはコード配列、が集合したものからなる、転写単位を含むプラスミドを
表わしている。転写単位は、宿主細胞により翻訳されたタンパク質が、細胞外へ
分泌させることを可能とする先導配列を含むことが好ましい。「組換え体発現系
」は、発現ベクターと適当な宿主微生物の組合せを意味している。酵母の発現系
、特にサツカロミセス９セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅを用いた系が好ましい。
「変異アミノ酸配列」は、天然の配列から意図的に変異されたヌクレオチド配列
によってコードされたポリペプチドを示している。「変異タンパク質」あるいは
「ミューティン」は、変異アミノ酸配列を含んだタンパク質を意味する。「実質
的に相同な」とは、核酸配列とアミノ酸配列の双方に用いられるが、特定の問題
となる配列、例えば変異配列が対照配列と１つあるいは複数の置換、欠失または
付加によって異なっており、その総体的効果が対照配列と問題となる配列の間に
、不都合な機能上の相違を生じないものであることを意味する。本発明の目的で
は、８０％以上の相同性ならびに、等価な生物学的に特異的な活性を有する配列
が本発明の範囲内で実質的に相同な配列と考えられる。それ以下の相同性および
それに相当する生物活性を有する配列は等価であるとみなされる。「天然の配列
」とは、野性型あるいは天然の形の遺伝子あるいはタンパク質と同一なアミノ酸
または核酸配列を示すものである。「Ｎ−グリコジル化部位」は以下に定義され
ている。本発明を定義する際に用いられている「不活性化する」という言葉は、
オリゴ糖部分と共有結合を形成することの可能なアミノ酸を除くために、選ばれ
たＮ−グリコジル化部位を改変することを意味する。
旦上且」盈ユ皿定
ヒ） ＩＬ−４活性は、例えばヒト扁桃腺細胞懸濁液由来のヒトＢ細胞の培養に
おいて観察される。濃縮されたＢ細胞集団は、２−アミノエチル臭化イソチオウ
ロニウムー処理を施したヒツジ赤血球を用いてＴ細胞をロゼツトに調製し、それ
に続いて、Ｔ細胞ヲ除くために、フィコール−ヒストバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈ
ｉｓｔｏｐａｑｕｅ） （シグマ化学（ｓｈｉｇｍａ Ｃｈｅ＋ｗｉｃａｌ Ｃ
ｏｒｐ、） 、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用い、さらに、単球、顆粒
球、活性化されたＢ細胞を除（ためにセファデックスＧＩＯ濾過を用いることに
よって調製され得る。濃縮に続き、Ｂ細胞標品は、使用前に液体窒素中で凍結す
ることができる。
活性測定のためには、凍結したＢ細胞は解凍、洗浄され、１０％の牛胎児血清、
５ Ｘｌ０−’Ｍの２−メルカプトエタノール、適当に希釈した被験試料、１２
．５量ｇ／ｄの親和性クロマトグラフィーによって精製されたＦ（ａｂ’）ｚ断
片ヒツジ抗ヒトＩｇｌ’ｌを含むＲＰＭ１１６４０培地１００ｍ中培地１ニ０
培養は６８ − ７２時間保温する．この保温時間の最後の１６時間は、７５Ｃ
ｉ／ｍ５ｏｌｅの比活性の０．５μｃｉ ［”Ｈ］−チミジンを細胞に与える０
次に、培養は、ガラス繊維が紙上に集められ、放射性標識の取り込みをシンチレ
ーションの計数によって測定する。
ネズミＩＬ−４活性に対する類似の測定法に関する詳細は、ブルックス（Ｂｒｏ
ｏｋｓ）らによって総説された参考文献， Ｍｅｔｈｏｄｓｈ鉦Ｌ」川： ３７
２（１９８５） 、に見ることができる。
ｂＩＬ−４活性測定において、活性の単位は、最大のチミジン取り込み量の５０
％を誘導するｈｌＬ−４量に照らして算出される０例えば、１：２０の希釈をし
た１００ｍの試料が、最大量の１７２のチミジン取り込みを起こした場合、１単
位は１００ｕ１の１７２０即ち５１１１中に含まれる活性として定義される。し
たがって、この試料はｌｄ当り１０００を５で割った量あるいは２００単位（Ｕ
／ｄ）のｈｌＬ−４活性を含むだろう。
ｈＩＬ−４ ンバク のヌクレオチドな゛びにアミノ′″ｌｕ野性型のｈＩＬ−
４タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列並びに、推定される
アミノ酸配列は、第１図に示されている．第１図では、全長に当たる天然のポリ
ペプチドのＮ末端メチオニンに相当するＡＴＧコドンから始まり、ヌクレオチド
に番号がつけられている．同様に、アミノ酸もこのメチオニンから番号付けがな
されている．天然のタンパク質には、成熟した分泌されるタンパク質でのＮ末端
となるヒスチジン残基の前部に、２３あるいは２５個のアミノ酸からなる先導配
列が含まれている。ｈｌＬ−４とネズミにおける相同物との比較に基づき、旧ｓ
ｔ ３がＮ末端であると推定される．しかし、平行して行われた発現実験によ
れば、Ｎ末端アミノ酸残基として、旧ｓ２３およびＨｉｓ”を有するいずれのタ
ンパク質についても等価な生物学的活性が示されている。
第２図は、ｈｌＬ−４ミユーテインをコードする合成遺伝子のヌクレオチド並び
にアミノ酸配列、ＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａ−ｈＩＬ−４− （Ａｓｐ”。
４ｓｐｌ！？）を示し、これは、本発明の範囲内での好ましい態様を表わしてい
る。
１ ！びにミニーーインの
第１図のヌクレオチド配列の全であるいは一部を含む無数のＤＮＡ構成は、付加
的な有用な制限酵素切断部位を含むオリゴヌクレオチドカセットと結合して、便
宜上調製され得る。本発明は、天然のｈｌＬ−４配列に実質的に相同な、１つ以
上の意図的なアミノ酸置換、欠失あるいは挿入を含むが、活性に対して負に作用
しない、ある類似タンパク質あるいはミューティンに関連するものである。
変異は、天然の配列断片に連結できる制限酵素部位にはさまれた特定の座位に導
入することができる変異配列を含む合成オリゴヌクレオチドによって行なうこと
ができる．連結反応の後、生じた再構成配列は、目的のアミノ酸置換、あるいは
欠失を有するミューティンをコードしている．この手法は、第３図−第６図に図
示されている。
もう１つの方法として、目的とした置換、欠失、挿入にしたがい改変された特定
のコドンを有する改変された遺伝子を与えるために、オリゴヌクレオチドを用い
て特定する、部位特異的変異生起法が用いられ得る．バウアー（Ｂａｕｅｒ ）
ら、堕匣鉦ニア３（１９８５）、クライク（Ｃｒａ ｉ ｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｉ ｕｅｓ Ｊａｎｕａｒｙ １９８５＋１２−１９、スミス（Ｓｓ＋１ｔｈ
）ら、如」匹江」」注肥肛力１上Ｐｒ１ｎｃｉ ｌｅｓ ａｎ±Ｍｅｔｈｏｄｓ
（ブレナム出版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１））、および米国特許
第４．５１８，５８４号明細書は、これに適した技術を開示しており、それらの
技術もまた参照により本明細書の一部を形成している。
いずれの手法に対しても、従来のオリゴヌクレオチド合成技術、例えばスート（
Ｓｏｏｄ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ１ｄ Ｒｅｓ， ４ ： ２５５７（１９７７）
およびヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ）ら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ． ２８ ： ２４４９（
１９７８）によって開示されたトリエステル合成法が適している。
部位特異的変異生起を行なう場合、改変されるべき遺伝子に対応するセンスある
いはアンチセンス・ストランドＤＮＡのいずれかを含む単鎖ＤＮＡを与えるため
に、改変されるべき遺伝子がＭ１３単鎖ファージまたは他の適当なベクターにク
ローニングされる。このＤＮＡは、Ｍ１３のファージの断片にアニールし、切れ
目のある二重鎖を与え、これを次にオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダ
イズさせる。このプライマーは、改変されるべきコドンを挟んだ配列に相補的で
あるが、これは変更が行なわれるべき部位に新たなアミノ酸を特定するコドン（
あるいは、そのようなコドンに相補的なアンチセンスコドン）を含んでいる。も
し、欠失が望まれるなら、プライマーは、正しい読み枠を維持し、かつ欠失する
アミノ酸を決める特定のコドンを欠いたものを用いる。もし、挿入が望まれるな
ら、プライマーは、挿入されるアミノ酸を特定する新たなコドンを配列中の適切
な部位に含むだろう．Ｗ換されるコドン、欠失されるコドンまたは挿入されるコ
ドンは、オリゴヌクレオチドの中央あるいはほぼ中央に位置することが好ましい
。
用いられるオリゴヌクレオチドプライマーの大きさは、ギャップを埋めるために
用いるＤＮＡポリメラーゼのエクソヌクレアーゼ活性による変異への影響を避け
るため、充分な長さが必要であることも考慮して、５′および３′伸長部分を持
つ変異部位への、安定で特異的なハイブリダイゼーションを最適化する必要性に
よって決定される。そのため、本発明にしたがって用いられるオリゴヌクレオチ
ドは、ふつう約１５から約２５個の塩基を含むだろう。さらに大きいサイズのオ
リゴヌクレオチドは不必要である。
次に、オリゴヌクレオチドプライマーを、改変すべき遺伝子を含む単鎖テンプレ
ート領域を有する、ギャップの入った二重鎖にハイブリダイズさせる。そして、
このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼＩ （クレノー断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ））、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはその他の適当なりＮ
Ａポリメラーゼによる反応によって、テンプレートストランドに沿って伸長され
