JPH02501860A - 触媒的抗体を用いる化学センサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に化学センサーに関し、更に詳しく言えば、抗原に可逆的に結合し うるか、または１種以上の反応体から１種以上の生成物への反応を触媒しうる、 あるいはその両方が可能な触媒的抗体を取り入れた化学センサーに関する。

本特許願は、米国特許願連続第６７４，２５３号明細書（１９８４年１１月２７ 日出願）と一部継続し、後者は現在委付された米国特許願連続第５５６，０１６ 号明細書（１９８３年１１月２９日出願）と一部継続し、これら特許願明細書の 内容は参考として本明細書中に取り入れている。

本明細書中には幾つかの刊行物をカッコ内のアラビア数字により引用している。

これら引用文献は本明細書の末尾に全部掲げである。本発明が関係している分野 の状況を一層詳しく記述するために、また本発明そのものを一層詳しく説明する ために、これら刊行物の開示を本明細書中に参考として取り入れている。

従来の技術および解決するための課題 化学センサーの発達は、ある糧の薄いガラス膜における電気化学的電位が浴溶液 中の水素イオン濃度に依存するということが発見された１９０６年に始まった（ １）。この発見の結果、最初の組電極が１９０９年に報告された（２）。この時 以来、化学センサーの発達には注目すべきものがあり、血中のガスや電解質の測 定方式が実質的発達を遂げた。これと比較して、代謝物および生体分子の検出の ためのセンサーの発達はそれほど進んではいない。

°「バイオセンサー」という用語は生物学的物質に対して特異的なセンサーを指 す。しかし、この用語は他の化学物質を検出するために生物学的物質を使用する センサーを特に指して述べるのによく使われている。

バイオセンサーはモニター装置であって、アナライト検出の選択性は生物学的分 子、例えば抗体、酵素、あるいは膜レセプターの結合特異性の結果である。アナ ライトの濃度は、これらアナライトの結合現象を電子的ある因は光学的信号とｂ つだ測定可能量に「変換すること」により測定される。このように、バイオセン サーの基本成分は生物学的分子、例えば抗体、酵素または膜レセプター、ならび にトランスデユーサ−である。

一般にバイオセンサーは三つの基本的節ちゅう：電気化学的、光学的、または物 理的のいずれかに入る。

これらのバイオセンサーは当業者にとってよく知られたトランスデユーサ−を取 り入れており、熱量計型、圧電型、電流滴定型、光ファイバー式、光学的導波管 型、脂質膜式、電位差計型、および電気化学的キャパシタンス／インーーダンス 装置を包含する。

上記バイオセンサー変換技術および装置を本発明に使用することはできるが、将 来の小型化における改良、ならびに質量分析、ガスクロマトグラフィー、および 核磁気共鳴分光法といった他の分析技術における改良がなされれば、このような 他の技術および方式も本発明に使用可能となろう。

既存バイオセンサーの生物学的成分は酵素、抗体、膜レセプター、完全細胞また は組織のいずれかである。

酵素、抗体、および膜レセプターはすべて生物学的巨大分子であり、その機能は 標的分子を極めて特異的に拘束することにある。センサーへの酵素およびレセプ ターの統合は大きな可能性をもつようにみえるが、商業的応用はしばしば制限さ れる。

酵素を取り入れたセンサーは多くの化学物質を検出できる。しかし、検出できる 化学物質は、その物質に対して安定な酵素が入手できるものに限られ、更に測定 できる分子を消費するかまたはつくり出す酵素に限られる。酵素触媒が知られて いない化学反応によりなお多数の化学物質が消費されあるいはつくり出されてい る。酵素に頼るバイオセンサーはアロステリズムによりその機能に限りがある。

アロステリンク酵素はモジュレータ−分子により刺激あるいは阻害される酵素れ ば、生成物あるいは何か他の分子のこともある。アロステリズムの結果として、 このような酵素の動力学的挙動はモジュレータ−濃度の変動によって著しく変わ る。アロステリック挙動の比較的簡単な１例は酵素がフィードバック阻害を受け る場合である。即ち、中間体ある込はその後の生成物の濃度が増加するにつれて 酵素の触媒効力が減少する場合である。従って多くのバイオセンサーの応用にこ のような酵素を使用することは制約があり、絶えず生成物を除去する必要がある 。

酵素センサーの更に一つの大きい欠点は、アナライトの結合親和力がその生物学 的役割によって決まるという事実に帰因する。大抵の酵素は１０３〜１０ａ　Ｍ −１の範囲の結合親和力をもち、この結合親和力が酵素センサーの感度を決定す る。このようにして、大抵の酵素センサーはせいぜいナノモル程度の検出限界を もつに止まる。

膜レセプターに関しては、十分量のタンパク質の単、離に困難がある。更にまた 、センサーに膜レセプターを商業的に応用することは、それらが本来もっている 不安定性のため、また高度に規制された環境そして容易に脱規制される環境を必 要とすることによりしばしば制限を受ける。

酵素のように、生物学的成分として抗体を取り入れたセンサーは、酵素と比べて 抗体の結合親和力の方が高いので、選択性が高く検出限界を相当に改善できる。

抗体は１０５〜１Ｑ１３　Ｍ−１の結合親和力をもち、従って抗体を取り入れた センサーはピコモル範囲の検出限界を有しうる。しかし、免疫学的反応を通して 抗体による抗原の認識と同定は普通１回限りの現象であるという事実により抗体 が制限される。抗原が抗体を飽和すると、特異的な抗原−抗体複合体の出現を測 定できる。しかし、抗原の捕獲にモノクローン抗体を使うか、ポリクローン抗体 を使うかどうかで、この反応（高親和力結合により、従って検出限界は向上する が、）は通常は容易に可逆とはならない。このようにして、抗体に基礎をおくセ ンサーは飽和されるようになり、その後の試料中のアナライトの存在を検知でき ない。このようなセンサーを繰り返し使用できないことが重要な欠点である。

抗原−抗体複合体を解離させる一般的方法は、低−溶液中で、または高濃度の塩 、尿素、またはチオシアネートの中で抗体をインキュベーションするものである 。このような方法は抗原結合部位を再生できるが、各手順は反応条件の慎重な調 節を必要とし、とりわけ数回の再生の繰り返し後に部分的なタンパク質変性を起 こすことがある。各結合現象の直後に抗原結合部位を再生するための信頼すべき 方法が無いことは、与えられたアナライトへの連続暴露をモニターすることので きる検知系の発達を挫折させるに至った。

広す濃度範囲にわたりアナライト濃度を繰り返し検出、測定でき、かつ抗原飽和 を起こすことなく校正することのできる高感度の耐久性検知系が、検知系分野の 現状に極めて望ましｂ進歩となるであろうことは容易に理解できることである。

発明の目的、特徴、および利点 それ故に、本発明の一般的目的は抗原と可逆的に結合できる抗体を取り入れた検 知系を提供することにある。

本発明の更に一つの目的は、極端に低濃度のアナライトを検出することのできる 高感度検知系を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、広い濃度範囲にわたりアナライトを検出できる高感 度検知系を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、試料毎に別個の再生過程を必要とせずにアナライト 濃度の増減の測定能力をもつ可逆的検知系を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、抗原結合部位の飽和を起こさずに系を校正できるよ うにした抗体を取り入れた検知系を提供することにある。

本発明の更にもう一つの目的は、新規アナライトに対し新しい触媒的結合部位を 使用する能力をもつ検知系を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、膜レセゾター類似の特性を有する触媒的結合部位を もつ検知系を提供することにある。

本発明の更にもう一つの目的は、酵素触媒が知られていない反応により消費また は生成される物質を検出できる検知系を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、化学反応によるアナライトの消費または生成の結果 として、環境の物理的または化学的変化を検出できる検知系を提供することにあ る。

本発明のもう一つの目的は、抗原に可逆的に結合で本発明の更にもう一つの目的 は、抗原に可逆的に結合できる触媒的モノクローン抗体を取り入れた検知系を提 供することにある。

本発明の更にもう一つの目的は、抗原結合部位を各結合現象の直後に再生できる 抗体を含む検知系を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、抗体の触媒的有効性を阻害するアナライトの検出用 抗体を含む検知系を提供することにある。

本発明のこれらのそして他の目的、特徴および利点は本発明により達成される。

課題を解決するための手段 本発明は一般に環境内の物理的または化学的変化を検出するための系に関する。

本検知系は、化学反応を行なわせる手段、その生理学的機能が非触媒的で、環境 の化学反応を触媒することのできる活性な生物学的分子、抗体の結合あるいはそ の後の化学反応により起こる環境の物理的または化学的変化を検出でき、そして 更にこれらの変化に関連した情報を発生することのできるトランスデユーサ−１ およびこれら変化に応答してトランスデユーサ−により発生した情報を処理する 手段からなる。活性な生物学的分子は、合理的に変換されるか、合成されるか、 または触媒として同定されたものが望ましｂｏ 本発明はまた環境中で起こる物理的または化学的変化を検出する方法に関し、こ の場合、これら変化は少なくとも一つの反応体が少なくとも一つの生成物へ変換 される環境中で起こる化学反応（あるいは複数の反応）の結果である。本性は、 反応体から生成物への変換を促進する条件下で反応体を活性生物学的分子と接触 させることにより環境中で化学反応を起こさせ、化学反応の結果として環境中で 起きる物理的または化学的変化を検知し、そしてこれら変化をそれに関連した情 報に変換し、これら物理的または化学的変化に応答してトランスデユーサ−によ り発生した情報を処理する諸工程からなる。

本発明のもう一つの面は、環境中で興味あるアナライトの存在を検出する検知系 に関するもので、該環境で興味の対象となるアナライトまたは何か他の成分を化 学反応の進行中に消費するか、発生せしめる。即ち、成分は共反応体、共生成物 、中間体、前駆体、あるいは他の種で、環境内の一つ以上の反応により生成ある いは消費されるものである。検知系は、反応を行なわせる手段、化学反応を触媒 できる活性な生物学的分子、環境の成分、典型的には（しかし、必ずしも必要で はないが）反応体、あるいは共反応体、あるいは生成物、あるいは共生成物の存 否を検知でき、更にそれに関する情報を発生することのできるトランスデユーサ −１およびトランスデユーサ−により発生した情報を処理する手段からなる。活 性な生物学的分子は合理的に変換されたもの、合成されたもの、または触媒とし て同定されたものが望ましい。

本発明はまた環境のアナライトまたは他の成分を化学反応の進行中に消費または 発生させる環境で、興味の対象となるアナライトを検出する方法に関する。本法 は、反応体から生成物への変換を促進する条件下で、化学反応の反応体を活性な 生物学的分子と接触させることにより化学反応を環境中で起こさせ、前に定義し た環境成分の存否を検知し、これに関する情報を発生させ、トランスデユーサ− により発生させた情報を処理して興味の対象となるアナライトの存在を決定する 諸工程からなる。

もう一つの特別な具体例を示すと、本発明は環境中の興味の対象となるアナライ トの検出系に関し、ここで環境の興味の対象となるアナライトまたは他の成分を 化学反応の進行中に消費または発生させ、トランスデユーサ−は抗体へのアナラ イトの結合を検知できまた更に該結合に関する情報を発生できるものである。

この系は反応を行なわせる手段、合理的に変換され、合成され、または反応に対 し触媒作用をもつことが確認された、環境の成分を拘束できる活性な生物学的分 子、アナライトの抗体への結合を検出しまたそれに関する情報を発生することの できるトランスデユーサ−１および前記情報を処理して興味の対象となるアナラ イトの存在を決定する手段からなる。

もう一つの具体例においては、本発明は環境中の関心あるアナライトまたは他の 成分の検出法に関し、本法は成分を触媒的抗体に結合させ、抗体への成分の結合 を検知し、この結合現象から得られたデータを変換し、該結合現象に関する情報 を発生させ、トランスデユーサ−により発生した情報を処理し、抗体に結合した 成分を含む化学反応を抗体に触媒させることによって抗体から結合成分を解放す ることからなる。アナライトあるいは関連した環境成分はその同じ環境で抗体か ら解放してもよいし、あるいは複合体を別個の環境へ取り出し、そこでアナライ トまたは関連成分を解放してもよ込。

本発明の更に他の具体例は、抗体により触媒される化学反応の阻害剤として作用 する化学物質の存在を検知するための前記系と方法を包含する。このような系お よび方法におかては、環境内の物理的または化学的変化あるｂは環境の成分の存 否が抗体接触反応の抑制により起こる。

図面の簡単な記述 本発明、ならびに本発明の他の目的、特徴、および利点は幾つかの特に適当な具 体例についての下記の記述から、図面を参照して読めば一層明確な、詳しい理解 が得られるであろう。

第１図は…に基づく触媒的抗体電位差計式バイオセンサーの概略図であり、 第２図は触媒的抗体を組み入れた免疫化学的に感受性をもつ電界効果トランジス ターの概略図であり、第６図は触媒的抗体を組み入れた電流滴定式バイオセンサ ーの概略図であり、 第４図は触媒的抗体を組み入れたインピーダンス型バイオセンサーの概略図であ り、 第５図は触媒的抗体を組み入れた光フアイバーセンサーの概略表示であり、 第６図は光７アイバーに基づく検知系の概略表示であり、 第７図は触媒的抗体を組み入れた電気発生化学発光（ＥＣＬ　）バイオセンサー の一構成の概略図であり、ンサーの概略図であり、 第９図はバルク音波（ＢＡＹ　）式化学センサーとして用いる結晶の上面および 底面図（Ａ）および側面図（Ｂ）を示し、 第１０図は触媒的抗体ＢＡＹバイオセンサーにおける結晶装着のため用いたｐ１ θｘｉｇｌａｓ　ハウジングを描いた図であり、 第１１図は触媒的抗体を組み入れた脂質２分子層バイオセンサーの概略表示であ り、 された触媒的抗体に対する可能な構成の概略表示を示し、（Ａ）天然または合成 脂質に共有結合で固定された触媒的抗体、（Ｂ）脂質に固定された触媒的抗体の Ｆａｂ　７ラグメント、（Ｃ）第二のタンパク質の股領域に共有結合で付いた触 媒的抗体のＦａｂ　７ラグメン）、（Ｄ）合成疎水性ポリペプチドに共有結合で 結合した触媒的抗体のＦａｂフラグメント、 第１３図は−に基づく触媒的抗体検知系の概略図であり、 第１４図は、第１図のバイオセンサーに対し時間分と応答（ボルト）の関数とし て表わしたメチルツー二トロフェニルカーポネー）　（ＭｐＮＰＣ）の二つの別 個の添加および希釈の差レスポンスをグラフに描いた図であり、 第１５図は遷移状態類縁体（ＴＳＡ　）　、メチルｐ−二トロフェニルホスフェ ート存在下−第１図のバイオセンサーに対する時間（分）とレスポンス（ボルト ）の関数としてＭｐＮＰＣの添加および希釈に対する電極の差レスポンスをグラ フに描いた図であり、第１６図はバイオセンサーからＴＥＡをフラッシュした後 、ＭｐＮＰＣの添加および希釈に対する第１図のバイオセンサーの差レスポンス をグラフに描いた図であり、第１７図は、二つの別個の、ただし第５図に示した ものと同一につくられた光フアイバーセンサーの、２５０μＭ　ＭｐＮＰＣの添 加に対するレスポンスをグラフに描いた図で、四角の記号は非阻害４８Ｇ７セン サーのレスポンスを表わし、プラス記号はＴＳＡ阻害センサーのレスポンスであ り、ダイヤモンド記号は示差信号を表わす、そして 第１８図は、２５０μＭ　ＭｐＮＰＣの添加に対する順次のレスポンスをグラフ に描すた図で、プラス記号はＴＳＡ阻害剤の存在下でのレスポンスを表わし、四 角の記号はＴＳＡ阻害剤をフラッシュし去った後のレスポンスを表わし、ダイヤ モンド記号は示差信号を表わす。

発明の詳細な記述 一般に本発明は環境中の物理的または化学的変化を検知する、あるいは環境中の 興味の対象となるアナライトの存在を検知するための系および方法に関し、活性 な生物学的分子を用いて化学反応を起こさせ、環境における変化を検知し、検知 データを情報に変換し、これをめる測定値が得られるように処理するものである 。活性な生物学的分子とは、一般にその生理学的機能が非触媒的であるあらゆる 生物学的分子またはその集合体を意味する。これらは、合理的に変換されたか、 合成されたか、あるいは触媒として同定された種であることが望ましい。活性な 生物学的分子は細胞内あるいは細胞上に含まれていても、細胞の成分あるいは組 織に含まれてもよ（、精製された形のこともあれば未Ｎ製の形のこともある。

活性な生物学的分子には下記のものが含まれるが、これに限定されない：触媒的 抗体、その天然種および合成種、このような抗体の７２グメント、これから導か れる合成ペプチド、化学的、物理的あるじは遺伝的修飾により触媒作用を与えた 抗体、例えば単一鎖抗体。

合理的に合成されたモノクローン抗体が最も好ましい。

本発明に関する下記の詳細な記述に使用した「検知」という用語は測定および定 量の概念を含む。このような測定および定量は興味の対象となるアナリストの全 量および（または）濃度に関してであり、測定はこの分野で公知の通り１回、間 欠的、あるいは連続的でよい。

用語「反応」および［反応を行なわせる手段」はそれらの最も広い意味で使用し てｂる。反応は酸化、還元、付加、変換、縮合、脱離、置換、開裂、転位、およ び化学種が消費されたり変換したりする他の現象を包含するが、特に制限はな− 。「消費された」とは元の種が変化、修飾、あるいは他の仕方で、異性体を含め て異なる化学種または物理種に変わる現象を意味する。「反応を行なわせる手段 」とは一般に分析を行なおうとする環境を含む容器、例えば容器、入れ物、タン ク、分析装置、ゾローブ、試料、導管、および利用しうる、またはこの分野で入 手可、能となる他の公知の手段を意味する。