る。
その結果生じた二重ストランドＤＮＡは、次にＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ Ｄ
ＮＡリガーゼでの処理により、閉環状ＤＮＡに転換され、そしてそれにより生じ
たヘテロ二重鎖は、大腸菌ＪＭ１０５ （ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 、ガイセ
ルスパーク（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド、米国）のような、適
当な宿主株を形質転換するために用いられる。宿主によるヘテロ二重鎖の複製に
より、両ストラン下の子孫が供給される。この形質転換された細胞は、次にプラ
ークを与えるために寒天培養地上にまかれ、これは変異生起法に用いたものに相
当する標識されたオリゴヌクレオチドを用いてスクリーニングされる。鏡型スト
ランドの子孫ではなく、変異型ＤＮＡに対しプライマーのハイブリダイゼーショ
ンが優先的に起きるような条件が用いられる。変異型遺伝子を含むＤＮＡは、次
に単離され、適当な発現ベクターにつなぎ換えられ、このベクターは、宿主株を
形質転換するために用いられる。そして、この宿主株は、類似のタンパク質を供
給するために培養される。
本発明の基礎をなす、特定の変異作製戦略は以下に記載されている。
Ｎ−グ１コシル 亡の ゞ
多くの分泌タンパク質は、翻訳された後、しばしばＮ−グリコジル結合によって
アスパラギンの側鎖に連結したオリゴサツカライド単位という形で、共有結合し
た炭水化物を獲得する。
特定の分泌タンパク質に連結したオリゴサツカライドの構造および数はきわめて
多様であるため、単一の糖タンパク質に帰する場合でも見かけ上の分子質量が広
い範囲に分布することになる。ヒトＩＬ−４は、このタイプの分泌型糖タンパク
質である。組換え体系において糖タンパク質を発現させる試みは、この多様な炭
水化物部分に起因する不均一性によって複雑となるであろう０例えば、精製され
たヒトあるいはネズミの顆粒球−大食細胞・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）
といった、組換え体糖タンパク質混合物は、重量にしてＯから５０％の炭水化物
を含むことがある。ミャジマ（Ｍｉｙａｊｉｍａ）ら、ＥＩＩＢＯＪｏｕｒｎａ
ｌ ５ ： １１９３（１９８６）は、Ｎ−グリコジル化部位をＮ−グリコジル
化を妨げ、酵母における発現産物の不均一性を減少させるために変異を導入した
、組換え体ネズミＧＭ−Ｃ５Ｆの発現を報告した。
組換え体分泌型糖タンパク質における、結合した炭水化物量の多様性の存在は、
精製法を複雑化し、そのため収量を減少させる。それに加え、もしこの糖タンパ
ク質が治療用剤として用いられるなら、被投与者は酵母の炭水化物部分に対しア
レルギー反応を起こし、治療の中断がめられる可能性がある。これらの理由から
、炭水化物量を減らしてあり、生物学的に活性で、均質な免疫系調節糖タンパク
質類似体が治療で使用するためにめられている。
不活性化されたＮ−グリコジル化部位を有する、機能を持つヒトＩＬ−４の変異
類似体は、オリゴヌクレオチド合成およびライゲーションを行なうか、あるいは
、上に記載したように、部位特異的変異生起法によって生産することができる。
これらの類似体タンパク質は、酵母の発現系を用いて、高収量に、均質で、炭水
化物が少なくなった型で、生産され得る０本発明は、Ｎ−グリコジル化部位を不
活性化するように、少なくとも１つ以上のアミノ酸の置換、欠失あるいは挿入を
含んだ、ヒトＩＬ−４の類憤型に関連するものである。
真核生物タンパク質のＮ−グリコジル化部位は、３連アミノ酸Ａｓｎ−Ａ’−Ｚ
によって特徴付けられるが、ここで、ＡＩは任意のアミノ酸、Ｚはセリンあるい
はトレオニンを表わしている。この配列内で、アスパラギン（Ａｓｎ）は、炭水
化物が共有結合するための側鎖にあるアミノ基を提供している。このような部位
は、Ａｓｎあるいは残基Ｚと他のアミノ酸との置換、ＡｓｎあるいはＺの欠失、
またはＡ１とＺとの間へのＺ以外のアミノ酸の挿入、あるいはＡｓｎとＡ１０間
への、Ａｓｎ以外のアミノ酸の挿入などによって、除去することができる。置換
は、保存的に行なわれることが好ましく、言い替えるなら、置換するアミノ酸が
、置換されるべき残基に似た物理化学的な特徴を有したものであることが最も好
ましい。同様に、欠失あるいは挿入法が適用される際には、その欠失または挿入
による生物学的活性に及ぼす影響が考慮されるべきである。
したがって、本発明による類似体ｈｌＬ−４は、ｈＩＬ−４の天然の配列に実質
的に相同な変異体アミノ酸配列を有し、この場合、天然の配列の中の少なくとも
１カ所のＡｓｎ−Ａ’−Ｚが、変異体配列中で、Ａｓｎ−Ａ２−ＹあるいはＸ−
Ａ”−Ａ３によって置き換えられているタンパク質であるが、ここで、
ＡＩ、ＡｍおよびＡ３は同一か、異なる任意のアミノ酸、ＸはＡｓｎ以外の任意
のアミノ酸、
ＹはＺ以外の任意のアミノ酸、そして
ＺはＳｅｔあるいはＴｈｒ
を表わしている。天然の配列中の全てのＡｓｎ−Ａ’−Ｚが、変異体配列中で、
Ａｓｎ−Ａ”−ＹあるいはＸ−Ａ”−Ａ３に置き換えられていることが好ましい
。
ここで、第１図に示されたｈｌＬ−４の配列について見てみると、天然のタンパ
ク質は、２カ所の推定されるＮ−グリコジル化部位を含んでおり、はじめの部位
は、第６２残基から始まる３連のＡｓｎＴｈｒＴｈｒであり、第２のものは、第
１２９残基から始まるＡｓｎＧ１ｎ５ｅｒである事がわかるだろう、 Ａｓｎに
対する適当に保存された置換アミノ酸には、Ａｓｐ、Ｇ１ｒ＋＋Ｇ１ｕ、Ａｌａ
、Ｇｌｙ、ＳｅｔおよびＴｈｒが含まれているが、このうち、Ａｓｐ、Ｇｌｎな
らびにＧｌｕが好ましい、ＺがＳｅｔの場合、適当な置換基は、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ
、 Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、ＧｌｕまたはＡｓｎであり、このうちＮ
ｅｔ、Ｌｅｕ、ｌｉｅならびにＶａｌが好ましい。ＺがＴｈｒの場合、保存的な
置換基は、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、ＧｌｙおよびＡｌａであり、Ｖａ
ｌ、Ｇｌｕ、八ｓｐあるいはＧｉｎが好ましい０本発明の状況から、ｈＩＬ−４
のＮ−グリコジル化部位を不活性化するために好ましい置換は、Ｔｈｒ”に対し
てはνａｌｓ Ａｓｎ”に対してはＡｓｐおよびＡｓｎＩ２９に対してはＡｓｐ
の置換である。
その他の保存的なアミノ酸の置換も、Ｎ−グリコジル化部位を欠いたタンパク質
を与えるために行なうことができる。こうした置換を含んだミューティンは、こ
こで特に開示され、請求されているものと同等であると考えられる。これらの位
置での置換効果の順による等縁付から、以下の第１表が与えられる。
１ ： ｈＩＬ−４アミノ １
最も好ましいもの Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ ＭｅｔＡｓｐ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ
シス−イン の −五多ｙｕ記
【換
本発明は、分子間の架橋形成あるいは正しくない分子内ジスフィト結合の形成を
避けるために、生物活性に必須でないシスティン残基を欠失させ、あるいは他の
アミノ酸と置換した、ｈｌＬ−４のミューティンについても考えを及ぼしている
。天然のｈｌＬ−４配列は、２７．４８．７０．８９．１２２および１５１番目
の位置に、６個のシスティン残基を含んでいる（第１図参照）、最初の５個のシ
スティンは、ネズミの類似物中に対応するものがあるが、一方、最後のシスティ
ンはそれに当たるものがない、したがって、最後の残基は置換あるいは欠失のた
めに妥当な候補である。
部位特異的変異生起法あるいはオリゴヌクレオチド置換法が、特定のシスティン
残基を欠失させ、あるいは保存的置換を与えるために用いることができる。置換
を行なうために好ましいアミノ酸は、Ｇｌｙ、 Ａ ｌａ、 Ｖａｌ 、 Ｌｅ
ｕ、 Ｉ ｌｅ、 Ｔｙｒ＋ Ｐｈｅ、 Ｈｉｓ、 Ｔｒｐ、 Ｓｅｒ＋ Ｔｈ
ｒあるいはＭｅｔなどの中性アミノ酸である。前記のうち、ＳｅｒおよびＴｈｒ
が好ましいものである。
ＫＥＸ２ブローアーゼ苦刃−１の ２
Ａｒｇ−Ａｒｇ、 Ａｒｇ−ＬｙｓあるいはＬｙｓ−Ａｒｇの対のような、隣接
する塩基性残基対が存在しないように改変するよう残基を欠失、付加あるいは置
換させることにより、ＫＥχ２プロテアーゼによるプロセッシングを受ける部位
を不活性化するために、適当な変異生起法を用いることができる。特にＬｙｓ−
Ｌｙｓ対は、ＫＥＸ２による切断をかなり受けにくく、Ａｒｇ−Ｌｙｓあるいは
Ｌｙｓ−ＡｒｇからＬｙｓ−Ｌｙｓへの転換は、ＫＥＸ２部位を不活性化するた
めの保存的な手法を代表するものである。この結果生ずるミューティンは、分泌
の際に切断が予定されるα−因子の先導配列以外の部位でのＫＥＸ２プロテアー
ゼによる切断を受けにくくなる。
第１図を見てみると、Ｌｙｓ−Ａｒｇ対がｈｌＬ−４の天然の配列の第１２３番
の位置に存在している。ＬｙｓＩｔ３あるいはＡｒｇＩｚ４をＡｒｇ以外のアミ
ノ酸に置換することにより、Ａｒｇ−Ａｒｇ、 Ａｒｇ−ＬｙｓあるいはＬｙｓ
−ＡｒｇのＫＥＸ２プロセッシング部位を内部に含まない、変異ｈｌＬ−４が与
えられる。マウスＩＬ−４配列との比較から、Ｌｙｓ１２３の欠失は保存的な変
異生起法であり、したがって、それが好ましいことを示唆している。他の方法と
して、Ａｒｇ＋２４をＬｙｓと置換することもできる。
ＫＥＸ２プｏ−ア−１，ａ ＋（７）１旌本発明のＩＬ−４タンパク質のために
好ましい発現系は、酵母宿主による組換え体タンパク質の分泌を誘導する酵母の
α−因子の先導配列をも用いている。理想的には、この系は、酵母のＫＥＸ２プ
ロテアーゼが請求められるタンパク質のＮ−末端から、分泌に際してα−因子先