本明細書中で用いた用語「活性な生物学的分子」とはその生理学的機能が非触媒 的である生物学的分子を意味する。下記の説明から明らかなように、このような 活性生物学的分子は、なるべくは合理的に変換されたもの、合成されたもの、ま たはある与えられた化学このような合成法は特許願連続第６７４，２５３号明細 書（１９８４年１１月２７日出願）および特許願連続第５５６，０１６号明細書 （１９８３年１１月２９日出願）（これら特許願の優先枢が請求されている）に 記載されている。活性な生物学的分子、特にモノクローン抗体を合理的に変換し 、合成し、あるいは同定するための方法についてもう一つの記述は文献に記載さ れている。

「生物学的分子」は一般に生物体を形成する化合物から構成された分子として定 義される。このような化合物はアミノ酸、核酸、糖類、膜脂質、または生物学的 補足因子でよい。

アミノ酸は２０個の必須アミノ酸およびタンパク質中に取り込むことのできる他 のアミノ酸を包含する。

アミノ酸から構成された分子はまた、ペプチド、即ちペプチド結合によって互に 連結されたアミノ酸から構成された鎖を包含する。これらは神経伝達物質、ホル モン、および（または）大きいペプチドの機能的部分から誘導されたペプチドと いった分子でよ込。アミノ酸から構成された分子はタンパク質、即ちより長鎖の ペプチドを包含し、これらは多くの非触媒的機能をもつことがあり、例えば電子 移動タンパク質（例えば、７エレドキクンおよびフラボトキシン）、免疫保護タ ンパク質（抗体）、神経インパルスを発生または伝達するタンパク質（例えば、 アセチルコリン、ドーパミン、およびロドプシン膜しセゾター）、構造タンパク 質（例えば、コラーゲン、フィブリン、糖タンパク質、エラスチンなど）、他の 結合タンパク質（例えば、ヒストン）、および集合輸送タンパク質（例えば、７ エリチン、ヘモグロビン）が包含される。

糖類には、単糖類（例えば、グルコース、フルクトースなど）、オリゴ糖（例え ば、ショ糖、ラフィノースなど）、および多糖類（例えば、デンプン−燃料貯蔵 分子、およびセルロース−構造分子）が含まれる。膜脂質には、リン脂質（例え ば、脂質２分子膜および他の脂肪酸）、糖脂質、コレステロール、およびその誘 導体、およびプロスタグランジンおよびその誘導体と８つだ分子が含まれる。核 酸には５個のよく知られたヌクレオチド（アデニン、グアニン、シトシン、ウラ シル、およびチミン）、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドあ、るい は核酸、例えばＤＮＡ　。

ｍ−ＲＮＡ、およびｔ−ＲＮＡが含まれる。補足因子は、その触媒としての機能 がポリペプチド鎖と会合するまで発生しないか特異的に方向づけられない生物学 的分子である。例はリボフラビン誘導体、ポルフィリン、チアミンピロホスフェ ート、およびニコチンアミド、アデニンジヌクレオチドなどである。

本明細書で用いた「抗原」という用語は前にまた更に本発明の明細な記述中に定 義された活性な生物学的分子により特異的に拘束される分子を意味する。

本発明センサーに使用される特に適当な活性生物学的分子は触媒として活性のあ る抗体、その断片、またはそれから誘導される合成ペゾチドである。更に他の特 に適当なものはモノクローン抗体であり、これは優先枢特許願に教示された方法 に従って触媒として合成されたもので後に更に詳しく記述する。

活性な生物学的分子は本発明センサー自身に使用してもよいし、あるｂは細胞ま たは細胞成分の中または上に、あるいは組織上に含まれてもよく、そしてこれら は精製された形でも未精製形でもよい。

本発明検出系は一般に活性な生物学的分子（典型的には以後化学反応を触媒でき る抗体（「触媒的抗体」）と呼ぶ）、化学反応の結果起こる現象を検知でき、か つ更にこれら現象に関連した情報を発生することのできるトランスデユーサ−１ およびこのように発生した情報を測る手段を含む。一般に、トランスデユーサ− により検知される現象は、化学種、例えば就中、反応体、共反応体、生成物、共 生酸物、前駆物質、中間体、あるじは継続反応に含まれるかもしれないかかる化 学種の出現あるいは消失のこともあれば、あるいは触媒的抗体と１種以上のこの ような化学種との反応あるいは結合による環境内での物理的または化学的変化で もよい。トランスデユーサ−は、−１温度、イオン状態、インピーダンス／キャ パシタンス特性、質量、発光特性（例えば、螢光および電気発生化学発光）、種 々な波長の光の吸収特性および反射特性における変化、電気ポテンシャル、波動 の伝搬、基質結合における変化などを含めて（これだけに限らない）物理的また は化学的現象の変化のいずれかを検知することによりこれら現象を検出する。こ バら現象は環境内で起こる化学反応あるｂは複数の反応と関連をもつ。

本発明はまた環境内で起こる各種現象を検出する方法にも関する。これら方法は 本発明検出系を使用するもので、一般に反応体を活性生物学的分子、例えば触媒 的抗体と接触させることにより環境内で化学反応を起こさせるか、または触媒的 抗体を環境の成分に結合させ、次に本発明検出系を使用して化学反応または抗体 結合の結果環境内で起こる現象を検知しかつ定量する、またはそのいずれかを行 なうことからなる。

触媒的抗体は、触媒しようとする反応に対する遷移状態の構造および電荷分布に 似せるように設計された分子を用いて動物を免疫化することによりつくるのが普 通である。動物はこの遷移状態類縁体（ＴＳＡ　）に対し異なるアミノ酸配列を もち、従って異なる結合親和力と触媒活性をもつ多くの異なる抗体をつくる。結 合性と触媒活性をめて種々な抗体を注意深くスクリーニングすると興味の対象と なる反応を触媒する抗体が得られる。

触媒的抗体とその反応体（抗原）との結合は、非触媒的抗体とその抗原との結合 とは異なることは明らかである。これら両種の抗体ともイオン力およびファンデ ル　ワールスカにより、また疎水性分配力により結合するが、通常の高親和力（ １０９〜１０１４　Ｍ−１）抗体と抗原との結合は結合条件下で逆反応が非常に 遅（、実際上不可逆である。

非触媒的抗体とは著しく違って触媒的抗体は抗原と可逆的に結合する。触媒的抗 体は、反応生成物が抗体により永久的に拘束されず、生成物が形成されそして抗 体から拡散し去ると遊離抗体結合部位が再生されるというように化学反応を触媒 する。このようにして触媒反応サイクルに備えることになる。更に、触媒的抗体 は可逆的に結合するので、本発明センサーはアナライトの濃度の増減に対し再現 性よく連続的に応答する。

触媒的抗体の可逆的結合能力は、抗体による抗原の認識と同定が一回きりの現象 であると込う事実からみて特に有意義である。典型的には、抗原が抗体を飽和す ると、特異的抗原−抗体複合体の出現を測定できる。

しかし、抗原捕獲にモノクローン抗体を用いるかポリクローン抗体を用するかど うかにより、この反応は普通は容易に可逆とはならない。結果として、同じ試料 中あるいはその後の試料中の特異的アナライトの存在は検出できない。これらが アナライトを繰り返し認識できないということが、検知系の成分として非触媒的 抗体を使用する上に大きい障害となる。

触媒活性をもつ抗体の最近の同定法は抗原結合部位を再生する新しい方法を提出 して込る。触媒的抗体をセンサー系に組み込むことは抗原−抗体複合体の解離と ｂう通常の問題を回避して可逆的センサーをつくり出すだけでなく、センサーが アナライト濃度を大きい濃度範囲にわたり検知できるようにしまた抗体部位の飽 和を起こすことなく校正できるようにする。更に、新規アナライトのために新し い触媒的抗体、従って新しい触媒部位をつくる能力、あるいは膜レセプターと同 様の結合特性をもつ触媒部位を形成させる能力は触媒的抗体センサーの開発に重 要な新しい領域を開くものである。触媒的抗体は潜在的にはどのアナライトに対 してもつくり出すことができるので、あるアナライトに対して特異的な触媒的抗 体を取り入れたセンサーはそのアナライトを他の方法では検出できないかもしれ ない環境下で検出できる。

本発明センサーは幾つかの異なる分野に応用できる。

一つの重要な分野は臨床医学であり、そこでは臨床的の異なる分析機器および技 術が使われている。現在まで、大抵の化学分析に対し放射性免疫検定技術が使わ れているが、これらは典型的には大きい中央病院や臨床実験室用に設計された大 型の高価な機器を必要とする。健康管理の費用を切りつめるための困難から、中 央集中型でない機関、例えば個々の病院の病棟、院外患者部課、および医師の診 療室で使用できる安価、小型の分析装置に対するより一層の需要が現在生じつつ ある。本発明バイオセンサーはその小型、低価格、選択性、および感度の結果と して上記要求をよく満すかもしれない。カリウム、ナトリウム、水素、リチウム 、およびカルシウムイオンに対しては信頼できる化学センサーが既に存在してい るが、殆どのタンパク質、ホルモン、代謝物、および有機薬物に対しては未だ開 発されねばならなり０ 獣畜健康管理はヒトの健康管理分野と同様の要望をもつもう一つの領域である。

バイオセンサーは動物の健康問題の監督および診断に多くの可能性のある応用を もつ。

バイオセンサーのもう一つの可能性ある大きい使用分野は発酵制御の領域である （３）。食品製造、医薬品製造、廃水処理およびエネルギー生産と論った分野で 、生化学および微生物的プロセスの多くの産業上の応用がある。発酵反応はまた このような生物工学的方法に重要な役割をもつ。生産を最適化するために含まれ る系を慎重に調節することが必要である。反応体と生成物の濃度、反応条件など の迅速かつ鋭敏なオン−ライン監視および制御には、発酵の基質と生成物に特異 的なセンサーが必要である。

環境の監視はバイオセンサーが要求されるもう一つの育ちつつある領域である（ ４）。大気、水、および土壌汚染に対してもち上がった関心は、農薬、フェノー ル類、フェノキシ酸、ニトリロトリアセテート、重金属、硝酸塩、リン酸塩、硫 酸塩、および尿素といった物質を監視するために化学センサーに対する需要が生 まれつつある。

防衛産業も痕跡量の化学および生物学的戦争薬剤を監視するため敏感な化学セン サーを必要としている。

化学センサーの他の応用には食品および飼料製造法および品質制御、農業診断薬 および監視、産業衛生、および毒物試験が包含される。

化学反応を触媒することのできる抗体を「触媒的抗体」と定義する。触媒的抗体 は「発明の技術分野」の中で前に引用したＳｃｈｏｃｈｅｔｍａｎおよびＭａｓ ｓｅｙ　、特許願連続第６７４，２５５号明細書（１９８４年１１月２７日出願 ）中に明確に示され記述されている。

物のいずれよりもエネルギー的に不利な構造を経て一つ以上の遷移を受ける。分 子レベルで言えば、これら遷移状態（または中間体構造）は結合の長さと結合角 の変化、ならびに結合の形成および切断を反映している。遷移状態に到達するた めに必要なエネルギーを活性化エネルギーと言い、これはまた遷移状態のエネル ギーと反応体のエネルギーとの間のエネルギー差と見做すこともできる。

触媒は、反応の活性化エネルギーを下げることにより化学反応速度を増加させる 。就中、推定遷移状態が似ている（即ち、遷移状態類縁体）とｂ５理由で選ばれ た免疫原であるハシテンまたは抗原に対して誘発された抗体は反応を触媒しうる 。このようにしてつくり出される抗体は遷移状態のエネルギーを反応体および生 成物と比べて安定化するに違いない。この方法は幾つかの触媒的モノクローナル 抗体の発生によ（実証された。

従って、この方法の特別な応用は、遷移状態類縁朱反応体、または生成物化合物 、またはこれら化合物を用いて、これらを担体タンパク質、例えば牛血清アルブ ミンあるいはキーホールリンペット　ヘモシアニンに共有結合で結合した後、マ ウスの免疫化を必要とする。いったん免疫反応がマウス血清に検出されたならば 、ポリクローン抗体を硫酸アンモニウム分別、分子半径およびアフィニティーク ロマトグラフィー技術の組み合わせにより該血清から単離できる。この抗体調製 物はポリクローンであるので、遷移状態構造を異なる特異性、親和力、およびア イソタイプで拘束する種々なタンパク質が存在するであろう。抗体分子の分布は 動物の免疫反応が完成するにつれ変化するであろう。

これとは著しく違って、モノクローン抗体細胞系は単一抗体をつ（す、このもの は遷移状態類縁体構造にきまったイデイオトーゾでまたきまった親和力で結合す る。これら細胞系はある特異的Ｂ細胞（免疫反応を示すマウスから単離）と適当 な骨髄腫腫瘍細胞との融合によりつ（られる。この細胞系は組織培養かマウスの 腫瘍の生体内継代により維持できる。

このように触媒的抗体はモノクローン抗体かポリクローン抗体のいずれでもよい 。モノクローン触媒的抗体の利点は多数の細胞系をふるい分けする能力、および 誘発遷移状態類縁体に固く結合するだけでなく最大の触媒活性も示す抗体を特異 的に確認する能力である。

更に、ハイブリドーマ細胞系は化学的に同一の一定した安価な抗体源を提供する 。モノクローン抗体の裂造法はこの分野で公知である。（Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ　 、Ｈ等、米国特許第４，１９６．２６５号明細書、１９８０年４月１日発行）。

合成およびセンサー応用の両方に対して従来の化学的および酵素的触媒に付随す る犬き込制約がある。化学的に触媒された方法はしばしば高温高圧を必要とし、 望む生成物を高収量で与えなり０これは激しい反応条件と反応の特異性の欠如が しばしば望ましくない副反応物の生成を起こすからである。更にまた、化学的触 媒は多くの重要な反応に対して未知であり、未来の触媒の合理的設計が極めて困 難である。商業的化学触媒について存在する他の不利な条件はこれらが比較的高 価であり、化学的活性化の必要性、大気圧でまた痕跡量の水の存在下で、あるい はそのめずれかで機能せず、そして大気中の酸素の存在下で可燃性または爆発性 に関する潜在的問題があることである。

酵素および抗体触媒は両方とも水溶液中室温で効果的に使用できるが、合成およ びセンサーへの酵素触媒の工業的応用は望む反応特異性をもつ天然酵素を同定し なげればならない必要性により制限を受ける。従って、産業上重要な反応を触媒 する多くのひ素をなお単離せねばならない。酵素触媒の他の不利な条件はタンパ ク質の不安定性、単離の難しさ、外来反応体（例えば、レドツクスあるいはトラ ンスアミナーゼ化合物）の必要性、ならびに酵素触媒作用（酵素の生理学的機能 の基本的部分）のアロステリック阻害である。

これとは対照的に、合理的に設計されたモノクローン抗体は多くの合成およびセ ンサー応用に対し理想的である。これらタンパク質の大規模生産ははっきり示さ れており、検出特異性は誘発ノ・ブテンと同じ位広くあるいは特異的にすること ができ、免疫グロブリンは温度および時間に関して極めて安定な生体分子であり 、アロステリック阻害は問題とならず、そして基質結合親和力および交代数は、 一つの遷移状態類縁体により誘発されたモノクローン触媒的抗体の一群から選ぶ ことができる。更に、抗体触媒は存在する酵素とは異なる経路により反応を促進 するように設計できるので、高価な共反応体の必要を軽減できる。この利点は新 しい反応条件（例えば、Ｐ）′Ｉ要件）を明確に決める上で、あるいは抗体結合 部位の再生速度を制御するための機構を確認する上で（例えば、エステラーゼ抗 体触媒は水酸化物イオンに一次依存性を示し、エステラーゼ酵素はそうでない） ％に貴重である。これら例のすべては合成またはセンサー応用いずれかに抗体触 媒を使用する重要な利点を示しているが、最も重要な利点は触媒を殆ど如何なる アナライトに対しても設計できると−うことである。

触媒的抗体は、非タンパク質分子、例えば生物学的補足因子および補酵素により 、あるいは非生物学的に誘導された補足因子により触媒された反応の速度あるい は部位および立体特異性を増すためにも使用できる。

前者の化合物群の例にはポルフィリン、フラビン、ニコチンアミドアデニンジヌ クレオチド、ぎリドキサールホスフェート、ビオチン、またはテトラヒドロフオ レート誘導体を包含するが、これらに限定するのではなり０非生物学的基礎をも つ補足因子の例にはアルミニウムポルフィリン、４−エチルピリジン、および白 金またはパラジウム触媒が含まれるが、これらに限定するのではない。

前記触媒的抗体は、種々な化学的変換の反応速度を促進するのに有用である。こ れらの反応は１分子、２分子、あるいはもつと一層複雑な性質のこともある。

これらは酵素により触媒される反応と同様の、例えば酸化、還元、異性化、付加 あるいは二重結合からの脱離、縮合、置換、加水分解、または転位といった反応 を触媒しうる。これらはまた非生物学的に関連のある反応、例えば有機金属分子 および重合体の合成、芳香族化合物のメタ−アルキル化および（または）立体特 異的水素化も触媒することができる。触媒的抗体センサーが種々なトランスデユ ーサ−法により極めて多数のアナライトの存在を検出できるのは、この反応機構 の広い多様性である。

アナライトの反応条件およびその後の検出は、抗体−反応体複合体の形成を許す 条件と同様広い。これら変化しうろことは明らかであろう。例えば、複合体形成 に適した一組の条件は、ｐＨ３，０から１０．０のβ値、４℃から６０℃の温度 に保ったプロトン性溶媒、なるべくは水を使用する溶液相およびエマルジョン反 応系を包含する。触媒反応は減圧または昇圧で行ないうるが、通常は常圧で行な う。溶液相および乳濁液反応系に加えて、適当な条件は抗体を物理的または化学 的に結合させる支持材料の使用を含む。このような支持体材料は当業者にとって 公知であり、これら材料に抗体を付着あるいは固定させる方法も同様である。

実際には、反応体（複数のこともある）を、抗体とその基質との間の複合体形成 に適した条件下で適当な抗体と接触させる。複合体形成した反応体（複数のこと もある）は生成物に変換され、生成物（複数のこともある）が複合体から放出さ れる。このように本発明センサーは、抗体結合部位で触媒された反応により自動 的に再生される。更にまた、各抗体に見られる触媒活性の結果、遷移状態構造の 堅固な結合を生じるので１、これらタンパク質は通常は反応体よりもずっと固（ 遷移状態類縁体を拘束する。従って、検定溶液中の遷移状態類縁体化合物の濃度 が非常に低いと、抗原結合部位に対する競合的結合によって抗体の触媒活性が減 少する。従って、既知量の基質の存在下で抗体接触反応速度の減少を監視するこ とによって、遷移状態類縁体の濃度を決定できる。

トランスデューサー 先行技術のバイオセンサーに用いるトランスデユーサ−は一般に三つの基本的範 ちゅう：電気化学的、光学的、および物理的トランスデユーサ−に入る。本発明 に用いるトランスデユーサ−も同様に同じ三つの基本的範ちゅうに入る。これら には、熱量計型、圧電型、電流滴定型、光ファイバー式、光学的導波管型、脂質 膜式、電位差計型、および電気化学的キャパシタンス／インーーダンス装置が含 まれる。これらトランスデユーサ−を、非触媒的抗体、酵素、およびタンパク質 しセゾターを取り入れた検知系に使用するように下に示す。しかし、これら同じ トランスデユーサ−およびこれらの操作原理は、本発明検知系に触媒的抗体と共 に応用できることは明らかであろう。

電気化学式トランスデユーサ−は酵素電極（５，６）、免疫化学媒介イオン輸送 電極（７ａ）、および電気化学的に連結された免疫化学的電極を有するものを包 含する。酵素電極は典型的には電位差計型イオン選択電極またはレドックス電極 または電流滴定式電極いずれかの表面上の酵素含有層からなる。酵素で触媒され た反応の反応体消費または生成物の形成の検知は酵素基質の検出に対する基準と なる◇ 典型的な１例はグルコースセンサーは、検知器表面上のゲルマトリックス中に固 定したグルコースオキシダーゼが次の反応： に従いグルコースの酸化を触媒す′る。電流滴定式電極は基質グルコースの濃度 変化を検出するために、酸素の消費ある込は過酸化水素の生成いずれかを検知す るために使用できる。同様な電極はまた電位差計型にも使用でき、この場合には 電気活性種の消費および（または）生成によって電極電位が変化する。電極の材 料は不活性金属または他の不活性伝導性材料のいずれでもよい。普通には白金、 金、およびガラス状炭素、が使用される。別法として、水素イオンに敏感な電位 差計型イオン選択性電極を使用して酵素含有層の可変化を検出しグルコース濃度 を決定することもできる。異なる酵素で同様な検知機構を使用することにより種 々な化学物質を検出できるが、これらの酵素に基づく検出方式は、検出できる化 学物質の数が安定な酵素の入手可能なものに限られる。それにも拘らず、本発明 触媒的抗体検知系におりては、酵素系に関連した制約を受けることなく同じ変換 装置を用いることができるが、この違いは酵素の代りに触媒的抗体を用しる点に ある。

免疫化学的媒介イオン輸送電極は公知のイオン選択的電極に基づ（。これら電極 は親水性イオンを低誘電率媒質、しばしば可塑化ｐｖｃ膜中に溶解し易くするた め疎水性イオノホアに頼っている。これらイオノホアは大環状あるいは非環状の いずれかであるが、特定イオンと錯体形成すると環状構造を生ずる。天然抗生物 質、例えばニブリシンおよびパリノマイシンがしばしばイオノホアとして使われ る。これら検知機構に基づ（イオン選択的電極は文献で十分確立され（７ｂ）、 現在ナトリウムおよびカリウムイオンの臨床的検定の５０％以上に使用されてい る（８）。これらセンサーは抗原標識したイオノホアを低誘電率膜中、イオン選 択的電極と同様の構造で使用する（７ａ）。イオノホアは膜−溶液界面を横切る 幾つかのイオン種の比較的小さｂ交換電流密度を可能にする。抗原へ抗体が結合 すると、各イオン種の交換電流密度を異なって変化させる結果、界面で混合電位 に変化を生ずる。

免疫電極バイオセンサーの１例で、抗原はイオノホアベンゾ−１５−クラウン− ５（７ａ）にカップリングさせた薬物ジゴキシンである。膜の表面で抗原をジゴ キシンへ拘束し界面を横切るイオン輸送の動力学に影響して平衡電位を変化させ る抗体−ジゴキシンを検出するためこの電極を使用する。この電極はまたジゴキ シン検出のため競合検定に使用することもできる。

抗体に対する検出限界はμｌ／／１ｒＬｌ範囲、またジゴキシンに対してはｎＭ 範囲である。

電気化学的に連結された免疫化学的センサーは文献に記載されているが、動作機 構として免疫化学的反応の直接検出に頼る信頼できるセンサーは記載されたこト カな−。このような免疫化学的センサーの１例として、酵素連結電極が使用され て来たが、このものは酵素−標識抗体が電位差計型または電流滴定型検出−ずれ かのための電気活性種を供給する（９）。

免疫化学的電極の更にもう一つの例は、免疫化学的に感じる電界効果トランジス ター（工ＭＦＥＴ　）である（１０，１１．１２）。この検出スキームは電界効 果トランジスターが膜−溶液界面における界面電荷の変化を測ることのできる能 力に頼っており、このようにして界面におけるイオン的に帯電した抗原あるいは 抗体の測定を可能にしている。

公知キャパシタンスまたはインピーダンストランスデユーサ−は、電極界面の電 気化学的インピーダンスを測定するものである。抗原または抗体すずれかをセン サーの表面（複数のこともある）に固定できる。対応する抗体または抗原がその 同等物に結合するとき、界面におけるその存在がイオン性二重層の組立てを変え 、界面インピーダンス（キャパシタンスおよび（または）コンダクタンス）を変 化させる。

光学的トランスデユーサ−（光ファイバーおよび導波管センサーにより代表され る）はトランスデユーサ−の第二の範ちゅうに入り、この分野でも公知である（ １３．１４）。光フアイバーセンサーは概念的には単純である。光ファイバーは 小屋化された分光光度計セルからセルへ光を運ぶ導管として単に使われるだけで ある。前記セルにおｈて反応体および（または）生酸物の濃度は光吸収、伝達、 または螢光技術のいずれかにより決定される。典型的には、可逆的指示系（比色 計または螢光計）をファイバーの端にある半透膜の内側にトラップする。−（１ ５）、ｐＯ２（１６）、１）ＣＯ２（１７）、およびグルコース（１８）に対す るセンサーが光ファイバーに基づくセンサーの例である。

゛この代わりに、光ファイバーと導波管を反射光が光フアイバー周囲の媒質（た とえば、水溶性試料溶液）の薄層に生じる変化によって部分的に変化させられる 完全内部反射モードで使用することもできる。この場合は、入射光と反射光は光 フアイバー表面から周囲の媒質へ広がる消光フィールドを介して周囲の媒質と相 互作用するので指数関数的に減衰する。この消光フィールドはほぼ反射光の波長 に等しい距離だけ周囲の媒質に広がる。消光フィールド内部のどんな吸収性分子 種でも光の一部を吸収することができるので、反射光強度の減少する原因となる 。同様に、消光フィールド領域の発螢光団は光で励起することができるので、こ の螢光放出を光ファイバーで効率よ（捕捉して分析用に後方へ導くことが可能で ある。

光導波管センサーは光ファイバーと同様な仕方で使用される。この場合には光フ ァイバーよりも光学プリズムが光波を導くのに使用される。光導波管センサーは 光ファイバーに対応するものと類似した方法である消光フィールド・モードまた はバルク励起モードのいずれでも作動させることが可能である。

光ファイバーと光導波管は消光フィールドまたはバルク励起モードのいずれでも 操作でき化学発光または電気的に発生させた化学発光（ＥＣＬ　）反応によって 発生した光を捕捉するのにも利用できる。このようなＥＣＬ　トランスジューサ ーは、たとえば、ルテニウムトリビスピリジン、Ｒｂ（Ｂｐｙ）３のようなＥＣ Ｌ−活性化合物（ＴＡＧ　）を検出するのに必要な極度に高感度の方法を提供す る。電気化学的発光化合物とＥＣＬ−ＴＡＧ定量システムは１９８５年１０月３ ０日にＢａｒｄらが出願した公開国際出願、出願番号７Ｉ６ＰＣＴ／ＵＳ８５１ ０２１５３及び１９８７年４月３０日にＭａｓｓｅｙらが出願した公開国際出願 、出願番号Ａ６ＰＣＴ　／　ｒｙ　ｓ　８７　／　００９８７の１ｎｔｅｒ　ａ ｌｉａに解説されている、ここに、これらの公開出願を本出願中に文献の援用を 行うものである。

ＥＣＬ　−ＴＡＧシステム、触媒抗体及び光ファイバーまたは導波管トランスジ ューサーと結合するバイオセンサーを下記に更に詳細に解説する。

他の種類の光トランスジューサーは光反射率の専門技術に基づくものである。最 も単純な方法には部分偏光させた入射光束をブルースター角で使用し、シリコン のような平滑な表面の反射力のモニター法が含まれる。一層に抗体を吸着または 固定化すると反射力が増加する結果となり、さらにその後抗原と反応させると反 射力が一層増加する結果となる（１９）。別の方法にはガラスプリズムまたは回 折格子上の金属薄膜のプラズモンを励起するのに完全内部反射を使用する表面プ ラズモン共鳴の測定法が含まれる（２０〕。この共鳴は特定の入射角における反 射光の鮮明な最小値として検出される。金属表面に由来する１μｍの数分の１以 内の槽液の屈折率の変化が結果として臨界入射角の変化となる。界面におけるタ ンパク質（及び抗原−抗体結合）の吸光度を、従って、共鳴角の変化として検出 することが可能である。

第３の種類のトランスジューサーは物理的トランスジューサーである。いろいろ な検出原理は生化学的反応をモニターするために温度や質量のような物理的変化 の測定に依存するものである。生化学的反応に対する反応熱の測定法の原理に基 づ込たトランスジューサーが知られている（２１）。最もありふれた例はＤａｎ ｉθ１８θｏｎらが開拓した酵素サーミスターであり（２２Ｌサーミスター近傍 の酵素に触媒された反応で発生するエンタルピー変化に由来する温度変化を検出 ｆるトランスジューサーとして高感度のサーミスターを使用するものである。酵 素反応は一般に２５−１Ｑ　Ｑ　Ｋ、Ｔ／ｍｏｂの範囲のかなりの熱発生を特徴 とする。

このバイオセンサーの最も直接的な実施例は熱酵素ゾローブ（ＴＥＰ　）であり 、酵素はサーミスター周囲のタンパク質に架橋結合させるかあるいは透析チュー ブにンスジューサーに直接付着させている。あいにく、この結合構造を使用する と、基質（分析対象）反応の酵素による触媒作用で発生した熱の大部分は周辺環 境に消失するので感度は低込。カラムの出口に配置したサーミスターを有するフ ロー・スルー・システムに支持粒子に結合させた酵素で充填した小さなカラムを 使用すればより効率のよい構成要素の配列が達成できる。

ｂろいろな酵素センサー装置を使用して多数の分析対象が検出された。検出濃度 範囲は酵素活性及び反応エンタルーーに依存し一般には０．０１から１０ｍ１ｄ の範囲である。表１（２２）は酵素サーミスターで分析した物質を濃度範囲と共 に一覧表にして示したものである。

表　１ 酵素サーミスターで分析された物質 アスコルビン酸　アスコルビン酸　０．０５−０．６オキシターービ ＡＤＰ　アピラービ　１−８ コレステロール　コレステロール　０．０３−０．１５オキシダーゼ　０．０３ −０．１５ クレアチニン　クレアチニンイミノ ヒドロラービ　０．０１　−　１０ グルコース　グルコースオキシターゼ 十カタラービ　０．００２−０．８ 乳酸　乳酸２−モノオキシ デナービ　０．００５−２ シユウ酸　シュウ酸オキシダーゼ　０．００５−０．５シユウ酸　シュウ酸デカ ルボキシ ラーゼ　０．１−３ トリグリセリド　リポプロティンリパーゼ　０．１−５尿素　ウレアーゼ　０． ０１　−５００尿酸　ウリカーゼ　０．０５−４ 可溶性酵素の分析 尿素　ウレアーゼ（可溶）　０．１−１００単位／ｍｌ過酸化水素　カタラーゼ （可溶）　０．１−１００単位／ゴグルコース＋ＡＴＰ　ヘキンキナービ（可溶 ）　０．１　−２．５単位／ｍｌ免疫学的分析置ＩＳＡ アルブミン（抗原）　固定化抗体十 インスリン（抗原）　〃　０．１−５０　μＬΔａ発酵分析及びプロセス制御 セロビオース　β−グルコシダーゼ＋ グルコースオキシダー ゼ＋カタラービ　０．０５−５ セフアロスポリン　セファロスボリナービ　０．００５−１０ラクトース　ラク タービとカメ２−ビ　０．０５　−１０ペニシリンＧ　ぺ匡シリナービ　０．０ ５　−５００スクロース　インベルタービ　ｏ、ｏｓ　−１ｏＯシカし、このよ うな酵素に基づ（熱バイオセンサーで検出できる分析対象物質の数量は既知の酵 素触媒が存在する化学反応によって消費または発生する分析対象物質に限定され る。

圧電音波トランスジューサーは周囲の物理的パラメーターの変化を検知するトラ ンスジューサーの別の例を示す。圧電結晶の表面に対する薄層フィルムの作用は あたかも薄層フィルムが結晶自体の等価質量の変化であるかのように結晶の共振 周波数を変化させる（２３）。このようにして、音波センサーはその表面（Ｓ） に結合する分子として大量の圧電基質の変化を効率よく測定する。バルク音波（ ＢＡＹ　）及び表面音波（ＳＡＷ　）　）ランスジューサーはガス検知器として 使用されてきたが（２４）液中の化学製品を検出するのに使用されたのは極く最 近のことである（２５．２６）。

バルク音波トランスジューサーは多くの種々の科学研究分野で圧電結晶表面上の 種々の被膜へのガス分子の吸収をモニターするガスセンサーとして使用されてい る（２４）。しかし、液体媒質中の圧電結晶の動作は砲とんど注目されていない 。ステアリン酸及びポリアクリルアミドデルの脂質薄膜の沈着によって界面化学 的性状が変動する水様性媒質中のＢＡＹ装置の研究結果が報告されている（２６ ）。抗体の表面固定化抗原への結合はこの装置の調波周波数に影響を及ぼすこと が実証されている。従って、ＢＡＹ）ランスジューサーは水様住環境で信頼性の ある動作が可能であり、従って、結晶表面上の免疫化学的反応を検出できる。

自然が使用している化学的検知機構、すなわち、脂質二層膜に埋め込まれたレセ プタータンパク質は高感度で選択性のある化学的トランスジューサーの例を与え るものである（２７．２８）。厳密には、天然のレセプタータンパク質は変換の 応用には必要でなく、膜−溶液界面における特異的化学事象（たとえば、抗原− 抗体または酵素−基質の結合）により脂質頭部の原子団の双極電位を役瓦させ膜 の電気伝導度を有意に一部変化させることが示唆されている。換言すれば、界面 の近くの荷電したまたは双極性の分子種の結合は膜内外のイオン移動に対する静 電的障壁を一部変化させる可能性がある。このような理由から、このような脂質 二重層膜を非触媒抗体、レセプタータンパク質、または酵素の代りに膜表面の中 へまたは上に触媒抗体を包埋することにより発明した触媒抗体検知システムにお けるトランスジューサーとして使用することが可能であり、関心のある分析対象 物質の濃度変化に迅速に可逆的に反応する高感度で選択性のあるバイオセンサー が達成されるのである。

化学反応に関連した種々の事象の検出以外にも、このトランスジューサーはこれ らの事象を電気または光の信号のような測定可能な量に１変換′または転化させ ることによってこれらの事象に関連した情報を発生させることもできる。これら の信号は技術的には周知の接続を介して示された情報を、たとえば、表示装置、 記録、及びデータのデジタル化を処理する装置へチャンネル別に送られる。

上記で考察した変換機構以外に、触媒抗体に触媒される反応に由来する物理的ま たは化学的変化を検出するために多くの他の分析化学的技術を使用することが可 能である。表■はこのようにして使用できる多（のありふれた分析技術を一覧表 にして示す。

表　■ 紫外及び可視吸収分光法　光音響分光法ラマン分光法 赤外分光法 螢光分光法　原子吸光分光法 原子放射分光法　原子螢光屈折率測定法プラズマ放射分光法 偏光測定法　施光分散法 円偏光二色性法　核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法原子スピン共鳴分光法　Ｘ線螢光 分光法Ｘ線回折法　電子回折法 Ｘ線光電子分光学（ｘｐｓ　）　中性子活性化分析法質量分光法　二次イオン質 量分光性 電気化学的電位差測定法　電解重量分析法電気化学的ポーラログラフイー　電気 化学ポルタンメトリー液体クロマトグラフィー　カラムクロマトグラフィー高速 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）　吸着クロマトグラフィー分配クロマトグ ラフィー　逆相クロマトグラフィー液液クロマトグラフィー　イオン交換クロマ トグラフィークロマトグラフィー　グルクロマトグラフィーガス液体薄層クロマ トグラフィー ペーパークロマトグラフィー　電気泳動性電気クロマトグラフィー　化学発光法 発電化学発光法　オージェ電子分光法 トランスジューサーが発生する情報処理の方法トランスジューサーが発生する情 報処理に使用される装置は技術的には周知の事項である。検出される物理的また は化学的現象の種類に応じて特定の装置が使用される。電気化学的、熱量測定的 及び脂質二重層膜トランスジューサーはしばしば電位計、電圧計、インーーダン ス分析計及びキャパシタンスブリッジに接続される。光電子増倍管、フォトダイ オ−ｒｌ　フォトトランジスタ、分光光度計、モノクロメータ−１及び７オトン カウンターは光及びＥＣＬ　）ランスジューサ・−が発生する情報を処理するの に広く使用される装置である。周波数カウンター及び遅延線発振器は圧電トラン スジューサーと共によ（使用される装置である。