導配列を切断するように構成されている。野性型のＮ−末端の旧Ｓ残基に直ちに
隣接したＬｙｓ−ＡｒｇＫＥＸ２プロテアーゼ部位を持つα−因子先導配列−ｈ
ｌＬ−４タンパク質の構成は、組換え体酵母による分泌の際に、必ずしも切断さ
れるわけではない、 ｈＩＬ−４のＬｙｓ−Ａｒｇ ＫＥＸ２認識部位とＮ−末
端の間に、４個のペプチド配列Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａが挿入されると
、ＫＥＸ２部位においてより効果的な切断が行なわれる。この結果生ずる産物は
、Ｎ−末端に４個のペプチドＧｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａを持ったｈｌＬ−
４タンパク質である。おそらく、酵母の５ＴＥ１３遺伝子産物、すなわちＮ−末
端のＧｌｕ−Ａｌａ対を切断するジペプチジル・アミノペプチターゼＡを過剰生
産することができる酵母株を使えば、ｉｎ ｖｉｖｏでこれらの残基を除くこと
ができるだろう。
しかし、Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ配列がＮ−末端に存在することによっ
て、野性型タンパク質と比べて、この類似体の生物活性に有意な差を与えないこ
とが観察されている。
え 二にお番る ンパク の
前述のように、酵母は類似体および天然型の組換え体ヒ）ＩＬ−４の発現のため
に好ましいものである。典型的な発現ベクターは、大腸菌内での選択と複製のた
めのｐＢＲ３２２由来のＤＮＡ配列（Ａｐ’遺伝子及び複製開始点）と、グルコ
ースにより抑制されるアルコールデヒドロゲナーゼ
酵母ＤＮＡ配列を含むｐＢｃ１０４（ＡＴＣＣ ６７、２３２）である。へＤＨ
２プロモーターは、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５８ ： ２６７４（１９８２）およびバイアー（Ｂｅｉｅｒ）ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３００ ： ７２４（１９８２）によって記載されている， ｐＢｃ１
０４プラスミドはまた、選択マーカーとしてＴｒｐｌ遺伝子および複製の２μ開
始点を含んでいる。プロモーターの隣りにはα−因子先導配列が存在し、酵母宿
主がらの異種蛋白質の分泌を可能とする．α−因子先導配列は、この配列の外来
の遺伝子への融合を容易にするために、その３′末端付近にＡｓｐ” ”％ Ｉ
）制限酵素切断部位を含むように修飾されている。ｐＢｃ１０４は、野性型ｈ
ＩＬ−４をコードするｃＤＮＡ挿入断片をも含む。このプラスミドの構築に関す
る詳細は、以下に与えられている。
他に用いることのできる発現ベクターは、α−因子プロモーターを含む酵母ノヘ
クター、例えばｐＹ ａ ｆＨｕＧＭ（ＡＴＣＣ ５３． １５７） ７：あり
、これは野性型のヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を担っている。そのほかのベクターは
、当業者に知られたものである。ｐＹαｆＨｕＧＭの構築は、すでに公開されて
いる欧州特許出願のＢＰ−Ａ−１８３， ３５０号明細書に記載されている。
形質転換のための、適当な酵母株の選択法は、選択マーカーの性質や、ベクター
のその他の性質によって決定されるだろう。
ｐＢｃ１０４あるいはｐｙαｆＨｕＧＭおよびそれらのベクター由来の、種々の
構築物による形質転換に適したＳ．セレビシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｊａｅ）株
は、イースト・ジエネティック・ストック・センター（ＹｅａｓｔＧｅｎｅｔｉ
ｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ） 、バークレイ、カリフォルニア州、米国［以
下参照］から入手可能であり、−色」工１−ｖ↓１ ａｄｅｌ ｈｉｓ２垣ＩＶ
士１９−などを含んでいる。特に好ましい発現株であるχν２１８１は、イース
ト・ジエネティック・ストック・センター、生物物理・医学物理学部、カリフォ
ルニア大学、バークレイ、カリフォルニア州９４７０２、米国、から入手できる
χ２１８１−ＩＢと、遺伝学部、ワシントン大学、シアトル、ワシントン州９８
１０５、米国、あるいはイミュネックス株式会社（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ） ％ ５１ユニバーシテイ・ストリート、シアトル、ワシントン州
９８１０１、米国、より入手できるＸＶ６１７−１−３Ｂという２種の１倍体株
を掛は合わせて作製した２倍体である。適当な形質転換法は、ヒンネン（Ｈｉｎ
ｎｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７５ ： １９２
９（１９７Ｂ）により記載されたものであり、０．６７％酵母窒素源ベース、０
．５％カザアミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｌｄアニデンおよび２０μｇ
／−ウラシルからなる選択培地上で、Ｔｒｐ”の形質転換を選択するものである
。
ｐＢｃ１０４あるいはＡＩＩＨ２またはα−因子プロモーターを含むその他の構
築物を含む宿主株は、発現のために８０μｇ／Ｉｎ１アデニンと８０μｇ／ｄウ
ラシルを補った、１％酵母抽出物、２％ポリペプトン１．１％グルコースから成
る、冨栄養培地中で成育させる。
ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制は、培地中のグルコースを除去することより行な
う。
ｒｈｌＬ−４ンバク の 制
酵母株の発酵により生ずる組換え体ヒトＩＬ−４タンパク質は、アーダル（Ｕｒ
ｄａｌ）ら、Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏ 、 ２９６ ： １７Ｈ１９８４）および
グラブシュタイン（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ）ら、ムｈＬ厘虹ユ６３ ： １４０５
（１９８６）により記載された方法と類似の方法により、一段階あるいは逐次的
な調製用ＨＰＬＣカラムを用いた逆相ＨＰＬＣステップにより精製され得る。
例えば、ｈｌＬ−４を含む酵母の調整培地は、０．４５μのフィルターにより濾
過され、はじめに、Ｓ−セファロース等の陽イオン交換担体によるバッチ吸着お
よび溶出により精製される。バッチ吸着／溶出ステップからプールしておいた画
分は、次に、１゜−２０μの逆相シリカ（バイダック（Ｖｙｄａｃ） 、ザ・セ
パレーション・グループ（Ｔｈｅ ５ｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ）、ヘス
ベリア、カリフォルニア州、米国）を充填した５ｃ１ｏＸ３０ｃｍＯカラムに、
１００ｄ／ｗｉｎの流速で注入される。このカラムは、酵母調整培地を通す前に
、０．１％トリフルオロ酢酸水溶液により平衡させ、次に、カラムに培地を流入
した後、溶出液の２８０ｎ＋＊における光学吸収が基線値に近づくまでこの溶媒
で洗浄する。このとき、アセトニトリル中において、流速１００ｄ／ｍｉｎで、
毎分１−２％の変化速度で、０から６０−１００％の溶媒Ｂより導かれる０、１
％トリフルオロ酢酸の勾配を用いてもよい、勾配を開始した後、適当な時間（１
０−２０分）で、微量の両分を採り、この両分の一部がポリアクリルアミドゲル
電気泳動および蛍光（フルオレスカミン）タンパク質測定法によってタンパク質
含量について分析される。
必要な場合は、さらにＨＰＬＣあるいは陽イオン交換クロマトグラフィーを用い
ることもある。
１里性
ｈｌＬ−４タンパク質は、免疫不全症あるいは腫瘍性状況の処置のための、有望
な治療薬である。そうした療法において、生理的に受容できる担体、あるいは希
釈物と組み合わせたｈｌＬ−４タンパク質を含む精製された組成物の形をとった
ｈｌＬ−４タンパク質は、Ｂ細胞およびＴ細胞の増殖を誘導するために効果的な
投与量で、非経口注入、皮下注射あるいはその他の適切な方法によって投与され
る。ＩＬ−４療法のための適切な投与量は、動物実験により示されたように、−
日、体重１ｋｇ当り０．１から１１００ｐである。もう１つの方法としては、特
定の免疫細胞クラスを単離し、ｈｌＬ−４タンパク質の存在下でｉｎ ｖｉｔｒ
ｏにおいて増殖させ１、追加量のｈｌＬ−４とともに腫瘍を退行させるために再
投与するような、養子免疫療法といった形で用いることができる。 ｈｌＬ−４
タンパク質は、ヒトインターロイキン−２とともに用いることもできる。
これらのガン治療法は、精製されたネズミＩＬ−４が、初代混合白血球培養中で
、細胞溶解性Ｔ白血球の生成を促進し、同種異系の細胞由来の抗原にあらかじめ
さらされた混合リンパ球集団中で細胞溶解活性を誘導するという観察によって示
唆されている。
細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、細胞毒性あるいはエフェクターＴ細胞とし
ても知られており、受容体を有し、抗原特異的なリンパ球である。同種異系反応
性ＣＴＬは、細胞溶解性細胞を刺激あるいは誘導するために用いられる同種異系
細胞の抗原と同じである、主要組織適合遺伝子（Ｍ）Ｉｃ）抗原を有する標的細
胞を溶解する。ウィルスあるいは腫瘍に特異的なＣＴＬは、抗原の認識において
「制限」されており、つまりその場合、抗原を有する標的細胞は、ＣＴＬそれ自
身と同じＭＢＣ抗原を有していなければならないのである。ＣＴＬは、ウィルス
関連膜抗原を発現している細胞を殺すことにより、ウィルスの複製を制御してお
り、また、ある腫瘍性細胞型の免疫系による監視と破壊にも間接的に関連してい
る。
ＣＴＬの生成は、最も箇潔には混合白血球培養（ＭＬＣ）において研究されてお
り、ここでは、遺伝的に異なる（同種異系の）個体由来リンパ球がＴ細胞の増殖
を誘導するために、ともに培養されている。こうしたＴ細胞は、外来のＭＨＣ抗