本発明の検知システムには触媒抗体が組み込まれている。検知システムに使用さ れる触媒抗体及び本発明の方法は自由に浮遊する粒子である試験環境またはトラ ンスジューサーの表面上に固定化したものまたはトランスジューサーに関連した 別の表面上に固定化したものについて公開する。むしろ、触媒抗体は周知の技術 である専門技術を使用して固定化され（２９）、その専門技術には一般に以下の ４種の異なる方法のいずれか１つ（またはそれらの組合わせ）が含まれる：すな わち、吸着：エントラップメント；架橋：または共有結合である。たとえば、ト ランスジューサーが脂質膜装置である検知システムでは、触媒抗体または触媒抗 体群は脂質膜の中または上に固定化される。トランスジューサーが電極またはゾ ローブのシステムでは触媒抗体はたとえば、電極またはゾロープの検知膜と電極 またはゾロープの先端に適合し保護する透析膜の間にはさまれた一片のろ紙のよ うなスペーサー上に固定化または捕捉されていてもよい。多数の検知システムに おいて、触媒抗体は適当なゲルマトリックス（たとえば、ポリアクリルアミド、 コラーダンまたは架橋したタンパク質）、シリコンウェハー、ポリマー、酸化し た金属表面またはその他の非伝導性表面の上に固定化してもよい。その他の固定 化方法には架橋、シランとの結合及び小胞、ミセル及び逆相ミセルにおける固定 化も含まれる。

本発明の１実施例では、環境におりて生起する化学反応の結果としての環境の物 理的または化学的変化を検出するのに電位測定触媒抗体のバイオセンサーを使用 することもできる。このような反応の１つはメチルｐ−ニトロフェニルカーボネ ート（Ｍｌ）ＮＰＣ）の加水分解であり、これは既知の触媒抗体によって触媒さ れる反応である。各ＭｐＮＰＣ分子の加水分解により２個の水素イオンを生成し て反応環境に変化を起こす、すなわち、−（が低下する。この反応は以下の通り である：ＭｐＮＰＣＰＮＰ スキーム１ 上記の反応に特異的な触媒抗体は抗体がこの反応を触媒するように下記の例１に 解説するようにして合成することができる。そのようにして生成した触媒抗体、 抗体４８Ｇ７を電位測定バイオセンサーに組み込む。

電位測定バイオセンサーには、加水分解に起因する一変化を検知し測定するトラ ンスジューサーとして組電極（イオン選択性電極）が使用される。図１に本発明 に準拠した組電極センサーを示す。ガラス管１０はこのセンサーの本体を構成す る。４８０７抗体は第１の膜と一感受性ガラス膜が検知エリア１８を形成するよ うに…感受性ガラス膜１６の表面上の第１の膜１４の背後に位置する、ろ紙が望 ましいが、スペーサー材料１２上に固定化または捕捉されている。第１の膜１４ は透析膜であることが望まし込。第１膜１４は締め付ケリング２０でガラス管の 末端に締め付けられてｂる。この締め付はリングは０−リングまたはシリコンゴ ムのチューブであってもよい。ガラス管１０は溶液２２（たとえば、０．１　Ｍ 　ａｃｘ　）が充填されその中に内部のＡｇ／ＡｇＣｌ電極２４が浸されて騒る 。

このセンサーをＭｐＮＰＣｆ含む試験溶液中に設定すると溶液は第１膜１４を通 って検知エリア１８中に通過する。検知エリア１８において４８Ｇ７で触媒され た加水分解の結果として生成した水素イオンは一感受性ガラス膜１６に向って拡 散する（同様にガラス膜から離れてゆく）。水素イオンがより多く生成すればそ れだけ検知エリアの濃度が上昇しその結果検知エリアを離れて大量の溶液中へイ オンが拡散する勾配かつ（り出される。検知エリアから拡散して出る速度が触媒 による生成速度に等しくなると定常状態に到達する。水素イオン生成速度は基質 ＭｐＮＰＣの濃度に比例するので、従って、−感受性ガラス膜における定常状態 の−は基質濃度の指標となる。化学量論的考察に基づくと、−電極が発生する情 報はｐ−ニトロフェノール（ＰＩＪＰ）、ＭｐＮＰＣ以外の他の加水分解の生成 物の濃度を計算するために処理することが可能である。従って、検知エリアにお ける変化を検出する以外にも、このセンサーは存在する分析対象物質を定量的に 検出する能力があり、さらに触媒抗体がセンサーに組み込まれているので、抗体 のその特異的抗原に対する結合は可逆的なのでこのセンサーが後続する分析で連 続的に使用できるように抗体の結合部位の再生が可能になっている。このような −に基づいた電位測定触媒抗体のバイオセンサーの使用法について下記の例でよ り詳細に解説する。

賢明な設計及びイオン選択性膜極で測定できるイオン種を生成または消費する関 心のある分析対象物質の反応を触媒する能力のある種々様々な触媒抗体の生産に よって本発明のバイオセンサーを使用する関心のある多数の分析対象物質に関す る定量法が便利になるであろう。本発明と一致する、他の１位測定電極がイオン 選択性膜に関連した電位変化の測定に代りに使用することも可能である。たとえ ば、被覆針金電極または電界効果トランジスタまたはＨａｆｅｍａｎら、ＵＳ特 許４４．５９１，５５０に記載されているもののようなその他の半導体トランス ジューサーもイオン濃度変化の測定にトランスジューサーとして使用できよう。

図２に本発明に準拠した別の型の電位測定触媒抗体バイオセンサーを示す。ここ に示すバイオセンサーは荷電感受性装置である免疫化学的感受性電界効果トラン ジスタ（工ＭＦＩＩ：Ｔ　）である。このトランスジューサーは半導体ｒ−）キ ャパシター２６で絶縁物３０に添付された膜２８、絶縁物３０は順番にシリコン 基板３２に添付されたものから構成されている。ドレーン３４からソース３６へ 流れる電流は半導体デートキャパシター２６上の荷電により変調される。ｒ−） キャパシターのデートエリア３８はトランジスター溶液界面４０がつ（られる溶 液に露出している。界面４０は水様溶液ではほぼ完全に分極したままになってｂ るイオン二重層を形成する。触媒抗体４２はトランジスター溶液界面４０に固定 化されている。触媒抗体４２が荷電をもつ抗！４４（分析対象物質、たとえば、 タンパク質、ポリペプチド、多くの薬物）と結合すると、正味の界面電荷が撹乱 され、この変化は下にある半導体デートキャパシターでモニターすることが可能 である。

このようにして半導体ｒ−）キャパシター２６がトランジスター溶液界面４０に 形成されたイオン二重層の正味の電荷の変化をモニターするのに使用される。抗 体は触媒性（すなわち、可逆性）なので、抗原は一過性にのみ結合し、従って、 分析対象物質の濃度が前の値に回復すると荷電の撹乱は消失する。

触媒抗体を組み込んだ電流測定バイオセンサーも分析対象物質の検出に使用され よう。図３では、電流測定バイオセンサーは一端が電極４８である管状トランス ジューサー４６で構成されている。電極４８はあらゆる不活性金属または他の不 活性な伝導体または半導体の材料、たとえば、白金、金、リン化インジウム及び ガラス状炭素のようなものでよい。電極４８は管状トランスジューサー４６を通 り電流計のような適当な測定装置に達する導線５０に接続されている。管状トラ ンスジューサーの内部はカプセル封じの材料５２（たとえば射出成形シラスチッ クまたはテフロン）で充填され材料５２が電極４８と導線５０を取り巻すてｂる 。管状トランスジューサー４６の電極端は０リング５６で定位置に保持された透 析膜５４によって包囲されてｂる。検知エリア５８は電極４８と透析膜５４で形 成されている。スペーサー材料６０、たとえば、−片のろ紙は触媒抗体で満たさ れて検知エリア５８に挿入されている。上記スキームＩに示した加水分解反応に 特異定な４８Ｇ７抗体はスペーサー材料６０に触媒抗体を捕捉して図６に示す電 流測定バイオセンサーの中へ組み込んでもよい。ついで管状トランスジューサー の先端を基質ＭｐＮＰＣを含む溶液に浸すと溶液は透析膜５４を通って検知エリ ア５８に入る。スペーサー材料６０上に捕捉された触媒抗体４８Ｇ７はＭｐＮＰ Ｃの加水分解を触媒してｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ　）を生成する。このよ うにして、生成物ＰＮＰはＰＮＰの対応する陽イオンへの酸化を介して電極４８ により検知エリア５８で検出される。電極４８をＰＮＰに対する適当な酸化電位 に保持することによって（約十Ｑ、９　Ｖｖ。

ＳＣＥ　）　、ＰＮＰは以下のように対応する陽イオンに酸化このようにして、 ＭｐＮＰＣの触媒による加水分解で生成するＰＮＰは酸化電流を検知して変換す る電極４８によってモニターされる。ついで酸化電流を測定しＰＮＰの濃度を計 算して得ることができる。

図４に本発明のインピーダンス（またはキャパシタンス）バイオセンサーｋ　示 ｔ。インピーダンスバイオセンサーは支持体材料６４に添付した電極６２から構 成されている。電極６２は導線６６によってインピーダンス測定装置６８に接続 されている。電極６２の表面上に触媒抗体７０が固定化されている。触媒抗体は イオン二重層内部の電極−溶液界面７４で分析対象物質７２（抗原）と一過性に 結合するために使用される。

イオン二重層上の抗体と結合した抗原が存在すると拡散二重層の実効誘電率が一 部変化して界面のインぎ一ダンスが変化する。この実効誘電率は種々の専門技術 によってモニターすることが可能で、通常は電極間にａｃ傷信号適用して電圧及 び電流の波形間の位相角の差異を測定する方法が含まれる。抗原は触媒抗体と一 過性にのみ結合するので、抗原濃度が前の値に復帰すると直ちに信号は逆転する 、すなわち、このセンサーは可逆的である。

本発明の別の実施例は光ファイバーに基づいた触媒抗体バイオセンサーである。

図５にこのような光フアイバーセンサーの略図を示し、また図６にその検出シス テムを示す。

図５及び６を参照すると、このセンサーは遮光性の密閉箱８０の中にある試料セ ルフ８へまた試料セルから光を搬送するのに使用する無作為に分散分岐したファ イバー束７６から構成されている。ファイバー束７６の内部には多数の試料セル へ光を搬送する励起ファイバー８２Ａと試料セルから反射光を搬送する多数の復 帰ファイバーがある。この代りに、２個の１本の光ファイバーを使用してもよい 。光源８４によって励起ファイバー８２Ａを介して試料セルに搬送される光が供 給される。このような光源の例としてはタングステンランプがある。フィルター ８６を励起ファイバー８２Ａと光源８４の間に置き選択した波長の光だけを透過 させてもよい。光電子増倍管８８は試料セルフ８から復帰ファイバーを通って復 帰する光の強さを測定するのに使用される。フィルター８９を復帰ファイバー８ ２Ｂと光電子増倍管８８の間に置き、たとえば、螢光放出またはルミネッセンス を測定するセンサーシステムで使用するために光電子増倍管８８に入る光を特定 波長域に限定するために使用してもよい。触媒抗体は薄す透析膜９２の付すてい るファイバー束７６の末端上に保持された一片のろ紙に捕捉されている。シリコ ンゴムチューブ９４はファイバー束７６へ膜９２を締め付けるのに使用される。

ファイバー束７６の末端の触媒抗体は反応を触媒して発色団を発生する。この発 色団はファイバー末端で光の一部を吸収し、その結果光電子増倍管８８に復帰す る反射光の量が減少する。これらのデータは光強度に比例する電圧に変換されて チャートレコーダー９６のような適当な装置で記録される。データをついでマイ クロプロセッサ−（示してない）に入力して発色団の濃度の分析及び計算を行っ てもよい。本発明のこの実施例は下記の例でさらに詳細に解説する。

本発明にはＥＣＬ　−ＴＡＧ検出システム、触媒抗体及び光ファイバーまたは光 導波管を連結した高感度選択性センサーも含まれる。図７にこのようなセンサー の構成を示す。図７を参照すると、透明電極９８が光ファイバーまたは導波管１ ００のいずれかの近くまたは表面に配置されている。この電極表面はたとえば、 白金、金、ガラス状炭素、インジウム−スズ酸化物などのようなＥＣＬ　−ＴＡ Ｇ検出システムに使用できるできれば伝導体材料であればどれでもよい。触媒抗 体１０２（または、そのＦａｂ分画ができればよい）は電極表面に固定化するか その代りに、別のしかし極めて接近した表面（示してない）に固定化する。抗体 １０２は望むらくは抗原の結合部位１０２Ａが電極表面から離れるような方向に なるように固定化処理によって定位させるとよい。リンカ−アーム１０４を介し て抗体に共有結合で付いているのは（または表面ないしは分子の近くの他のどこ か）　ＥＣＬ−活性部分（ＴＡＧ　）　１０６が抗原またはハプテンとつながっ たもの、つながれた抗原またはハプテン１０８から構成されている三機能性分子 である、これは抗原結合部位１０２Ａで抗体と弱く結合している。光はＥＣＬ反 応によって発生する。たとえば、このＴＡＧはルテニウムトリス−ビピリジン、 Ｒｕ（Ｂｐｙ）３でもより０つながれた抗原またはノ・ブテン１０８は触媒抗体 １０２に分析対象物質１１０より弱対象物質１１０が存在しないと（これはつな がれた抗体１０８より大きな結合平衡定数をもつ）、つながれた抗原またはハシ テン１０８は抗原結合部位１０２Ａに結合してＴＡＧ　１０６は電気化学的に放 棄されるのでＥＣＬは不活性になる。分析対象物質１１０が存在すると、つなが れた抗原またはハプテン１０８は結合部位１０２Ａを競合することにより迅速に 置換し、さらに解放されたＴＡＧ　１０６は電気化学的になり従ってＥＣＬが活 性になる。解放されたＴＡＧ　１０６は電極の近傍で光電子をつくって電極９８ でＥＣＩ、過程に参加する。

ＥＣＬ反応で発生した光の一部は光ファイバーまたは導波管１００で捕捉されつ いで検知エリアのセンサーから検知環境の外への経路でたとえば、光電子増倍管 のような外部の光測定機器へ導かれる。ＴＡＧ　１０６はＫＣＬの過程では消費 されないのでＴＡＧ　１０６が抗体結合部位１０２Ａに結合しない限りＥＣＬ過 程を介して自由に連続して光電子を発生し続ける。プローブ型構造にセンサーを 保持するためには、光測定機器１１２はセンサー（たとえば、光感受性半導体素 子ダイオードまたは半導体基板に集積したトランジスタ、示してない）の一部と するかさもなければこの光をプローブから光測定機器１１２へ導波管または光フ ァイバー１００を通して導くべきである。

むしろ、分析対象物質が結合部位から迅速に放出されるように抗体は分析対象物 質のある種の反応を触媒するべきかもしれない。こうすれば分析対象物質の濃度 が減少したとき、つながれた抗体またはハプテンが抗体と再結合するのが可能に なるからである。使用する触媒抗体はつながれた抗体が検出過程中に一部変化す ることがないようにつながれた抗体とのいかなる反応も触媒してはならない。つ ながれた抗原が分析対象物質で置換されな込ように、つながれた抗原は分析対象 物質よりも低い結合定数をもつように設計することも望ましい。

本発明には分子認識素子として触媒抗体を使用する熱量測定バイオセンサーも含 まれる。触媒抗体は関心のあるある種の分析対象物質の反応を選択的に触媒する ために使用される： 触媒される反応は熱を発生（発熱反応）するものでも熱を吸収（吸熱反応）する ものでもより０反応により発生または吸収される熱の検出には温度トランスジュ ーサーが使用される。関心のある分析対象物質の存在は分析対象物質を生成また は消費する反応の熱に基づいて熱量測定法によって検出すればよい。トランスジ ューサーはたとえば、熱電対、抵抗温度検出器、集積回路温度検出器またはサー ミスターのような周知の温度トランスジューサーであればどれでもよい。できれ ば、触媒抗体はセンサーとしてプローブ型バイオセンサーが使用できるように温 度トランスジューサーの表面上または近くに固定化する。本発明に準拠した代表 的熱量測定バイオセンサーシス′テムを図８に示す。

このシステムは入口１１６に接続したサンプリングバルブ１１４から構成され、 １１６は順番に２チヤンネルポンプ１１８にさらに接続されている。ポンプ１１ ８は一対のカラム１２０Ａ及び１２０Ｂに接続されている。カラム１２０Ｂは関 心のある分析対象物質の反応を触媒する触媒抗体で充填されており、これはカラ ム内部に固定化されている。力２ム１２０Ａは触媒抗体を含まず従って、内部標 準として使用される。サーミスター１２２Ａ及び１２２Ｂはカラム１２０Ａ及び １２０Ｂの末端にそれぞれ添付されている。各サーミスター１２２Ａ及び１２２ Ｂは電気的にホイートストンブリッジ１２４に接続されている。排液出口１２６ Ａ及び１２６Ｂもそれぞれ各カラム１２０Ａ及び１２０Ｂに付−ている。ダブル ジャケットの硬質ガラスの筐体１２８がカラム１２０Ａと１２０Ｂを取り囲んで ｂる。