原に特異的であり（１つの個体の細胞上に存在し、他の個体にはない抗原）、そ
れゆえ同種異系反応性Ｔ細胞と呼ばれている。ＣＴＬの活性化と分化には、ＣＴ
Ｌ前駆細胞、Ｔ「ヘルパー」細胞および単球／大食細胞系列の補助細胞の参加が
必要とされる。 ＣＴＬ応答は、特定のＴ細胞集団による抗原の認識によって開
始され、適当な抗原にさられれることがひきがねとなって、ＣＴＬ前駆体でのリ
ンホカイン受容体の発現および、ヘルパーＴ細胞によるリンホカインの分泌が開
始される。ＣＴＬ前駆体によるリンホカインの結合は、抗原によって活性化され
たＣＴＬ前駆体の増殖と、おそらく細胞溶解性状態への分化を誘導する。しがし
、ＣＴＬ前駆体は、その細胞溶解状態に達するために必ずしも増殖する必要はな
く、殺傷能力は、見かけ１分化した機能である。
Ｔ細胞が担っている溶解サイクルは、生きたエフェクター細胞と適当な抗原決定
基を有する標的細胞との、細胞−細胞接触によって開始する。明かな抗原による
活性化を必要とせずに、広範な標的細胞に対し細胞溶解活性を示すナチュラルキ
ラー（ＮＸ）細胞とは異なり、ＣＴＬは区別可能な特異性により溶解を行なう、
エフェクターおよび標的細胞の接触および接着に続き、いわゆる「リーサル・ヒ
ツト（ｌｅｔｈａｌ ｂｉｔ）Ｊがなされ、それにより標的の膜透過性が破壊さ
れる。これにより、浸透圧の増大と最終的な細胞質の損失を招く。このエフェク
ター細胞は、さらに他の標的細胞を認識、溶解する能力を保っている。
ＣＴＬの増殖と分化は、可溶性の増殖ホルモンにより制御されており、その中で
、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は最も重要なものであると考えられている
。今回、ＩＬ−４も、機能的に活性なＣＴＬの生成に深く関係していることが示
された。特に、ＩＬ−４は、初代の混合白血球培養（ＭＬＣ）においてＣＴＬの
生成に対する強力なヘルパー因子として働き、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されたＭ
ＬＣ記憶集団において、溶解活性を誘導する。精製された組換え体ＩＬ−４およ
びルー２を直接比較することにより、初代ＭＬＣにおけるＣＴＬの生成の増大に
対しては、ＩＬ−２よりもＩＬ−４の方がより強力であることが示された。この
２つのリンホカインはＩＬ−２ではＩＬ−４とは異なって、明かな抗原刺激がな
くても、あらかじめ誘導を受けていない培養中で溶解性集団の増大を招く点が相
違する。ＩＬ−４によってｔ！：；導される細胞溶解の特異性は、重要な治療上
の手法をもたらす可能性があり、もし、非特異的なリンホカイン−活性化キラー
（ＬＡＫ ）細胞の導入（例えばＩＬ−２ＬＡＫ療法）による副作用が減少すれ
ば、養子（アトブチイブ）免疫療法の効果は促進されるであろう。
関連した観察において、組換え体ＩＬ−４は、分裂促進剤によって活性化された
Ｔ細胞、胸腺細胞、記憶Ｔ細胞、およびＣＴＬを含む様々な機能的サブタイプの
同種異型反応性のＴ細胞クローンの増殖を効果的に誘導することが示されている
。ＩＬ−４はＬｙｔ２＋表面抗原を有する分裂促進剤活性化ネズミ牌臓細胞の増
殖誘導に関し、ＩＬ−２と同等の刺激効果があることが示されている。
したがって、ＩＬ−４はＴ細胞の増殖および機能の重要な制御因子であることは
明かである。
以下の議論は、本発明の特定の態様に関する更なる説明を与えることを意図した
ものである。以下に記載される実験において、ＤＮＡの制限酵素消化、ゲル電気
泳動によるＤＮＡ断片の精製、ＤＮＡ断片のライゲーション、大腸菌（ＲＲＩ株
が一貫して用いられた）への形質転換、および制限酵素による消化による構築物
の分析および確認といった、標準的な分子生物学的技術は、マニアティス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリー−マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ） （コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９Ｂ２）によって記載
された方法にしたがった。
！−刑ｈＩＬ−４コード るｃＤＮＡの −一ζ工」１母Ｕ、いた・ 刑 ンバ
ク の
合成オリゴヌクレオチドは、ヒトＩＬ−４ＯＮおよびＣ−末端コード領域配列に
相補的となるように構築された。Ｎ−末端プローブは、配列５’−ＣＡＧＴＴＧ
ＧＧＡＧＧＴＧＡＧＡＣＣＣＡＴ−３’を有し、一方Ｃ−末端フローブは、配列
５’−ＴＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＡＡＴＡ−３’を有している。合成
法は、スートら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 ４ ： ２５５？（
１９７７）およびヒロセら、Ｔｅｔ、Ｌｅｔｔ、 ２８ ： ２４４９（１９７
８）によって開示された方法と実質的に同じ、標準的な自動化されたトリエステ
ル法である０合成の後、オリゴヌクレオチドは、脱保護され、セファデックス（
Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０クロマトグラフイーと、それに続く調製用ゲル電気
泳動により精製される。このオリゴヌクレオチドは、スクリーニング用のプロー
ブとして用いるために、マニアティスら、モレキュラー・クローニングニア・ラ
ボラトリ−・マニュアル（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−，１
９８２）に開示されたような標準的技術により、”Ｐ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌ
クレオチド・キナーゼを用いて！！ｐにより末端、を放射性標識される。
フィトヘムアグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ） （ＰＩ（
Ａ）および、フォルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ｐｈｏｒｂｏｌ １
２−ｎｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ） （ＴＭＡ）により刺激を受け
た、ヒト抹消血Ｔリンパ球（ＰＢＴ）から抽出した全ａｉＲＮＡから単離した、
ポリアデニル化されたｍＲＮＡの逆転写によって、ｃＤＮＡライブラリーが構築
された。このｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩと７４ＤＮＡポリメラーゼを用
いて２本鎖にされ、ｃＤＮＡ中のＥｃｏＲＩ切断部位を、引続き行なうＥｃｏＲ
１切断から保護するためにＥｃｏＲＩメチラーゼでメチル化を施し、ＥｃｏＲＩ
リンカ−とライゲーションし、ｃＤＮＡの両端にあるリンカ−を１コピーを残し
てすべて除去するためにＥｃｏＲＩで消去し、バクテリオファージλｇｔｌｏ−
Ｚ旦ｃｏＲＩで切断してから脱リン酸化して作られたアームにライゲージジンす
る（ヒユーイン（Ｈｕｙｎｈ）ら、ＤＮＡクローニングニア・プラクティカル・
アプローチ（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｐｒａｃｔｃａｌ Ａｐｐｒｏａ
ｃｈ）、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）ｆｊ、ＩＲＬ出版ｐｐ４９−７８） 、ラ
イゲーションしたＤＮＡは、ファージ粒子にパッケージングされ、２．５Ｘ１０
’の組換え体からなるライブラリーが作製される。５Ｘ１０Ｓの組換え体が大腸
菌株Ｃ６００ｈｆｌ−上にまかれ、放射性標識した上記オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いて、標準的なプラーク・ハイブリダイゼーション法によってスクリー
ニングされる。３個のハイブリダイゼーションに陽性を示すクローンがＰＢＴラ
イブラリーから単離された。これらのクローンはプラーク法で精製され、バクテ
リオファージＤＮＡを調製するために用いられ、ＥｃｏＲＩで消化された。この
消化物をアガロースゲルで電気泳動し、ナイロン・フィルターにプロットし、上
記２種のオリゴヌクレオチドプローブに対する断片のハイブリダイゼーションを
再検定した。１つのクローンは両方のプローブにハイブリダイゼーション陽性を
示す断片を含んでいた。その内部にＥｃｏＲＩ切断部位を含むこのＤＮＡ断片は
、ＥｃｏＲＩによる部分的消化に続き、調製用アガロースゲル電気泳動によって
単離され、次に唯一のＥｃｏＲＩ部位、Ｂａａｉ ＨＩ部位および多数のその他
の唯一の制限酵素切断部位をもつポリリンカーを含む、標準的なりローニングベ
クターｐＢＲ３２２（ｐＧｅｍｂ ｌ ）のＥｃｏＲｌ切断物へサブクローニン
グされた。その結果生じたプラスミドは、ｐＧｅ＋＋＋ｂｌ ： ｈＴＬ−４と
なづけた。ｐＧｅ＋＋＋ｂｌと実質的に同じである典型的なベクターの例は、デ
ンテ（Ｄｅｎ ｔｅ ）ら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １
１ ： １６４５（１９８３）によって記述されている。
適当な大腸菌宿主株を形質転換した後、プラスミドＤＮＡを標準的な方法によっ
て精製し、ＥｃｏＲＶとハ飢Ｉによって切断した。
生じた断片をハｉ１８およびＢａｍＨＩ−切断を施したｐＢＣ（Ｃ５Ｆ−１）お
よび、ＫＥＸ２α−因子プロセッシング部位と旧ｓｔｓアミノ酸末端を有するｈ
ｌＬ−４の初めの４アミノ酸を与える下記のリンカ−断片にライゲーションした
。
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ ＡｓｐＫＥχ２プ
ロテアーゼは、Ａｒｇ残基の直後でペプチドを切断する。
この構築物は、ｐＢＣ１０４と呼ばれた。
ｐＢｃ１０３も実質的に同様にして、ｈｌＬ−４の影、吐■−回ｌ断片、と１１
８およびβ可Ｉ切断を施したｐＢＣ（ＣＳＦ−１＞と、ＭＨＸ２切断部位の直後
で、かつ旧ｓｚｓの前に位置する付加的な旧５−Ｇｌｙをコードする、次に示し
たオリゴヌクレオチド断片とのライゲーションにより調製された。
この結果生ずる発現ベクターは、ｐＢｃ１０３およびｐＢｃ１０４と呼ばれ、大
腸菌内で増幅され、すでに述べた方法により、酵母株ＸＶ２１８１を形質転換す
るために用いられた。形質転換された酵母は、ＡＩ））１２プロモーターの脱抑
制が促進される条件の下、栄養培地中で培養され、そこで生ずる調整培地につい
て、ヒツジ抗−ヒトＩｇＭ Ａ（ａｂ）ｚ断片を共活性化因子として用いたｈＩ
Ｌ−４の活性測定を行なった。この活性測定により、ｐＢｃ１０４−形質転換Ｘ
Ｖ２１８１によって調整された培地に対して４３．４２７０／ｄの培地活性が示
され、ｐＢｃ１０３・−形質転換Ｘν２】８１により調整された培地に対して４
６．１４９Ｕ／ａｉｌの培地活性が示された。
突差３Ｉｉ」止（淵１Ｊλ二」まｊ１力
【殊曵透築天然のｈｌＬ−４タンパク質
に存在する、２カ所のアスパラギン−結合グリコジル化部位（Ａｓｎ６２および
Ａｓｎ１２９）は、この位置のコドンをアスパラギン酸をコードするコドンを代
えることにより除かれた。これにより、酵母細胞により分泌されたタンパク質の
Ｎ−結合グリコシル化あるいは過グリコジル化でさえも妨げられ、それにより、
より均質な産物の生産が可能となる。前述のｈｌＬ−４のｅＤＮＡ （ｐＢｃ１
０４）のＮ−グリコジル化部位は、ｃＤＮＡの一部を以下に述べるような目的の
ヌクレオチドの変更を含む合成オリゴヌクレオチドにより置換することにより不
活性化された。
第１図に示された野性型ｈｌＬ−４のｃＤＮＡの配列を含むクローニングベクタ
ー（ｐＧｅｍｂ Ｉ ： ｈｌＬ−４）は、成熟ｈＩＬ−４の１２番目のヌクレ
オチド以降を切断する制限酵素ＥｃｏＲＶと、ベクターのポリリンカー領域内の
ｈＩＬ−４のｃＤＮＡから下流を切断するＢａ＋ａ Ｈ１によって切断された。
約５５０塩基対のｈｌＬ−４ｃＤＮＡ断片が、ｐＢＲ３２２由来のベクターｐＰ
Ｌ−３に、このベクターをＥｃｏＲＶとＢａｍ ＨＩにより消化することにより
サブクローニングされた（第３図参照）。
これにより生じたプラスミドはＬ２２５と名付けられた。
ｈＩＬ−４ｃＤＮＡを含むＬ２２５由来のＩＩＮＡ断片は、次にプラスミドＬ２
２５をＣｌａ Ｉで消化しくｈｌＬ−４ｃＤＮＡの５’ ） 、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼで処理して平滑末端にし、ｃＤＮＡを含んでいる断片を除去するために
ム旦１で消化する（ポリリンカー領域内のｈｌＬ−４ｃＤＮＡに対し３′側で）
ことによりｐＢＲ３２２由来のベクターｐＧＥＭ−３（プロメガ・バイオチック
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ）、マディソン、ウィスコンシン州、米国）に
サブクローニングされた。ベクターｐＧＥＭ−３はＨｉｎｄｎｌで消化し、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、次にＳｓｔ Ｉで消化した。生
じたプラスミドはＬ２５７と名付けられた。このプラスミドは、下記のオリゴヌ
クレオチド置換変異生起法を行なうために用いられた。アミノ酸残基あるいはヌ
クレオチドの番号付けに関する全ての記載は、第１図の番号付けにしたがってお
り、残基およびヌクレオチドは、推定上の天然のシグナルペプチドを含む全長の
翻訳産物のＮ−末端から数えられている。
６２番の位置にあるアスパラギンをコードするコドンは、以下のようにしてアス
パラギン酸をコードするコドンに変更された。
プラスミドＬ２５７は、ヌクレオチド１５２で切断するＨｉｎｃ ＩＩおよびヌ
クレオチド２１１で切断するＰｓｔ Ｉで消化された。ここで生じたベクター断
片は、単離され、下記のオリゴヌクレオチドＡにライゲーションされた。
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ。
上記の、下線を施したヌクレオチドは、野性型ｃＤＮＡ配列からの変更部分を示
している。ヌクレオチド１８４でのＡ／ＴからＧ／Ｃへの変更だけで、１つのア
ミノ酸の変更（Ａｓｎ”からＡＳｐ６２）を特定するコドンを生ずる。その他の
５塩基の変更は、アミノ酸配列を改変しないが、改変された配列の同定を容易に
するための制限酵素切断部位（ハ旦■およびＮｈｅ Ｉ ）を導入する。
同様に、１２９番の位置のアスパラギンをコードするコドンは、下記の合成オリ
ゴヌクレオチドＢを用いて、ｈＩＬ−４ｃＤＮＡ中のＥｃｏＲ１部位（ヌクレオ
チド３６０）からＲｓａ １部位（ヌクレオチド３９３）のＤＮＡ断片を置換す
ることによってアスパラギン酸をコードするコドンに変更した。
下線を施したヌクレオチドは、野性型ｃ Ｄ Ｎ’Ａ配列がらの変更部分を示し
ている。ヌクレオチド３８５でのＡ／ＴからＧ／Ｃへの変更だけで、１つのアミ
ノ酸の変更（Ａｓｎ１２９からＡｓｎ１２９）を特定するコドンを生ずる。その
他の塩基の変更は、アミノ酸配列を改変することな（、Ｓａｌ １制限酵素部位
を導入する。プラスミドＬ２５７から由来した、両方のコドン改変を担うプラス
ミドはｐＢＣ１３２と名付けられた。
ミューティンのための酵母発現ベクターを調製するために、ｈＩＬ−４（八５ｐ
６ｚ、 Ａｓｐ＋ ２９ ）をコードするＤＮＡ断片を以下に示すように操作す
ることにより、ＥｃｏＲＶおよび５ｓｔｌで消化してｐＢｃ１３２ベクターから
除かれ、酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０に挿入された。
ｐＩＸＹ１２０は、その異種の挿入物を除いては、ｐＢｃ１０４と実質的に同一
である。後に述べるように、ｐＢＣ１０４も、本発明のミューティンの発現のた
めに、ｐｌＸＹ１２０の代わりに用いることができる。
酵母発現ベクターｐＩＸＹ１２０（第４図）は、下記由来のＤＮＡ配列を含んで
いる。
１、大腸菌ベクターｐＢＲ３２２由来で、複製開始点と大腸面内での選択に用い
るアンピシリン耐性マーカーを含む、鋤Ｉ （ヌクレオチド５６２）からＥｃｏ
Ｒｌ （ヌクレオチド４３６１ ）に至る長い制限断片。
２、 酵母Ｓ、セレビシェ由来のＤＮＡ断片。このＤＮＡ断片は、酵母内での選
択マーカーとしてのＴＲＰ−１遺伝子、酵母の２−複製開始点、Ｓ、セレビシェ
のＭＤＩ（２プロモーター、および分泌ペプチドであるα−因子（ブレイク（Ｂ
ｒａｋｅ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ８１ ： ４６４２（１９８４）、クジャン（Ｋｕｒｊａｎ）とハース
コビッツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉ ｔｚ）、Ｃｅ１ｌ ３０ ： ９３３（１９８２
、および米国特許第４．５４６．０８２号明細書を参照）をコードする遺伝子由
来の８５アミノ酸のシグナルペプチドを含んでいる。 ハ姐１８制限酵素部位は
、異種の遺伝子への融合を促進するために、α−因子シグナルペプチド内のヌク
レオチド２３７に導入された。ヌクレオチド２４１のＴ残基はオリゴヌクレオチ
ド−標的ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異生起法によってＣ残基に変更された。
３、 マルチプル・クローニングサイトを含む合成オリゴヌクレオチド、これは
α−因子シグナルベブチドの３′末端付近の匣１８部位（アミノ酸７９）から、
２μ配列：に含まれる４徂１部位に挿入された。
４、複製開始点および遺伝子開領域を含む単鎖バクテリオファージｆ１から由来
した５１４塩基対のＤＮＡ断片。この断片は、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ配列のＮｒｕ
１部位に挿入された。ｆｌの複製開始部位が存在するために、適当な（雄型）
大腸菌株に形質転換し、さらにバクテリオファージｆ１により多感染を受けたと
き、ベクターの単鎖コピーが生成される。これにより、ベクターのＤＮＡ配列決
定が促進され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異生起法を行うことが可能となる。
酵母の発現ベクターであるｐｌＸＹ１２０は、制限酵素ハ姐１８により消化され
、これは、α−因子先導ベブチドの３′末端付近（ヌクレオチド２３７）を切断
し、またＢａｍＨＩによる消化を行なってポリリンカー内で切断した。この大き
なベクター断片を精製し、第４図に示されるような、以下の２種のＤＮＡ１片に
ライゲーションした。
１、 プラスミドＧｅｍｂｌ ： ｈｌＬ−４から得られる、ム吐Ｖ部位（成熟
型ｈｌＬ−４のヌクレオチド１３６）からＢａｍＨ１部位（Ｇｅｍｂｌ ： ｈ
ｌＬ−４ポリリンカー中のｈｌＬ−４ｃＤＮＡに対し３′側）のｈｌＬ−４ｃＤ
ＮＡ断片。
２、 以下の合成オリゴヌクレオチドリンカー１゜これはα−因子先導ペプチド
の３′末端を更生し、これをｈＩＬ−４の５′の４アミノ酸に、読み枠に合うよ
うに融合するものである。このオリゴヌクレオチドは、また、ｈｌＬ−４のＮ−
末端に融合した８アミノ酸の同定ペプチドをもコードしている。ｈｌＬ−４タン
パク質にこの配列を融合することにより、特異的な抗体を用いて検出が可能とな
り、最初にｈＩＬ−４の発現と精製を監視するために用いｐｌＸＹ１１８（第５
図）と呼ばれるこのプラスミドは、グルコースによって抑制されるＡＤＨ２プロ
モーターの制御下にある野性型ｈｌＬ−４遺伝子を含んでいる。α−因子先導ベ
ブチドがあるために、酵母細胞からのｈｌＬ−４の分泌が可能となる。α−因子
先導配列の、タンパク質加水分解的なプロセッシングは、α−因子先導配列のＬ
ｙｓ−Ａｒｇ残基（アミノ酸８３と８４）の後ろで起きる。
Ｎ−結合グリコシル化を受けるコンセンサスな部位を除くｂｌＬ−４遺伝子を含