筐体１２８は温度制御した水槽に浸たされる（示してない）。運転時には、担体 バッファー溶液がサンプリングバルブ１１４を通って入口１１６へ供給され、つ いで２個のカラム１２０Ａと１２０Ｂを通って２チヤンネルポンプによって排液 出口１２６Ａと１２６Ｂに送られる。触媒される反応の反応物質を含む溶液はサ ンプリングバルブ１１４を通して担体バッファー溶液中に注入されさらに上記に 解説したようにシステムを通してポンプで送られる。試料溶液がカラム１２０Ｂ にポンプで送られると、カラム上に固定化された触媒抗体が熱を発生または消費 する反応を触媒する。この熱を熱変化をホイートストンブリッジ１２４への電気 的接続に変換するサーミスター１２２Ｂで検出する。

溶液はついで排液出口１２６Ｂを介してカラム１２０Ｂを通過する。ホイートス トンブリッジ１２４は電位計（示してない）に接続されサーミスター１２２Ｂと 参照カラム１２０Ａ上のサーミスター１２２Ａとの間の微分抵抗をモニターする のに使用する。電位計のアナログ出力は入力データを処理して関心のある分析対 象物質の濃度を与えるマイクロプロセンサー（示してない）を使用してモニター される。

本発明の別の実施例では、触媒抗体を圧電化学センサーの選択的かつ可逆的分子 認識素子として使用する。

図９にバルク音波（ＢＡＹ　）化学センサーを示す。図１０に圧電結晶を装着す るのに使用する筐体を示す。

両方の図９と１０を参照すると、アルミニウム電極１２９が石英結晶１３１の上 部と底部に添付されている。フォイル１３３で結晶１３１への電気的接続がなさ れている。フォイル１３３は白金または銀のような伝導性材料であればよい。結 晶１３１はシリコンｏリング１３５で硬質ガラス筐体１３７に保持されている。

触媒抗体（示してない）はアルミニウム電極１２９上にポリアクリルアミドデル 中でまたは直接にアルミニウムに既知の方法で固定化する（２６）。ＢＡＹ化学 センサーの使用法を下記の例でさらに解説する。

本発明のなお別の実施例では、触媒抗体は関心のある分析対象物質の濃度変化に 迅速に反応する高感度で選択性のバイオセンサーを得るために脂質二重層バイオ センサーに組み込まれている。触媒抗体脂質−二重層は触媒抗体がその膜上また は膜中に固定化または修飾されている平面二層脂質膜に基づくものである。触媒 抗体は浴槽溶液から関心のある分析対象物質に特異的に結合する。膜−溶液界面 に分析対象物質が存在すると界面の構造が撹乱され、結果として膜内外のイオン 種の流れに対するエネルギー障壁が変化する、すなわち、イオン透過性と電気的 インぎ−ダンスが変化する。この抗体は固く結合していな込分子種に限って分析 対象物質の反応を触媒するので、分析対象物質は抗体とは瞬間的にしか結合せず 、従って、このシステムの反応は可逆的である、すなわち、脂質二層膜センサー は分析対象物質濃度が増加しても減少しても反応する。

本発明に準拠した脂質二層バイオセンサーは図１１に示すような構造が望ましい 。ＢＬＭ　１３６はＬａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔの方法を使用して蒸着 させるかまたはヒドロゲル支持体１３８の表面上に自己集合の方法で蒸着させる 。これらの方法は技術的には既知のものである（６０）。ヒｒロデル支持体は支 持するためだけでな（ＢＬＭに必要な水様住環境を保持するので使用される。絶 縁基板１３７は銀の薄層１４０で被覆されている。薄層１４０の表面１４２はＡ ｇＣ］−の薄層をつくるために塩素添加される、これによって伝導度変化を測定 するＡｇ／ＡｇＣ１準参照電極をつくる。外部の電流増幅器１４４は膜を通過す る電流、１ｍを増幅するために使用され、この膜電流は水槽溶液中の参照電極１ ５１に装着した電圧源１４９で膜に適用した小さな電圧撹乱に対する反応によっ て膜を通して流れるものである。この電流増幅器はミクロ製造技術を使用して絶 縁基板１３７に集積することが望ましい。ＤＣ電位を発生させるおそれのあるイ オン濃度勾配を回避するためには、ａｃまたはパルス波ｄａの撹乱電位のいずれ かを使用する方が望ましい。

触媒抗体１４６はＢＩ、Ｍ　１３６に固定する。荷電のあるまたは双極性の分析 対象物質（抗原）１４８は溶液−膜外面１５０に接近して触媒抗体と結合する。

分析対象物質１４８がＢＬＭ　１３６のイオン伝導度に影響するためには、ＢＬ Ｍ１３６中の脂質分子とのイオン性及び双極性の相互作用がその構造を攪乱でき るように可能な限り接近することが重要である。電流増幅器１４４の出力、ｖｏ ｕｔは膜を通過する電流、工□に比例する。

脂質二層膜１３６の表面における触媒抗体１４８による分析対象物質１４８の結 合と加水分解は膜の物理化学的性質を攪乱しくたとえば、双極子−双極子、荷電 −荷電、及び／または荷電−双極子相互作用または反応生成物の脂質膜への分配 ）、これが膜通過電流の部分的変化をおこす。このように、電流増幅器の出力は 水槽溶液中に分析対象物質が存在することを示す。この代りに、もし基質が水槽 溶液に含まれている場合はこの触媒抗体の触媒的性質の阻害剤の存在及び／また は濃度も検出される。

図１２Ａ−Ｄに示すように多種多様な方法が触媒抗体を脂質二層膜にまたは膜中 に固定するのに使用される。図１２Ａに、このような固定化が可能になるように 特別に合成した脂質分子に共有結合で付すている触媒抗体を示す。図１２Ｂに触 媒抗体のＦａｂ分画のみが固定化されて結合部位と界面との間の距離を最小限に した以外は同様の配置を示す。この代りに、触媒抗体を膜の天然または合成のタ ンバク質分子に共有結合で付けてもよい。図１２０に、触媒抗体のＦａ’ｂの部 分を通常は細胞膜に包埋されて見出されるロドプシンのような第２タンパク質分 子の膜関連領域に共有結合で付けたものを示す。膜関連領域は末梢または統合− 膜タンパク質のいずれでもよ（また完全に脂質膜に付いてｂても図１２０に示す ようにその中に包埋されていてもよい。図１２Ｄには、触媒抗体のＦａｂ部分が 非極性脂質二層膜内部環境をエネルギー論的に好む疎水性アミノ酸から合成した 合成ポリペプチドに共有結合で付いているものを示す。これらの配置は触媒抗体 、またはその一部分が膜−溶液界面に固定する多くの異なった方法の極く数例に 過ぎない。

本発明に準拠したセンサーによって触媒抗体の結合または触媒活性のいずれも検 出することを可能にするものである。従って、センサーはこの抗体の結合部位の 触媒活性のある抗原に結合するほぼどんな分子の濃度でも測定するのに使用する ことができる。阻害剤の存在下では、この触媒活性が着るしく減少するので、阻 害された触媒活性の測定は阻害剤の濃度を示すものである。

従って、本発明は分子認識素子として触媒抗体を組み込んだバイオセンサーを企 図するものであり、これは触媒作用阻害剤の存在及び／または濃度を検出するの に使用する。たとえば、フオスフオリルコリン（コリンエステルの加水分解に対 する遷移状態の類似体）と結合する種々の抗体が同定されている。さらに、モノ クローナル抗体（ＭＯＰＣＩ　６７　）と結合する少くとも１種の７オス７オリ ルコリンが芳香族コリンエステルの加水分解を触媒することが報告されている（ ６１）。

このように１実施例では、図１に示したーに基づくバイオセンサーがコリンエス テラーゼ阻害剤またはコリンエステラーゼ及びコリンエステル結合タンパク質（ アセチルコリン膜レセプター）の存在下で抗体ＭＯＰＣＩ６７の触媒活性のモニ ターに使用できる可能性がある（　Ｈａｚｌｅｔｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ 　Ａｍｅｒｉｃａ、工ｎＣ，。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌθ、　ＭＤ　）。このような阻害剤には現在化学的及び生物学 的兵器として使用される多数の神経毒が含まれる。バイオセンサーには芳香族コ リンエステルの加水分解を触媒する触媒抗体ＭＯＰＣＩ６７が組み込まれている ： ＴＡＣ ｏ２Ｎ（ＱΣｏ−＋　ＨＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）３＋ａｃｏ、；＋２ ａ＋抗体ＭＯＰＣ１６７の調製法は既知である（３２）。抗体ＭＯＰＣ１６７は 芳香族コリンエステルと結合し反応に対する遷移状態の構造をエネルギー論的に 安定化させる。反応生成物はゆるく結合しているので加水分解生起後に結合部位 から拡散して、触媒部位は再生される。

ＭＯＰＣ１６７をその分子認識素子として使用するバイオセンサーは抗体の触媒 部位に結合する分子の存在を検出するのに使用してもよい。

さて、図１に示したバイオセンサーに言及すると、ＭＯＰＣＩ　６７は膜１４と 一感受性ガラス膜１６０間のスペーサー材料１２上に捕捉されている。センサー の先端は透析膜を通ってＭＯＰＣ１６７抗体金含んで込る検知エリア１８に拡散 する芳香族コリンエステルを含んでいる溶液に浸たされている。抗体は芳香族コ リンエステルの加水分解を触媒し、検知エリアの−を変える酸を生成する。芳香 族コリンエステル存在下の一定化の測定は、従って、ＭＯＰＣ１６７抗体の触媒 活性の指標である。もし阻害剤を含む試料を水槽溶液に添加すると、これが検知 エリアに拡散して検知エリアの−が水槽溶液の値に向って上昇するように抗体の 活性を阻害する。

このやり方で、阻害剤の存在及び／または良度がモニターされる。このように、 触媒抗体センサーを使用して阻害剤の存在について試料を試験することもできる 。

バイオセンサーは阻害剤を含んでいないバッファー溶液中に約６０分間浸けてお くことによって再生することができる。阻害剤バイオセンサーの他の実施例は種 種のトランスジューサー及び／または触媒抗体が使用される場合が考えられよう 。

触媒抗体の調製 触媒モノクローナル抗体はＫＯｐｒＯＷＳｋｉらによって開示された技術を修飾 した方法で調製される、１９８０年４月１日発行ＵＳ特許腐４．１９６，２６５ 、これはここに参考文献として組み込まれている。この過程の詳細は技術的には 既知である。特異的反応物を目指して一連のモノクローナル抗体が適当な条件の 下で調製される。これには適当な抗原を用いる最初のＢＡＬＢ／Ｃマウスの免疫 処置が含まれる。抗原は希望する反応物でもよい；希望する反応物はペプチドま たはその他の担体分子に結合する；反応中間体；または反応物の類似体、生成物 または反応中間体でもよい。ここで使用する用語の”アナログには異性体、同族 体または化学構造に関してその反応物と十分に類似しているその他の化合物でア ナログに対してつくった抗体は反応物との免疫反応に参加するがそのアナログの 反応を必らずしも触媒しないものを包含することとする。

抗体産生リンパ球を免疫処置したマウスの牌臓から除去し、さらに５Ｐ２１０細 胞のような骨髄腫とハイブリダイズしてハイブリドーマを発現させた。これらの ハイブリドーマ細胞をつぎにマイクロタイタープレートのウェルで平板培養する 。この一連のモノクローナル抗体をハイプリドーマ細胞によって産生させ適当な 条件下で希望する反応を触媒するモノクローナル抗体を同定するために適当な条 件下でスクリーニングを行った。スクリーニングは反応物の標準溶液をマイクロ タイターウェルから抜き取った培地を等分して処理すれば容易に実施できる、つ ぎに従来の機器による方法で存在する希望した生成物を測定する。この測定はた とえば、分光光度法またはガス−液または高速液体クロマトグラフィーで容易に 実施することができる。

希望した生成物または反応物の標準試料との比較により、反応速度が計量しても よい。このやシ方で、／Ｓイブリドーマ細胞を含むウェルが触媒モノクローナル 抗体を産生じているのが確認される。選定したハイプリドーマ細胞をつぎに培養 してコロニーをつくる。

これらのコロニーをさらに＞−Ｂ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖ□の方式で増 殖させてもよい。後者の場合は、同遺伝子型のＢＡＬＢ／Ｃマウスのようなマウ スに選定したハイブリドーマ細胞を腹腔内に接種して、一般に２ないし３週間以 内に腫瘍をつくる。これらの腫瘍は希望したモノクローナル抗体を含む腹水癌を 伴う。ついでモノクローナル抗体は限外ろ過、超遠心、透析及び免疫アフイニテ イクロマトグラフイーのような従来の方法で腹水癌から分離回収される。

ある酵素に対する基質として知られている抗原を目指すモノクローナル抗体を調 製して使用し基質の生成物への転換速度を増加させてもよい。この方法はたとえ ば、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガニ９／）シト、酵素β−〇−ガラクトシダ ーゼの基質として知られるものを０−ニトロフェノール及びβ−Ｄ−ガラクトー スに転換する速度を増加させるのに有用である。この方法で、この酵素に対する 一連のモノクローナル抗体が上記に解説した一般的技術に準拠して酵素をＢＡＬ Ｂ／Ｃマウスに接種して進めることによって調製されている。

このようにして産生じた一連の抗体を適当な条件下でスクリーニングしてこの酵 素の活性部位に結合する最初のモノクローナル抗体を同定する。このようなモノ クローナル抗体は適当な条件下で酵素に対する抗原（基質）の結合を阻害した抗 体についてスクリーニングを実施して同定してもよい。このスクリーニング過程 は酵素の結合活性を測定する従来の方法、たとえば、ラジオイムノアッセイ（Ｒ 工Ａ）によって便利に実施してもよい。このようにして同定された最初のモノク ローナル抗体は一般的な技術に準拠して分離回収され、新規のＢＡＬＢ／Ｃマイ スに接種するのに使用される。一般的技術に従って最初のモノクローナル抗体に 対する一連のモノクローナル抗体が産生される。このようにして産生した抗体は ゛抗イディオタイプ”モノクローナル抗体と呼ばれる。一連の抗イデイオタイプ のモノクローナル抗体はつぎに一般的な方法に基づいてスクリーニングを実施し て、適当な条件下で抗原（基質）と結合してこれを生成物に変える抗イデイオタ イプのモノクローナル抗体を同定する。”適当な条件”とは抗体−反応物複合体 形成に必要な上記に解説したパラメーターの範囲内の条件を意味するも、のとす る。このようにして産生じた抗イデイオタイプのモノクローナル抗体は本発明に 一致して基質の生成物への転換速度を増加させるために使用してもよい。

共通因子によって別の方法で触媒される反応を触媒する能力のあるモノクローナ ル抗体を調製するには、反応物または反応物または生成物に結合させた共通因子 をマウスに接種し、さらに上記に引用したＫｏｐｈｏｗｓｋｉの一般的方法に従 う。一連のハイプリドーマ細胞をつぎに一般的方法に従って調製し、さらに遊離 の共通因子及び反応物と複合体を形成し、化学反応速度を増加させまた生成物を 放出することができるモノクローナル抗体についてスクリーニングを実施する。

このようなモノクローナル抗体は、たとえば、インドールピルビン酸−ピリドキ サミン・リン酸イミンに対して指向し、インドールピルビン酸のアミノ酸トリプ トファンへの転換速度を選択的に増加させる。できれば反応混合物に適当な共通 因子を少くともモノクローナル抗体と等モル数の量だけ添加することが望ましい 。

ある特定の反応に対する触媒モノクローナル抗体を発生させる方法はＪａｃｏｂ ｓらの”触媒抗体”、Ｊ、　Ａｍ。

Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１０９，４７　、２１７４−２１７６（１９８７）及 びＮａｐｐｅｒらの゛抗体によって触媒される立体特異的環化”、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２３７　、１０４１−１０４３（１９８７）に開示されている、この開示の 参考文献はこ＼に文献の欄に組み込まれている。Ｊａ−ｃｏｂｓらに従った触媒 抗体の調製の例は例１における特異的加水分解反応を触媒できるものである。

例　１ ｐ−ニトロフェニルカーボネートの加水分解を触媒することができる触媒活性抗 体４８Ｇ７の調製相当するカーボネー）　（１１の水溶液加水分解反応に対する 、正４面体のニトロフェニルホスホネート遷移状態類似体（２）に対してモノク ローナル抗体を特異的に発現させた。

（〜　抗原の調製 ４−ニトロフェニルホスホ、＋　−ト（２１ｔ−トリエチルホスファイトとメチ ル５−ブロモペンタノエートカラ５段階で合成した。ホスホネート（２）を、ｐ Ｈ５，０の希塩酵中で、１−（３−ジメチルアミノ）プロピル）−３−エチルカ ルボジイミドを用いることにより担体たん白質であるウシ血清アルブミン（ＢＳ Ａ　）とキーホールリンペットに結合させ、ｐＨ７，４の１０ｍＭホスフェート −１５０ｍＭ　ＮａＣｔバッファ、−に対して徹底的に透析した。ニトロフェニ ルホスフェート共軛体を加水分Ｍｆることによってハプテン／担体の比を定量し たところ、１５：１の範囲内の比率が得られた。５ケの炭素からなるスペーサー の方向と長さは、抗体が、ホスフェート残基を抗体の表面に近づけ、水と接近で きるように結合するであろう確率を最大にするように選ばれた。

（Ｂ）　モノクローナル抗体の調製 ＢＡＬＢ／ＣマウスをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント中で乳濁液とした１３Ｓ Ａ−ホスフェート共軛体で免役させた。

細胞融合の相手としてＳ　Ｐ　２１０ミエローマを使用する標準法によって細胞 融合を行った。ＩｇＧ’ｊ腹水から、セファロース４Ｂに結合させたプロティン Ａ上でアブイニテイークロマトグラフイーを行って精製し、反応液バッファーに 対して徹底的に透析した。抗体は、１０チナトリウムドデシルサルフエートポリ アクリルアミドデル電気泳動を行い、クーマシーブルー染色した結果均質である と判定された。

ＫＬＨ−ホスホネート（２）付加体に対するモノクローナル抗体の発生により競 合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて阻害的であった２０のＩｇＧ’Ｓを与えた。