む酵母発現ベクターを作製するために、プラスミドｐＩＸＹ１１８をＥｃｏＲｌ
（コれはＡＤＨ２プロモーターの５′側を切断する）および５ｓｔｌ（これは
ｈＩＬ−４遺伝子の３′側を切断する）によって消化した（第５図）。この大き
なベクター断片を精製し、以下のＤＮＡ断片にライゲーションされた。
１、ＡＤＨ２プロモーター、α−因子先導配列およびｈｌＬ−４の初めの４アミ
ノ酸を担うｐｌＸＹ１１８由来のＥｃｏＲｌからＥｃｏＲＶまでのＤＮＡ断片（
これは、この断片内に影」Ｉ部位が存在するため、必要とされた）、
２、 プラスミドｐＢｃ１３２中に含まれる、ＥｃｏＲＶ部位（成熟型ｈｌＬ−
４のヌクレオチド１３から）から５ｓｔ１部位（ｈｌＬ−４ｃＤＮＡの３′側）
までのｈｌＬ−４ｃＤＮＡ挿入断片。
ここで生じたプラスミドをｐｌＸＹ１３３とした。これは、Ａｓｐ６２とＡｓｐ
１２９のコドン変更および、Ｎ−末端における８アミノ酸からなる融合ペプチド
をもつｈＩＬ−４遺伝子を酵母発現ベクター中に含んでいる。
最終的な酵母発現プラスミドは、α−因子先導配列に対してｈｌＬ−４ｃＤＮＡ
を融合するために用いるオリゴヌクレオチドリンカー配列を除けば、プラスミド
ｐＩＸＹ１３３と同一である（オリゴヌクレオチド２、第６図）。この酵母発現
プラスミドは、以下の説明および第６図に示されたようにして構築された。
酵母発現ベクターｐｌＸＹ１２０は、上述のようにして制限酵素匣１８およびＢ
ａｇ ＨＩで切断された。この大きなベクター断片は、次のＤＮＡ断片とライゲ
ーションされた。（１）プラスミドｐｘｘｙ１３３由来の、ＥｃｏＲＶ（ヌクレ
オチド１３の位置）からＢａｎ ＨＩ部位（ｈｌＬ−４ｃＤＮＡの３′側）のｈ
ｌＬ−４（Ａｓｐ” Ａｓｐ”’）ｃＤＮＡ、（２）α−因子先導ベブチドの３
′末端を匣１８（アミノ酸Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−
Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）部位から再生し、これをｈｌＬ−４のＮ−末端の４ア
ミノ酸に読み枠を合わせてＥｃｏＲＶ部位で融合させた合成オリゴヌクレオチド
（オリゴヌクレオチド２、第６図）。このオリゴヌクレオチドの配列は、以下に
示されている。
これにより生ずるプラスミドは、ｐｌＸＹ１５７と名付けられた（第６図）。こ
のベクターは酵母内に存在すると、非グリコジル化変異ｈｌＬ−４のグルコース
により制御された発現および分泌が可能となる。回収されるｈｌＬ−４は、酵母
のプロテアーゼであるジペプチジル−アミノ−ペプチダーゼＡ （ｄｉｐｅｐｔ
ｉｄｙｌ−ａｍｉｎｏ−ｐａｐｔｉｄａｓｅ Ａ ）によってプロセッシングを
受けないため、Ｎ−末端に４アミノ酸Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａを含んで
いる。α−因子先導配列の大部分はＫＥＸ２遺伝子産物によって、Ｌｙｓ−Ａｒ
ｇ残基（先導配列のアミノ酸８３および８４）の後ろで、タンパク質加水分解的
に除去される。
前述のやや冗長な経路は、ｐＢＣ１０４からＥＣ０ＲＶ ＢＪυ）（ＩのＩＬ−
４ｃＤＮＡを含む断片を切り出し、この断片を消化し、上述したように、アスパ
ラギン−結合型グリコジル化部位を改変するために合成オリゴヌクレオチドを用
いてＥｃｏＲＶ −５ｓｔ Ｉ断片とじて再構成することにより、短縮できる。
ｐＢｃ１０４はｐＩＸＹ１１８について上述したように、ＥｃｏＲＩとＳｓｔ
ＩおよびＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで切断し、再構成した変異ＩＬ−４のＥｃｏ
ＲＶ −５ｓｔ Ｉ断片とライゲーションされ得るベクター断片のに吐Ｉ−鎖ｔ
ｌおよび匡吐１−ＥｃｏＲＶを生ずることができる０次にこの構築物を、ハ１１
８とＢａｇ ＨＩで切断し、これにより得られるベクター断片を、（１）ＩＬ−
４類似遺伝子を含む同じプラスミド由来のＥｃｏＲＶ−Ｂａｓ＋ＨＩ断片、およ
び、（２）ｐｌＸＹ１５７と同一のＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａ−ｈｌＬ−４−（
Ａｓｐ”。
Ａｓｐｌ！？）に対する酵母発現ベクターを生成するために、上述の合成オリゴ
ヌクレオチド２にライゲーションすることができる。
４： の および ンパク の １
ｈｌＬ−４類似タンパク質ＧｌｕＡｌａＧ１ｕＡ１ａ−ｈＩＬ−４−（Ａｓｐｈ
ｚ、 Ａｓｐ’ ” ）をコードする発現プラスミドを含む酵母は、４℃で保存
したＹＮＢ−ｔｒｐ寒天寒天上地上持された。新たな寒天プレートは、−週間毎
に凍結したグリセロール保存（−７０℃）から用意された。
前培養は、１リツトルのＹＮＢ−ｔｒｐ培地（６，７ｇ／ ｆ酵母窒素源、５
ｇ／ ｌカザアミノ酸、４０ｗｇ／ｌアデニン、１６０＋ａｇ／ｊ！ウラシル、
および２００ｍｇ／ｆチロシン）にいくつかの単離された形質転換体酵母コロニ
ーを接種し、３０℃で激しく振盪しながら、２本の２リツトルフラスコで一夜培
養した。翌朝までに、培養は静止期に入り、００６００が２から７となり、飽和
した。
２本の１０リツトル容量のファーメンタ−を浄化し、滅菌した後、その許容量の
８０％まで、１２１５０ ＹＥＰ培地（１２ｇ／ｆｆｉ酵母抽出物、５０ｇ／
ｉ！ペプトン）で満たし、３０°Ｃで、５００ ６００ｒｐｍの攪拌、１０−１
２ＬＰＭの通気条件に維持した。接種材料を加えた。２時間成育させた後、５０
％のグルコース栄養素を、１０−１２時間の間に５０ｇ／ Ｑとなるような速度
で添加し始めた。次に、栄養源を５０％エタノールへと移行させ、６時間で全体
として１０ｄ／／２となるように添加した。
発酵の総経過時間は、約２０時間であった。最終的な光学密度（６００ｎｍ ）
は３０から４５の範囲であった。ファーメンタ−を２０″Ｃに冷やし、集菌法を
開始した。まず、５Ｍ ＮａＯＨを添加してｐＨを８．０に調整した。ファーメ
ンタ−を内容物を清浄な大型ガラス瓶に集めた。次にこの酵母ビール（ｂｅｅｒ
）を、０．４５μフイルターカセツトを用いたミリボア・ペリコン・フィルター
システム（Ｍｉｌｌｉｐｏａｒｅ Ｐｅ１ｌｉｃｏｎ ｆｉｌｔｅｒ ｓｙｓｔ
ｅｍ）で濾過し、滅菌した１０２の大型ガラス瓶に集めた。
濾過された酵母上清中のＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａ−ｈｌＬ−４−（Ａｓｐｂｔ
、 Ａｓｐ’ ”）ミューティン（ＩＬ−４ミユーテイン）は、Ｓ−セファロー
スゲルによルハッチ吸着、５０＋ｅＭ Ｂ −７ラニンｐＨ４，０および５０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳｐＨ７，４による洗浄、０．５Ｍ ＮａＣ１および５０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ ｐＨ７，４による溶出、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、
ＭＯＮＯ−Ｓカラムによるクロマトグラフィー、および１００ｍＭ ）リスに対
する透析により精製された。
第一段階において、酵母ビール中に含まれるＩＬ−４ミニ−ティンは、バッチ吸
着法によりＳ−セファロースゲルに結合した。
典型的な操作では、４００ｄのセファロースのゲルスラリー（ｓｌｕｒｒｙ）
（１容量のゲル：１容量の０．５Ｍβ−アラニンｐＨ４，０）を１０ｆの酵母ビ
ールに加えた。この溶液のｐＨを２ＮのＨ（Ｊを添加することによりｐＨ３，６
に調整した。次に、この溶液を１０分間攪拌し、３０分間ゲルを沈澱させる。こ
の上清を焼結ガラスじょうごを通してデカントし、組換え体ｈｌＬ−４ミューテ
ィンを含んだゲルスラリーがじょうごに残った。
このゲルを、５００−の５０１１Ｍβ−アラニンｐＨ４，０で洗浄し、次に１２
の５０ｍＭ ＨＥＰＢＳ ｐＨ７゜４で２回洗浄した０次に、ＩＬ−４ミユーテ
インは、２００ｄの０．５Ｍ ＮａＣｊ！、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７，４
溶液を用いて５回洗浄してゲルから溶出された。最も高濃度のＩＬ−４ミユーテ
インを含んだＳ−セファロース溶出液１から３をプールし、が過滅菌し、）ＩＰ
Ｌｃにかけるまで４℃で保存しておいた。１０％以下のＩＬ−４ミユーテインを
含む４回、５回の溶出液は、別にとり、・濾過滅菌し、４°Ｃで保存した。粗酵
母ビール、非結合画分、３回の洗浄液、１−３回および４−５回の保存されてい
る溶出液からそれぞれ得た試料について、免疫ドツトプロットおよび５ＤＡ−Ｐ
ＡＧＥによりＩＬ−４の存在を調べた。プールした溶出液中のタンパク質濃度は
、ＢＣＡアッセイにより決定された。Ｓ−セファロース画分は、１００ｉ！、の
酵母ビールが処理されるまで集められた。
この時点で、（上述のように）１−３回の洗浄による全ての溶出液をプールした
ものを、０．１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ） ／発熱物質除去水で平衡化し
たウォーターズ（讐ａｔｅｒｓ）ＬＣ−５００ＨＰＬＣを用いて、１５−２０μ
のＣ−４逆相シリカを充填した５Ｃ１１Ｘ３０Ｃ１１のカラムにかけた。Ｃ−４
カラムは、１！の０．１％ＴＦＡ／発熱物質除去水溶液で洗浄した０Ｍｉ換え体
ｈｌＬ−４を含んだ画分をカラムにかけ、毎分２％の変化速度、毎分１００−の
流速で、０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液の勾配によって溶出した。
Ｃ〜Ｊ ＲＰＣカラムからのピーク画分を保存し、１／１０量の０．５Ｍβ−ア
ラニンｐＨ４を添加した。試料を採り、プールしたものを２０ＩｄのＭＯＮＯ−
Ｓカラム（１，６ｅｍ Ｘ ｌ０ＣＩ１１． ファルマシア）に、７ｄ／分の流
速でかけた。試料を注入した後、カラムを１００ａｌ！の５０ａ＋ＭトリスｐＨ
７，４で洗浄し、ＩＬ−４ミユーテインは、ＩＭ ＮａＣ１，１００ｗ＋Ｍトリ