４．４μＭ抗体の存在（Ｋ観察された）及び不在（Ｋ観察されず）におけるカー ボネー）　Ｉ　（１１の加水分解の速度は基質濃度の函数として決定された。カ ーボネートの加水分解は、１０ｍＭトリス−塩酸中ｐＨ８，５３０’Ｃでニトロ フェル−トイオンの放出にょる４　００　ｎｍにおける吸収の増加を追かけるこ とによって追跡した。

ＩｇＧはカーボネート（１）の加水分解を、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−ｍｅｎｔｅｎ の速度式（１）と一致する反応速度で触媒することが見出され、ＫｃａｔとＭｉ ｃｈａｅｌｉｓ常数［：Ｉｇ〕＋　ｆｌ）→（Ｉｇ（１１１→［Ｉｇ’）千生酸 物Ｋｍはそれぞれ１．４±０．２分及び６６０＋１２０μＭであることが見出さ れた。このＩｇＧはＫ。ａｔ、　＝　２９分−１及びＫＭ　−３５０μＭであり 、反応促進の割合は、バックグラウンドの１６，０００倍であった。ＩｇＧは触 媒活性抗体４８Ｇ７と名付けられた。

（Ｃ）　触媒活性抗体４’ＢＧ７の使用触媒活性抗体は例２−７において記述さ れたようにバイオセンサとして用いることができる。

例　２ −に基いた触媒抗体バイオセンサによるｐ−ニトロフェニルカーボネートの加水 分解の結果として−の変化を検知すること。

酵素電極の配座と似通った配座をとっている酵素擬似体としての触媒抗体を組み 込んでいる−に基いた触媒抗体バイオセンサを用いてメチルｐ−ニトロフェニル カーポネー）　（ＭｐＮＰＣ）の加水分解の促進の結果起る−の変化を測定した 。触媒抗体４８Ｇ７は、前に述べｆｃ（スキームＪ　）　ＭｐＮＰＣの加水分解 反応を触媒することが示された。触媒抗体４８０７は、例１中で記載されている 方法論にしたがって合成され、その触媒活性が確認される。

触媒抗体４８Ｇ７は、天然の酵素に較べると比較小さい反応促進！’（ｒ生成す る。したがって、観察された−の差は小さいが再現性のある形で容易に測定する ことができる。その上、基質ＭｐＮＰＣの自然発生的加水分解速度は、有意性が あり、触媒抗体の存在のためではないバックグラウンドの一変化奮起す。図１３ には、これらの制限条件を取り除くのに用いられた検知システムが示されている 。２つの小型−電極１５２と１５４を用いて２つの差をモニターした。４８０７ 触媒酵素を１つの電極１５２に捕獲し、非特異的抗体を他の電極１５４に捕獲し た。３着目の対照電極１５６も用いた。

２つの小型…電極１５２と１５４　（Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏ−ｄｅｓ　Ｉｎ ｃ、、　Ｍｏｄｅｌ　Ｍ　Ｉ　−４０４）を、図１３に示しであるように、２つ のＫｅｉｔｈｌｅｙ　６１７１を位計を用いた非恒温槽中でモニターした。ＩＢ Ｍ／ＰＣ１６２を用いて、２つの電位計からデータを得て、保存し、そして２つ のシグナルの間の差を計算し表示した。Ｉ　ＢＭ／ＰＣも取得し貯蔵したデータ に基いて種々の化学分子種の濃度を計算することもできる。

電極は図１において前に示され、記述されたように形成された。今回１と図１３ について言うと、１枚の薄い（約０．２龍の厚さ）、直径２．５Ｉｍの濾紙（ワ ットマン＋２）ｔｌ−扁平ガラス−電極１５２と１５４のそれぞれの組電極の各 々の端に置いた。１μノの部分量の濃縮たん白質（約２００１ｎＩｉ／廐）を、 次に濾紙の上に加えた（すなわち４８Ｇ７触媒抗体を電極１５２上にそして豚ガ ンマ−Ｇを電極１５４の上に）。次に、薄い透析膜（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　、　５ｐｅｃｔｒａ／　Ｐｏｒ　２　）の 濾紙の上に置き、内径２．５間の１片のシリコンのゴム管とともに保持した。

対照電極１５６と２つの組電極１５２と１５４ｔ−２，５ｍｌのｐＨ８，５のバ ッファー（０，１４ＭＫＣｔ、　０．ＯｉＭトリス、　０．０２　％アジ化ナト リウム）中に入れ、３６時間安定化させた。２つの電位の間の差は、溶液におい て２，３分だけ安定であった。溶液に約１２時間後いた後（示してない）、Ｍｐ ＮＰＣに対する応答は、約１２時間であったが、測定の残りは溶液中で約３６時 間後に行った。２つの電位の間の差は、溶液中で２．６分間だけ、安定であった 。ＭｐＮＰＣに対する応答は溶液中で約１２時間後に（ｆＡ１１定した）が測定 の残りは溶液中で約３６時間後に遂行された。

図１４には、ＭｐＮＰＣの２つの連続的添加と希釈に対する電極の差別的応答を 示す。示でれた時間においては、ＴＨＦ中の５　［］　ｍＭ　ＭｐＮＰＣ１０μ ｉ　’ｒ：加えた。（（Ｍ、ｐＮＰＣ−２２０μＭ）。溶液を、次に示しである ようにバッファー（最終ＣＭｐＮＰＣ）　＝　３１−４μＭ）を加えることによ って希釈した。

図１５は、電極を触媒を効果的に阻害する遷移状態類似体（ＴＳＡ　）、５０μ Ｍ中に電極をインキュベートした後にＭｐＮＰＣの添加、希釈に対する電極の応 答を示している。

図１６は、ＴＳＡをバッファー中で２時間洗うことによって電極から取除いた後 、電極の差別的応答を示す。

電極の差別的は小さいが、再現性があった。応答の方向（正の差別的応答）は、 触媒抗体電離の表面におけるＨ＋の産生について予期した通りでちった。試料溶 液の希釈したとき、センサシステムの応答反応は減少し、触媒抗体センナは可逆 的であることが確められた。実験的条件は応答反応の大きさを増加させるために 最適化することができることは疑いない。

ＴＳＡは触媒抗体によって結合され、その触媒活性部位を不活性化するので、Ｔ ＳＡの存在においては、センナシステムは、期待されるように、ＭｐＮＰＣを添 加しても応答しなかった。ＴＳへの存在において、なんら反応がないことは、応 答は、実験的な人為産物ではなく、電極上のたん白質の触媒活性によることの積 極的な証明である。センサシステムの応答はＴＳＡへの暴露後、ＴＳＡの存在し ないバッファー中にヘセン？’ｅ！けることによって、センサの応答は再生し、 応答は可逆的でチシ、ＴＳＡの存在において応答がないことは人為産物ではない ことを再び実証している。したがって、触媒活性のそう失または阻害は、このセ ンナにおいて、ＴＳＡ　または、関連化学物質種の濃度をモニタするのに用いる ことができる。

例　３ 光ファイバーに基いた、触媒抗体バイオセンサを用いてｐ−ニトロフェノキサイ ド（ＰＮＰ　）を検出することによるメチルｐ−ニトロフェニルカルボネート（ ＭｐＮＰＣ）の存在を検知すること スキームＩにおいて記述され、示されたように４８０７抗体で触媒されたＭｐＮ ＰＣの加水分解の結果として産生され７′ｃｐ−ニトロフェノキサイド（ＰＮＰ 　）の存在は光ファイバーに基いた触媒抗体バイオセンサの使用によって検知き れた。囚５は光フアイバーセンナの模式図を示している。図６には検知システム を描かれている。図５及び図６に関しては、波長を４０５　ｎｍ領域に限定する ために、ランプと励起ファイバー８２Ａの間に干渉フィルター８６を有する光源 として、タングステンランプを用いた。４８Ｇ７触媒抗体で満たされた濾紙９０ は、薄い透析膜９２のついたファイバーの束の端の上に保持された。透析膜９２ は、ファイバ−の束７６の端にシリコンラバーの管９４によって固定された。光 ファイバーの束７６の端にある触媒抗体は、り０％フォア−ＰＮＰ　（Ｅ４００ ｎｍ　−１８，３００Ｍ−１ｃｍ−”　）を形成する反応を触媒する。

クロモフォア−は、ファイバーの束の端における光の部分を吸収し光増複管へ光 が反射して戻るのを減少させる。バックグラウンドの自然発生的加水分解速度は 大きいので、抗体の触媒的活性による反応全決定するために、差別的測定が必要 である。データは、Ｈｅａｔｈ　５ｔｒｉｐ−ｃｈａｒｔ　ｒｅｃｏｒｄｅｒ　 ９　（５で記録され、後に分析のためＩＢＭ／ＰＣ（示されていない）へインプ ットした。ＩＢＭ／ＰＣはＭｐＮＰＣの濃度を計算するためプログラムを行う。

光フアイバーセンナの調製は、例２において上に述べたような組電極センサの調 製とはゾ同一であった。

直径８　ｍｍ、の薄いフィルターペーパー（約０．２ｍｇ）（ワットマン４２） ｔ−光ファイバーの束の端の上に位置させた。１ｏｘｉの濃縮（約２００ｍｐ／ ｍＡ）４８ｏ７触媒抗体をフィルターペーパーに適用した。次に、薄い透析膜（ ＤＩＡＣＨＥＭ八１［１，１へ）’（Ｃフィルターペーパーをおおってのせ、内 径６．４１１１１＋のシリコンゴム管の一片とともにその位置に保持した。

光ファイバーｔ５／ｄのバッファー（例２に使用されているバッファーと同一） を含む光を遮閉したセルの中に入れ、透過光のシグナルが安定化する迄放置し九 （約２５分）・基質、ＭｐＮＰＣを、時折セルを開けて光ファイバーを除くこと によってガスクロ用注射筒で加えた。ブタγ−Ｇたん白質（非触媒的プロティン ）で触媒たん白質を置き換えることによって対照測定を別の実験において行った 。

ＭｐＮＰＣに対する応答は、ＴＳＡの存在と非存在また検知領域からバッファー でＴＳＡを洗うことによってセンサを再生した後測定した。結果は図１７と１８ に示されている。

図１７は、２５０ＢＭのＭｐＮＰＣの添加に対する、２つの異るが、同一に調製 した光フアイバーセンサの応答？比較している；４１の記号は非阻害的４８Ｇ７ センサ（すなわち、ＴＳＡの不在下における）の応答を表し、＋の記号はＴＳＡ で阻害したセンサ（すなわち、ＴＳＡの存在における）の応答である。ダイアモ ンド記号は２つの記号の間の差を示す。

図１８は同じセンサのＴＳＡ阻害剤の存在（＋記号）と、ＴＳｋ阻害剤（４）の 記号）を洗い出した後の両方における応答を比較している。ダイアモンドの記号 は両者の差を表している。

ＴＳＡの存在下の応答は基質の自然発生的加水分解のバックグラウンドによる光 吸収を表している。非阻害−触媒抗体の存在においては、はるかに大きな反応が 歓談された。その差は、抗体の触媒活性の存在によるセンサの応答を表している 。

例　４ 湿度感受性トランスデユーサ−であるサーミスターを内蔵した熱量測定触媒抗体 バイオセンサーを用いて、ＭｐＮＰＣの加水分解に関する反応熱を、触媒抗体４ ８０７を反応の選択触媒として測定し、その結果を止揚の如くスキーム１に示し た。バイオセンサーシステムハ図８に示す。調節ボアグラス（網目４０−８０、 ボアー直径５５　ｎｍ　；コーニンググラス製）上に固定化されたたん白質（１ ２０Ｂ中の４８０７触媒抗体及び１２０Ａ中のブタｒ−Ｇ）を填めた２本のカラ ム１２０Ａ及び１２０Ｂ（内径５　ｖｔｘ　＋長さ２５ｍｍ）’！ｅ、高温水浴 中に浸した二重壁プレキシグラスハウジング１２８中に入れた（図示せず）。た ん白質はＷｅｅｔａｌｌの方法に従って、３−アミノグロビルトリエトキンシラ ンで変質し、グルタルアルデヒドで処理することによって、調節ボアグラス上に 固定化した。２チヤンネル嬬動性ポンプ１１８　（ＬＫＢモデル１２０００）を 用いて、０．１４Ｍ　Ｋｃｔ　、　０．０１　Ｍ　）リス、０．０２％窒化ナト リウム。

ｐＨ８，５溶液を２つのカラムｃｏ、ｓｍｚＺ分）を通じて吸引した。３０にΩ サーミスター１２２人及び１２２Ｂ（オメガエンジニアリング）ヲ、そｎぞれカ ラム１２０Ａと１２０Ｂの出口に置いた。微分抵抗のモニターはＷｈｅａｔｓｔ ｏｎｅ　ｂｒｉｄｇｅ　１２４とエレクトロメーター（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ　ｍｏ ｄｅｌ　５１７　）　（図示せず）を用いて行なった。エレクトロメーターのア ナログ出力はデータ読み取ジ板（Ｍｅｔｒａｂｙｔｅ　ｍｏｄｅｌ　ＤＡＳ　− １６）　ｋ備え付けたＩＢｌ＆ＰＣ（図示せず）ｋ用いてモニターした。

ＭｐＮＰＣの試料（１０−２００ＢＭ）は１００μｌの試料ループ付きのサンプ リングパルプ１１４を用いて運搬流中に注入される。

例　５ バルク音波圧電トランスジューサーを使用する４８Ｃ）７触媒抗体によるメチル ｐ−ニトロフェニルカーボネートの粘合の検出 ４８Ｇ７触媒抗体を組み込んだバルク音波圧電トランスジューサーを使用してＭ ｐＮＰＣの抗体との結合を検知してＭｐＮＰＣの存在を検出した。１９に示すよ うに、ＡＴ−カットした石英精品１３１（１−１０ＭＨｚ）をアルミニウムの薄 膜（２００−８００ｎｍ　）で結晶の両面を被覆してアルミニウム電極１２９を つくった。

図１０には一面のみが溶液に露出するようにこの結晶をシリコン０リング１３５ で硬質ガラス筐体１３７中に保持したことを示す。４８Ｇ７触媒抗体はアルミニ ウム電極の表面に固定化する。結晶への電気的接続は銀箔１３３で行う。ラジオ 局仮数の増幅器（示さない）を結晶と共に使用して結晶を固有共振周波数で駆動 してフィードバックループを形成する。発振周波数は周波数カウンターで測定す る（示さなＩＡ）。測定はファラデーケージ（示さない）内で実施しノイズを除 去する。

結晶とホルダーはｉｏｏｆｆｉｔｇ器に固定して、２５ｍ１の０．１４　Ｍ　Ｋ Ｃｌ　、　０．ＯＩ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　、　０．０２％アジ化ナトリウムｅｐ８８ ．５のバッファー溶液を注意深く加えて小量のバッファーで結晶表面を最初にぬ らす。ＭｐＮＰＣに対する反応の測定には、１０−１２５μｌの５０ｍＭＭｐＮ ＰＣ（ＴＨＦ中）を２５ｍ１のバッファーに加える。

結晶の発振周波数が安定化後、上記に解説したようにＭｐＮＰＣを加える。Ｍｐ ＮＰＣが４８０７に結合するにつれて、固有共振周波数が撹乱され、それによっ てＭｐＮＰＣの存在が示される。この撹乱は結晶自体の等質量変化を示すものと 考えられるので、ＭｐＮＰＣの濃度を計算してもよいと思われる。

例　６ 脂質二層化学センサーを使用する４８Ｇ７触媒抗体によるメチルｐ−ニトロフェ ニルカーボネートの結合の検出 図１１に検知素子の一部として平面支持脂質二層膜を組み込んだ触媒抗体センサ ーのダイアグラムを示鳴センサーは銀１４０の薄膜（〜５００　ｎｍ　）を２７ ｘ７５ｍｍの顕微鏡スライドグラス上に５×５間の正方形の開口部を有するシャ ドウマスクを通して蒸着し０．５×２０鶴の回線に接続する（正方形電極への電 気的接触のため）。銀薄膜１４０の上部表面１４２はスライドガラスを一部浸漬 して塩素添加しく正方形電極が浸漬されるが接触回線は一部した浸たきないよう に）１．０　Ｍ　ＫＣｌの水溶液を攪拌し０．８　Ｖの電圧を銀電極と同一溶液 中の銀線に適用して１０分間電圧を供給した。

ついでスライドガラスを蒸留水で洗浄し乾燥する。ヒドロゲルマトリックス１３ ８にスピンキャスティングニヨシ（通常のフォトレジストスピンナーヲ使用）９ ．５％（Ｗ／ｖ）アクリルアミド＊　０．５　％　（ｗ／ｖ　）　Ｎ　。

Ｎ′　−メチレン−ビス−アクリルアミド、　ｏ、ｏ、ｏ　ｓ　ｑｂリボフラビ ン−５′−フォスフェート、及び１％Ｎ。

Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　−テトラメチルエチレンジアミンを０．１Ｍリン酸バッファー （ｐｉ（７）中に溶解してスライドグラス上に薄膜を作る。ついでスライド′ｔ −２５４ｎｍの紫外光で６０分照射しアクリルアミドゲルの重合を誘導した。つ いでスライドを０．１　Ｍ　ＫＣ１溶液中に貯蔵する。脂質二層膜１３６　（１ ：　１　ｖ／ｖのフオスファチジルコリンとコレステロールの混合物）に３．１ Ｍ　ＫＣｌのサブフェーズからＬａｎｇｍｕｉｒ　−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ、法（３ ４）を使用して堆積させる（０．１％Ｗ／ｖのヘキサン中の溶液）。スライドグ ラスを表面圧力３　Ｑ　ｍＮ　ｍ″″１−！で単層膜が圧縮される前にサブフェ ーズに浸たした。圧縮後スライドグラスを５　ｍｘ　ｍ１ｎ−１の速度で界面を 通して引き抜き、ついで同一速度で再び浸漬する、このようにして、ポリアクリ ルアミドデル上に７オスフオリビド／コレステロールの二層を堆積させる。テフ ロンシリンダー（示さない）をつぎに一部浸したスライド周囲に配置し約５Ｑｍ のスライド周囲に密閉容積をつくる。電気的接触は正方形電極と八ｇ　／　Ａｇ ＣＡ参照電塚１５１に行ないまた０、１　Ｍ　ＫＣｌの密封容積に配置した。

脂質二層センサーの電気伝導度を１０　ｍＶ　、　Ｉ　ＫＨｚの矩形波をセルに 適用してモニターＬ、Ｋｅｉｔｈｌｅｙ　６１７電位計をＩＢＭ／ＰＣに接続し て使用し各半サイクルの末端で電流を測定した。

触媒抗体（４８Ｇ７　）’（＋−脂質二層センサーの周囲が５ＯＮ体積の中へ１ ００μ！の抗体の濃縮液（０，Ｉ　ＭＫＣｔ中にｉ　ｍＭ　）を加えて生理的に 吸収させて脂質二層膜に固定する。吸収がおこるまで６０分放置後、ＭｐＮＰＣ に対する反応をＴＨＦ中に５０鮨の基質を２００μ！加えて測定し、さらに伝導 度の変化をモニターする。

ＭｐＮＰＣはＥＣＬ及び光導波管センサーを用いて４８Ｇ７触媒抗体によシ検出 される。光導波管センサーは図７に示されており、光透過性伝導物質の薄層を導 波管１００の外面に沈着させることによって調製される。

例えばインジウム−スズ酸化物を散布したジ又は金おるいはプラチナの極めて薄 いフィルム（＜１０ｎｍ）をシャドウマスクを通して蒸発させることによって望 みの電極型（例えば５Ｘ５ｍｍ方形）を作ることができる。電極９８への電気的 接触は伝導性のエポキシを用いた電線が使用され、連結部及び電線はエポキシ又 はシリコンゴム等の適当な非伝導性物質で覆われている（図７には示されていな い）。

Ｎ、ｐ−ニトロフェニルアニリン又はつないり抗原１０８（強い親和力では結合 されておらず又、４８Ｇ７によって化学的変化を受けてい力い）のような他の類 縁物質及びＴＡＧ部分１０６　、　Ｒｕ（ｂｐｙ）ｓが下に示されている： この分子は次のようにして合成される：すなわち次に示すようにｐ−ニトロアニ リ７　ｆ　ＥＤＴＡ−ｂｉｓ−無水物と反応させて−２を合成する。

２の無水物基がアミン誘導体のルテニウム化合物に結合するとＡを生する。

ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣＩ　）を用いて４にポリ（エチレンオ キサイド）誘導体と反応させてＡに反応性側鎖を付加し、希望する化合物ユを合 成する。これは抗体への結合が可能である。

ポリ（エチレンオキサイド）誘導体５はとスーアミノーポリ（エチレンオキサイ ド）を４−フロロ−３−二トロフェニルアジドと反応させることによって合成さ れる。ポリ（エチレンオキサイド）の結合アームの長さは種々の分子量のとスー アミノーポリ（エチレンオキサイド）ｔ−使用することによって変えることがで きる。

二機能性分子ユはｌ　［Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＫＣ１液中１　ｍ９／Ｉｄ；（Ｄ触媒抗 体溶液と１０μＭの分子ユの溶液を等容量混合することによって触媒抗体へ結合 される、抗体へ結合するために分子量の反応性アジド側鎖を適当な位置において 、触媒抗体は連結鎖のついた抗原に結合するアジド基はリジン、ヒスチジン、チ ロシンなどのアミノ酸残基の１つと反応することが期待できる。

（Ｂ１４８Ｇ７触媒抗体の固定 触媒抗体４８Ｇ７のＦａｂ’部分はその抗体ｋ、Ｆｃ部分全開裂するペプシンで 処理することに生成する、次にアルキルチオールで処理することによって内部鎖 のジサルフイド結合が切れて目的とするＦａｂ’フラグメメントは、電極ｔ−Ｎ −３−マレイミドプロピルジメチルエトキシシランで活性化し、次に触媒抗体の Ｆａｂ’フラグメントの−ＳＲ基を表面のマレイミド基へ結合させることによっ て、電極表面へ固定化される。

（Ｃ）　ＭｐＮＰＣの検出 ＥＣＬ触媒センサーの目盛の付は方は、センサーを遮光して、５０　ｍＭ　）リ プロピルアミン、０．０５１ツイーン２０、及び１Ｑ　Ｑ　ｍＭ　ＫＣ１溶液に ＭｐＮＰＣを１〜５００μＭの濃度範囲に入れた溶液中へ入れることによって行 わ−れる。白金補助電極及び標準電極（例えばＡｇ／ＡｇＣ！　）　（示されて いない）を上記センターと共にこの溶液中へ入れ、標準電極に対して＋１．５ｖ の電圧′ｔ−電気化学的電位計（例えばＥＧ　＆　Ｇ　Ｐｒ１ｎｃｅｔｏｎＡｐ ｐｌｉｅｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｒｐ−ｍｏｄｅｌ　２７３　）　ｋ用いて 透明な電極９８にかける。ＥＣＬ反応によって発生する光は、光増幅管１１２の 出力を測定することによってモニターされる。未知濃度の試料中のＭｐＮＰＣの 測定は、試料を等量の１００　ｍＭ　）リプロビルアミン、０．１　％ツイーン ２０．２０　Ｑ　ｍＭ　ＫＣ１溶液と混合し、そして発生するＥＣＬ光を目盛り 付は方法のところで記載したようにセンサーで測定することによって行われる。

ＭＯＰＣＩ　６７のごときコリンエステル受容体蛋白を模擬した抗体を組み込ん だ−に基づいた触媒抗体バイオセンサーが化学及び生物戦用（ＣＢＷ　）薬物及 びその他の阻害剤を検出するのに用いられる。例えば、アセチルコリン（Ａｃｈ 　）はコリン作動性ニューロンの連接部端にある小胞中に貯蔵されている重要な 神経伝達物質で神経の衝撃によって遊離される。遊離した神経伝達物質は連接部 の裂は目を通って拡散し後部シナツブの神経膜にあるＡｃｈ受容体へ結合し、そ れが神経衝撃を刺激する。多くのＣＢＷ薬物はへｃｈ受谷体へ結合し、神経シナ ラプスを通して神経衝撃の伝達をフロロ、りすることによって作用する。触媒抗 体ＭＯＰＣＩ　６７はコリンエステル（神経Ａｃｈ受容体）に結合し、それらの 加水分解を触媒する。特殊な例として、ＭＯＰＣＩ　６７はＳｃｈｅｍｅ　Ｉの 上部に示した反応にしたがってｐ−二トロフェニルＮ−ト’Ｊメチルアンモニオ エテルカルボネート（ＮＴＡＣ）の加水分解を触媒する。ＭＯＰＣＩ　６７によ って触媒されるコリンエステルの加水分解は木葉イオン全生成し、それが実施例 ２に記載したーに基づいた生物センサーを使用して検出することができる。

このようにＡｃｈ阻害剤は、触媒作用阻害によって生ずる木葉イオン濃度の変化 を感知することによって検出される。

この例において、ＭＯＰＣＩ　６７は小さなｐ）！電極端に捕捉され、そして非 特異的ＩｇＡ抗体が第２（対照）の−電極上に捕捉される、第３の標準電極も使 用される。

この配置は図１６に示した例２の配置と同じである。

Ａｇ／ＡｇＣ２標準電極に対する各ＰＨ電糧の電位測定に２箇の電位計が使用さ れる。マイクロコンピュータ（ＩＢＭ／ＰＣ）によシ２箇の一電罹の感応間の差 違を計算してデータを得る。

図１に示すように電極は例のものと同一の配置である。薄い（約０．２ｍｉ＋） 直径２．５１ｒ１Ｌのろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ　＋２）を平坦−膜一電極（Ｍｉｃ ｈｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ　Ｉｎｃ、、　Ｍ　１−４０４型）の末端上に置く。

１等分容積の濃縮タンパク質（約２００１ｎ９Ｚｍｌら、電極上）ＭＯｐｃ１６ °７触媒抗体及び第２電極上の免疫グロブリンＡｉっぎにろ紙に適用した。薄層 透析膜（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ　ｔ　５ｐ ｅｃｔｒａ　／　Ｐｏｒ　２　）をつぎにろ紙上に置き、さらに内径２．５龍の シリコンゴムチューブで定位置に保持した。

参照電極及び２個の組電極は２．５肘のｐｌ（８，５のバッファー（０，１４Ｍ ＫＣ２，０，０１ＭＴｒｉｓ　、　０−０２　％アジ化ナトリウム）の中に置き 、安定した電位になるまで安定化させるために放置した。ＮＴＡＣに対するシス テムの反応は０．０２５計のｉ　Ｑ　ｍＭ　ＮＴＡＣ塩化物をバッファー中に加 えて多重測定した（　（ＮＴＡＣ］　−００，１ｍＭ。微分反応をマイクロコン ピュータ−でモニターした。

ＮＴＡＣに対する反応の阻害剤による減衰は阻害剤を含む２．５１ｎｔのバッフ ァー溶液に６０分間電極を入れて測定する。バッファー中の０．０２５１１Ｌｔ の１０　ｍＭ　ＮＴＡＣ塩化物をついで加えてその反応を阻害剤のないときの反 応と比較する。

このやり方で、阻害剤濃度’ｉ　ＮＴＡＣに対する反応とを関連させる較正曲線 全描く。効果的な阻害剤はＮＴＡＣのＭＯＰＣ１６７触媒抗体に対する結合を遮 断しまた加水分解は起こらなかった；従って、微分−反応はゼロである。この方 法によう、ＭＯＰＣＩ　６７は−に基づいたセンサーンステムと共に使用してコ リンエステルレセプターを模倣しまたＣＢＷ試薬の存在及びコリンエステルレセ プターの他の阻害剤の定量も可能である。

引　用　文　献 １＋Ｍ、Ｃｒｅｍｅｒ、Ｚ、Ｂｉｏｌ、４７，５６２　（１９０６）。

２、　Ｆ、Ｈａｂｅｒ　ａｎｄ　Ｚ、Ｆｕｅｍｅｎｓｉｅｖｉｃｚ、Ｚ、Ｐｈ　 ｓ、Ｃｈｅｍ、、６７．３８５＋１９０９１゜ ３、工＋Ｘａｒｕｂｅ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅ ｎ　ｉｎｅｅｒｉｎＲｅｖｉｅｗｓ、２，３１３　＋１９８４１゜４、　Ｈ＋Ｙ 、Ｎｅｕｊａｈｒ、＠Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｇｅｎｅｔ、Ｅｎａ、Ｒｅｖ 、、ｌ、１６７−１８６　［１９８４）。

５、　ｒ、Ｗ＋５ｃｈｅｌｌｅｒ、Ｆ−５ｃｈｕｂｅｒｔ、Ｒ，ｋｅｎｎｅｂｅ ｒｇ、Ｈ，Ｇ、Ｍｕｌｌｅｒ。

Ｍ、Ｊａｎｃｈｅｎ、ａｎｄ　Ｈ，Ｗｉｅｓｅ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、！、１ 　（１９８５）。

６−　Ｇ、Ｇ、Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ、”Ｍｅｄｉｃａｌ、ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇ ｉｃａｌ　入ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆ　Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　 Ｄｅｖｉｃｅｓ、”　Ｃｈ、９　（Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｊ。

Ｋｏｒｙｔａ）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＋　Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ　（１９１１ １０）。

７、　ａｌ　Ｍ、Ｙ、Ｘｅａｔｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇ−Ａ、Ｒｅｃｈｎｉｔｚ、” ＰｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃＤｉｇｏｘｉｎ　Ａｎｚｉｂｏｄｙ　Ｍｅａｓｕ ｒｅｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ａｎｔｉｇｅｎ−工ｏｎｏｐｈｏｒｅＢａｓｅｄ　 Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ、”　Ａｎａｌ、Ｃｈｅｒｎ、、５６ ，８０１−８０６（１９８４）。

７、　ｂ）　Ｈ，Ｆｒｅｉｓｅｒ、ｅｄｉｔｏｒ、”Ｉｏｎ−５ｅｌｅｃｔｉｖ ｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ　ｉｎ入ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ”　Ｖｏｌｓ、ｌ　ａｎｄ　２．Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 　（１９８０１゜ ８、　Ｊ、５ａｖｏｒｙ、Ｒ，Ｌ、Ｂｅｒｔｈｏｌｆ、Ｊ−Ｃ，Ｂｏｙｄ、Ｄ、 Ｅ、Ｂｒｕｎｓ、Ｒ，Ａ。

Ｆｅ１ｄｅｒ、Ｍ、Ｌｏｖｅｌｌ、Ｊ、Ｒ，５ｈｉｐｓ、Ｍ、Ｒ，Ｗｉｌｌｓ、 Ｊ、Ｄ。

Ｃｚａｂａｎ、ＸＪ、Ｃｏｆｆｅｙ、ａｎｄ　Ｘ、Ｍ−０’Ｃｏｎｎｅｌｌ、＋ Ａｄｖａｎｃｅｓ　１ｎＣ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　０ｖｅｒ　ｔ ｈｅ　Ｐａ５ｔ　２５　Ｙｅａｒｓ、”　Ａｎａｌ−Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、１９ ８０．９９　（１９８６１゜１０＋ｃ、　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、　”Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｍｅａｓｕｒａｒａｅｎｔ　ｗｉｔｈｌｌ、 Ｇ、Ｆ、　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ、　”Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　５ｅｎｓｉｔｉｖ ｅ　Ｆｉｅｌｄ　ＥｆｆｅｃｔＴｒａｎｓｉｓｔｏｒｓ”　ｉｎ　”Ｅｉｏｓｅ ｎｓｏｒｓ：　ＦｕｎｄＩＬｍｅｎｔａｌｓ　ａｎｄ１２、Ｊ＋Ｊａｎａｔａ　 ａｎｄ　Ｇ、乙Ｂｌａｃ３ｃｂｕｒｎ、　”ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｅ ｎｓｏｒｓ、”　Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、、５８　７６６人　（１９８６）；　ｂ ）Ｊ＋工。

Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇ、Ｇ−Ｖｕｒａｋ、　”Ｆｅ１ｄｅｒ−。ｐｔｉ ｃ　５ｅｎｓｏｒｓ　ｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ 、”　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２４．１２３　（１９８４１゜Ｄｉａｂｅｔｅｓ　 Ｃａｒｅ、　５−、２４５　（１９８２１，。

２０、Ｂ−Ｌｉｅｃｉｂｅｒｇ、　Ｃ−Ｎｙｌａｒ＋ｃ！ｅｒ、　ａｘｒａニー 　Ｌｕｎｄｓｔｒｏｎ＋、　−５ｕｒｆａｃｅＰｌａｓｒｎｏｎ　Ｒｅ５ｏｎａ ｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｇａｓ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ 、”５ｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａｔｏｒｓ、　４．２９９　（１９８３ ）。

２１＋Ｂ、　Ｄａｎｉａｌｓｓｏｎ　ａｔ　ａｌ、、”Ｅｎｚｙｍｅ　Ｔｈｅｒ ｍｉｓｔｏｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ　ａｎｄＴｈｅｉｒ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、ＡＤＤ−Ｂｉｏｃｎｅｍ、ａｎｃｉＢｉｏｅｎａｉ ｎ−、２，９７−１４３（１９８１）。

２２−　Ｂ−Ｄａｎｉｅｌｓｓｏｎ、　ａｎｄ　Ｘ−Ｍｏ５ｂａｃｈ、　−Ｔｈ ｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　 ５ｅｎｓｏｒｓ、”　ｉｎ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ 　ａｎｃｉ　入ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、”　（入＋Ｐ＋Ｆ、Ｔｕｒｎｅｒ、Ｋ −Ｆａｒｕｂｅ、　ａｎｄ　Ｇ、Ｓ−Ｗｉｌｓｏｎ、　ｅｄｓ−）ｚ　Ｐ、　５ ７５−５９５−０ｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒ ｄ、　Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８７−２３、ａｌ　Ｃ０５ａｕｅｒｂｒｅｙ、　Ｚ 、　Ｐｈｖｓ、、　１５５．２０６　（１９５９）；　ｂ）　Ｇ。

５ａｕｅｒｂｒｅｙ、　ンー助ＬＬｔ　１７Ｌ　４５７　（１９６４１゜２４、 Ｊ、Ｆ、　Ａｌｄｅｒ　ａｎｄ　Ｊ、Ｊ、　ＭｃＣａｌｌｕｒｎ、　”Ｐｉｅｚ ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｃｒｙｓｔａｌｓｆｏｒ　Ｍａｓｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ、”　７．１０８゜１１６９　（１９８３） 。

２５、Ｊ、ｌ　Ｒｏｅｄｅｒｄｅｒ　ａｒｏｉ　Ｇ、Ｊ、Ｂａ５ｔｉａａｎｓ、 Ａｎａｌ、Ｃｈｅｒｎ、＊　５５゜２３３３　（１９８３）。

２６、　Ｍ−Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｃ−Ｌ、入ｒｔｈｕｒ、ａｎｄ　Ｇ、に、Ｄｈ ａｌｉｗａｌ、”ＬｉｑｕｉｄＰｈａｓｅ　ＰｉｅＺＯｅｌｅＣｔｒｉＣａｎｄ 　Ａｃｏｕｓｔｉｃ　Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ　５ｔｕｄｉｅｓＯｆ工ｎｔｅ ｒｆａｃｉａｌ工ａｕ＝＋ｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、”　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅ ｍ、、　５８．１２０６１１９８６）　。