スｐＨ８の直線勾配で溶出した０次に、ＩＬ−４のピーク画分を保存し、１００
ｍＭ ）リスｐＨ８に、４°Ｃで一夜透析し、濾過滅菌した。生産および精製が
完了すると、高い活性を持つ産物全体が滅菌したポリエチレン管中に４℃で保存
された。精製されたｈｌＬ−４（Ａｓｐ”、Ａｓｐ””）の比活性は、ＢＣＧＦ
活性測定法によると、１■あたり３．１±１０７単位であった。
実施１土屓−合亘血且羞遣（虞］、ｉ渭 ０”２ の６ＩＬ−４は、通常はＩＬ
−２あるいは骨髄細胞増殖因子であるＩＬ−３に反応する、ある種の因子−依存
性、非Ｂ−細胞系列の増殖を刺激することが示されている。グラブシュタインら
、Ｊ、ＥｘＬ伽Ｌ１６３ ： １４０５（１９８６）およびリーら、カ１ｃ、Ｎ
ａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８３： ２０６１ （１９８６）を参照の
こと。ＩＬ−４が初期Ｔ細胞集団、特に機能的に活性なＴ細胞の生成に関しても
影響を与えることを示すために、混合白血球培養（Ｍｌ、Ｃ）中でのＣＴＬの生
成に関する効果を調査した。ＭＬＣは副最適濃度のＣ５７ＢＬ／６牌臓応答細胞
および、同種異型で、照射を受けたＤＢＡ／ ２肺臓刺激細胞を用いて確立され
た。培養開始５日後５ＩＣｒ二標識Ｐ８１５ネズミ（ＤＢＡ／２起源）腫瘍標的
細胞に対する溶解活性が測定された。
ネズミＩＬ−４ｃＤＮＡは、リーら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＬＩＳＡ ８３ ：２０６１ （１９８６）によって記載されているｃＤＮＡ配
列を用いて、フォルボールミリスチン酸酢酸によって刺激を受けたＥＬ４胸腺腫
瘍細胞からの、サイズによって分別したｍＲＮＡから作製したライブラリーから
クローニングした。全長のｃＤＮＡは、ＰＢＲ３２２配列、トリプトファン選択
のための酵母のＴＲＰＩ遺伝子、酵母の２μ複製開始点および酵母のアルコール
・デヒドロゲナーゼ２ （ＡＤＨ２）プロモーター、ならびに合成と分泌を指示
するために充分なα−因子先導配列を含む酵母発現ベクターにサブクローニング
された。
発現プラスミドは、酵母株７９ （ｃｒ、 ｔｒ且ユ、 １ｅｕ２−２）に形質
転換し、Ｔｒｐ”形質転換体を選択した。精製のために、１リツトルの富栄養培
地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、１％グルコース）に接種することにより培
養を行ない、３０°Ｃで静止期になるまで成育させた。ＰＭＳＦおよびペプスタ
チンＡを集菌の際に添加した。細胞は、遠心および０．４５−の酢酸セルロース
フィルターで汐過して除いた。ｒｌＬ−４は、アーダルら１．し旦＋ｒｏ＋す１
邦−２９６： １７Ｈ１９８４）によって既に記載されている溶媒系を用いた、
高速液体クロマトグラフィー（）ＩＰＬｃ）を５サイクル行なって酵母上清から
均質にまで精製された。均質な組換え体および天然のネズミＩＬ−４は、以下に
記載のＢ細胞増殖アッセイ法で測定したところ、２．ＯＸ １０５Ｕ／μｇの同
様な比活性を示した。
５×１０ｓのＣ５７ＢＬ／６ネズミ牌臓細胞および、５Ｘ１０’のガンマ線照射
（２，５０Ｏｒ）を受けたＤＢＡ／２ネズミ牌性の刺激された細胞を混合したＭ
ＬＣは、２−の培養液を含む直径１６ｍｍの培養ウェル中で開始された。培養液
は、５％の牛胎児血清（ＦＢＳ）、５Ｘ１０’含むダルベツコの改変イーグル培
地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）
であり、これは、実質的に、セロティーニ（Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ）ら、Ｊ、Ｅｘ
、Ｍｅｄ、１４０ ： ７０３（１９７４）によって開示されたものと同じで
ある。培養物には、初め、２ｎｇ／−の均質な天然のネズミＩＬ−４（ｎＩＬ−
４） 、Ｌｏｎｇ／ｄの組換え体ヒトＩＬ−２あるいは培地を添加した。培養開
始後５日に、９６穴ウエルのＶ−底マイクロタイタープレート中で、エフェクタ
ー細胞とＳ ＋ Ｃｒ標１Ｐ８１５標的細胞（２Ｘ１０’細胞／ウエル）との比
を種々変えて、２００１Ｊｌ容、二連で保温することによって、溶解活性を試験
した。３．５時間保温した後、プレートを遠心し、各々のウェルから上清１５０
Ａｔ！を採取し、ガンマカウンターで計数した。得られた結果は、第６図に示さ
れている。第６図では、報告されているパーセント比５ＩＣｒ遊離は、１００Ｘ
［ｃｐｍ（実験的） −ｃｐ−（自発的） ］ ／ ［ｃｐ−（最大値） −
ｃｐｓ （自発的）］で決められるが、ここで、自発的な遊離（１１８ｃｐｍ）
は培地中でＰ８１５を保温することにより、そして最大遊離（８０１ｃｐ＋＋＋
）は、ＩＮＨＣＪ中でＰ８１５を保温することにより決定された。１溶解単位（
Ｌｔｌ）は、２Ｘ１０’のＰ８１５標的細胞を５０％溶解させるために必要とさ
れる細胞数として定義され、用量−反応曲線から決定される。パーセント回収率
は、培養された反応細胞の初期数に対するパーセンテージとしての５日目に回収
される細胞数に等しい。
初めに２ｎｇ／−の均質な、天然のＩＬ−４を添加した培養が、外来のＩＬ−４
が存在しない対照培養に比べ細胞を基準として５０−倍高い細胞溶解活性を示し
、培養物当りでは、さらに１０〇−倍の活性を示した。１０ｎｇ／ｉｍのｒｌＬ
−２を補った培養は、対照培養に比べ高いＣＴＬ活性を示したが、溶解活性は、
ＩＬ−４を補った培養中で現れるものよりも７分の１低いものだった。応答性細
胞と同系の標的細胞に対する溶解活性は、特異的な同種異系の標的に対するもの
の２％以下である（データは示していない）ため、ＩＬ−４あるいはＩＬ−２を
補ったＭＬＣ中で生じる細胞溶解性１９２３球は、同種異系抗原に特異的だった
。このデータは、ＩＬ−４が同種異系の細胞溶解性１９２３球の生成に対する強
力なヘルパー因子であることを示している。
６：ｔ Ｔ ・にお番る Ｌ症肢五性坐誘盪ある期間を越えて培養されたＭＬＣ
集団は、徐々にＣＴＬ活性を失って行くが、同種異系の細胞あるいは培養上清に
さらすことにより、高いレベルの細胞溶解活性を再び誘導することができる。
このようなＭＬＣ記憶集団に対するＩＬ−４の効果を調べるために、１４日目の
Ｃ５７ＢＬ／ ６抗−ＤＢＡ／ ２初代ＭＬＣから得られた細胞を、組換え体Ｉ
Ｌ−２あるいはＩＬ−４存在下で培養し、３日後に細胞溶解活性を測定した。
混合白血球培養は、２５ｄのフラスコ中、２０ｍの総容量で、２５Ｘ １０’Ｃ
５７ＢＬ／ ６牌臓細胞および２５ Ｘ １０’の照射（２５０Ｏｒ ）を受け
たＤＢＡ／ ２牌性の刺激を受けた細胞で構成された。開始後１４日で、初代培
養から細胞が採取され、５Ｘ１０’の細胞を、ｌｎｇ／Ｉｎ１の組換え体ネズミ
ＩＬ−４，０，５ｎｇ／ｄの組換え体ヒトＩＬ−２あるいは培地を含んだ２ｄ容
量のコースタ−（Ｃｏｓｔａｒ） １６ｍｍ培養ウェル中で再培養した。３日後
、培養物は、！＋（ｒ標識Ｐ８１５標的細胞に対し溶解活性を試験した。この実
験における自発的遊離は、２０４ｃｐ＋ｍであったが、最大遊離は１ 、８２９
ｃｐｍであった。
第７図に示されるように、いずれかのリンホカインに細胞をさらすことにより、
細胞増殖と、高レベルの細胞溶解活性の誘導が起こる。ＩＬ−４とともに保温さ
れた培養中で生ずる溶解活性は、培地中で保温された対照培養中で観察されるも
のに比べて１００倍高く （第７図）、外来のリンホカインにさらす前の１４日
目の集団の活性よりも８０倍高かった（データは示していない）。
これらの培養中にＩＬ−４で誘発されたＣＴＬ活性は、初代ＭＬＣの場合と同様
に抗原特異的であった（データは示していない）。したがって、ルー４は、ルー
２と同様に、一度活性化されてから休止している記憶Ｔ細胞集団中に、それ以上
の抗原刺激を必要とする事なく抗原特異的な細胞溶解活性の発現を誘導する。
１７：ＩＬ−４とＩＬ−２の − ・、の へＣＴＬ産生の増加能における組換
え体ＩＬ−４およびＩＬ−２の相対的効果を直接検定するために、種々の濃度の
、均質な組換え体ＩＬ−４あるいはＩＬ−２を同種異型の初代混合白血球培養に
加え、それにより生ずる溶解活性を５日後に測定した。
この実験において、混合白血球培ｔ （ＭＬＣ）は、２Ｘ１０”のＣ５７ＢＬ／
６牌臓細胞および、５Ｘ１０’の照射（２，５０Ｏｒ）を受けたＤＢＡ／２
（同種異系）あるいはＣ５７ＢＬ／６ （同系）のネズミ牌性細胞からなり、種
々の量の組換え体ＩＬ−４あるいはＩＬ−２が添加された。５ｌＣｒ標識Ｐ８１
５に対する溶解活性は、上述のように、５日後に測定された。自発的遊離は平均
すると１２５ｃｐＩ１１であったが、最大遊離８８６ｃｐｍが観察された。
双方のリンホカインが細胞増殖およびＣＴＬ活性を増大させるが、最適量のＩＬ
−４を含む培養中で現れる溶解活性のレベルは、最低量のＩＬ−２を加えた培養
中で観察されたものよりも３−４倍高かった。さらに、副最適量のリンホカイン
用量においては、同程度の溶解活性を得るのに必要なＩＬ−４はＩＬ−２の約１
７１ｏであった。これらのデータは、同種異系株の組み合わせからなる混合白血
球培養中では、ＩＬ−４は刺激されていない前駆体からのＣＴＬの生成に関して
はＩＬ−２よりも強力なヘルパーであることを示している。 ＩＬ−２あるいは
ＩＬ−４を補った同種異系の肚Ｃでは、はぼ同数の細胞が回収されるため、この
データは、ＣＴＬが高頻度で存在するか、あるいは個々のＣＴＬがより大きな溶
解活性を持つことを反映しているであろう。
培 地 ５５ ４ ２１ ＜１
上記および実施例６および７に示したデータは、ＩＬ−４が初代および記憶ＭＬ
Ｃ集団において増殖と細胞溶解活性の両方を誘導することを示し、ＣＴＬの生成
に関する新らたな制御メカニズムを明らかにしている。
８： ２ のチ１
胸腺細胞は、６−１０週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊメスマウスから得られ、５％ＦＢ
Ｓ、上述の培養補充物を含み、また、以下の第３表に示されているように、０．