２７、Ｊ、　Ｊａｎａｔａ、　Ｒ，Ｊ、　１（ｕｂｅｒ、　ａｎｄ　Ｍ、　Ｔｈ ｏｍｐｓｏｎ。

−Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｒｎｉｃａｌ　５ｅｎｓｏｒ　ｆｏｒ　５ｅｌｅｃｔｉ ｖｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａｌ　５ｐｅｃｉｅｓ　−Ｅｓｐ 、　ｆｏｒ　Ｇａｓ　ｏｒ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｕｓｅ　ｉｎＤｅｔｅｃｔｉｎｇ　 Ｅｎｚｙｒｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ａｎｔｉｇｅｎ　ｅｔｃ、Ｗｉｔｈ八ｃｃ へｒａｃｙ、”　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ＋　８５１０２３゜２ ８、　１！、Ｍ、　ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ、　”Ｌｉｐｉｄ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　 ＥｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＥｌｅｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ 　ｏｆ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｈｅｒｅｗｉｔｈ、”　Ｕ−５゜Ｐａｔｅｎｔ　 Ｎｏ、　４，４９０，２１６゜Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ　Ｐｏ１ｙｓａｃｃｈ ａｒｉｄｅ、”　Ｓｃｉ、、　１６２．３６９１１９６８３゜ｒｉｇ・　３ Ｆｉｇ、　４ Ｆｉｇ、　５ ｒｉｇ、６ Ｆｉｇ・　９ Ｆｉｇ、１０ Ｆｉｇ、　１１ 特表千２−５０１８６０　（３０） ＣＤ Ｆｉ９．１２ Ｆｉｇ、１３ Ｆｉｇ、１４ ｌ乙・答　（ポ′ルト） ｆも・　答　い゛ルト） 口　０８し　込４ 手続補正書（自発） １．事件の表示 ＰＣＴ　／　ＵＳ　８８　／　０４４２６２、発明の名称 触媒的抗体を用いる化学センサー ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　イゲン、インコーボレーテッド ４、代理人 居　所　〒１００東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビルヂング３３ １ 明細書及び請求の範囲翻訳文 手続補正書 平成２年１月ノ２日

Claims (65)

【特許請求の範囲】
1. １．環境下における物理的又は化学的変化を検出するためのシステムであつて、 （ａ）化学反応を実施する手段； （ｂ）その生理学的機能が非触媒的であつて、少なくとも１つの反応成分を少な くとも１つの生成物に変換する化学反応を触媒することのできる活性生物学的分 子；及び （ｃ）環境中での変化に関する情報を感知しプロセツシングするための手段； を含む上記システム。
2. ２．該活性生物学的分子が合理的に変質され、合成され、または触媒として同定 されている請求の範囲第１項記載のシステム。
3. ３．触媒的に活性な生物学的分子が抗体、そのフラグメントまたはそれから誘導 される合成ぺブチドである請求の範囲第１項記載のシステム。
4. ４．活性生物学的分子が細胞内または細胞上、細胞成分内または細胞成分上、あ るいは組織内または組織上に含有されている請求の範囲第１項記載のシステム。
5. ５．環境にわける物理的又は化学的変化を検出するため方法であつて、該変化は 、少なくとも１つの反応成分が少なくとも１つの生成物に変換される環境中にお いて起こる化学反応の結果であり； （ａ）反応成分が生成物に変換するのを促進する条件下で、その生理学的機能が 非触媒的である触媒的に活性な生理学的分子と反応成分とを接触せしめて、環境 中で化学反応を起こし；次いで （ｂ）変化に関する情報を感知しプロセツシングする；ことを含む上記方法。
6. ６．活性生物学的分子が合理的に変質され、合成され、または触媒として同定さ れている請求の範囲第５項記載の方法。
7. ７．触媒的に活性な生物学的分子が抗体、そのフラグメントまたはそれから誘導 される合成ぺブチドである請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．活性生物学的分子が細胞内または細胞上、細胞成分内または細胞成分上、あ るいは組織内または組織上に含有されている請求の範囲第５項記載の方法。
9. ９．環境中の分析対象物を検出するシステムであつて； （ａ）化学反応を実施する手段； （ｂ）その生理学的機能が非触媒的であつて、少くとも１つの反応成分を少なく とも１つの生成物に変換する化学反応を触媒することのできる活性生物学的分子 ；及び （ｃ）分析対象物の存在または非存在に関連した情報を感知しプロセツシングす るための手段；を含む上記システム。
10. １０．環境中の分析対象物を検出する方法であつて；（ａ）その生理学的機能が 非触媒的である触媒的に活性な生物学的分子と反応成分とを接触せしめて、環境 中で化学反応を起こし； 次いで （ｂ）分析対象物の存在または非存在に関連した情報を感知しプロセツシングす る； ことを含む上記方法。
11. １１．分析対象物が化学反応中に消費されまたは産生される請求の範囲第１０項 記載の方法。
12. １２．環境における物理的又は化学的変化を検出するためのシステムであつて、 （ａ）化学反応を実施する手段； （ｂ）小なくとも１つの反応成分を少なくとも１つの生成物に変換する化学反応 を触媒することができるように合理的に変質され、合成されまたは同定された抗 体； （ｃ）化学反応によつて引き起こされる環境中での物理的または化学的変化を検 出でき、且つ該変化に関連した情報を作成できるトランスデューサー；及び（ｄ ）該変化に応答してトランスデューサーによつて作成される情報をプロセツシン グするための手段；を含む上記システム。
13. １３．トランスデューサーによつて作成される情報から環境成分を検出するため の手段を更に含んでいる請求の範囲第１２項記載のシステム。
14. １４．環境中での物理的または化学的変化が、反応成分の生成物への変換によつ て引き起こされる請求の範囲第１２項記載のシステム。
15. １５．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１２項記載のシステム。
16. １６．トランスデューサーが熱量測定デバイスである請求の範囲第１２項記載の システム。
17. １７．トランスデューサーが流体圧力測定デバイスである請求の範囲第１２項記 載のシステム。
18. １８．触媒抗体が流体圧力測定デバイスの表面上に固定化されている請求の範囲 第１７項記載のシステム。
19. １９．トランスデューサーがオブテイカルフアバーデバィスである請求の範囲第 １２項記載のシステム。
20. ２０．トランスデューサーが光波ガイドデバイスである請求の範囲第１２項記載 のシステム。
21. ２１．トランスデューサーが電位差測定デバイスである請求の範囲第１２項記載 のシステム。
22. ２２．トランスデューサーが電流測定デバイスである請求の範囲第１２項記載の システム。
23. ２３．トランスデューサーが脂質膜デバイスである請求の範囲第１２項記載のシ ステム。
24. ２４．トランスデューサーが電気化学的キヤパシタンス／インビーダンスデバイ スである請求の範囲第１２項記載のシステム。
25. ２５．抗体が細胞内または細胞上、細胞成分内または細胞成分上、あるいは組織 内または組織上に含まれている請求の範囲第１２項記載のシステム。
26. ２６．抗体のフラグメントまたはそれから誘導される合成ぺブチドを含んでいる 請求の範囲第１２項記載のシステム。
27. ２７．環境における物理的又は化学的変化を検出するための方法であつて、該変 化は、少なくとも１つの反応成分が少なくとも１つの生成物に変換される環境に おいて起こる化学反応の結果であり； （ａ）反応成分が生成物に変換するのを促進する条件下で、その生理学的機能が 非触媒的である触媒的に活性な生物学的分子と反応成分とを接触せしめて、環境 中で化学反応を起こし； （ｂ）化学反応の結果として起こる物理的または化学的変化を感知し、該変化を 該変化に関連した情報に変換し；次いで （ｃ）化学反応の結果である物理的または化学的変化に応答してトランスデュー サーにより作成された情報をプロセツシングする； ことを含む上記方法。
28. ２８．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２７項記載の方法。
29. ２９．分析対象物が化学反応期間中に消費されまたは産生される環境中の分析対 象物を検出するためのシステムであつて、 （ａ）化学反応を実施する手段； （ｂ）化学反応を触媒するように合理的に変質され、合成されまたは同定された 抗体； （ｃ）分析対象物の存在または非存在に関係した環境での変化を検出でき、且つ それに関連した情報を作成できるトランスデューサー； 及び （ｄ）トランスデューサーによつて作成される情報をプロセツシングするための 手段； を含む上記システム。
30. ３０．トランスデューサーにより作成される情報から環境成分を検出するための 手段を更に含む請求の範囲第２９項記載のシステム。
31. ３１．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第２９項記載のシステム。
32. ３２．分析対象物が化学反応期間中に消費されまたは産生されるような環境中の 分析対象物を検出するための方法であつて、 （ａ）反応成分の生成物への変換を促進する条件下で、反応成分と触媒抗体とを 接触せしめて環境中で化学反応を起こさせ； （ｂ）環境中での分析対象物の存在または非存在を感知し、それに関連した情報 をトランスデュースし；次いで （ｃ）トランスデューサーにより作成された情報をプロセツシングする； ことを含む上記方法。
33. ３３．環境中の分析対象物を検出するためのシステムであつて、 （ａ）化学反応を実施するための手段；（ｂ）化学反応を触媒することができる ように変質され、合成されまたは同定された抗体であつて、且つ環境成分に結合 することのできる抗体； （ｃ）抗体への分析対象物の結合を検出でき、且つ該結合に関連した情報を作成 できるトランスデューサー；及び （ｄ）トランスデューサーによつて作成される情報をプロセツシングする手段； を含む上記システム。
34. ３４．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第３３項記載のシステム。
35. ３５．抗体がトランスデューサーの表面上に固定化されている請求の範囲第３３ 項記載のシステム。
36. ３６．環境中の分析対象物を検出する方法であつて、（ａ）分析対象物を触媒抗 体に結合させ；（ｂ）分析対象物の抗体への結合を検出し、該結合に関連した情 報をトランスデュースし； （ｃ）トランスデューサーによつて作成された情報をプロセツシングし；次いで （ｄ）分析対象物の反応を触媒することによつて抗体から分析対象物を遊離させ る； ことを含む上記方法。
37. ３７．分析対象物の抗体への結合が起こる環境中で分析対象物を抗体から遊離さ せることを更に含む請求の範囲第３６項記載の方法。
38. ３８．抗体が化学反応を触媒するのを促進する第２の環境に分析対象物−抗体複 合体を移すことによつて、分析対象物を抗体から遊離させることを更に含む請求 の範囲第３６項記載の方法。
39. ３９．分析対象物が、触媒抗体の触媒活性のインヒビターである請求の範囲第３ ６項記載の方法。
40. ４０．インヒビターのないバツフアーを含む第２の環境にインヒビター−抗体複 合体を移すことによつて、インヒビターを抗体から遊離させることを更に含む請 求の範囲第３９項記載の方法。
41. ４１．発色性またはルミネツセンス特性を有する環境成分を検出することによつ て、環境中の分析対象物の存在を検出するシステムであつて、 （ａ）化学反応を実施する手段； （ｂ）光源； （ｃ）感知末端、光源からの光を感知末端へ伝達するための光フアイバー、及び 感知末端からの光を光受信手段へ伝達するための返送光フアイバーを含む光感知 手段； （ｄ）その生理学的機能が非触媒的であつて化学反応を触媒することのできる活 性生物学的分子であつて、感知手段の感知末端近くに位置する一定量の活性生物 学的分子； （ｅ）反応環境から返送光フアイバーへの光を受信し、該光を電気シグナルに変 換できる光受信手段；及び（ｆ）電気シグナルをプロセツシングする手段；を含 む上記システム。
42. ４２．活性生物学的分子が、触媒として合理的に変質され、合成されまたは同定 されたモノクローナル抗体である請求の範囲第４１項記載のシステム。
43. ４３．発色性またはルミネツセンス特性を有する環境成分を検出することによつ て、環境中の分析対象物の存在を検出するシステムであつて、 （ａ）化学反応を実施するための手段；（ｂ）感知末端、及び感知末端の近くで 作成される光を光受信手段へ伝達する光フアイバーまたはウエイブガイド； （ｃ）電極； （ｄ）電気的に作成された化学ルミネツセント分子；（ｅ）該ルミネツセント分 子に結び付いた抗原；（ｆ）その生理学的機能が非触媒であつて化学反応を触媒 することができ、分析対象物と抗原に結合することができ、そして化学ルミネツ セント分子に共有結合する活性生物学的分子であつて、感知手段の感知末端の近 くの該電極上に位置する一定量の活性生物学的分子； （ｇ）化学ルミネツセント分子から光フアイバーまたは光ウエイプガイドヘの光 を受信するための光受信手段であつて、該光を電気シグナルに変換できる光受信 手段；及び （ｈ）該電気シグナルをプロセツシングする手段；を含む上記システム。
44. ４４．活性生物学的分子が、触媒として合理的に変質され、合成されまたは同定 されたモノクローナル抗体である請求の範囲第４３項記載のシステム。
45. ４５．環境中で起こる反応の結果としてのｐＨ変化を検出するシステムであつて 、 （ａ）化学反応を実施するための手段；（ｂ）ｐＨ感知末端を有する第１のイオ ン選択電極；（ｃ）ｐＨ感知末端を有する第２のイオン選択電極；（ｄ）対照電 極； （ｅ）その生理学的機能が非触媒的であつて、第１の電極のｐＨ感知末端の近く での反応を触媒することのできる一定量の活性生物学的分子； （ｆ）第２の電極のｐＨ感知末端の近くに位置する一定量の非触媒的蛋白質； （ｇ）第１及び第２のイオン選択電極のｐＨ感知末端に関連しており、且つ電極 によつて作成される電気シグナルを受信するための対照電極に関連した手段；（ ｈ）該受信手段によつて受信された電気シグナルをプロセツシングする手段； を含む上記システム。
46. ４６．活性生物学的分子が、触媒として合理的に変質され、合成されまたは同定 された請求の範囲第４５項記載のシステム。
47. ４７．環境中で起こる化学反応から生じる環境の温度変化を検出するシステムで あつて、 （ａ）化学反応を実施する手段； （ｂ）感知した温度を電気シグナルまたは光シグナルに変換できる温度感知エレ メント； （ｃ）その生理学的機能が非触媒的であつて反応を触媒することができ、且つ温 度感知エレメントの近くに位置する一定量の活性生物学的分子； （ｄ）電気シグナルまたは光シグナルを受信する温度感知エレメントと関連した 手段；及び （ｅ）該受信手段からの電気シグナルまたは光シグナルをプロセツシングする手 段； を含む上記システム。
48. ４８．熱感知エレメントがサーミスターを含む請求の範囲第４７項記載のシステ ム。
49. ４９．サーミスターがカラムの末端に位置している請求の範囲第４７項記載のシ ステム。
50. ５０．一定量の触媒抗体がカラム内のマトリツクス上に固定化されている請求の 範囲第４９項記載のシステム。
51. ５１．活性生物学的分子が、触媒として合理的に変質され、合成されまたは同定 されたモノクローナル抗体である請求の範囲第４７項記載のシステム。
52. ５２．環境中の化合物の生物学的分子への結合を検出するシステムであつて、 （ａ）反応を実施するための手段； （ｂ）天然の振動数を有する圧電気結晶であつて、結合によつて生じる天然振動 数の混乱を感知することによつて該成分の結合を検出することのできる圧電気結 晶； （ｃ）その生理学的機能が非触媒的であつて、環境中の該成分に結合することが てき、且つ該結晶の表面上またはその近くに位置する一定量の活性生物学的分子 ；（ｄ）結晶の天然振動数の混乱を検出するための、結晶表面に連結した手段； 及び （ｅ）該混乱に関連した情報をプロセツシングするための手段； を含む上記システム。
53. ５３．分析対象物が、一定量の活性生物学的分子によつて触媒される反応の反応 成分、協同反応成分または生成物の中間体である請求の範囲第５２項記載のシス テム。
54. ５４．圧電気結晶が、トップ表面及びボトム表面を有するクウオーツ結晶、該ト ップ表面に固着された第１電極、及び該ボトム表面に固着された第２電極を有し 、且つ第１及び第２電極が検出手段に連結している圧電気結晶である請求の範囲 第５３項記載のシステム。
55. ５５．一定量の活性生物学的分子がトップ表面またはボトム表面に固定化されて いる請求の範囲第５２項記載のシステム。
56. ５６．活性生物学的分子が、触媒として変質され、合成されまたは同定されたモ ノクローナル抗体である請求の範囲第５２項記載のシステム。
57. ５７．検出手段が、電極に連結したフイードバツクループ中のラジオ周波数増幅 器を含む請求の範囲第５３項記載のシステム。
58. ５８．プロセツシング手段が周波数カウンターである請求の範囲第５３項記載の システム。
59. ５９．環境中の分析対象物の結合を検出するシステムであつて、 （ａ）反応を実施するための手段； （ｂ）支持体に設けられた２層脂質膜；（ｃ）支持体に固着され、電導性金属塩 層に固着された伝導性金属層を含む内部対照電極； （ｄ）外部対照電極； （ｅ）その生理学的機能が非触媒的であつて、２層脂質膜の近くの分析対象物に 結合することのできる一定量の活性生物学的分子； （ｆ）内部及び外部対照電極に連結した２層脂質膜からの電気シグナルを受信し 増幅する手段；及び（ｇ）該増幅受信手段によつて受信されたデータをプロセツ シングする手段； を含む上記システム。
60. ６０．分析対象物が、活性生物学的分子によつて触媒される反応成分、協同反応 成分または生成物の中間体である請求の範囲第５９項記載のシステム。
61. ６１．分析対象物が、活性生物学的分子の触媒活性のインヒビターである請求の 範囲第６０項記載のシステム。
62. ６２．活性生物学的分子が、触媒として合理的に変質され、合成されまたは同定 されたモノクローナル抗体である請求の範囲第６０項記載のシステム。
63. ６３．分析対象物が、荷電されたものまたは２極性のものである請求の範囲第６ １項記載のシステム。
64. ６４．電導性金属層がＡｇを含み、電導性金属塩の層がＡｇＣｌを含む請求の範 囲第６１項記載のシステム。
65. ６５．２層脂質膜からの電気シグナルを受信し増幅するための手段が、該膜の内 部又は外部にある請求の範囲第６１項記載のシステム。