２５％ＰＨＡ−Ｍ（ギブコ研究所、グランド・アイランド、ニューヨーク州）が
存在・非存在し、組換え体ヒトＩＬ−２あるいはネズミルー４が存在する２００
Ｉ！！（７）ＲＰｆｌｌ １６４０中で、１．５ Ｘ １０’細胞／ウエルで培
養された。培養は、２．０ ｇ Ｃｉの［３Ｈ］チミジン（７５Ｃｉ／ｍ５ｏｌ
ｅ）で、７２時間ノ１ｌｌＪｌｒｅｌ中ｃｖｆ＆後ノ１８時間の間パルス標識さ
れ、ガラス繊維フィルター上に集菌され、取り込まれた放射性標識が測定された
。
ｒＩＬ−２およびｒｌＬ−４は、１０ｎｇ／ｄで用いられた。結果は、以下の第
３表に、二連の培養の平均ｃｐｓ（士標準偏差）として表わされている。
３：ｒＩＬ−４による の 。
これらの結果は、ＩＬ−４が、共分裂促進刺激の有無に関わらす胸腺細胞の増殖
を誘発することを示している。加えられた分裂促進剤の存在下で、増殖は有意に
（７×）促進された。
９ ： ＩＬ−４による發 Ｔ 】 の１゛記憶Ｔ細胞を、１４日口の初代ＭＬ
Ｃ中で生成させた。初代！１ＬＣは、２５ｃ１ｉＩノフラスコ中、２０ｍ（７）
培養液中で、２５Ｘ１０’ Ｃ５７ＢＬ／６牌臓細胞および２５ Ｘ １０ｈの
照射（２５００ｒ ）を受けたＤＢＡ／ ２牌性の刺激を受けた細胞で構成され
た。培養液は、５％の牛胎児血清、５Ｘ１０−’Ｍの２−メルカプトエタノール
、およびさらに添加アミノ酸を含むダルベツコの改変イーグル培地であり、これ
は、実質的には、セロティ一二ら１．し士視」短九−１刊： ７０３（１９７４
）によって開示されたものと同じである。二代目ＭＬＣのために、１３日口の初
代ＭＬＣから回収された５Ｘ１０’細胞を、２−の培養液を含んだ１６１１ＩＩ
１１の培養ウェル中で、５Ｘ１０’の照射（２５０Ｏｒ ）を受けたＤＢＡ／
２牌臓細胞とともに培養した。次に、これらの細胞を、２００Ｉｌ！／ウエルの
培養液と指示された添加物とを含む９６ウエルの平底のプレート中で、１０’の
細胞／ウェルで保温することによる同種異系細胞による再刺激を受ける前あるい
は３日後に、ｒｌＬ−４（４ｎｇ／ｄ）あるいはｒｌＬ−２（４ｎｇ／ｄ）に反
応した増殖に関する試験に供した。培養は、１．０ ｐ Ｃｉの［３Ｈ］チミジ
ン（７５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、ニューイングランド・ヌクレアー（Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）、ボストン、マサチューセッツ州）で、７２時間の
培養期間中の最後の１８時間の間パルス標識され、ガラス繊維フィルター上に集
菌された。放射性標識の取り込みは、液体シンチレーション分光測定により決定
された。結果は、二連の培養に関する平均ｃｐｓとして（士標準偏差）、下記の
第４表に示されている。
第４表
およびゝ 能の昔 Ｔ のｒＩＬ−４に・ る・欠上述の結果は、ＩＬ−４とＩ
Ｌ−２の間の増殖誘発効果の相違を示している。ＩＬ−４とは異なり、ＩＬ−２
は抗原刺激がなくても培養周期の後期にある細胞の増殖を誘発することができる
。しかし、同種異系抗原によって再び刺激されると、記憶細胞は、ＩＬ−２より
もＩＬ−４の添加に対して、明らかにより強い応答を示す。
浄書（内容に変更なし）
八ＴＧ ＧＧＴ ＣＴＣＡＣＣＴＣ（Ｃ入Ａ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＣＣＣＣＴ
ＣＴＧ ＴＴＣＴＴＣＣＴＧ ＣＴＡ ４５Ｍｅｌ−Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｔ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐ【ｏ Ｐｒｏ Ｌａｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ １ｓＴＴＡ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＴＣＡＴＣＡＡＡ ＡＣＴ
ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＧＣＣＴＣＡＣＡ ＧＡＧ ＣＡＣ入ＡＧ １３５Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｇｌｕ ｌｉｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｉｎ ＬＹＩＩ ４５八ＣＴ ＣＴＧ ＴＧＣＡｃ
ｅ ＧＡＧ ＴＴＧ ＡＣＣＧＴＡ ＡＣＡ ＧＡＣＡＴＣＴＴＴ ＧＣＴ Ｇ
ＣＣＴＣＣ１８０Ｔｈｒ Ｌｅｕ ＣＹＳ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ ６０ＧＧ
Ｔ ＧＣＧ ＡＣＴ ＧＣＡ ＣＭ； ＣＡＧ ＴＴＣＣＡＣＡＧＧ ＣＡＣＡ
ＡＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＡＴＣＣＧ入 ３１５Ｇｌｙ 入１ａ Ｔｈｒ 八ｌａ
Ｇｉｎ Ｇｉｎ Ｔｈｅ Ｈｌｓ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｇｉｎ Ｌｅｕ
Ｉｌｅ Ａｒｇ １０５第 ２ 凹
ＧｌｕＡｌｏＧＩＬＮａ −ｈＴＬ−４（Ａｓｐ ６２．ＡＳｐ１２タンの［Ｆ
Ｉ第 ４ 凹
第 Ｓ 凹
Ｖ７６ 図
０舅 た ９２ ＜１．５
補正書の翻訳文提出書
（特許法第１８４条の８）
平成 元年 ６月ｔｙｔＷ留
特許庁長官 吉 １）文 毅 殿
１、特許出願の表示
ｐｅｒ／Ｕｓ８７１０３１１４
２、発明の名称
ヒト・インターロイキン−４ミューティン３、特許出願人
住 所 アメリカ合衆国ワシントン用９８１０１． シアトル。
ユニバーシティ・ストリート ５１．イミュネツクス・ビルディング
名 称 イミュネツクス・コーポレーション４、代理人
住 所 東京都千代田区大手町二丁目？番１号新大手町ビル ２０６区
５、補正書の提出日
： ン゛ の −
１、抗腫瘍細胞溶解性Ｔリンパ球集団中で、増殖および溶解活性を誘発すること
ができ、ｈＩＬ−４の野性型アミノ酸配列に実質的に相同な変異アミノ酸配列を
持ち、野性型配列中の少なくとも１カ所のＡｓｎ−Ａ’−Ｚが、Ａｓｎ、−Ａ″
ｌ−ＹあるいはＸ−Ａ”−Ａ”の変異配列に置換されており、ここで、
ＡＩ、ＡＸおよびＡ３は、任意の同一あるいは異なるアミノ酸であり、
Ｘは、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸であり、Ｙは、Ｚ以外の任意のアミノ酸であ
り、Ｚは、Ｓｅｒあるいは丁ｈｒである；
インターロイキン−４（ｈｌＬ−４） 類似タンパク譬。
２、請求の範囲第１項記載のｈＩＬ−４類似タンパク質であるｈｌＬ−４（Ａｓ
ｐ”、八５ｐ１２９） 。
３、請求の範囲第２項記載のｈｌＬ−４類似タンパク質であるＧｌｕＡｌａＧｌ
ｕＡｌａ−ｈｌＬ−４（Ａｓｐ”、ＡｓｐＩ２９）。
４、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載のｈＩＬ−４類似タン
パク質をコードするＤＮＡ配列。
５、請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列を含む組換え体発現ベクター。
６、発現を促進する条件下で、請求の範囲第５項記載の組換え体発現ベクターに
よって形質転換した微生物を培養することを含む、ｈｌＬ−４１似タンパク質の
製造方法。
７、生理学的に受容可能な担体あるいは希釈物とともにＩＬ−４あるいは請求の
範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載の生物学的に有効な量の類似体Ｉ
Ｌ−４を含む、抗腫瘍性細胞溶解性Ｔリンパ集団の増殖および溶解活性を誘発す
る薬剤組成物。
８、生理学的に受容可能な担体あるいは希釈物とともに、生物学的に有効な量の
ＩＬ−４あるいは請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか１項に記載のＩＬ−
４類似体を含む組成物をＴ細胞に接触させることを含む、細胞溶解性Ｔリンパ球
集団の増殖と該集団における溶解活性を誘導する方法。
９、 リンパ球が、あらかじめウィルス関連抗原へ露出することによって活性化
される、請求の範囲第８項記載の方法。
１０、リンパ球が、あらかじめ腫瘍抗原へ暴露されることによりて活性化される
、請求の範囲第８項記載の方法。
１１、リンパ球をｅｘ ｖｉｖｏで誘発および増殖させ、養子免疫療法において
患者に再投与する、請求の範囲第１０項記載の方法。
１２、＠乳類に対して、治療学的に有効な量のＩＬ−４あるいは請求の範囲第１
項ないし第３項のいずれか１項に記載した類似ｈｌＬ−４を投与することを含む
、抗腫瘍あるいは抗ウィルス細胞溶解性Ｔリンパ球の増殖および活性化を誘導す
る方法。
１３、生物学的に有効な量のＩＬ−４あるいは請求の範囲第１項ないし第３項の
いずれか１項に記載した類似ｈＩＬ−４および生理学的に受容可能な担体または
希釈物からなる抗ウイルス剤組成物。
１４、生物学的に有効な量のＩＬ−４あるいは請求の範囲第１項ないし第３項の
いずれか１項に記載した類似ｈｌＬ−４および生理学的に受容可能な担体または
希釈物からなる抗腫瘍剤組成物。
１５、付加的に、ＩＬ−４あるいはＩＬ−２の存在の下、ｅｘ ｖｉｖｏで増大
された治療学的に有効な量のＴリンパ球を含む、請求の範囲第１４項記載の抗腫
瘍剤組成物。
手続補正書（方式）
１、事件の表示
ＰＣＴ／ＵＳ８７１０３１１４
２、発明の名称
ヒト−インターロイキン−４ミユーテイン３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
住所
名 称 イミュネックス・コーポレーション４、代理人
住、所 東京都千代田区大手町二丁目２呑１号新大手町ビル ２０６区
国際調査報失
１°″″ａｂｅ＋ｗｌ Ａ″１ｓｌ−ｅａｂｅｅ Ｈ＠、 ｐ（７／Ｕ３９７／
Ｑ３１１４